含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定方法
专利名称：含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种复方中药制剂的检测方法，具体一种含有颠茄流浸膏的中药栓剂 中硫酸阿托品含量的测定方法。
背景技术：
颠茄流浸膏是一种棕色的液体，气微臭，系由颠茄叶按流浸膏制法而得的制剂，主 要含有茛菪碱、阿托品等生物碱，其中，阿托品等生物碱主要有解除平滑肌的痉挛、抑制腺 体分泌、解除迷走神经对心脏的抑制，使心跳加快、散大瞳孔，升高眼压；兴奋呼吸中枢的作 用。因此颠茄流浸膏也具有能解除平滑肌痉挛，抑制腺体分泌的功效，常被用来制成各种中 药制剂。如由马应龙药业集团股份有限公司独家生产的复方中药栓剂麝香痔疮栓(专利号 02139187)，该品种是由牛黄、珍珠、麝香酮、三七、五倍子、冰片、颠茄流浸膏、炉甘石等多种 组份制成的栓剂，具有清热解毒，消肿止痛，止血生肌功能。为了保证产品功效，对成品栓剂 中阿托品的测定一直必须进行质量控制环节，目前通常采用药典规定的薄层色谱法对含有 颠茄流浸膏的中药栓剂进行测定，该方法比较简单易行，但缺点是只能鉴别栓剂中阿托品 的有无，而无法进一步检测阿托品的具体含量。并且麝香痔疮栓本身组份多(主要已知成 份就达8种)、工艺复杂，栓剂中阿托品含量的成份在下述情况都可能会发生变化1、不同 批次的产品中阿托品含量可能会发生变化，从而对产品的质量控制具有指导意义；2、当对 产品存放一段时间后，阿托品的含量也可能会变化，从而对药品有效期的设定具有重要影 响。因此，为保证药品质量，有必要采用建立更先进，更有效，更灵敏专属的方法既可以鉴别 颠茄流浸膏中硫酸阿托含量的有无、又可以有效反映麝香痔疮栓中颠茄流浸膏中硫酸阿托 品的含量，有效提高麝香痔疮栓的质量。但是未见任何有关于对含有颠茄流浸膏的中药栓 剂中硫酸阿托品含量检测方法的报道。高效液相色谱法是以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分 离技术，可用于分析有机化合物，在西药领域中药品含量检测上被广泛应用。但是由于西 药与中药的显著不同，西药药品通常组份少、且成份明确，检测时，理论板数和分离度高，容 易形成清晰的主峰，得到的检测数据精确度高。而中药制剂特别是复方制剂，由于成分多且 复杂(如麝香痔疮栓)，甚至还有不明成份的物质，有的复方中药中还可能含有与被检测成 份结构与性状极其相似物质，测试时供试样品溶液制备更为困难，使控制色谱柱条件困难， 这些都会对分析结果产生各种干扰，采用高效液相色谱法进行分析时，理论板数和分离度 低，供试品与对照品色谱峰容易出现不一致，其主峰与前后峰容易出现交叠，使得测量的精 确度下降，这是目前高效液相色谱法难以应用于分析复方中药栓剂中阿托品含量的主要原 因。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，提供了一种含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸 阿托品含量的测定方法，解决了现有含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品的检测只能
3鉴别有无，无法检测其含量的问题，特别适用于对麝香痔疮栓中硫酸阿托品含量的检测，操 作简单快速，准确可靠，灵敏度、精密度高，从而对有效的控制栓剂质量具有重要的指导意 义。本发明含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定方法，包括下述步 骤a.控制色谱条件色谱柱为安捷伦十八烷基硅烷键合硅胶(Anglient Zorbax Eclipse XDBC-18， 3. 5um)高效液相色谱柱，检测波长为200nm-400nm，配制流动相A为0. 03-0. 07MKH2P04，pH 为1-4. 5的磷酸盐缓冲液、B为乙腈，A与B混合质量比为90% -65% 10% -35% ；b.对照品溶液的制备对照品为硫酸阿托品，先用5-15%的硫酸溶解，再加入流动相制成对照品溶液；c.供试品溶液的制备供试品为含有颠茄流浸膏的中药栓剂，先用5-15%的硫酸溶解，分离出硫酸阿托品后再加入流动相制成供试品溶液；d.分别吸取对照品溶液及样品供试品溶液利用液相色谱仪采用外标法进行高效 液相色谱法测定阿托品的含量。所述步骤a中，A为0. 05MKH2P04, pH为3的磷酸盐缓冲液，A与B的混合质量比例 为72 28%，检测波长为210nm。步骤b中，使用对照品为硫酸阿托品，相对于IOOmg硫酸阿托品加入5-15%的 硫酸40-80ml溶解，然后加入步骤a中配制的流动相，控制溶液中硫酸阿托品的浓度为 0. 01-500mg. mL—1即为对照品溶液。所述步骤c中，供试品为含有颠茄流浸膏的中药栓剂，相对于9g含有颠茄流浸膏 的中药栓剂加入5-15%的硫酸30-70ml溶解，将溶解液进行萃取，干燥后得到干燥残留物， 然后加入步骤a中配制的流动相，控制溶液中残留物的浓度为0. 01-2500mg. mL—1即为供试 品溶液。所述萃取方法为将溶解有中药栓剂的溶解液进行超声波提取，再冷却后过滤、然 后进行氯仿萃取和干燥剂吸收剩余水层，最后将溶液进行蒸发干燥得到干燥残留物。所述 干燥剂可选用干燥硫酸钠，所述氯仿萃取最好进行至少三次。蒸发温度优选45-50°C。超声 提取前可对溶解液进行水浴控制温度在30-55°C°C，超声提取时间优选为3-10分钟。