3-乙酰氧基-8,24-羊毛甾二烯-21-酸的抗肿瘤活性及其在医药中的应用的制作方法
专利名称：3-乙酰氧基-8,24-羊毛甾二烯-21-酸的抗肿瘤活性及其在医药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明公开了 3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸的体内外抗肿瘤活性，研究表明该化合物对H22荷瘤具有较好的抑制作用，对人肝癌细胞SMMC-7721和人乳腺癌细胞 MCF-7均有较好的杀伤作用。属于中药有效成分提取制备及其在医药和保健品领域中的应用。
背景技术：
3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸为一种四环三萜酸。现代研究表明其具有抑制枯草杆菌生长的活性。癌症，亦称恶性肿瘤，为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病，是目前危害人类健康甚至生命的重要疾病之一。近年来，由于环境污染、化学污染和电离辐射等因素的影响，癌症的发病率呈急剧上升趋势。据不完全统计，我国每年新增癌症患者180万，死亡 140万，平均每分钟就有1. 3人死于癌症。目前治疗癌症多为药物与化疗相结合的方法，而该方法多具毒副作用。三萜类物质具有抑制肿瘤细胞生长、止痛、镇静、抗过敏、消炎、解毒、护肝、降血压、降血脂等功效。但是关于3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸的抗肿瘤活性及其应用的研究却至今未见有报道。
发明内容
本发明公开了 3-乙酰氧基_8，24-羊毛留二烯-21-酸的体内外抗肿瘤活性，该化合物能够明显地改善机体免疫功能和杀伤癌细胞等作用。按药剂学方法，可以将本发明的3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸制成多种临床药物剂型作为治疗肿瘤的药物，所说的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型本发明的药物组合物含有疗效有效量的3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸为活性成分，以及含有一种或多种药学上可以接受的载体。上述的载体是指药学领域常规的药物载体，包括稀释剂、赋形剂、填充剂、黏合剂、 湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体。本发明可以组合物的形式通过口服、静脉、肌肉注射或胃肠外给药方式施用于这种治疗的患者。按照药学领域的常规生产方法制备各种剂型如片剂、颗粒剂、冲剂、胶囊、栓剂、喷雾剂、缓释剂和注射剂。也可使其活性成分与一种或多种载体或药物组合，制成所需剂型。下述的药理实验证实了 3-乙酰氧基_8，24-羊毛留二烯-21-酸具有治疗和预防肿瘤的药理活性。3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸的体内外抗肿瘤活性的检测摘要方法采用H22荷瘤小鼠模型和MTT法检测了 3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸的体内外抗肿瘤活性。结果①体内结果表明当剂量为10mg/kg/d时，抑瘤率最高可达到52. 31% ；能够明显地改善小鼠机体免疫功能。②体外研究结果表明该化合物对人肝癌细胞SMMC-7721和人乳腺癌细胞MCF-7均有较好的杀伤作用，其细胞杀伤率最大分别为 77. 97%和 90%。结论3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸具有较好的体内外抗肿瘤活性，能够明显地改善机体免疫功能和杀伤癌细胞。1 材料1. 1药物3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯_21_酸，由本实验室分离得到；注射用环磷酰胺(CTX)，批号09090521，江苏恒瑞医药股份有限公司产品；5_氟尿嘧啶(5-Fu)，购于吉林省肿瘤医院。MTT(Sigma) ;DMS0 (北京化工厂)；1. 2动物昆明小鼠50只，雄性，体重18 22g。购自吉林大学基础医学动物中心。1. 3仪器酶标仪(Multiskan)；离心机(S0RVALL) ；二氧化碳培养箱(NAPC0法国)。2方法和结果2.1 方法2. 1. 1体内抗肿瘤方法动物购入后，先饲养观察，使其适应环境1周。无菌条件下取接种7d的腹水型荷瘤小鼠的腹水，用生理盐水1 3稀释成细胞悬液，以每鼠0. ImL 接种于小鼠左后肢腋窝皮下。然后随机分为正常对照组；生理盐水模型对照组；阳性对照药环磷酰胺20mg/kg/d组；3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸5mg/kg/d和10mg/kg/d 组，共5组，每组10只。除第1组动物正常饲养，作为正常对照外；环磷酰胺组隔天腹腔注射给予环磷酰胺，3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸组每天灌胃给药；生理盐水对照组每天灌服生理盐水。各组小鼠自由取食饮水。每天观察小鼠的状态，连续10d，末次给药 24h后，称重，小鼠摘眼球取血0. 5 lmL，室温静置2h，1000r/min离心20min，取血清待测 IL-2含量。