一种气泡上升法检测纤溶酶效价的方法
专利名称：一种气泡上升法检测纤溶酶效价的方法
技术领域：
本发明涉及制药技术领域，尤其涉及一种气泡上升法检测纤溶酶效价的方法。
背景技术：
纤溶酶蛋白水解酶，是用于脑梗死、高凝血状态及血栓性脉管炎等外周血管疾病。本品作用于纤维蛋白原及纤维蛋白(血栓前体蛋白)，使其降解为小分子可溶片段，容易分解和从血循环中清除，从而产生去纤维蛋白效应；本品促使组织纤溶酶原激活物(t-PA)由内皮细胞释放，并增强其活性，故具抗血栓功能；本品可降低血小板聚集及血液黏度；本品还具有降低心肌耗氧量，改善微循环的功能。本品静脉注入人体内，3小时后血药浓度达到最高，药品本身及其降解产物均可通过血-脑脊液屏障，主要经肾脏、肝脏代谢后随尿液排出。
蛇毒纤溶酶的降纤抗凝、溶解血栓作用，早在二十世纪七十年代就有报道，但其成分复杂，含有多种毒素，极少量杂质成分的残留可能会产生致命反应。因此是否可以分离纯化获得单一活性成分，决定了蛇毒纤溶酶的应用前景。本公司经过十几年的努力，解决了这ー技术难题，本公司研制的纤溶酶纯度高、无出血毒、神经毒、异常毒等毒性，具有降纤抗凝、溶解血栓等作用，且具有疗效好、再次梗塞率低的特点，是新一代理想抗血栓药物，并实现了纤溶酶的产业化生产。为了保证ー个药品能够安全有效地应用于临床，在研制过程中必须进行质量研究，制定出一系列的质量控制标准。对于纤溶酶来说，保证临床疗效的唯一并且关键技术方法决定于酶的活性，而评定酶的活性除了临床效果观察(药效学)之外，最主要的是要有一种准确、标准、稳定的酶活力检测方法。因此，研究ー个操作简单、准确可靠而又稳定的评定酶活力的測定方法是该品实现产业化必不可少的重要环节。我们经过十多年的努力和反复试验发明了本方法。目前文献中使用的此类酶的效价測定有以下两种測定方法一、纤维蛋白平板法纤维蛋白平板法是最早用于纤溶活性測定的方法之一，是将琼脂糖、血纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液按一定比例混合，制成人工血栓平板。在平板上点上系列标准样和待测的样品，于37°C下恒温培养18h，测量酶在平板上产生的溶圈直径，然后以标准品浓度的对数为横坐标，以溶圈面积的对数为纵坐标，进行线性回归并绘出线性回归曲线，根据线性回归曲线求得所述供试品溶液的效价。该法优点是简便直观，但存在以下不足I、測定值易受平板均匀度、恒温孵育时间等因素的影响。2、制板操作麻烦，平板的厚度和成分不容易均匀。3、同一平板上检测的样品数量少。4、反应时间长，不便于生产过程控制。5、溶圈形状有时不规则，检测溶圈直径的误差大。ニ、紫外分光光度法即紫外分光光度法測定所生成的分解产物的吸光度变化。就是利用凝血酶将纤维蛋白原活化形成交联纤维蛋白，制成人工血栓，再加样品进行人工血栓分解，以紫外分光光度计测定所生成的分解产物的吸光度变化，计算出纤维蛋白溶解酶活性的方法。(在规定条件下，I分钟溶解I μ g纤维蛋白(可凝固蛋白)为ー个纤溶酶活カ单位)。紫外分光光度法(国家药品标准WS-IOOOl-(HD-0805)-2002)存在以下不足I、该法水解反应后多次洗涤剩余的纤维蛋白，洗涤过程中因胶块容易碎而丢失，影响检测結果。2、操作繁琐、耗时长，不便于生产过程控制。3、纤维蛋白原来源于动物血液，成分复杂、杂质量不确定，杂质不同程度地抑制纤溶酶效价，甚至不同批次的纤维蛋白原都将影响纤溶酶效价測定
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种测定结果准确可靠、操作简单、快速，并克服了不同来源或不同批次纤维蛋白原对效价測定的干扰的气泡上升法检测纤溶酶效价的方法。本发明所述气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其測定步骤为一、配制供试品溶液取供试品纤溶酶适量，然后加入PH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，根据供试品效价估计值将所述供试品纤溶酶稀释为每I毫升中含10-10000単位的溶液；ニ、配制纤溶酶标准溶液取纤溶酶标准品适量，加入PH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液稀释成每I毫升中含10-10000単位的至少两种不同浓度的标准品溶液；三、測定方法取若干试管，各精密加入1-10毫克/毫升的纤维蛋白原溶液