为了尽可能的避免上述的各种干扰，发明人通过反复研究摸索发现在选择色谱柱 为安捷伦十八烷基硅烷键合硅胶高效液相色谱柱，英文名为=AnglientZorbax Eclipse XDB C-18,3. 5um，控制流动相A为0. 03-0. 07MKH2P04、pH为1-4. 5的磷酸盐缓冲液、B为乙 腈，A与B混合质量比为90%-65% 10%-35%时，理论板数及分离度上升，特别是当A为 磷酸盐缓冲液(0. 05MKH2P04，用溶解的磷酸调节到pH = 3)，B为乙腈，A与B的混合质量比 为72% 28%时，样品分离效果明显，样品峰分离度及分离纯度大幅度提高，满足了检测 的准确性和精确性要求，明显改善中药成分繁杂难分离的影响。进一步的，考虑到供试品为中药栓剂，要检测其中硫酸阿托品含量应先进行萃取， 但是这类含有颠茄流浸膏中药栓剂组分复杂，类似结构及性质的成分在检验过程中会起干 扰作用，而萃取时有可能会发生不仅萃取到硫酸阿托品，同时还会萃取到其它物质，从而影响最终检测结果的准确性，发明人根据相似相溶的原则问题，在保护或无破坏被研究的主 要成分硫酸阿托品的同时、通过改变或破坏其他相似结构或性质的干扰成分(譬如茛菪碱 类生物碱)的化学结构和性质以达到尽可能分离纯化样品的方法，非常适合复方中药制剂 的分离，因此在供试品萃取前先使用5-15%的硫酸溶解供试品，利用硫酸阿托品能耐受于 硫酸中不被破坏，同时硫酸对于硫酸阿托品以外其它成份又有清除作用(例如硫酸可破坏 麝香酮、茛菪碱类生物碱等等)，从而使供试品在萃取就前尽可能的减少其它成份对萃取步 骤的影响。并且，为了保证制备的供试品溶液和对照品溶液的一致性，对于对照品也相应加 入5-15%硫酸溶液进行溶解。在萃取步骤中，中药成分存在繁杂难分离的问题，要避免同时萃取出硫酸阿托品 以外的物质，发明人还针对性改进了一般中药标准中采用单纯的有机溶剂萃取的方法，通 过采用超声波提取、有机溶剂萃取和干燥剂吸收剩余水层的组合方法排除水分及水分中成 分干扰，进一步去除本中药栓剂样品溶液复杂的类似结构及性质的成分在检验过程中的干 扰作用。采用超声波提取，一则可以增加主要分析成分的溶解，二则采用超声波去除其他杂 质干扰作用；采用干燥剂吸收有机相中的剩余水分以排除水分及水分中的杂质干扰，以达 到纯化样品作用。萃取出干燥残留物硫酸阿托品纯度高，为下步采用外标法进行高效液相 色谱法测定阿托品的含量提供了有效保障，所述干燥剂并不特别限制，优选干燥硫酸钠。有益效果1.与原经典薄层色谱鉴别颠茄流浸膏中硫酸阿托品的方法相比较，本发明不光能 够有效鉴别栓剂中硫酸阿托品的有无，更可以及时有效反映硫酸阿托品的含量变化。2.通过对色谱条件的控制和选择，对供试品用硫酸进行前期酸处理，以提高阿托 品的萃取纯度，最大程度的避免中药栓剂样品溶液中复杂的类似结构及性质的成分在测定 过程中的干扰作用。3.利用超声波提取和氯仿萃取的组合方式，进一步解决了中药成分繁杂难分离的 问题。4.样品峰纯度高，分离度及理论板数均非常高，理论板数按硫酸阿托品峰计算高 于6000，分离度高于3，远远高于方法学研究基本要求理论板数及分离度要求，且准确性 好，精确度高，重复性实验结果RSD仅为1.1%。5.通过对不同批次含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定，可以反 应不同批次间硫酸阿托品的含量变化，对调整工艺、原料配方优化等研究具有重要意义；通 过对中药栓剂置放不同时间后硫酸阿托品含量的测定，从而可以对其有效期的确定具有重 要参考价值。6.本发明适合各种含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定，也适用 于其它含有颠茄流浸膏的复方中药剂型，如乳剂、膏剂等。特别适合于背景技术中介绍的由 马应龙药业集团股份有限公司生产的复方中药栓剂麝香痔疮栓。
具体实施例方式实施例1 控制色谱条件柱安捷伦十八烷基硅烷键合硅胶(Anglient Zorbax EclipseXDB C-18,3. 5um)美国安捷伦科技有限公司制。
流动相A 磷酸盐缓冲液0. 05M KH2P04,用磷酸溶液调节到pH = 3 ;B 乙腈；同溶 剂洗脱(isocratic elution)A B = 72% 28%检测波长210nm。对照品溶液的制备精密称量106mg硫酸阿托品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号 100040-200510))对照品溶解入10%的硫酸50ml中，将得到的溶液0. 5ml加入流动相至硫 酸阿托品的溶液浓度为0. 0424mg/ml。最终得到的溶液作为对照品溶液。供试品溶液的制备供试品马应龙药业集团股份有限公司制“麝香痔疮栓”(批号091101)。配制方法9g痔疮栓放入三角烧瓶中，加入10%的硫酸50ml，在水槽上加热温 度30-55°C，直到基本溶化(约5分钟)，然后放入超声槽5分钟，将经超声波提取后的混 合溶液冷却到室温，经过褶皱纸过滤器过滤到分离漏斗中，加入浓氨水溶液调节溶液PH在 9-10，振摇5分钟，然后加入50ml氯仿(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，再次振摇 5分钟，将混有氯仿的混合溶液经过带有2g干燥硫酸钠的褶皱纸过滤器将氯层分离到三角 烧瓶。再使用氯仿按上述方法重复萃取两次，每次使用氯仿25ml。收集三次萃取后的溶液 置于真空旋转蒸发器上蒸(水槽温度45-50°C )，将得到的干燥残留物溶解到流动相中，控 制残留物在溶液浓度为0. 9mg. mL—1。得到的溶液作为供试品溶液使用。测定仪器高效液相色谱仪(型号Anglient 1200型)。