禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物的制作方法
专利名称：禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物。
背景技术：
禽流感是由正黏病毒科甲型流感病毒引起的一种禽烈性传染病，其临床表现为呼 吸系统疾病、产蛋下降等。禽流感曾在世界各地爆发流行，引起禽只大量死亡及生产性能的 急剧下降，使养禽业遭受巨大的经济损失。陆基家禽，水禽及野鸟均可被感染，以引起呼吸 系统和严重败血症以致全身多脏器功能衰竭，病情进展快、病死率高为主要特征。禽流感作为人流感新毒株形成的最庞大基因库将对人类造成直接感染，一些禽流 感病毒(H7型)正在发生变异，而变异的病毒能够在人与人之间传播，目前，共有包括中国 在内的15个国家暴发了人禽流感疫情，共造成412人感染，其中256人死亡。在禽类中传 染的所有禽流感病毒中，H5N1禽流感病毒现已具备大流行开始所需的所有先决条件，即迄 今为止，H5W病毒造成严重病情人数和死亡人数最多，它跨越了物种传染屏障，从禽类传染 到了人类。一旦形成有效的人与人之间的传播，H5W病毒将变异成引起新一轮流感疫情所 需的特性。目前，急需一种具备高水平的生物利用度、稳定理化性能及高效安全的禽流行性 感冒病毒的特异性抗病毒药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种具备高水平的生物利用度、稳定理化性能及高效安全的 禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物。本发明所提供的禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其活性成分为 四种反义核酸，所述四种反义核酸的核苷酸序列分别为序列表中的序列4、序列7、序列11 和序列14。本发明的禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其中所述四种反义 核酸为任意质量比。本发明的禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其中所述四种反义 核酸的质量比为1 1 1 1。本发明的禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其中还包括可药用 载体或赋形剂。本发明的禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物具备高水平的生物利 用度、稳定理化性能，无毒副作用，无耐药性，能特异性直接杀死AIV，抗病毒效果好，成本低 廉
MTv ο
具体实施例方式
人工合成如下反义核酸
AMl 5，-CAUCCACAUCACUCUGCUGUU-3’ ；
AM2 5，-CCUGCCGUAGAUGGCCCUCUU-3'；
AM3 5，-AAGGCGAGGAUAAAUGCAUUU-3’ ；
AM4 5，-GCAACAACAAGAGGAUCACUU-3’ ；
ANPl5-AUU⑶CAUACUCCUCAGCAUU-3，；
ANP25-CU⑶GACUUG⑶CAUCAUCUU-3，；
ANP35-AAUUCCCCUUUGACGCGUAUU-3，；
ANP45-UUGAACAAGCCCAUCAUCAUU-3，；
APAl5-CACCGAGAGCCCAGUUUAAUU-3，；
APA25-C⑶UUUCCGCCUUCCUUCUUU-3，；
APA35-GAAU⑶GGUACUUGUAGCAUU-3，；
APA45-UCUUU⑶GAUACCAUUUUCUU-3，；
APBl5-GUCCAUCAACCGGGUUGAGUU-3，；
APB25-UACCAUUCUCUUG⑶CCUGUU-3，；
APB35-GAAU⑶GGUGCUUAUAGCAUU-3，；
APB45-UUUCCCUAAGCUAGCCAUCUU-3，。
流感毒株腳1，H9N2实验条件涉及H5亚型的在BSL-3实验室进行，其它在BSL-2实验室进行。细胞系犬肾细胞MDCK反义核酸均为1. 5 μ g/ml采用细胞病变级数指标测定反义核酸抗病毒活性.Dayl 铺板消化前期准备的MDCK细胞，离心收集，细胞计数，用完全培养基将细胞浓度 调到1 X IO5个/ml，铺24孔板，于37°C二氧化碳培养箱中进行培养18-24小时。Day2 显微镜观察细胞的密度，待细胞长满孔板面积的70 80%时，且细胞状态良好。 吸去培养液，每孔加入300 μ 1待筛选药物，每个药物10个孔。温育1小时后，加入100 μ 1 流感病毒(感染比为0.01)，吸附2小时后，用营养液洗去未吸附的病毒后，再加入完全培养 基，在37°C和5% CO2环境中继续培养。实验过程中还设不加病毒和反义核酸的正常细胞 对照组，加病毒、不加反义核酸阳性对照组和加反义核酸药物、不加病毒的阴性对照组。Day3-5 观察药物对细胞的保护效应，并对结果进行评判。结果评判对照组成立和细胞病变评判指标。(1)正常细胞对照组实验过程无病变；阳性对照组出现细胞病变，且到实验结束 时90%以上细胞产生病变；药物阴性对照实验过程细胞无病变。(2)细胞病变评判指标细胞无病变-细胞病变在25%以下 +细胞病变在26%-50% ++细胞病变在51%-75% +++细胞病变在76%-100% ++++