O.1-1. O毫升，将各试管置于37±0. 5摄氏度水浴中保温2-4分钟，然后在各试管中加入1-10BP単位/毫升的凝血酶溶液O. 1-1. O毫升，同时精密加入步骤(ニ)所得标准品溶液或步骤(一)所得供试品溶液各0.1-1.0毫升，立即摇匀并计时，各试管中的反应物质在10秒内凝结，当凝块内的小气泡上升到反应系统体积的一半时，立即分别记时，然后以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线性回归并绘出线性回归曲线，根据线性回归曲线求得所述供试品溶液的效价。本发明所述气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其相比现有技术的有益效果是(一 )经多次实验证明，本发明所述气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，克服了纤维蛋白平板法測定值易受平板均匀度、恒温孵育时间、样品杂质等因素的影响以及制板操作麻烦，平板的厚度和成分不容易均匀等影响及紫外分光光度法不同批次或来源的纤维蛋白原对纤溶酶效价測定有干扰，致使測定结果不准确的缺点，本发明所述方法经多次证明不同批次或来源的纤维蛋白原不干扰纤溶酶效价的測定，从而測定结果不因外界条件而变化，结果更准确。( ニ)本发明克服了纤维蛋白平板法及紫外分光光度法反应时间长、操作繁琐、耗时长等缺点，用简便、快捷的方法直接测量纤溶酶效价，且影响因素较少，便于生产过程的控制。
具体实施例方式下面将以具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。本发明所用试验材料，纤溶酶标准品为自制，其余材料如无特别说明，均为市售购
买产品。本发明所述气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，具体为一、配制供试品溶液取供试品纤溶酶适量，然后加入PH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，根据供试品效价估计值将所述供试品纤溶酶稀释为每I毫升中含10-10000単位的溶液；ニ、配制纤溶酶标准溶液取纤溶酶标准品适量，加入PH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液稀释成每I毫升中含10-10000単位的至少两种不同浓度的标准品溶液 ；三、測定方法取若干试管，各精密加入1-10毫克/毫升的纤维蛋白原溶液
O.1-1. O毫升，将各试管置于37±0. 5摄氏度水浴中保温2-4分钟，然后在各试管中加入1-10BP単位/毫升的凝血酶溶液O. 1-1. O毫升，同时精密加入步骤(ニ)所得标准品溶液或步骤(一)所得供试品溶液各0.1-1.0毫升，立即摇匀并计时，各试管中的反应物质在10秒内凝结，当凝块内的小气泡上升到反应系统体积的一半时，立即分别记时，然后以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线性回归并绘出线性回归曲线，根据线性回归曲线求得所述供试品溶液的效价。实施例I :本发明所用试验材料，纤溶酶标准品为自制，其余材料如无特别说明，均为市售购
买产品。试剂的配制pH7. 6的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液取三羟甲基氨基甲烷6. 05克，加水500毫升溶解后，加O. I摩尔/升盐酸溶液360毫升，混匀，调节pH至7. 6，加水至1000毫升。2. 5BP単位/毫升的凝血酶溶液取凝血酶，加上述PH7. 6的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液溶解并稀释成每I毫升中含2. 5BP単位的溶液。。2. 5毫克/毫升的纤维蛋白原溶液取纤维蛋白原，加上述PH7. 6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解并稀释成每I毫升中含可凝固蛋白约2. 5毫克的溶液。标准品溶液的制备取纤溶酶标准品，加上述PH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液分别稀释成每I毫升中50、100、150、200单位的溶液。供试品溶液的制备取纤溶酶供试品适量，根据效价的估计值，加上述PH7. 6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释成每I毫升中含100単位的溶液。供试品纤溶酶效价的測定方法取试管若干支，各精密加入2. 5mg/ml的纤维蛋白原溶液O. 5ml，置37°C ±0. 5°C水浴中保温约3分钟，加入2. 5BP单位/ml的凝血酶溶液
O.5ml,同时精密加入上述标准品溶液各O. 2ml，立即摇匀并计吋。反应系统应在10秒内凝结，当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，立即记吋。每种浓度测3次，3次測定中最大值与最小值的差不得超过平均值的10%，求平均值。以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应終点时间的对数为纵坐标，进行线性回归。供试品溶液按上法测定，用线性回归方程求得供试品溶液的效价。实施例2 本发明所用试验材料，纤溶酶标准品为自制，其余材料如无特别说明，均为市售购买产品。试剂的配制pH7. 6的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液取三羟甲基氨基甲烷6. 05克，加水500毫升溶解后，加O. I摩尔/升盐酸溶液360毫升，混匀，调节pH至7. 6，加水至1000毫升。