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定。分析总保 留时间为10-30分钟，预计硫酸阿托品保留时间为2. 5-10分钟，测量的理论板数按硫酸阿 托品峰计算为10879. 030，分离度为7. 8，主峰与前后峰分离效果好。实验1.精密度试验取实施例1对照品溶液，吸取10ul注入高效液相色谱仪分析，连 续分析6次，计算各峰面积比的RSD为1. 5%。2.重复性试验取实施例1供试品溶液6份，各吸取10ul注入高效液相色谱仪分 析，计算硫酸阿托品含量，测定结果RSD为1. 1 %。实施例2 控制色谱条件柱同实施例1。流动相:A 磷酸盐缓冲液0. 03M KH2P04 pH = 3 ;B 乙腈；同溶剂洗脱(isocratic elution)A B = 90% 10%检测波长400nm对照品溶液的制备精密称量106mg硫酸阿托品对照品溶解入5 %的硫酸40ml中，将得到的溶液 0. 5ml，加入流动相至硫酸阿托品的溶液浓度为0. 01mg/ml。最终得到的溶液作为对照品溶液。供试品溶液的制备供试品马应龙药业集团股份有限公司制“麝香痔疮栓”。(批号091101)配制方法将10%的硫酸50ml更换为5%的硫酸70ml，控制残留物在溶液浓度为2500mg/ml，其余同实施例1，得到的溶液作为供试品溶液使用。测定仪器高效液相色谱仪(型号=Anglient 1200型) 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定。分析总保 留时间为10-30分钟，预计硫酸阿托品保留时间为2. 5-10分钟，测量的理论板数按硫酸阿 托品峰计算为6189. 050，分离度为3. 5，主峰与前后峰分离效果好。实施例3 控制色谱条件柱同实施例1。流动相A 磷酸盐缓冲液0. 07M KH2P04 pH = UB 乙腈；同溶剂洗脱(isocratic elution)A B = 65% 35%检测波长2IOnm对照品溶液的制备精密称量106mg硫酸阿托品对照品溶解入5 %的硫酸80ml中，将得到的溶液 0. 5ml，加入流动相至硫酸阿托品的溶液浓度为500mg/ml。最终得到的溶液作为对照品溶液。供试品溶液的制备供试品马应龙药业集团股份有限公司制“麝香痔疮栓”。(批号091101)配制方 法将10%的硫酸50ml更换为15%的硫酸30ml，控制残留物在溶液浓度为0. 01mg/ml，其 余同实施例1，得到的溶液作为供试品溶液使用。测定仪器高效液相色谱仪(型号=Anglient 1200型)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定。分析总保留时间为10-30分钟，预计硫酸阿托品保留时间为2. 5-10分钟，测量的 理论板数按硫酸阿托品峰计算为7126. 450，分离度为4. 3，主峰与前后峰分离效果好。实施例4 控制色谱条件柱同实施例1。流动相A 磷酸盐缓冲液0. 05M KH2P04、pH4、B 乙腈；同溶剂洗脱 (isocraticelution)A B = 90% 10%检测波长240nm对照品溶液的制备精密称量106mg硫酸阿托品对照品溶解入10%的硫酸50ml中，将得到的溶液 0. 5ml，加入流动相至阿托品的溶液浓度为0. 0424mg/ml。最终得到的溶液作为对照品溶液。供试品溶液的制备供试品马应龙药业集团股份有限公司制“麝香痔疮栓”(批号091101)。配制方法9g痔疮栓放入三角烧瓶中，加入10%的硫酸50ml (26ml浓硫酸溶解到 250ml水中)，在水槽上加热温度30-55 °C，直到基本溶化(约5分钟)，然后放入超声槽3 分钟，将经超声波提取后混合溶液冷却到室温，经过褶皱纸过滤器过滤到分离漏斗中，加入 浓氨水调节溶液PH在9-10，振摇3分钟，然后加入50ml氯仿，再次振摇5分钟，将混有氯仿 的混合溶液经过带有Ig干燥硫酸钠的褶皱纸过滤器将氯层分离到三角烧瓶。再使用氯仿 重复上述方法萃取两次，每次使用氯仿25ml。收集三次萃取后的溶液置于真空旋转蒸发器上蒸(水槽温度45-50°C )，将得到的干燥残留物溶解到流动相中，控制残留物在溶液浓度为0. 9mg/ml。得到的溶液作为供试品溶液使用。测定仪器高效液相色谱仪(型号=Anglient 1200型)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定。分析总保留时间为10-30分钟，预计硫酸阿托品保留时间为2. 5-10分钟，测量的 理论板数按硫酸阿托品峰计算为6178. 020，分离度为3. 6，主峰与前后峰分离效果较好。实施例5 控制色谱条件柱同实施例1。流动相A 磷酸盐缓冲液0. 05M KH2P04、pH4、B 乙腈；同溶剂洗脱 (isocraticelution)A B = 90% 10%检测波长240nm对照品溶液的制备精密称量106mg硫酸阿托品对照品溶解入10%的硫酸50ml中，将得到的溶液 0. 5ml，加入流动相至硫酸阿托品的溶液浓度为0. 0424mg/ml。最终得到的溶液作为对照品溶液。供试品溶液的制备供试品马应龙药业集团股份有限公司制“麝香痔疮栓”(批号091101)。配制方法9g痔疮栓放入三角烧瓶中，加入10%的硫酸70ml，在水槽上加热温度 30-55 0C V，直到基本溶化(约5分钟)，然后放入超声槽10分钟，将经超声波提取后混合溶 液冷却到室温，经过褶皱纸过滤器过滤到分离漏斗中，加入浓氨水调节溶液PH在9-10，振 摇10分钟，然后加入50ml氯仿，再次振摇5分钟，将混有氯仿的混合溶液经过带有5g干燥 硫酸钠的褶皱纸过滤器将氯层分离到三角烧瓶。