同时，将取血后的小鼠处死，完整摘取瘤块、胸腺和脾脏，分别称重，计算抑瘤率和器官免疫指数(脾脏指数和胸腺指数)。计算结果及统计肿瘤抑制率=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重X100%。胸腺指数=胸腺重(mg)/体重(g)，脾脏指数=脾脏重(mg)/体重(g)。IL-2含量测定采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测，操作步骤按照说明进行。加入终止液后，轻轻混合，在酶标仪上450nm处读取吸收值(OD)。依据标准品OD值， 采用ELISA标准曲线绘制软件作标准曲线，依据标准曲线计算各样品的IL-2含量。实验数据用〕±lS表示，并采用SPSS18. Ofor Windows统计软件进行分析。P < 0. 05说明在统计学上呈显著差异，P <0.01说明在统计学上呈极显著差异。2. 1. 2体外细胞毒性实验方法采用MTT法，实验步骤如下，采用指数生长期的 SMMC-7721和MCF-7细胞，配置成浓度为4 X IO4个/mL的细胞悬液，每孔100 μ L，接种于 96孔板，37°C、5%饱和湿度培养24h后，按设计浓度加受试药，每孔加药量100 μ L，每个剂量4个平行孔。再培养72h后，加入MTT每孔20 μ L，继续培养4h后，弃去上清，每孔加 150 μ LDMS0,微量振荡器震荡lOmin，置酶标仪上492nm波长处测定吸光度。
计算结果及统计抑制率=(0D _-ODseVODratt X 100%。OD值以平均值士标准差来表示。并采用SPSS18. Ofor Windows统计软件进行分析。P < 0. 05说明在统计学上呈显著差异，P < 0. 01说明在统计学上呈极显著差异。2. 2 结果2. 2.1体内抗肿瘤实验2. 2. 1. 1对H22荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯_21_酸对H22荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用结果如表 1所示。从表中可知，该物质对小鼠移植瘤的生长呈现较明显的抑制作用(p<0. 05)。当剂量为10mg/kg/d时，抑瘤率最大为52.31%,且同对照组相比，存在显著性差异(P < 0. 01)。 表 13-乙酰氧基_8，24-羊毛留二烯-21-酸对荷瘤小鼠肿瘤的影响
TableIAnti-tumor activity of 3-acetoxylanosta-8,24-dien-21-oic acidin H22mice
组别剂量(mg/kg/d) 动物数瘤重抑瘤率GroupDose NumberWeightInhibition ratioControl生理盐水 101.95 ±1.07-CTX20 100.69 ±0.15"64.62Compoud 15 101.04±0.22'46.6710 100.93 ±0.36*""52.31
与对照组比:*P < 0. 05 ；**P < 0. Olc,Compared with thecontrol group, *P
< 0. 05 ；**P < 0. 01。2. 2. 1. 2对H22荷瘤小鼠免疫器官的影响3-乙酰氧基_8，24-羊毛甾二烯-21-酸对吐2荷瘤小鼠免疫器官的影响结果如表2所示。从表中可知，小鼠荷瘤后脾脏指数明显升高，而胸腺指数下降。3-乙酰氧基-8， 24-羊毛留二烯-21-酸作用后，脾脏指数和胸腺指数呈不同程度的降低和增高。与正常饲养组相比，3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸组的胸腺指数不存在显著性差异，但脾脏指数均存在显著性差异(P <0.05)；与生理盐水对照组相比，3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸组的脾脏指数低于生理盐水组，但均不存在显著性差异(P >0.05)；与CTX组相比，脾脏指数高于CTX组但不存在显著性差异，胸腺指数高于CTX组且存在显著性差异。表23-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯_21_酸对荷瘤小鼠免疫器官的影响Table2Effects of 3-acetoxylanosta_8,24-dien-21_oic acid on immune organ in H22mice
权利要求
1.3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸在制备预防治疗癌症药物中的用途及其相关的应用。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于所说的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。
全文摘要
本发明公开了3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸的体内外抗肿瘤活性，研究表明该化合物对H22荷瘤具有较好的抑制作用，对人肝癌细胞SMMC-7721和人乳腺癌细胞MCF-7均有较好的杀伤作用，属于中药有效成分提取制备及其在医药和保健品领域中的应用方法，并为其在预防治疗肿瘤及其功能性保健品的应用提供了理论依据。
文档编号A61P37/02GK102232957SQ20101015936
