一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗及其制备方法
专利名称：一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗及其制备方法，属于兽医生物制品技术领域。
背景技术：
犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)感染是多发生于犬科动物的ー种烈性传染病。临床表现以急性出血性肠炎和非化脓性心肌炎为特征。CPV属细小病毒科，细小病毒属。CPV对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力。犬感染CPV发病急，死亡率高，常呈暴发性流行；不同年龄、性別、品种的犬均可感染；本病发生没有明显的季节性。近年来，随着我国工作犬(军犬、警犬、导盲犬等)、实验用犬和宠物犬饲养量的大幅増加，犬细小病毒感染日趋严重，给养业犬带来了重大的经济损失，成为危害养犬业重大 疫病之一。本病发病迅速，疫苗免疫接种是预防本病的有效措施。本发明的目的是制备出ー种安全、有效的犬细小病毒蜂胶灭活疫苗，并以蜂胶作为佐剂制备ー种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗。
发明内容
本发明的目的是利用犬细小病毒株作为生产疫苗的毒株，通过在F81细胞在进行病毒繁殖，经过收获、灭活，并以蜂胶作为佐剂制备一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗，以制备ー种既能减小犬注射疫苗后的不良反应又能增强犬对该灭活病毒的应答反应。为达到上述目的，本发明所采用的具体技术方案如下
一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗，犬细小灭活病毒以蜂胶为佐剂而制成的犬细小病毒蜂胶灭活疫苗。上述犬细小病毒蜂胶灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下
(1)犬细小病毒的培养及灭活将细小病毒生产用疫苗株接种F81细胞36°C培养，当接毒细胞有80%出现病变吋，收获病毒细胞培养液，经过O. 2%甲醛灭活，180转/分钟的摇床内摇48小吋，以制备病毒灭活液；
(2)蜂胶液制备；
(3)按每ml疫苗含蜂胶干物质含量为8 15mg标准添加蜂胶溶液搅拌15 20分钟，使其充分混合乳化。进ー步地，所述的蜂胶液制备由以下步骤完成选取已知纯度的蜂胶，经破碎后过筛，溶于95%的こ醇溶液，再根据要求配成适当浓度的溶液于4°C下保存备用。(4)本发明是以本发明人于中国兽医药品监察所菌种室购买的一株犬细小病毒CPVl作为生产疫苗的毒株，犬细小病毒CPV1，2003. 3. 3，冻干(O. 5ml)，有效期15年。本发明的犬细小病毒蜂胶灭活疫苗的用途，主要用于控制犬细小病毒病。
具体实施方式
I.细小病毒灭活原液的制备。(I)将生长良好的F81细胞按常规方法传代，待细胞长成80%单层后，倾去生长液，换以含1%毒种的维持液(含2%新生牛血清的MEM)，置36°C继续培养，转瓶转速为8 IOr / h。(2)接种后，毎日观察细胞病变，当细胞病变(CPE)达80%左右时即可收获，冻融I次，置_15°C以下冻结保存，待检备用。(3)按病毒液总量的O. 2%加入甲醛溶液，充分混匀，置36°C下灭活，待温度升至36°C开始计吋，180转/分钟的摇床中不间断摇动，灭活48小吋。2.佐剂原液的制备 选取购自山东临清市清坤蜂蜡巢础加工厂已知纯度的蜂胶，经破碎后过筛，溶于95%的こ醇溶液，再根据要求配成适当浓度的溶液于4°C下保存备用。3.成品的制备
按每ml疫苗含蜂胶干物质含量为8 15mg标准添加蜂胶溶液搅拌15 20分钟，使其充分混合乳化。4.犬细小病毒蜂胶灭活疫苗的检验方法
(I)性状本品静置后，上层为粉红色液体，下层为淡粉红色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。(2)无菌检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验,应无菌生长。(3)安全检验用2 10月龄健康易感犬5只，各皮下注射疫苗3ml，连续观察10日，应全部健活。(4)效カ检验用2 10月龄健康易感犬5只，各皮下注射疫苗Iml，同时设不接种对照犬5只。免疫后14日采血，分离血清，分别测定抗MEV HI抗体，免疫犬抗MEVHI抗体均应彡I :32，对照犬抗MEV HI抗体均应彡I :4。5.甲醛和汞类防腐剂残留量測定按《中国兽药典》附录进行測定，应符合兽用生物制品通则的規定。6.犬细小病毒蜂胶灭活疫苗安全性试验