再使用氯仿重复上述方法萃取两次，每次 使用氯仿25ml。收集三次萃取后的溶液置于真空旋转蒸发器上蒸(水槽温度45-50°C)，将 得到的干燥残留物溶解到流动相中，控制残留物在溶液浓度为0. 9mg/ml。得到的溶液作为 供试品溶液使用。测定仪器高效液相色谱仪(型号=Anglient 1200型)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定。分析总保 留时间为10-30分钟，预计硫酸阿托品保留时间为2. 5-10分钟，测量的理论板数按硫酸阿 托品峰计算为8173. 065，分离度为4. 8，主峰与前后峰分离效果好。比较例(以常规的方法制备对照品及供试品溶液，再利用高效液相色谱法测定) 控制色谱条件柱WAT054275 Waters Symmetry C_18，5ym。美国沃特世科技有限公司制流动相乙睛-磷酸盐缓冲液取6. 8g磷酸二氢钾溶于IOOOml水中，加入IOml三乙胺，用 磷酸调节PH值至2. 8，乙睛磷酸盐混合质量比7 93 ；检测波长为210nm。对照品溶液的制备
精密称取硫酸阿托品对照品适量，加流动相制成每1ml含0. 17mg的溶液，即得。供试品溶液的制备供试品马应龙药业集团股份有限公司制“麝香痔疮栓”，批号(批号091101)精密称取供试品9g，置离心管中，加氨试液50ml，摇勻，再加乙酸乙酯50ml，剧烈 振摇，离心(10°C，转速为每分钟4000转)5分钟，取上清液，上述方法反复操作五次，合并乙 酸乙酯液，蒸干，残渣加流动相溶解并转移至10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇勻，滤 过，续滤液备用；精密量取上述续滤液1ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至每1ml流动相 含残渣0. 045mg的溶液，摇勻，滤过，取续滤液，即得。测定法仪器高效液相色谱仪(型号Anglient 1200型)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入高效液相色谱仪测定，发现 理论板数为2498. 356及分离度为0. 8，均达不到高效液相色谱法检测基本要求，样品分离 很差，主峰和前后峰分离效果不好，原因可能是色谱条件及样品处理不纯引起。
权利要求
一种含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定方法，其特征在于，包括下述步骤a.控制色谱条件色谱柱为安捷伦十八烷基硅烷键合硅胶(Anglient Zorbax Eclipse XDBC-18，3.5um)高效液相色谱柱，检测波长为200nm-400nm，配制流动相A为0.03-0.07MKH2PO4，pH为1-4.5的磷酸盐缓冲液、B为乙腈，A与B混合质量比为90％-65％∶10％-35％；b.对照品溶液的制备对照品为硫酸阿托品，先用5-15％的硫酸溶解，再加入流动相制成对照品溶液；c.供试品溶液的制备供试品为含有颠茄流浸膏的中药栓剂，先用5-15％的硫酸溶解，分离出硫酸阿托品后再加入流动相制成供试品溶液；d.分别吸取对照品溶液及样品供试品溶液利用液相色谱仪采用外标法进行高效液相色谱法测定阿托品的含量。
2.如权利要求1所述的含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定方法，其 特征在于，所述步骤a中，A为0. 05MKH2P04, pH为3的磷酸盐缓冲液，A与B的混合质量比 例为72 28%，检测波长为210nm。
3.如权利要求1所述的含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定方法， 其特征在于，步骤b中，使用对照品为硫酸阿托品，相对于106mg硫酸阿托品加入5-15% 的硫酸40-80ml溶解，然后加入步骤a中配制的流动相，控制溶液中硫酸阿托品的浓度为 0. 01-500mg. mL—1即为对照品溶液。
4.如权利要求1所述的含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定方法，其 特征在于，所述步骤c中，供试品为含有颠茄流浸膏的中药栓剂，相对于9g含有颠茄流浸膏 的中药栓剂加入5-15%的硫酸30-70ml溶解，再将溶解液进行萃取，干燥后得到干燥残留 物，然后加入步骤a中配制的流动相，控制溶液中残留物的浓度为0. 01-2500mg. mL—1即为供 试溶液。
5.如权利要求4所述的含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定方法，其 特征在于，所述萃取方法为将溶解有中药栓剂的溶解液进行超声波提取，再冷却后过滤、 然后进行氯仿萃取和干燥剂吸收剩余水层，最后将溶液进行蒸发干燥得到干燥残留物。
全文摘要
本发明涉及一种含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定方法。解决了目前中药制药领域只能检测含有颠茄流浸膏的中药栓剂中酸硫阿托品的有无，而无法测定其含量的问题。通过控制色谱条件、对照品和供试品溶液的制备，最后分别吸取对照品溶液及样品供试品溶液利用液相色谱仪采用外标法进行高效液相色谱法测定阿托品的含量的方法，能够精确测定阿托品的含量，其主峰与前后峰分离效果好，理论板数和分离数高，对于中药栓剂的质量控制具有重要意义。
文档编号A61P9/14GK101869630SQ20101016097
公开日2010年10月27日 申请日期2010年4月30日 优先权日2010年4月30日