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月29日 优先权日2010年4月29日
发明者包海鹰, 赵兴华 申请人:包海鹰
技术领域：
本发明公开了 3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸的体内外抗肿瘤活性，研究表明该化合物对H22荷瘤具有较好的抑制作用，对人肝癌细胞SMMC-7721和人乳腺癌细胞 MCF-7均有较好的杀伤作用。属于中药有效成分提取制备及其在医药和保健品领域中的应用。
背景技术：
3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸为一种四环三萜酸。现代研究表明其具有抑制枯草杆菌生长的活性。癌症，亦称恶性肿瘤，为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病，是目前危害人类健康甚至生命的重要疾病之一。近年来，由于环境污染、化学污染和电离辐射等因素的影响，癌症的发病率呈急剧上升趋势。据不完全统计，我国每年新增癌症患者180万，死亡 140万，平均每分钟就有1. 3人死于癌症。目前治疗癌症多为药物与化疗相结合的方法，而该方法多具毒副作用。三萜类物质具有抑制肿瘤细胞生长、止痛、镇静、抗过敏、消炎、解毒、护肝、降血压、降血脂等功效。但是关于3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸的抗肿瘤活性及其应用的研究却至今未见有报道。
发明内容
本发明公开了 3-乙酰氧基_8，24-羊毛留二烯-21-酸的体内外抗肿瘤活性，该化合物能够明显地改善机体免疫功能和杀伤癌细胞等作用。按药剂学方法，可以将本发明的3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸制成多种临床药物剂型作为治疗肿瘤的药物，所说的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型本发明的药物组合物含有疗效有效量的3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸为活性成分，以及含有一种或多种药学上可以接受的载体。上述的载体是指药学领域常规的药物载体，包括稀释剂、赋形剂、填充剂、黏合剂、 湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体。本发明可以组合物的形式通过口服、静脉、肌肉注射或胃肠外给药方式施用于这种治疗的患者。按照药学领域的常规生产方法制备各种剂型如片剂、颗粒剂、冲剂、胶囊、栓剂、喷雾剂、缓释剂和注射剂。也可使其活性成分与一种或多种载体或药物组合，制成所需剂型。下述的药理实验证实了 3-乙酰氧基_8，24-羊毛留二烯-21-酸具有治疗和预防肿瘤的药理活性。3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸的体内外抗肿瘤活性的检测摘要方法采用H22荷瘤小鼠模型和MTT法检测了 3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸的体内外抗肿瘤活性。结果①体内结果表明当剂量为10mg/kg/d时，抑瘤率最高可达到52. 31% ；能够明显地改善小鼠机体免疫功能。②体外研究结果表明该化合物对人肝癌细胞SMMC-7721和人乳腺癌细胞MCF-7均有较好的杀伤作用，其细胞杀伤率最大分别为 77. 97%和 90%。结论3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸具有较好的体内外抗肿瘤活性，能够明显地改善机体免疫功能和杀伤癌细胞。1 材料1. 1药物3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯_21_酸，由本实验室分离得到；注射用环磷酰胺(CTX)，批号09090521，江苏恒瑞医药股份有限公司产品；5_氟尿嘧啶(5-Fu)，购于吉林省肿瘤医院。MTT(Sigma) ;DMS0 (北京化工厂)；1. 2动物昆明小鼠50只，雄性，体重18 22g。购自吉林大学基础医学动物中心。1. 3仪器酶标仪(Multiskan)；离心机(S0RVALL) ；二氧化碳培养箱(NAPC0法国)。2方法和结果2.1 方法2. 1. 1体内抗肿瘤方法动物购入后，先饲养观察，使其适应环境1周。无菌条件下取接种7d的腹水型荷瘤小鼠的腹水，用生理盐水1 3稀释成细胞悬液，以每鼠0. ImL 接种于小鼠左后肢腋窝皮下。然后随机分为正常对照组；生理盐水模型对照组；阳性对照药环磷酰胺20mg/kg/d组；3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸5mg/kg/d和10mg/kg/d 组，共5组，每组10只。除第1组动物正常饲养，作为正常对照外；环磷酰胺组隔天腹腔注射给予环磷酰胺，3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸组每天灌胃给药；生理盐水对照组每天灌服生理盐水。各组小鼠自由取食饮水。每天观察小鼠的状态，连续10d，末次给药 24h后，称重，小鼠摘眼球取血0. 5 lmL，室温静置2h，1000r/min离心20min，取血清待测 IL-2含量。同时，将取血后的小鼠处死，完整摘取瘤块、胸腺和脾脏，分别称重，计算抑瘤率和器官免疫指数(脾脏指数和胸腺指数)。