3BP単位/毫升的凝血酶溶液取凝血酶，加上述PH7. 6的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液溶解并稀释成每I毫升中含3BP単位的溶液。。3毫克/毫升的纤维蛋白原溶液取纤维蛋白原，加上述pH7. 6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解并稀释成每I毫升中含可凝固蛋白约3毫克的溶液。标准品溶液的制备取纤溶酶标准品，加上述PH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液分别稀释成每I毫升中50、100、150、200单位的溶液。供试品溶液的制备取纤溶酶供试品适量，根据效价的估计值，加上述PH7. 6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释成每I毫升中含100単位的溶液。供试品纤溶酶效价的測定方法取试管若干支，各精密加入3. Omg/ml的纤维蛋白原溶液O. 5ml，置37°C ±0. 5°C水浴中保温约3分钟，加入3. OBP单位/ml的凝血酶溶液
O.5ml,同时精密加入上述标准品溶液各O. 2ml，立即摇匀并计吋。反应系统应在10秒内凝结，当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，立即记吋。每种浓度测3次，3次測定中最大值与最小值的差不得超过平均值的10%，求平均值。以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应終点时间的对数为纵坐标，进行线性回归。供试品溶液按上法测定，用线性回归方程求得供试品溶液的效价。实施例3 本发明所用试验材料，纤溶酶标准品为自制，其余材料如无特别说明，均为市售购
买产品。试剂的配制pH7. 8的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液取三羟甲基氨基甲烷适量，加水500毫升溶解后，加O. I摩尔/升盐酸液适量，混匀，调节pH至7. 8，加水至1000毫升。8BP単位/毫升的凝血酶溶液取凝血酶，加上述PH7. 8的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液溶解并稀释成每I毫升中含8BP単位的溶液。。8毫克/毫升的纤维蛋白原溶液取纤维蛋白原，加上述pH7. 8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解并稀释成每I毫升中含可凝固蛋白约8毫克的溶液。标准品溶液的制备取纤溶酶标准品，加上述PH7.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液分别稀释成每I毫升中50、100、150、200单位的溶液。供试品溶液的制备取纤溶酶供试品适量，根据效价的估计值，加上述PH7. 8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释成每I毫升中含100単位的溶液。供试品纤溶酶效价的測定方法取试管若干支，各精密加入8. Omg/ml的纤维蛋白原溶液O. 5ml，置37°C ±0. 5°C水浴中保温约3分钟，加入8. OBP单位/ml的凝血酶溶液
O.5ml,同时精密加入上述标准品溶液各O. 2ml，立即摇匀并计吋。反应系统应在10秒内凝结，当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，立即记吋。每种浓度测3次，3次測定中最大值与最小值的差不得超过平均值的10%，求平均值。以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应終点时间的对数为纵坐标，进行线性回归。供试品溶液按上法测定，用线性回归方程求得供试品溶液的效价。下面我们采用优选的实施例I或实施例2或实施例3来测定纤溶酶效价，比较不同批次或来源的纤维蛋白原对本发明所述方法及紫外分光光度法測定的结果的影响。采用本发明所述效价測定法，用若干种不同批次或来源的纤维蛋白原測定同一批次纤溶酶。结果见表一。表一使用本发明所述气泡上升法用不同批次或来源的纤维蛋白原測定同一批次纤溶酶效价的结果
权利要求
1.一种气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其特征在于，所述方法为 一、配制供试品溶液取供试品纤溶酶适量，然后加入PH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，根据供试品效价估计值将所述供试品纤溶酶稀释为每I毫升中含10-10000单位的溶液； 二、配制纤溶酶标准品溶液取纤溶酶标准品适量，加入PH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液稀释成每I毫升中含10-10000单位的至少两种不同浓度的标准品溶液； 三、测定方法取若干试管，各精密加入1-10毫克/毫升的纤维蛋白原溶液0.1-1. 0毫升，将各试管置于37±0. 5摄氏度水浴中保温2-4分钟，然后在各试管中加入1-10BP单位/毫升的凝血酶溶液0.1-1.0毫升，同时精密加入步骤(二)所得标准品溶液或步骤(一)所得供试品溶液0. 1-1. 0毫升，立即摇匀并计时，各试管中的反应物质在10秒内凝结，当凝块内的小气泡上升到反应系统体积的一半时，立即分别记时，然后以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线性回归并绘出线性回归曲线，根据线性回归曲线求得所述供试品溶液的效价。