发明者陈平 申请人:马应龙药业集团股份有限公司
技术领域：
本发明涉及一种复方中药制剂的检测方法，具体一种含有颠茄流浸膏的中药栓剂 中硫酸阿托品含量的测定方法。
背景技术：
颠茄流浸膏是一种棕色的液体，气微臭，系由颠茄叶按流浸膏制法而得的制剂，主 要含有茛菪碱、阿托品等生物碱，其中，阿托品等生物碱主要有解除平滑肌的痉挛、抑制腺 体分泌、解除迷走神经对心脏的抑制，使心跳加快、散大瞳孔，升高眼压；兴奋呼吸中枢的作 用。因此颠茄流浸膏也具有能解除平滑肌痉挛，抑制腺体分泌的功效，常被用来制成各种中 药制剂。如由马应龙药业集团股份有限公司独家生产的复方中药栓剂麝香痔疮栓(专利号 02139187)，该品种是由牛黄、珍珠、麝香酮、三七、五倍子、冰片、颠茄流浸膏、炉甘石等多种 组份制成的栓剂，具有清热解毒，消肿止痛，止血生肌功能。为了保证产品功效，对成品栓剂 中阿托品的测定一直必须进行质量控制环节，目前通常采用药典规定的薄层色谱法对含有 颠茄流浸膏的中药栓剂进行测定，该方法比较简单易行，但缺点是只能鉴别栓剂中阿托品 的有无，而无法进一步检测阿托品的具体含量。并且麝香痔疮栓本身组份多(主要已知成 份就达8种)、工艺复杂，栓剂中阿托品含量的成份在下述情况都可能会发生变化1、不同 批次的产品中阿托品含量可能会发生变化，从而对产品的质量控制具有指导意义；2、当对 产品存放一段时间后，阿托品的含量也可能会变化，从而对药品有效期的设定具有重要影 响。因此，为保证药品质量，有必要采用建立更先进，更有效，更灵敏专属的方法既可以鉴别 颠茄流浸膏中硫酸阿托含量的有无、又可以有效反映麝香痔疮栓中颠茄流浸膏中硫酸阿托 品的含量，有效提高麝香痔疮栓的质量。但是未见任何有关于对含有颠茄流浸膏的中药栓 剂中硫酸阿托品含量检测方法的报道。高效液相色谱法是以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分 离技术，可用于分析有机化合物，在西药领域中药品含量检测上被广泛应用。但是由于西 药与中药的显著不同，西药药品通常组份少、且成份明确，检测时，理论板数和分离度高，容 易形成清晰的主峰，得到的检测数据精确度高。而中药制剂特别是复方制剂，由于成分多且 复杂(如麝香痔疮栓)，甚至还有不明成份的物质，有的复方中药中还可能含有与被检测成 份结构与性状极其相似物质，测试时供试样品溶液制备更为困难，使控制色谱柱条件困难， 这些都会对分析结果产生各种干扰，采用高效液相色谱法进行分析时，理论板数和分离度 低，供试品与对照品色谱峰容易出现不一致，其主峰与前后峰容易出现交叠，使得测量的精 确度下降，这是目前高效液相色谱法难以应用于分析复方中药栓剂中阿托品含量的主要原 因。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，提供了一种含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸 阿托品含量的测定方法，解决了现有含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品的检测只能
3鉴别有无，无法检测其含量的问题，特别适用于对麝香痔疮栓中硫酸阿托品含量的检测，操 作简单快速，准确可靠，灵敏度、精密度高，从而对有效的控制栓剂质量具有重要的指导意 义。本发明含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定方法，包括下述步 骤a.控制色谱条件色谱柱为安捷伦十八烷基硅烷键合硅胶(Anglient Zorbax Eclipse XDBC-18， 3. 5um)高效液相色谱柱，检测波长为200nm-400nm，配制流动相A为0. 03-0. 07MKH2P04，pH 为1-4. 5的磷酸盐缓冲液、B为乙腈，A与B混合质量比为90% -65% 10% -35% ；b.对照品溶液的制备对照品为硫酸阿托品，先用5-15%的硫酸溶解，再加入流动相制成对照品溶液；c.供试品溶液的制备供试品为含有颠茄流浸膏的中药栓剂，先用5-15%的硫酸溶解，分离出硫酸阿托品后再加入流动相制成供试品溶液；d.分别吸取对照品溶液及样品供试品溶液利用液相色谱仪采用外标法进行高效 液相色谱法测定阿托品的含量。所述步骤a中，A为0. 05MKH2P04, pH为3的磷酸盐缓冲液，A与B的混合质量比例 为72 28%，检测波长为210nm。步骤b中，使用对照品为硫酸阿托品，相对于IOOmg硫酸阿托品加入5-15%的 硫酸40-80ml溶解，然后加入步骤a中配制的流动相，控制溶液中硫酸阿托品的浓度为 0. 01-500mg. mL—1即为对照品溶液。所述步骤c中，供试品为含有颠茄流浸膏的中药栓剂，相对于9g含有颠茄流浸膏 的中药栓剂加入5-15%的硫酸30-70ml溶解，将溶解液进行萃取，干燥后得到干燥残留物， 然后加入步骤a中配制的流动相，控制溶液中残留物的浓度为0. 01-2500mg. mL—1即为供试 品溶液。所述萃取方法为将溶解有中药栓剂的溶解液进行超声波提取，再冷却后过滤、然 后进行氯仿萃取和干燥剂吸收剩余水层，最后将溶液进行蒸发干燥得到干燥残留物。所述 干燥剂可选用干燥硫酸钠，所述氯仿萃取最好进行至少三次。蒸发温度优选45-50°C。超声 提取前可对溶解液进行水浴控制温度在30-55°C°C，超声提取时间优选为3-10分钟。为了尽可能的避免上述的各种干扰，发明人通过反复研究摸索发现在选择色谱柱 为安捷伦十八烷基硅烷键合硅胶高效液相色谱柱，英文名为=AnglientZorbax Eclipse XDB C-18,3. 