一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法
专利名称：一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种PCR技术。更具体的说，本发明涉及一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法。
背景技术：
焦磷酸测序技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须进行荧光标记，操作极为简便。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并通过光学系统生成一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成 正比，然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。焦磷酸测序中所使用的模板需要通过一种称为emPCR的方法制备得到。目前基于焦磷酸测序原理的454高通量测序中的emPCR方法属于常规技术，并且市场上也有开发相
对成熟的商品可以直接应用。例如采用罗氏公司推出的试剂盒-RocheGS Titanium LV
emPCR Kit (Lib-L) v2，按其说明书记载的步骤操作，即可制得测序所需的emPCR产物。利用RocheGSTitanium LV emPCR Kit (Lib-L) v2试剂盒制备测序所用的emPCR产物的步骤如下I)乳化油、emPCR扩增混合液和试剂准备，其中emPCR扩增混合液包括下列各组分
4 SV Emulsion--
__体积百分比(v/v) 体积(μ ν)
_超纯水____240
emPCRAdditive__38.4%__360
_5 X 扩增液__22.4%__210
_] _扩增引物__8 %__75_
emPCR 酶混合液__53%__50_
_PPiase__02%__2_
总计100%937
I-1-1-1 I2) DNA文库捕获；3)乳化；
4)扩增，扩增反应的程序如下所示①94°C,4min;②94。。，30s;③60°C,10min;步骤②至③共50个循环； ④10 O 保存；5)磁珠回收；6) DNA文库磁珠富集；7)测序引物退火，即制得测序所用的emPCR产物。现有的这种基于焦磷酸原理的454高通量测序中emPCR的方法对于所构建的文库中片段大小的要求比较苛刻，如果片段大小差别过大，就会导致emPCR扩增出的磁珠上序列信号强度差异很大，进而影响后续测序时信号的读取效率及准确性，产生较多的冗余数据，使有效数据降低30%以上，同时造成试剂和实验时间的浪费，增加实验成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服上述基于焦磷酸原理的454高通量测序中的技术缺陷，提供一种新的用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法。本发明解决上述技术问题所采取的技术方案之一是一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序中emPCR的方法，其包括如下步骤 I)乳化油、emPCR扩增混合液和试剂准备；2) DNA文库捕获；3)乳化；4)扩增；5)磁珠回收；6) DNA文库磁珠富集；7)测序引物退火，即制得测序所用的emPCR产物；其中，步骤I)所述的emPCR扩增混合液包括下列各组分emPCRAdditive,
30.6% 43. 0% (v/v) ;5X 扩增液，18. 4% 21. 5% (v/v);扩增引物，2. 0% 7. 5% (v/V) ; emPCR 酶混合液,2. 6% 5. 9% (v/v) ;PPiase, O. I % O. 3% (v/v)。上述各组分均为RocheGS Titanium LV emPCR Kit (Lib-L) v2 试剂盒自带产品。较佳的，emPCR扩增混合液包括下列各组分emPCR Additive, 38. 4% (v/v) ；5X扩增液，20. 3% (v/v);扩增引物，4. 8% (v/v) ;emPCR 酶混合液，5. 3% (v/v) ；PPiase,0.2% (v/v);余量为水。本发明中，所述的水是本领域常规的用于测序的水，优选超纯水。 本发明中，所述的emPCR扩增混合液的总体积是本领域基于焦磷酸原理的454高通量测序中所采用的常规总体积，一般为930μ I 980 μ 1，本发明最佳的是937 μ L。本发明的一较佳实例为，步骤I)所述的emPCR扩增混合液的总体积为937 μ L，包括下列各组分360 μ LemPCRAdditive ；180 200μ L5X扩增液；35 55 μ L扩增引物；50 μ LemPCR酶混合液；2 μ LPPiase ;其余为水。各组分含量如下表所示
权利要求
1.一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序中emPCR的方法，其包括步骤 1)乳化油、emPCR扩增混合液和试剂准备； 2)DNA文库捕获； 3)乳化； 4)扩增； 5)磁珠回收； 6)DNA文库磁珠富集； 7)测序引物退火，即制得测序所用的emPCR产物； 其特征在于，步骤I)所述的emPCR扩增混合液包括下列各组分emPCRAdditive,30. 6% 43. 0% (v/v) ;5X 扩增液，18. 4% 21. 5% (v/v);扩增引物，2. 0% 7. 5% (v/V) ;emPCR 酶混合液，2. 6% 5. 9% (v/v) ;PPiase，0. 1% O. 3% (v/v);余量为水。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤I)所述的emPCR扩增混合液包括下列各组分emPCR Additive, 38. 4 % (v/v) ;5X 扩增液，20. 3 % (v/v);扩增引物，4.8% (v/V) ;emPCR 酶混合液,5. 3% (v/v) ；PPiase,0. 2% (v/v);余量为水。