(I)最小使用日龄犬一次单剂量接种疫苗的安全性试验取49日龄健康易感犬20只，随机分成4组，5只/组。前3组分别皮下接种本发明人按本发明提供的方法制备的3个批次的疫苗(第I批、第2批和第3批)，Iml/只；第4组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察犬精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应。经皮下途径一次单剂量接种犬后，犬精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身未见不良反应，所有犬均健活。(2)单剂量重复接种疫苗的安全性试验取49日龄健康易感犬20只，随机分成4组，5只/组。前3组分别皮下接种以上本发明人制备的3个批次的疫苗，Iml/只，14日后加强免疫一次，Iml/只；第4组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察犬精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应。经皮下途径重复接种疫苗后，犬精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身未见不良反应，所有犬均健活。(3)-次超剂量接种疫苗的安全性试验取49日龄健康易感犬20只，随机分成4组，5只/组。前3组分别皮下接种3个批次疫苗，3ml /只；第4组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察犬精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应。(4)疫苗对怀孕母犬的安全性试验取怀孕母犬10只，随机分成2组，5只/组。第I组于产前20日皮下接种疫苗，3ml /只；第2组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察犬精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应，并跟踪观察其产仔情況。怀孕母犬于产前20日经皮下超剂量接种后，母犬精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身末见不良反应，所有犬均健活，且产仔正常。(5)结论用3批犬细小病毒蜂胶灭活疫苗进行了一次单剂量接种的安全试验、单剂量重复接种的安全性试验、一次超剂量接种的安全试验及对怀孕母犬一次超剂量接种的安全性试验，结果均是安全的。表明该疫苗用于免疫接种犬是安全的。7.犬细小病毒蜂胶灭活疫苗效カ试验
取以上本发明人制备的3批犬细小病毒蜂胶灭活疫苗，使用前将疫苗分别用水稀释至一定剂量。取健康易感犬20只，随机分为4组，5只/组。1、2、3组犬分别皮下免疫3批疫苗
I.Oml/只，对照组不进行免疫。3个免疫组和对照组在免疫后14日ロ服细胞培养株强毒液15ml (含15X107 TCID50)攻毒，观察10日，记录发病情況。3批疫苗试验结果无明显差异。疫苗免疫后14日，对犬肠炎病毒株强毒的攻毒保护率均为100%。8.本发明的优点
本发明是利用细小病毒CPVl株作为生产疫苗的病毒株，通过在F81细胞上进行病毒繁殖，经过收获、灭活制得细小病毒灭活原液。并以蜂胶作为佐剂，以加强灭活苗的作用，井能减小注射疫苗后的不良反应，因此是安全、有效的犬细小病毒蜂胶灭活疫苗。权利要求
1.一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗，其特征在于犬细小病毒株在F81细胞上进行病毒繁殖，经过收获、灭活，并以蜂胶作为佐剂混合制成灭活苗。
2.权利要求I所述的灭活疫苗的制备方法，主要包括如下步骤 1)细小病毒灭活原液的制备； 2)蜂胶溶液的制备； 3)成品疫苗制备按每ml疫苗含蜂胶干物质含量为8 15mg标准添加蜂胶溶液搅拌15 20分钟，使其充分混合乳化。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的犬细小病毒灭活原液的制备步骤包括将生长良好的F81细胞按常规方法传代，待细胞长成80%单层后，倾去生长液，换以含1%毒种的维持液(含2%新生牛血清的MEM)，置36°C继续培养，转瓶转速为8 IOr / h ;接种后，每日观察细胞病变，当细胞病变(CPE)达80%左右时即可收获，冻融I次，置_15°C以下冻结保存，待检备用；按病毒液总量的O. 2%加入甲醛溶液，充分混匀，置36°C下灭活，待温度升至36°C开始计吋，180转/分钟的摇床中不间断摇动，灭活48小吋。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，蜂胶液制备由以下步骤完成选取已知纯度的蜂胶，经破碎后过筛，溶于95%的こ醇溶液，再根据要求配成适当浓度的溶液于4°C下保存备用。
5.根据权利要求2-3任一项所述的制备方法，其特征在于，成品疫苗为黄褐色混悬液，密封保存于4-8°C中。
6.权利要求I所述的犬细小病毒蜂胶灭活疫苗的用途，主要是用于犬细小病毒病的免疫。
全文摘要
本发明提供了一种犬细小病毒蜂胶灭活苗及其制备方法。本发明的实质内容是将犬细小病毒株在F81细胞上进行病毒繁殖，经过收获、灭活，并以蜂胶作为佐剂制备一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗。本疫苗能够有效预防犬源细小病毒病的发生，并能显著减少注射疫苗后的不良反应，为宠物疾病的控制创造条件。
文档编号C12N7/02GK102657860SQ20121013088
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月1日 优先权日2012年5月1日
发明者单虎, 张传美, 杨瑞梅, 秦晓冰, 韩先杰, 黄娟 申请人:青岛农业大学