5um，控制流动相A为0. 03-0. 07MKH2P04、pH为1-4. 5的磷酸盐缓冲液、B为乙 腈，A与B混合质量比为90%-65% 10%-35%时，理论板数及分离度上升，特别是当A为 磷酸盐缓冲液(0. 05MKH2P04，用溶解的磷酸调节到pH = 3)，B为乙腈，A与B的混合质量比 为72% 28%时，样品分离效果明显，样品峰分离度及分离纯度大幅度提高，满足了检测 的准确性和精确性要求，明显改善中药成分繁杂难分离的影响。进一步的，考虑到供试品为中药栓剂，要检测其中硫酸阿托品含量应先进行萃取， 但是这类含有颠茄流浸膏中药栓剂组分复杂，类似结构及性质的成分在检验过程中会起干 扰作用，而萃取时有可能会发生不仅萃取到硫酸阿托品，同时还会萃取到其它物质，从而影响最终检测结果的准确性，发明人根据相似相溶的原则问题，在保护或无破坏被研究的主 要成分硫酸阿托品的同时、通过改变或破坏其他相似结构或性质的干扰成分(譬如茛菪碱 类生物碱)的化学结构和性质以达到尽可能分离纯化样品的方法，非常适合复方中药制剂 的分离，因此在供试品萃取前先使用5-15%的硫酸溶解供试品，利用硫酸阿托品能耐受于 硫酸中不被破坏，同时硫酸对于硫酸阿托品以外其它成份又有清除作用(例如硫酸可破坏 麝香酮、茛菪碱类生物碱等等)，从而使供试品在萃取就前尽可能的减少其它成份对萃取步 骤的影响。并且，为了保证制备的供试品溶液和对照品溶液的一致性，对于对照品也相应加 入5-15%硫酸溶液进行溶解。在萃取步骤中，中药成分存在繁杂难分离的问题，要避免同时萃取出硫酸阿托品 以外的物质，发明人还针对性改进了一般中药标准中采用单纯的有机溶剂萃取的方法，通 过采用超声波提取、有机溶剂萃取和干燥剂吸收剩余水层的组合方法排除水分及水分中成 分干扰，进一步去除本中药栓剂样品溶液复杂的类似结构及性质的成分在检验过程中的干 扰作用。采用超声波提取，一则可以增加主要分析成分的溶解，二则采用超声波去除其他杂 质干扰作用；采用干燥剂吸收有机相中的剩余水分以排除水分及水分中的杂质干扰，以达 到纯化样品作用。萃取出干燥残留物硫酸阿托品纯度高，为下步采用外标法进行高效液相 色谱法测定阿托品的含量提供了有效保障，所述干燥剂并不特别限制，优选干燥硫酸钠。有益效果1.与原经典薄层色谱鉴别颠茄流浸膏中硫酸阿托品的方法相比较，本发明不光能 够有效鉴别栓剂中硫酸阿托品的有无，更可以及时有效反映硫酸阿托品的含量变化。2.通过对色谱条件的控制和选择，对供试品用硫酸进行前期酸处理，以提高阿托 品的萃取纯度，最大程度的避免中药栓剂样品溶液中复杂的类似结构及性质的成分在测定 过程中的干扰作用。3.利用超声波提取和氯仿萃取的组合方式，进一步解决了中药成分繁杂难分离的 问题。4.样品峰纯度高，分离度及理论板数均非常高，理论板数按硫酸阿托品峰计算高 于6000，分离度高于3，远远高于方法学研究基本要求理论板数及分离度要求，且准确性 好，精确度高，重复性实验结果RSD仅为1.1%。5.通过对不同批次含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定，可以反 应不同批次间硫酸阿托品的含量变化，对调整工艺、原料配方优化等研究具有重要意义；通 过对中药栓剂置放不同时间后硫酸阿托品含量的测定，从而可以对其有效期的确定具有重 要参考价值。6.本发明适合各种含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定，也适用 于其它含有颠茄流浸膏的复方中药剂型，如乳剂、膏剂等。特别适合于背景技术中介绍的由 马应龙药业集团股份有限公司生产的复方中药栓剂麝香痔疮栓。
具体实施例方式实施例1 控制色谱条件柱安捷伦十八烷基硅烷键合硅胶(Anglient Zorbax EclipseXDB C-18,3. 5um)美国安捷伦科技有限公司制。
流动相A 磷酸盐缓冲液0. 05M KH2P04,用磷酸溶液调节到pH = 3 ;B 乙腈；同溶 剂洗脱(isocratic elution)A B = 72% 28%检测波长210nm。对照品溶液的制备精密称量106mg硫酸阿托品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号 100040-200510))对照品溶解入10%的硫酸50ml中，将得到的溶液0. 5ml加入流动相至硫 酸阿托品的溶液浓度为0. 0424mg/ml。最终得到的溶液作为对照品溶液。供试品溶液的制备供试品马应龙药业集团股份有限公司制“麝香痔疮栓”(批号091101)。配制方法9g痔疮栓放入三角烧瓶中，加入10%的硫酸50ml，在水槽上加热温 度30-55°C，直到基本溶化(约5分钟)，然后放入超声槽5分钟，将经超声波提取后的混 合溶液冷却到室温，经过褶皱纸过滤器过滤到分离漏斗中，加入浓氨水溶液调节溶液PH在 9-10，振摇5分钟，然后加入50ml氯仿(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，再次振摇 5分钟，将混有氯仿的混合溶液经过带有2g干燥硫酸钠的褶皱纸过滤器将氯层分离到三角 烧瓶。再使用氯仿按上述方法重复萃取两次，每次使用氯仿25ml。收集三次萃取后的溶液 置于真空旋转蒸发器上蒸(水槽温度45-50°C )，将得到的干燥残留物溶解到流动相中，控 制残留物在溶液浓度为0. 9mg. mL—1。得到的溶液作为供试品溶液使用。测定仪器高效液相色谱仪(型号Anglient 1200型)。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定。分析总保 留时间为10-30分钟，预计硫酸阿托品保留时间为2. 