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的emPCR扩增混合液的总体积为930 μ L 980 μ L。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的emPCR扩增混合液的总体积为937 μ L，包括下列各组分:360 μ L emPCRAdditive ; 180 200 μ L 5 X 扩增液；35 55 μ L扩增引物；50 μ L emPCR酶混合液;2 μ L PPiase ;余量为水。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的emPCR扩增混合液的总体积为937 μ L，包括下列各组分290 μ L 超纯水；360 μ L emPCRAdditive ； 190 μ L5X 扩增液；45 μ L 扩增引物；50 μ LemPCR 酶混合液；2μ L PPiase。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤4)所述扩增的反应程序为①90-95°C,3-6min ；②93-95。。，28-32s ；③57-59°C,4-5min ；④66-70。。，28-32s ； 步骤②至④共45-55个循环； ⑤4-10°C保存。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应程序中步骤②至④为②94-95。。，28-32s ；③57-58°C,4-5min ；④67-69。。，28-32s。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应程序中步骤①为94°C，4min ;步骤⑤为10°C保存。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应程序为①94°C,4min ；②94。。，30s ；③58°C,4. 5min ；④68。。，30s ； 步骤②至④共50个循环； ⑤10°C保存。
10.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的高通量测序为基于焦磷酸原理的454高通量转录组测序。
全文摘要
本发明公开了一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法，其是在配制emPCR扩增混合液的过程中，将超纯水、5×扩增液、扩增引物、emPCR扩增混合液和PPiase的体积做了调整；在进行扩增反应时将扩增条件由一步扩增改为两步扩增。采用本发明所述emPCR的方法能够有效降低非特异性扩增信号，减少冗余的数据，使有效数据的产量提高30％，同时提高了实验效率，节约了实验成本。
文档编号C12Q1/68GK102719528SQ20121013026
公开日2012年10月10日 申请日期2012年4月27日 优先权日2012年4月27日
发明者孙子奎, 孟和, 陈永灿 申请人:上海派森诺生物科技有限公司
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种PCR技术。更具体的说，本发明涉及一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法。
背景技术：
焦磷酸测序技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须进行荧光标记，操作极为简便。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并通过光学系统生成一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成 正比，然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。焦磷酸测序中所使用的模板需要通过一种称为emPCR的方法制备得到。目前基于焦磷酸测序原理的454高通量测序中的emPCR方法属于常规技术，并且市场上也有开发相
对成熟的商品可以直接应用。例如采用罗氏公司推出的试剂盒-RocheGS Titanium LV
emPCR Kit (Lib-L) v2，按其说明书记载的步骤操作，即可制得测序所需的emPCR产物。利用RocheGSTitanium LV emPCR Kit (Lib-L) v2试剂盒制备测序所用的emPCR产物的步骤如下I)乳化油、emPCR扩增混合液和试剂准备，其中emPCR扩增混合液包括下列各组分
4 SV Emulsion--
__体积百分比(v/v) 体积(μ ν)
_超纯水____240
emPCRAdditive__38.4%__360
_5 X 扩增液__22.4%__210
_] _扩增引物__8 %__75_
emPCR 酶混合液__53%__50_
_PPiase__02%__2_
总计100%937
I-1-1-1 I2) DNA文库捕获；3)乳化；
4)扩增，扩增反应的程序如下所示①94°C,4min;②94。。，30s;③60°C,10min;步骤②至③共50个循环； ④10 O 保存；5)磁珠回收；6) DNA文库磁珠富集；7)测序引物退火，即制得测序所用的emPCR产物。现有的这种基于焦磷酸原理的454高通量测序中emPCR的方法对于所构建的文库中片段大小的要求比较苛刻，如果片段大小差别过大，就会导致emPCR扩增出的磁珠上序列信号强度差异很大，进而影响后续测序时信号的读取效率及准确性，产生较多的冗余数据，使有效数据降低30%以上，同时造成试剂和实验时间的浪费，增加实验成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服上述基于焦磷酸原理的454高通量测序中的技术缺陷，提供一种新的用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法。本发明解决上述技术问题所采取的技术方案之一是一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序中emPCR的方法，其包括如下步骤 I)乳化油、emPCR扩增混合液和试剂准备；2) DNA文库捕获；3)乳化；4)扩增；5)磁珠回收；6) DNA文库磁珠富集；7)测序引物退火，即制得测序所用的emPCR产物；其中，步骤I)所述的emPCR扩增混合液包括下列各组分emPCRAdditive,