实验组筛选结果如表1.表1.反义核酸在细胞上的抗病毒活性分析
处理方式MDCK细胞病变率序号反义核酸H5N1 H9N21AMl+++ +2AM2+ +3AM3++ +
4AM4-+
55ANPl++++
6 ANP2+++
7. ANP3++
8ANP4+-
9APAl++++
10APA2++
11APA3++
12APA4+++++
13APBl+-
14APB2-— 15、APB3+++ 16APB4++++
18阳性对照组++++++++
19阴性对照组-_
20 正常细胞对照组上述细胞病毒实验分析结果表明AM4、ANP3、APA3、APB2为优选。毒性分析Dayl 铺板消化前期准备的MDCK细胞，离心收集，细胞计数，用完全培养基将细胞浓度 调到IX IO5个/ml，铺24孔板，在37°C二氧化碳培养箱中培养18-24小时。Day2 显微镜观察细胞的密度，待细胞长满孔板面积的70 80%时，且细胞状态良好。 吸去培养液，每孔加入300 μ 1待筛选药物，每种药物加10孔。在37°C和5% CO2环境中继 续培养继续培养。实验过程中设只加PBS液无反义核酸的阴性对照组。Day3-5 观察药物对细胞的毒性效应，并对结果进行评判，结果如表2。
表2.反义核酸毒性分析
四种反义核酸AM4、ANP3、APA3和APB2按照任意质量比混合制成本发明的反义核 酸药物。具体以反义核酸AM4、ANP3、APA3和APB2按照质量比为1 1 1 1混合制成 的反义核酸药物为例。反义核酸药物稳定性分析高温流通蒸汽高温105°C，20分钟灭菌不影响其生物活性。极端温度50°C存放2个月不影响其生物活性。室温存放24个月不影响其生物活性。低温-20°C存放48个月不影响其生物活性。动物实验试验动物20日龄的SPF鸡160只，分成16组，每组10只。病毒H5m，H9N2实施方案(一)药效性试验将实验组用H5W或H9N2毒感染(感染毒剂量100个TCID50)， 24小时后，分别肌肉注射各单体反义核酸或本发明的核酸药物，剂量均为10 μ g，并设只攻 毒不用反义核酸阳性对照组和设立只用反义核酸、不攻毒的作为阴性对照组。攻毒后每日 观察鸡的情况，14天后统计鸡死亡数(见表3、表4)。表3、各单体反义核酸及本发明核酸药物对SPF鸡人工感染H5W毒后的治疗性试
验结果 表4、各单体反义核酸及本发明核酸药物对SPF鸡感染H9N2后的治疗性试验结果 ( 二 )不同给药组对鸡体内病毒抑制试验鸡只在注射反义核酸药物72小时和 168小时后，分别用灭菌的棉拭子涂擦泄殖腔，将浸透分泌物的棉拭子放入含青霉素、链霉 素2000U/ml的HANK'S液中，充分捻动、震荡，8000转/min，离心lOmin，取上清液作为接种 材料。分别接种10日龄SPF鸡胚，培养5d后冻死活胚，全部测定血凝性，以HA效价> 21og2 判定为鸡只排病毒阳性(见表5)，结果表明本发明的反义核酸可以获得良好的治疗效果。表5.各单体反义核酸及本发明核酸药物对SPF鸡感染H5m，H9N2抑制效果
权利要求
禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其活性成分为四种反义核酸，所述四种反义核酸的核苷酸序列分别为序列表中的序列4、序列7、序列11和序列14。
2.根据权利要求1所述的抗病毒反义核酸药物，其特征在于所述四种反义核酸为任 意质量比。
3.根据权利要求1或2所述的抗病毒反义核酸药物，其特征在于所述四种反义核酸 的质量比为1 1 1 1。
4.根据权利要求3所述的抗病毒反义核酸药物，其特征在于还包括可药用载体或赋 形剂。
全文摘要
本发明公开了一种禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物。本发明的禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其活性成分为四种单体反义核酸，所述四种反义核酸的核苷酸序列分别为序列表中的序列4、序列7、序列11和序列14。本发明的禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物具备高水平的生物利用度、稳定理化性能，无毒副作用，无耐药性，能特异性直接杀死AIV，抗病毒效果好，成本低廉。
文档编号A61P31/16GK101920022SQ20101015965
公开日2010年12月22日 申请日期2010年4月29日 优先权日2010年4月29日