5-10分钟，测量的理论板数按硫酸阿 托品峰计算为10879. 030，分离度为7. 8，主峰与前后峰分离效果好。实验1.精密度试验取实施例1对照品溶液，吸取10ul注入高效液相色谱仪分析，连 续分析6次，计算各峰面积比的RSD为1. 5%。2.重复性试验取实施例1供试品溶液6份，各吸取10ul注入高效液相色谱仪分 析，计算硫酸阿托品含量，测定结果RSD为1. 1 %。实施例2 控制色谱条件柱同实施例1。流动相:A 磷酸盐缓冲液0. 03M KH2P04 pH = 3 ;B 乙腈；同溶剂洗脱(isocratic elution)A B = 90% 10%检测波长400nm对照品溶液的制备精密称量106mg硫酸阿托品对照品溶解入5 %的硫酸40ml中，将得到的溶液 0. 5ml，加入流动相至硫酸阿托品的溶液浓度为0. 01mg/ml。最终得到的溶液作为对照品溶液。供试品溶液的制备供试品马应龙药业集团股份有限公司制“麝香痔疮栓”。(批号091101)配制方法将10%的硫酸50ml更换为5%的硫酸70ml，控制残留物在溶液浓度为2500mg/ml，其余同实施例1，得到的溶液作为供试品溶液使用。测定仪器高效液相色谱仪(型号=Anglient 1200型) 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定。分析总保 留时间为10-30分钟，预计硫酸阿托品保留时间为2. 5-10分钟，测量的理论板数按硫酸阿 托品峰计算为6189. 050，分离度为3. 5，主峰与前后峰分离效果好。实施例3 控制色谱条件柱同实施例1。流动相A 磷酸盐缓冲液0. 07M KH2P04 pH = UB 乙腈；同溶剂洗脱(isocratic elution)A B = 65% 35%检测波长2IOnm对照品溶液的制备精密称量106mg硫酸阿托品对照品溶解入5 %的硫酸80ml中，将得到的溶液 0. 5ml，加入流动相至硫酸阿托品的溶液浓度为500mg/ml。最终得到的溶液作为对照品溶液。供试品溶液的制备供试品马应龙药业集团股份有限公司制“麝香痔疮栓”。(批号091101)配制方 法将10%的硫酸50ml更换为15%的硫酸30ml，控制残留物在溶液浓度为0. 01mg/ml，其 余同实施例1，得到的溶液作为供试品溶液使用。测定仪器高效液相色谱仪(型号=Anglient 1200型)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定。分析总保留时间为10-30分钟，预计硫酸阿托品保留时间为2. 5-10分钟，测量的 理论板数按硫酸阿托品峰计算为7126. 450，分离度为4. 3，主峰与前后峰分离效果好。实施例4 控制色谱条件柱同实施例1。流动相A 磷酸盐缓冲液0. 05M KH2P04、pH4、B 乙腈；同溶剂洗脱 (isocraticelution)A B = 90% 10%检测波长240nm对照品溶液的制备精密称量106mg硫酸阿托品对照品溶解入10%的硫酸50ml中，将得到的溶液 0. 5ml，加入流动相至阿托品的溶液浓度为0. 0424mg/ml。最终得到的溶液作为对照品溶液。供试品溶液的制备供试品马应龙药业集团股份有限公司制“麝香痔疮栓”(批号091101)。配制方法9g痔疮栓放入三角烧瓶中，加入10%的硫酸50ml (26ml浓硫酸溶解到 250ml水中)，在水槽上加热温度30-55 °C，直到基本溶化(约5分钟)，然后放入超声槽3 分钟，将经超声波提取后混合溶液冷却到室温，经过褶皱纸过滤器过滤到分离漏斗中，加入 浓氨水调节溶液PH在9-10，振摇3分钟，然后加入50ml氯仿，再次振摇5分钟，将混有氯仿 的混合溶液经过带有Ig干燥硫酸钠的褶皱纸过滤器将氯层分离到三角烧瓶。再使用氯仿 重复上述方法萃取两次，每次使用氯仿25ml。收集三次萃取后的溶液置于真空旋转蒸发器上蒸(水槽温度45-50°C )，将得到的干燥残留物溶解到流动相中，控制残留物在溶液浓度为0. 9mg/ml。得到的溶液作为供试品溶液使用。测定仪器高效液相色谱仪(型号=Anglient 1200型)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定。分析总保留时间为10-30分钟，预计硫酸阿托品保留时间为2. 5-10分钟，测量的 理论板数按硫酸阿托品峰计算为6178. 020，分离度为3. 6，主峰与前后峰分离效果较好。实施例5 控制色谱条件柱同实施例1。流动相A 磷酸盐缓冲液0. 05M KH2P04、pH4、B 乙腈；同溶剂洗脱 (isocraticelution)A B = 90% 10%检测波长240nm对照品溶液的制备精密称量106mg硫酸阿托品对照品溶解入10%的硫酸50ml中，将得到的溶液 0. 5ml，加入流动相至硫酸阿托品的溶液浓度为0. 0424mg/ml。最终得到的溶液作为对照品溶液。供试品溶液的制备供试品马应龙药业集团股份有限公司制“麝香痔疮栓”(批号091101)。配制方法9g痔疮栓放入三角烧瓶中，加入10%的硫酸70ml，在水槽上加热温度 30-55 0C V，直到基本溶化(约5分钟)，然后放入超声槽10分钟，将经超声波提取后混合溶 液冷却到室温，经过褶皱纸过滤器过滤到分离漏斗中，加入浓氨水调节溶液PH在9-10，振 摇10分钟，然后加入50ml氯仿，再次振摇5分钟，将混有氯仿的混合溶液经过带有5g干燥 硫酸钠的褶皱纸过滤器将氯层分离到三角烧瓶。再使用氯仿重复上述方法萃取两次，每次 使用氯仿25ml。收集三次萃取后的溶液置于真空旋转蒸发器上蒸(水槽温度45-50°C)，将 得到的干燥残留物溶解到流动相中，控制残留物在溶液浓度为0. 