30.6% 43. 0% (v/v) ;5X 扩增液，18. 4% 21. 5% (v/v);扩增引物，2. 0% 7. 5% (v/V) ; emPCR 酶混合液,2. 6% 5. 9% (v/v) ;PPiase, O. I % O. 3% (v/v)。上述各组分均为RocheGS Titanium LV emPCR Kit (Lib-L) v2 试剂盒自带产品。较佳的，emPCR扩增混合液包括下列各组分emPCR Additive, 38. 4% (v/v) ；5X扩增液，20. 3% (v/v);扩增引物，4. 8% (v/v) ;emPCR 酶混合液，5. 3% (v/v) ；PPiase,0.2% (v/v);余量为水。本发明中，所述的水是本领域常规的用于测序的水，优选超纯水。 本发明中，所述的emPCR扩增混合液的总体积是本领域基于焦磷酸原理的454高通量测序中所采用的常规总体积，一般为930μ I 980 μ 1，本发明最佳的是937 μ L。本发明的一较佳实例为，步骤I)所述的emPCR扩增混合液的总体积为937 μ L，包括下列各组分360 μ LemPCRAdditive ；180 200μ L5X扩增液；35 55 μ L扩增引物；50 μ LemPCR酶混合液；2 μ LPPiase ;其余为水。各组分含量如下表所示
权利要求
1.一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序中emPCR的方法，其包括步骤 1)乳化油、emPCR扩增混合液和试剂准备； 2)DNA文库捕获； 3)乳化； 4)扩增； 5)磁珠回收； 6)DNA文库磁珠富集； 7)测序引物退火，即制得测序所用的emPCR产物； 其特征在于，步骤I)所述的emPCR扩增混合液包括下列各组分emPCRAdditive,30. 6% 43. 0% (v/v) ;5X 扩增液，18. 4% 21. 5% (v/v);扩增引物，2. 0% 7. 5% (v/V) ;emPCR 酶混合液，2. 6% 5. 9% (v/v) ;PPiase，0. 1% O. 3% (v/v);余量为水。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤I)所述的emPCR扩增混合液包括下列各组分emPCR Additive, 38. 4 % (v/v) ;5X 扩增液，20. 3 % (v/v);扩增引物，4.8% (v/V) ;emPCR 酶混合液,5. 3% (v/v) ；PPiase,0. 2% (v/v);余量为水。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的emPCR扩增混合液的总体积为930 μ L 980 μ L。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的emPCR扩增混合液的总体积为937 μ L，包括下列各组分:360 μ L emPCRAdditive ; 180 200 μ L 5 X 扩增液；35 55 μ L扩增引物；50 μ L emPCR酶混合液;2 μ L PPiase ;余量为水。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的emPCR扩增混合液的总体积为937 μ L，包括下列各组分290 μ L 超纯水；360 μ L emPCRAdditive ； 190 μ L5X 扩增液；45 μ L 扩增引物；50 μ LemPCR 酶混合液；2μ L PPiase。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤4)所述扩增的反应程序为①90-95°C,3-6min ；②93-95。。，28-32s ；③57-59°C,4-5min ；④66-70。。，28-32s ； 步骤②至④共45-55个循环； ⑤4-10°C保存。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应程序中步骤②至④为②94-95。。，28-32s ；③57-58°C,4-5min ；④67-69。。，28-32s。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应程序中步骤①为94°C，4min ;步骤⑤为10°C保存。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应程序为①94°C,4min ；②94。。，30s ；③58°C,4. 5min ；④68。。，30s ； 步骤②至④共50个循环； ⑤10°C保存。
10.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的高通量测序为基于焦磷酸原理的454高通量转录组测序。
全文摘要
本发明公开了一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法，其是在配制emPCR扩增混合液的过程中，将超纯水、5×扩增液、扩增引物、emPCR扩增混合液和PPiase的体积做了调整；在进行扩增反应时将扩增条件由一步扩增改为两步扩增。采用本发明所述emPCR的方法能够有效降低非特异性扩增信号，减少冗余的数据，使有效数据的产量提高30％，同时提高了实验效率，节约了实验成本。
文档编号C12Q1/68GK102719528SQ20121013026
公开日2012年10月10日 申请日期2012年4月27日 优先权日2012年4月27日
发明者孙子奎, 孟和, 陈永灿 申请人:上海派森诺生物科技有限公司
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