2.根据权利要求I所述的气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其特征在于 所述步骤(三)为取试管若干支，各精密加入2. 5mg/ml的纤维蛋白原溶液0. 5ml，置370C ±0. 5°C水浴中保温约3分钟，加入2. 5BP单位/ml的凝血酶溶液0. 5ml,同时精密加入步骤(二)所述标准品溶液或步骤(一)所述供试品溶液各0. 2ml，立即摇匀并计时。反应系统应在10秒内凝结，当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，立即记时。每种浓度测3次，3次测定中最大值与最小值的差不得超过平均值的10%，求平均值。以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线性回归，用线性回归方程求得供试品溶液的效价。
3.根据权利要求I所述的气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其特征在于所述PH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液配制方法为取三羟甲基氨基甲烷适量，加水500毫升溶解后，加0. I摩尔/升盐酸溶液适量，混匀，调节pH至6-9，再加水稀释至1000毫升。
4.根据权利要求I所述的气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其特征在于所述1-10BP单位/毫升的凝血酶溶液的配制方法为取凝血酶，加入PH6-9三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液溶解并稀释成每I毫升中含1-10BP单位的溶液。
5.根据权利要求I所述的气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其特征在于所述1-10毫克/毫升的纤维蛋白原溶液的配制方法为取纤维蛋白原，加PH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解并稀释成每I毫升中含可凝固蛋白1-10毫克的溶液。
全文摘要
本发明涉及制药技术领域，具体公开了一种气泡上升法检测纤溶酶效价的方法。所述方法选用pH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液作溶剂，用1-10BP单位/毫升的凝血酶溶液与1-10毫克/毫升的纤维蛋白原溶液制备底物，纤溶酶标准品用pH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液稀释成每1毫升中10-1000单位的标准品溶液，按所述方法制备制成标准回归曲线。供试品用pH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液稀释成每1毫升中约含10-1000单位的供试品溶液，同法测定，依据标准曲线计算供试品的效价。本发明消除了不同来源纤维蛋白原对纤溶酶效价测定的干扰，检验操作简便快速，测定结果准确可靠，解决了纤溶酶质量控制的关键技术方法，从而使纤溶酶产业化过程质量控制准确、稳定、可行。
文档编号C12Q1/34GK102703575SQ201210132470
公开日2012年10月3日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者吴丹, 彭兴华, 蒲丽萍, 马骉 申请人:北京赛升药业股份有限公司
技术领域：
本发明涉及制药技术领域，尤其涉及一种气泡上升法检测纤溶酶效价的方法。
背景技术：
纤溶酶蛋白水解酶，是用于脑梗死、高凝血状态及血栓性脉管炎等外周血管疾病。本品作用于纤维蛋白原及纤维蛋白(血栓前体蛋白)，使其降解为小分子可溶片段，容易分解和从血循环中清除，从而产生去纤维蛋白效应；本品促使组织纤溶酶原激活物(t-PA)由内皮细胞释放，并增强其活性，故具抗血栓功能；本品可降低血小板聚集及血液黏度；本品还具有降低心肌耗氧量，改善微循环的功能。本品静脉注入人体内，3小时后血药浓度达到最高，药品本身及其降解产物均可通过血-脑脊液屏障，主要经肾脏、肝脏代谢后随尿液排出。