9mg/ml。得到的溶液作为 供试品溶液使用。测定仪器高效液相色谱仪(型号=Anglient 1200型)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定。分析总保 留时间为10-30分钟，预计硫酸阿托品保留时间为2. 5-10分钟，测量的理论板数按硫酸阿 托品峰计算为8173. 065，分离度为4. 8，主峰与前后峰分离效果好。比较例(以常规的方法制备对照品及供试品溶液，再利用高效液相色谱法测定) 控制色谱条件柱WAT054275 Waters Symmetry C_18，5ym。美国沃特世科技有限公司制流动相乙睛-磷酸盐缓冲液取6. 8g磷酸二氢钾溶于IOOOml水中，加入IOml三乙胺，用 磷酸调节PH值至2. 8，乙睛磷酸盐混合质量比7 93 ；检测波长为210nm。对照品溶液的制备
精密称取硫酸阿托品对照品适量，加流动相制成每1ml含0. 17mg的溶液，即得。供试品溶液的制备供试品马应龙药业集团股份有限公司制“麝香痔疮栓”，批号(批号091101)精密称取供试品9g，置离心管中，加氨试液50ml，摇勻，再加乙酸乙酯50ml，剧烈 振摇，离心(10°C，转速为每分钟4000转)5分钟，取上清液，上述方法反复操作五次，合并乙 酸乙酯液，蒸干，残渣加流动相溶解并转移至10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇勻，滤 过，续滤液备用；精密量取上述续滤液1ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至每1ml流动相 含残渣0. 045mg的溶液，摇勻，滤过，取续滤液，即得。测定法仪器高效液相色谱仪(型号Anglient 1200型)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入高效液相色谱仪测定，发现 理论板数为2498. 356及分离度为0. 8，均达不到高效液相色谱法检测基本要求，样品分离 很差，主峰和前后峰分离效果不好，原因可能是色谱条件及样品处理不纯引起。
权利要求
一种含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定方法，其特征在于，包括下述步骤a.控制色谱条件色谱柱为安捷伦十八烷基硅烷键合硅胶(Anglient Zorbax Eclipse XDBC-18，3.5um)高效液相色谱柱，检测波长为200nm-400nm，配制流动相A为0.03-0.07MKH2PO4，pH为1-4.5的磷酸盐缓冲液、B为乙腈，A与B混合质量比为90％-65％∶10％-35％；b.对照品溶液的制备对照品为硫酸阿托品，先用5-15％的硫酸溶解，再加入流动相制成对照品溶液；c.供试品溶液的制备供试品为含有颠茄流浸膏的中药栓剂，先用5-15％的硫酸溶解，分离出硫酸阿托品后再加入流动相制成供试品溶液；d.分别吸取对照品溶液及样品供试品溶液利用液相色谱仪采用外标法进行高效液相色谱法测定阿托品的含量。
2.如权利要求1所述的含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定方法，其 特征在于，所述步骤a中，A为0. 05MKH2P04, pH为3的磷酸盐缓冲液，A与B的混合质量比 例为72 28%，检测波长为210nm。
3.如权利要求1所述的含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定方法， 其特征在于，步骤b中，使用对照品为硫酸阿托品，相对于106mg硫酸阿托品加入5-15% 的硫酸40-80ml溶解，然后加入步骤a中配制的流动相，控制溶液中硫酸阿托品的浓度为 0. 01-500mg. mL—1即为对照品溶液。
4.如权利要求1所述的含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定方法，其 特征在于，所述步骤c中，供试品为含有颠茄流浸膏的中药栓剂，相对于9g含有颠茄流浸膏 的中药栓剂加入5-15%的硫酸30-70ml溶解，再将溶解液进行萃取，干燥后得到干燥残留 物，然后加入步骤a中配制的流动相，控制溶液中残留物的浓度为0. 01-2500mg. mL—1即为供 试溶液。
5.如权利要求4所述的含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定方法，其 特征在于，所述萃取方法为将溶解有中药栓剂的溶解液进行超声波提取，再冷却后过滤、 然后进行氯仿萃取和干燥剂吸收剩余水层，最后将溶液进行蒸发干燥得到干燥残留物。
全文摘要
本发明涉及一种含有颠茄流浸膏的中药栓剂中硫酸阿托品含量的测定方法。解决了目前中药制药领域只能检测含有颠茄流浸膏的中药栓剂中酸硫阿托品的有无，而无法测定其含量的问题。通过控制色谱条件、对照品和供试品溶液的制备，最后分别吸取对照品溶液及样品供试品溶液利用液相色谱仪采用外标法进行高效液相色谱法测定阿托品的含量的方法，能够精确测定阿托品的含量，其主峰与前后峰分离效果好，理论板数和分离数高，对于中药栓剂的质量控制具有重要意义。
文档编号A61P9/14GK101869630SQ20101016097
公开日2010年10月27日 申请日期2010年4月30日 优先权日2010年4月30日
发明者陈平 申请人:马应龙药业集团股份有限公司
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