技术领域：
本发明涉及一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗及其制备方法，属于兽医生物制品技术领域。
背景技术：
犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)感染是多发生于犬科动物的ー种烈性传染病。临床表现以急性出血性肠炎和非化脓性心肌炎为特征。CPV属细小病毒科，细小病毒属。CPV对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力。犬感染CPV发病急，死亡率高，常呈暴发性流行；不同年龄、性別、品种的犬均可感染；本病发生没有明显的季节性。近年来，随着我国工作犬(军犬、警犬、导盲犬等)、实验用犬和宠物犬饲养量的大幅増加，犬细小病毒感染日趋严重，给养业犬带来了重大的经济损失，成为危害养犬业重大 疫病之一。本病发病迅速，疫苗免疫接种是预防本病的有效措施。本发明的目的是制备出ー种安全、有效的犬细小病毒蜂胶灭活疫苗，并以蜂胶作为佐剂制备ー种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗。
发明内容
本发明的目的是利用犬细小病毒株作为生产疫苗的毒株，通过在F81细胞在进行病毒繁殖，经过收获、灭活，并以蜂胶作为佐剂制备一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗，以制备ー种既能减小犬注射疫苗后的不良反应又能增强犬对该灭活病毒的应答反应。为达到上述目的，本发明所采用的具体技术方案如下
一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗，犬细小灭活病毒以蜂胶为佐剂而制成的犬细小病毒蜂胶灭活疫苗。上述犬细小病毒蜂胶灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下
(1)犬细小病毒的培养及灭活将细小病毒生产用疫苗株接种F81细胞36°C培养，当接毒细胞有80%出现病变吋，收获病毒细胞培养液，经过O. 2%甲醛灭活，180转/分钟的摇床内摇48小吋，以制备病毒灭活液；
(2)蜂胶液制备；
(3)按每ml疫苗含蜂胶干物质含量为8 15mg标准添加蜂胶溶液搅拌15 20分钟，使其充分混合乳化。进ー步地，所述的蜂胶液制备由以下步骤完成选取已知纯度的蜂胶，经破碎后过筛，溶于95%的こ醇溶液，再根据要求配成适当浓度的溶液于4°C下保存备用。(4)本发明是以本发明人于中国兽医药品监察所菌种室购买的一株犬细小病毒CPVl作为生产疫苗的毒株，犬细小病毒CPV1，2003. 3. 3，冻干(O. 5ml)，有效期15年。本发明的犬细小病毒蜂胶灭活疫苗的用途，主要用于控制犬细小病毒病。
具体实施方式
I.细小病毒灭活原液的制备。(I)将生长良好的F81细胞按常规方法传代，待细胞长成80%单层后，倾去生长液，换以含1%毒种的维持液(含2%新生牛血清的MEM)，置36°C继续培养，转瓶转速为8 IOr / h。(2)接种后，毎日观察细胞病变，当细胞病变(CPE)达80%左右时即可收获，冻融I次，置_15°C以下冻结保存，待检备用。(3)按病毒液总量的O. 2%加入甲醛溶液，充分混匀，置36°C下灭活，待温度升至36°C开始计吋，180转/分钟的摇床中不间断摇动，灭活48小吋。2.佐剂原液的制备 选取购自山东临清市清坤蜂蜡巢础加工厂已知纯度的蜂胶，经破碎后过筛，溶于95%的こ醇溶液，再根据要求配成适当浓度的溶液于4°C下保存备用。3.成品的制备
按每ml疫苗含蜂胶干物质含量为8 15mg标准添加蜂胶溶液搅拌15 20分钟，使其充分混合乳化。4.犬细小病毒蜂胶灭活疫苗的检验方法
(I)性状本品静置后，上层为粉红色液体，下层为淡粉红色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。(2)无菌检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验,应无菌生长。(3)安全检验用2 10月龄健康易感犬5只，各皮下注射疫苗3ml，连续观察10日，应全部健活。(4)效カ检验用2 10月龄健康易感犬5只，各皮下注射疫苗Iml，同时设不接种对照犬5只。免疫后14日采血，分离血清，分别测定抗MEV HI抗体，免疫犬抗MEVHI抗体均应彡I :32，对照犬抗MEV HI抗体均应彡I :4。5.甲醛和汞类防腐剂残留量測定按《中国兽药典》附录进行測定，应符合兽用生物制品通则的規定。6.犬细小病毒蜂胶灭活疫苗安全性试验