发明者韩健宝 申请人:韩健宝
技术领域：
本发明涉及禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物。
背景技术：
禽流感是由正黏病毒科甲型流感病毒引起的一种禽烈性传染病，其临床表现为呼 吸系统疾病、产蛋下降等。禽流感曾在世界各地爆发流行，引起禽只大量死亡及生产性能的 急剧下降，使养禽业遭受巨大的经济损失。陆基家禽，水禽及野鸟均可被感染，以引起呼吸 系统和严重败血症以致全身多脏器功能衰竭，病情进展快、病死率高为主要特征。禽流感作为人流感新毒株形成的最庞大基因库将对人类造成直接感染，一些禽流 感病毒(H7型)正在发生变异，而变异的病毒能够在人与人之间传播，目前，共有包括中国 在内的15个国家暴发了人禽流感疫情，共造成412人感染，其中256人死亡。在禽类中传 染的所有禽流感病毒中，H5N1禽流感病毒现已具备大流行开始所需的所有先决条件，即迄 今为止，H5W病毒造成严重病情人数和死亡人数最多，它跨越了物种传染屏障，从禽类传染 到了人类。一旦形成有效的人与人之间的传播，H5W病毒将变异成引起新一轮流感疫情所 需的特性。目前，急需一种具备高水平的生物利用度、稳定理化性能及高效安全的禽流行性 感冒病毒的特异性抗病毒药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种具备高水平的生物利用度、稳定理化性能及高效安全的 禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物。本发明所提供的禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其活性成分为 四种反义核酸，所述四种反义核酸的核苷酸序列分别为序列表中的序列4、序列7、序列11 和序列14。本发明的禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其中所述四种反义 核酸为任意质量比。本发明的禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其中所述四种反义 核酸的质量比为1 1 1 1。本发明的禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其中还包括可药用 载体或赋形剂。本发明的禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物具备高水平的生物利 用度、稳定理化性能，无毒副作用，无耐药性，能特异性直接杀死AIV，抗病毒效果好，成本低 廉
MTv ο
具体实施例方式
人工合成如下反义核酸
AMl 5，-CAUCCACAUCACUCUGCUGUU-3’ ；
AM2 5，-CCUGCCGUAGAUGGCCCUCUU-3'；
AM3 5，-AAGGCGAGGAUAAAUGCAUUU-3’ ；
AM4 5，-GCAACAACAAGAGGAUCACUU-3’ ；
ANPl5-AUU⑶CAUACUCCUCAGCAUU-3，；
ANP25-CU⑶GACUUG⑶CAUCAUCUU-3，；
ANP35-AAUUCCCCUUUGACGCGUAUU-3，；
ANP45-UUGAACAAGCCCAUCAUCAUU-3，；
APAl5-CACCGAGAGCCCAGUUUAAUU-3，；
APA25-C⑶UUUCCGCCUUCCUUCUUU-3，；
APA35-GAAU⑶GGUACUUGUAGCAUU-3，；
APA45-UCUUU⑶GAUACCAUUUUCUU-3，；
APBl5-GUCCAUCAACCGGGUUGAGUU-3，；
APB25-UACCAUUCUCUUG⑶CCUGUU-3，；
APB35-GAAU⑶GGUGCUUAUAGCAUU-3，；
APB45-UUUCCCUAAGCUAGCCAUCUU-3，。
流感毒株腳1，H9N2实验条件涉及H5亚型的在BSL-3实验室进行，其它在BSL-2实验室进行。细胞系犬肾细胞MDCK反义核酸均为1. 5 μ g/ml采用细胞病变级数指标测定反义核酸抗病毒活性.Dayl 铺板消化前期准备的MDCK细胞，离心收集，细胞计数，用完全培养基将细胞浓度 调到1 X IO5个/ml，铺24孔板，于37°C二氧化碳培养箱中进行培养18-24小时。Day2 显微镜观察细胞的密度，待细胞长满孔板面积的70 80%时，且细胞状态良好。 吸去培养液，每孔加入300 μ 1待筛选药物，每个药物10个孔。温育1小时后，加入100 μ 1 流感病毒(感染比为0.01)，吸附2小时后，用营养液洗去未吸附的病毒后，再加入完全培养 基，在37°C和5% CO2环境中继续培养。实验过程中还设不加病毒和反义核酸的正常细胞 对照组，加病毒、不加反义核酸阳性对照组和加反义核酸药物、不加病毒的阴性对照组。Day3-5 观察药物对细胞的保护效应，并对结果进行评判。结果评判对照组成立和细胞病变评判指标。(1)正常细胞对照组实验过程无病变；阳性对照组出现细胞病变，且到实验结束 时90%以上细胞产生病变；药物阴性对照实验过程细胞无病变。(2)细胞病变评判指标细胞无病变-细胞病变在25%以下 +细胞病变在26%-50% ++细胞病变在51%-75% +++细胞病变在76%-100% ++++