蛇毒纤溶酶的降纤抗凝、溶解血栓作用，早在二十世纪七十年代就有报道，但其成分复杂，含有多种毒素，极少量杂质成分的残留可能会产生致命反应。因此是否可以分离纯化获得单一活性成分，决定了蛇毒纤溶酶的应用前景。本公司经过十几年的努力，解决了这ー技术难题，本公司研制的纤溶酶纯度高、无出血毒、神经毒、异常毒等毒性，具有降纤抗凝、溶解血栓等作用，且具有疗效好、再次梗塞率低的特点，是新一代理想抗血栓药物，并实现了纤溶酶的产业化生产。为了保证ー个药品能够安全有效地应用于临床，在研制过程中必须进行质量研究，制定出一系列的质量控制标准。对于纤溶酶来说，保证临床疗效的唯一并且关键技术方法决定于酶的活性，而评定酶的活性除了临床效果观察(药效学)之外，最主要的是要有一种准确、标准、稳定的酶活力检测方法。因此，研究ー个操作简单、准确可靠而又稳定的评定酶活力的測定方法是该品实现产业化必不可少的重要环节。我们经过十多年的努力和反复试验发明了本方法。目前文献中使用的此类酶的效价測定有以下两种測定方法一、纤维蛋白平板法纤维蛋白平板法是最早用于纤溶活性測定的方法之一，是将琼脂糖、血纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液按一定比例混合，制成人工血栓平板。在平板上点上系列标准样和待测的样品，于37°C下恒温培养18h，测量酶在平板上产生的溶圈直径，然后以标准品浓度的对数为横坐标，以溶圈面积的对数为纵坐标，进行线性回归并绘出线性回归曲线，根据线性回归曲线求得所述供试品溶液的效价。该法优点是简便直观，但存在以下不足I、測定值易受平板均匀度、恒温孵育时间等因素的影响。2、制板操作麻烦，平板的厚度和成分不容易均匀。3、同一平板上检测的样品数量少。4、反应时间长，不便于生产过程控制。5、溶圈形状有时不规则，检测溶圈直径的误差大。ニ、紫外分光光度法即紫外分光光度法測定所生成的分解产物的吸光度变化。就是利用凝血酶将纤维蛋白原活化形成交联纤维蛋白，制成人工血栓，再加样品进行人工血栓分解，以紫外分光光度计测定所生成的分解产物的吸光度变化，计算出纤维蛋白溶解酶活性的方法。(在规定条件下，I分钟溶解I μ g纤维蛋白(可凝固蛋白)为ー个纤溶酶活カ单位)。紫外分光光度法(国家药品标准WS-IOOOl-(HD-0805)-2002)存在以下不足I、该法水解反应后多次洗涤剩余的纤维蛋白，洗涤过程中因胶块容易碎而丢失，影响检测結果。2、操作繁琐、耗时长，不便于生产过程控制。3、纤维蛋白原来源于动物血液，成分复杂、杂质量不确定，杂质不同程度地抑制纤溶酶效价，甚至不同批次的纤维蛋白原都将影响纤溶酶效价測定
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种测定结果准确可靠、操作简单、快速，并克服了不同来源或不同批次纤维蛋白原对效价測定的干扰的气泡上升法检测纤溶酶效价的方法。本发明所述气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其測定步骤为一、配制供试品溶液取供试品纤溶酶适量，然后加入PH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，根据供试品效价估计值将所述供试品纤溶酶稀释为每I毫升中含10-10000単位的溶液；ニ、配制纤溶酶标准溶液取纤溶酶标准品适量，加入PH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液稀释成每I毫升中含10-10000単位的至少两种不同浓度的标准品溶液；三、測定方法取若干试管，各精密加入1-10毫克/毫升的纤维蛋白原溶液
O.1-1. O毫升，将各试管置于37±0. 5摄氏度水浴中保温2-4分钟，然后在各试管中加入1-10BP単位/毫升的凝血酶溶液O. 1-1. O毫升，同时精密加入步骤(ニ)所得标准品溶液或步骤(一)所得供试品溶液各0.1-1.0毫升，立即摇匀并计时，各试管中的反应物质在10秒内凝结，当凝块内的小气泡上升到反应系统体积的一半时，立即分别记时，然后以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线性回归并绘出线性回归曲线，根据线性回归曲线求得所述供试品溶液的效价。本发明所述气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其相比现有技术的有益效果是(一 )经多次实验证明，本发明所述气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，克服了纤维蛋白平板法測定值易受平板均匀度、恒温孵育时间、样品杂质等因素的影响以及制板操作麻烦，平板的厚度和成分不容易均匀等影响及紫外分光光度法不同批次或来源的纤维蛋白原对纤溶酶效价測定有干扰，致使測定结果不准确的缺点，本发明所述方法经多次证明不同批次或来源的纤维蛋白原不干扰纤溶酶效价的測定，从而測定结果不因外界条件而变化，结果更准确。( ニ)本发明克服了纤维蛋白平板法及紫外分光光度法反应时间长、操作繁琐、耗时长等缺点，用简便、快捷的方法直接测量纤溶酶效价，且影响因素较少，便于生产过程的控制。