计算结果及统计肿瘤抑制率=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重X100%。胸腺指数=胸腺重(mg)/体重(g)，脾脏指数=脾脏重(mg)/体重(g)。IL-2含量测定采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测，操作步骤按照说明进行。加入终止液后，轻轻混合，在酶标仪上450nm处读取吸收值(OD)。依据标准品OD值， 采用ELISA标准曲线绘制软件作标准曲线，依据标准曲线计算各样品的IL-2含量。实验数据用〕±lS表示，并采用SPSS18. Ofor Windows统计软件进行分析。P < 0. 05说明在统计学上呈显著差异，P <0.01说明在统计学上呈极显著差异。2. 1. 2体外细胞毒性实验方法采用MTT法，实验步骤如下，采用指数生长期的 SMMC-7721和MCF-7细胞，配置成浓度为4 X IO4个/mL的细胞悬液，每孔100 μ L，接种于 96孔板，37°C、5%饱和湿度培养24h后，按设计浓度加受试药，每孔加药量100 μ L，每个剂量4个平行孔。再培养72h后，加入MTT每孔20 μ L，继续培养4h后，弃去上清，每孔加 150 μ LDMS0,微量振荡器震荡lOmin，置酶标仪上492nm波长处测定吸光度。
计算结果及统计抑制率=(0D _-ODseVODratt X 100%。OD值以平均值士标准差来表示。并采用SPSS18. Ofor Windows统计软件进行分析。P < 0. 05说明在统计学上呈显著差异，P < 0. 01说明在统计学上呈极显著差异。2. 2 结果2. 2.1体内抗肿瘤实验2. 2. 1. 1对H22荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯_21_酸对H22荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用结果如表 1所示。从表中可知，该物质对小鼠移植瘤的生长呈现较明显的抑制作用(p<0. 05)。当剂量为10mg/kg/d时，抑瘤率最大为52.31%,且同对照组相比，存在显著性差异(P < 0. 01)。 表 13-乙酰氧基_8，24-羊毛留二烯-21-酸对荷瘤小鼠肿瘤的影响
TableIAnti-tumor activity of 3-acetoxylanosta-8,24-dien-21-oic acidin H22mice
组别剂量(mg/kg/d) 动物数瘤重抑瘤率GroupDose NumberWeightInhibition ratioControl生理盐水 101.95 ±1.07-CTX20 100.69 ±0.15"64.62Compoud 15 101.04±0.22'46.6710 100.93 ±0.36*""52.31
与对照组比:*P < 0. 05 ；**P < 0. Olc,Compared with thecontrol group, *P
< 0. 05 ；**P < 0. 01。2. 2. 1. 2对H22荷瘤小鼠免疫器官的影响3-乙酰氧基_8，24-羊毛甾二烯-21-酸对吐2荷瘤小鼠免疫器官的影响结果如表2所示。从表中可知，小鼠荷瘤后脾脏指数明显升高，而胸腺指数下降。3-乙酰氧基-8， 24-羊毛留二烯-21-酸作用后，脾脏指数和胸腺指数呈不同程度的降低和增高。与正常饲养组相比，3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸组的胸腺指数不存在显著性差异，但脾脏指数均存在显著性差异(P <0.05)；与生理盐水对照组相比，3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸组的脾脏指数低于生理盐水组，但均不存在显著性差异(P >0.05)；与CTX组相比，脾脏指数高于CTX组但不存在显著性差异，胸腺指数高于CTX组且存在显著性差异。表23-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯_21_酸对荷瘤小鼠免疫器官的影响Table2Effects of 3-acetoxylanosta_8,24-dien-21_oic acid on immune organ in H22mice
权利要求
1.3-乙酰氧基-8，24-羊毛留二烯-21-酸在制备预防治疗癌症药物中的用途及其相关的应用。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于所说的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。
全文摘要
本发明公开了3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸的体内外抗肿瘤活性，研究表明该化合物对H22荷瘤具有较好的抑制作用，对人肝癌细胞SMMC-7721和人乳腺癌细胞MCF-7均有较好的杀伤作用，属于中药有效成分提取制备及其在医药和保健品领域中的应用方法，并为其在预防治疗肿瘤及其功能性保健品的应用提供了理论依据。
文档编号A61P37/02GK102232957SQ20101015936
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月29日 优先权日2010年4月29日
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