实验组筛选结果如表1.表1.反义核酸在细胞上的抗病毒活性分析
处理方式MDCK细胞病变率序号反义核酸H5N1 H9N21AMl+++ +2AM2+ +3AM3++ +
4AM4-+
55ANPl++++
6 ANP2+++
7. ANP3++
8ANP4+-
9APAl++++
10APA2++
11APA3++
12APA4+++++
13APBl+-
14APB2-— 15、APB3+++ 16APB4++++
18阳性对照组++++++++
19阴性对照组-_
20 正常细胞对照组上述细胞病毒实验分析结果表明AM4、ANP3、APA3、APB2为优选。毒性分析Dayl 铺板消化前期准备的MDCK细胞，离心收集，细胞计数，用完全培养基将细胞浓度 调到IX IO5个/ml，铺24孔板，在37°C二氧化碳培养箱中培养18-24小时。Day2 显微镜观察细胞的密度，待细胞长满孔板面积的70 80%时，且细胞状态良好。 吸去培养液，每孔加入300 μ 1待筛选药物，每种药物加10孔。在37°C和5% CO2环境中继 续培养继续培养。实验过程中设只加PBS液无反义核酸的阴性对照组。Day3-5 观察药物对细胞的毒性效应，并对结果进行评判，结果如表2。
表2.反义核酸毒性分析
四种反义核酸AM4、ANP3、APA3和APB2按照任意质量比混合制成本发明的反义核 酸药物。具体以反义核酸AM4、ANP3、APA3和APB2按照质量比为1 1 1 1混合制成 的反义核酸药物为例。反义核酸药物稳定性分析高温流通蒸汽高温105°C，20分钟灭菌不影响其生物活性。极端温度50°C存放2个月不影响其生物活性。室温存放24个月不影响其生物活性。低温-20°C存放48个月不影响其生物活性。动物实验试验动物20日龄的SPF鸡160只，分成16组，每组10只。病毒H5m，H9N2实施方案(一)药效性试验将实验组用H5W或H9N2毒感染(感染毒剂量100个TCID50)， 24小时后，分别肌肉注射各单体反义核酸或本发明的核酸药物，剂量均为10 μ g，并设只攻 毒不用反义核酸阳性对照组和设立只用反义核酸、不攻毒的作为阴性对照组。攻毒后每日 观察鸡的情况，14天后统计鸡死亡数(见表3、表4)。表3、各单体反义核酸及本发明核酸药物对SPF鸡人工感染H5W毒后的治疗性试
验结果 表4、各单体反义核酸及本发明核酸药物对SPF鸡感染H9N2后的治疗性试验结果 ( 二 )不同给药组对鸡体内病毒抑制试验鸡只在注射反义核酸药物72小时和 168小时后，分别用灭菌的棉拭子涂擦泄殖腔，将浸透分泌物的棉拭子放入含青霉素、链霉 素2000U/ml的HANK'S液中，充分捻动、震荡，8000转/min，离心lOmin，取上清液作为接种 材料。分别接种10日龄SPF鸡胚，培养5d后冻死活胚，全部测定血凝性，以HA效价> 21og2 判定为鸡只排病毒阳性(见表5)，结果表明本发明的反义核酸可以获得良好的治疗效果。表5.各单体反义核酸及本发明核酸药物对SPF鸡感染H5m，H9N2抑制效果
权利要求
禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其活性成分为四种反义核酸，所述四种反义核酸的核苷酸序列分别为序列表中的序列4、序列7、序列11和序列14。
2.根据权利要求1所述的抗病毒反义核酸药物，其特征在于所述四种反义核酸为任 意质量比。
3.根据权利要求1或2所述的抗病毒反义核酸药物，其特征在于所述四种反义核酸 的质量比为1 1 1 1。
4.根据权利要求3所述的抗病毒反义核酸药物，其特征在于还包括可药用载体或赋 形剂。
全文摘要
本发明公开了一种禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物。本发明的禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物，其活性成分为四种单体反义核酸，所述四种反义核酸的核苷酸序列分别为序列表中的序列4、序列7、序列11和序列14。本发明的禽流行性感冒病毒的特异性抗病毒反义核酸药物具备高水平的生物利用度、稳定理化性能，无毒副作用，无耐药性，能特异性直接杀死AIV，抗病毒效果好，成本低廉。
文档编号A61P31/16GK101920022SQ20101015965
公开日2010年12月22日 申请日期2010年4月29日 优先权日2010年4月29日
发明者韩健宝 申请人:韩健宝
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