具体实施例方式下面将以具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。本发明所用试验材料，纤溶酶标准品为自制，其余材料如无特别说明，均为市售购
买产品。本发明所述气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，具体为一、配制供试品溶液取供试品纤溶酶适量，然后加入PH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，根据供试品效价估计值将所述供试品纤溶酶稀释为每I毫升中含10-10000単位的溶液；ニ、配制纤溶酶标准溶液取纤溶酶标准品适量，加入PH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液稀释成每I毫升中含10-10000単位的至少两种不同浓度的标准品溶液 ；三、測定方法取若干试管，各精密加入1-10毫克/毫升的纤维蛋白原溶液
O.1-1. O毫升，将各试管置于37±0. 5摄氏度水浴中保温2-4分钟，然后在各试管中加入1-10BP単位/毫升的凝血酶溶液O. 1-1. O毫升，同时精密加入步骤(ニ)所得标准品溶液或步骤(一)所得供试品溶液各0.1-1.0毫升，立即摇匀并计时，各试管中的反应物质在10秒内凝结，当凝块内的小气泡上升到反应系统体积的一半时，立即分别记时，然后以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线性回归并绘出线性回归曲线，根据线性回归曲线求得所述供试品溶液的效价。实施例I :本发明所用试验材料，纤溶酶标准品为自制，其余材料如无特别说明，均为市售购
买产品。试剂的配制pH7. 6的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液取三羟甲基氨基甲烷6. 05克，加水500毫升溶解后，加O. I摩尔/升盐酸溶液360毫升，混匀，调节pH至7. 6，加水至1000毫升。2. 5BP単位/毫升的凝血酶溶液取凝血酶，加上述PH7. 6的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液溶解并稀释成每I毫升中含2. 5BP単位的溶液。。2. 5毫克/毫升的纤维蛋白原溶液取纤维蛋白原，加上述PH7. 6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解并稀释成每I毫升中含可凝固蛋白约2. 5毫克的溶液。标准品溶液的制备取纤溶酶标准品，加上述PH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液分别稀释成每I毫升中50、100、150、200单位的溶液。供试品溶液的制备取纤溶酶供试品适量，根据效价的估计值，加上述PH7. 6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释成每I毫升中含100単位的溶液。供试品纤溶酶效价的測定方法取试管若干支，各精密加入2. 5mg/ml的纤维蛋白原溶液O. 5ml，置37°C ±0. 5°C水浴中保温约3分钟，加入2. 5BP单位/ml的凝血酶溶液
O.5ml,同时精密加入上述标准品溶液各O. 2ml，立即摇匀并计吋。反应系统应在10秒内凝结，当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，立即记吋。每种浓度测3次，3次測定中最大值与最小值的差不得超过平均值的10%，求平均值。以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应終点时间的对数为纵坐标，进行线性回归。供试品溶液按上法测定，用线性回归方程求得供试品溶液的效价。实施例2 本发明所用试验材料，纤溶酶标准品为自制，其余材料如无特别说明，均为市售购买产品。试剂的配制pH7. 6的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液取三羟甲基氨基甲烷6. 05克，加水500毫升溶解后，加O. I摩尔/升盐酸溶液360毫升，混匀，调节pH至7. 6，加水至1000毫升。
3BP単位/毫升的凝血酶溶液取凝血酶，加上述PH7. 6的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液溶解并稀释成每I毫升中含3BP単位的溶液。。3毫克/毫升的纤维蛋白原溶液取纤维蛋白原，加上述pH7. 6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解并稀释成每I毫升中含可凝固蛋白约3毫克的溶液。标准品溶液的制备取纤溶酶标准品，加上述PH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液分别稀释成每I毫升中50、100、150、200单位的溶液。供试品溶液的制备取纤溶酶供试品适量，根据效价的估计值，加上述PH7. 6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释成每I毫升中含100単位的溶液。供试品纤溶酶效价的測定方法取试管若干支，各精密加入3. Omg/ml的纤维蛋白原溶液O. 5ml，置37°C ±0. 5°C水浴中保温约3分钟，加入3. OBP单位/ml的凝血酶溶液