(I)最小使用日龄犬一次单剂量接种疫苗的安全性试验取49日龄健康易感犬20只，随机分成4组，5只/组。前3组分别皮下接种本发明人按本发明提供的方法制备的3个批次的疫苗(第I批、第2批和第3批)，Iml/只；第4组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察犬精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应。经皮下途径一次单剂量接种犬后，犬精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身未见不良反应，所有犬均健活。(2)单剂量重复接种疫苗的安全性试验取49日龄健康易感犬20只，随机分成4组，5只/组。前3组分别皮下接种以上本发明人制备的3个批次的疫苗，Iml/只，14日后加强免疫一次，Iml/只；第4组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察犬精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应。经皮下途径重复接种疫苗后，犬精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身未见不良反应，所有犬均健活。(3)-次超剂量接种疫苗的安全性试验取49日龄健康易感犬20只，随机分成4组，5只/组。前3组分别皮下接种3个批次疫苗，3ml /只；第4组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察犬精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应。(4)疫苗对怀孕母犬的安全性试验取怀孕母犬10只，随机分成2组，5只/组。第I组于产前20日皮下接种疫苗，3ml /只；第2组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察犬精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应，并跟踪观察其产仔情況。怀孕母犬于产前20日经皮下超剂量接种后，母犬精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身末见不良反应，所有犬均健活，且产仔正常。(5)结论用3批犬细小病毒蜂胶灭活疫苗进行了一次单剂量接种的安全试验、单剂量重复接种的安全性试验、一次超剂量接种的安全试验及对怀孕母犬一次超剂量接种的安全性试验，结果均是安全的。表明该疫苗用于免疫接种犬是安全的。7.犬细小病毒蜂胶灭活疫苗效カ试验
取以上本发明人制备的3批犬细小病毒蜂胶灭活疫苗，使用前将疫苗分别用水稀释至一定剂量。取健康易感犬20只，随机分为4组，5只/组。1、2、3组犬分别皮下免疫3批疫苗
I.Oml/只，对照组不进行免疫。3个免疫组和对照组在免疫后14日ロ服细胞培养株强毒液15ml (含15X107 TCID50)攻毒，观察10日，记录发病情況。3批疫苗试验结果无明显差异。疫苗免疫后14日，对犬肠炎病毒株强毒的攻毒保护率均为100%。8.本发明的优点
本发明是利用细小病毒CPVl株作为生产疫苗的病毒株，通过在F81细胞上进行病毒繁殖，经过收获、灭活制得细小病毒灭活原液。并以蜂胶作为佐剂，以加强灭活苗的作用，井能减小注射疫苗后的不良反应，因此是安全、有效的犬细小病毒蜂胶灭活疫苗。权利要求
1.一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗，其特征在于犬细小病毒株在F81细胞上进行病毒繁殖，经过收获、灭活，并以蜂胶作为佐剂混合制成灭活苗。
2.权利要求I所述的灭活疫苗的制备方法，主要包括如下步骤 1)细小病毒灭活原液的制备； 2)蜂胶溶液的制备； 3)成品疫苗制备按每ml疫苗含蜂胶干物质含量为8 15mg标准添加蜂胶溶液搅拌15 20分钟，使其充分混合乳化。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的犬细小病毒灭活原液的制备步骤包括将生长良好的F81细胞按常规方法传代，待细胞长成80%单层后，倾去生长液，换以含1%毒种的维持液(含2%新生牛血清的MEM)，置36°C继续培养，转瓶转速为8 IOr / h ;接种后，每日观察细胞病变，当细胞病变(CPE)达80%左右时即可收获，冻融I次，置_15°C以下冻结保存，待检备用；按病毒液总量的O. 2%加入甲醛溶液，充分混匀，置36°C下灭活，待温度升至36°C开始计吋，180转/分钟的摇床中不间断摇动，灭活48小吋。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，蜂胶液制备由以下步骤完成选取已知纯度的蜂胶，经破碎后过筛，溶于95%的こ醇溶液，再根据要求配成适当浓度的溶液于4°C下保存备用。
5.根据权利要求2-3任一项所述的制备方法，其特征在于，成品疫苗为黄褐色混悬液，密封保存于4-8°C中。
6.权利要求I所述的犬细小病毒蜂胶灭活疫苗的用途，主要是用于犬细小病毒病的免疫。
全文摘要
本发明提供了一种犬细小病毒蜂胶灭活苗及其制备方法。本发明的实质内容是将犬细小病毒株在F81细胞上进行病毒繁殖，经过收获、灭活，并以蜂胶作为佐剂制备一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗。本疫苗能够有效预防犬源细小病毒病的发生，并能显著减少注射疫苗后的不良反应，为宠物疾病的控制创造条件。
文档编号C12N7/02GK102657860SQ20121013088
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月1日 优先权日2012年5月1日
发明者单虎, 张传美, 杨瑞梅, 秦晓冰, 韩先杰, 黄娟 申请人:青岛农业大学
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