O.5ml,同时精密加入上述标准品溶液各O. 2ml，立即摇匀并计吋。反应系统应在10秒内凝结，当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，立即记吋。每种浓度测3次，3次測定中最大值与最小值的差不得超过平均值的10%，求平均值。以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应終点时间的对数为纵坐标，进行线性回归。供试品溶液按上法测定，用线性回归方程求得供试品溶液的效价。实施例3 本发明所用试验材料，纤溶酶标准品为自制，其余材料如无特别说明，均为市售购
买产品。试剂的配制pH7. 8的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液取三羟甲基氨基甲烷适量，加水500毫升溶解后，加O. I摩尔/升盐酸液适量，混匀，调节pH至7. 8，加水至1000毫升。8BP単位/毫升的凝血酶溶液取凝血酶，加上述PH7. 8的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液溶解并稀释成每I毫升中含8BP単位的溶液。。8毫克/毫升的纤维蛋白原溶液取纤维蛋白原，加上述pH7. 8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解并稀释成每I毫升中含可凝固蛋白约8毫克的溶液。标准品溶液的制备取纤溶酶标准品，加上述PH7.8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液分别稀释成每I毫升中50、100、150、200单位的溶液。供试品溶液的制备取纤溶酶供试品适量，根据效价的估计值，加上述PH7. 8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释成每I毫升中含100単位的溶液。供试品纤溶酶效价的測定方法取试管若干支，各精密加入8. Omg/ml的纤维蛋白原溶液O. 5ml，置37°C ±0. 5°C水浴中保温约3分钟，加入8. OBP单位/ml的凝血酶溶液
O.5ml,同时精密加入上述标准品溶液各O. 2ml，立即摇匀并计吋。反应系统应在10秒内凝结，当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，立即记吋。每种浓度测3次，3次測定中最大值与最小值的差不得超过平均值的10%，求平均值。以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应終点时间的对数为纵坐标，进行线性回归。供试品溶液按上法测定，用线性回归方程求得供试品溶液的效价。下面我们采用优选的实施例I或实施例2或实施例3来测定纤溶酶效价，比较不同批次或来源的纤维蛋白原对本发明所述方法及紫外分光光度法測定的结果的影响。采用本发明所述效价測定法，用若干种不同批次或来源的纤维蛋白原測定同一批次纤溶酶。结果见表一。表一使用本发明所述气泡上升法用不同批次或来源的纤维蛋白原測定同一批次纤溶酶效价的结果
权利要求
1.一种气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其特征在于，所述方法为 一、配制供试品溶液取供试品纤溶酶适量，然后加入PH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，根据供试品效价估计值将所述供试品纤溶酶稀释为每I毫升中含10-10000单位的溶液； 二、配制纤溶酶标准品溶液取纤溶酶标准品适量，加入PH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液稀释成每I毫升中含10-10000单位的至少两种不同浓度的标准品溶液； 三、测定方法取若干试管，各精密加入1-10毫克/毫升的纤维蛋白原溶液0.1-1. 0毫升，将各试管置于37±0. 5摄氏度水浴中保温2-4分钟，然后在各试管中加入1-10BP单位/毫升的凝血酶溶液0.1-1.0毫升，同时精密加入步骤(二)所得标准品溶液或步骤(一)所得供试品溶液0. 1-1. 0毫升，立即摇匀并计时，各试管中的反应物质在10秒内凝结，当凝块内的小气泡上升到反应系统体积的一半时，立即分别记时，然后以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线性回归并绘出线性回归曲线，根据线性回归曲线求得所述供试品溶液的效价。
2.根据权利要求I所述的气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其特征在于 所述步骤(三)为取试管若干支，各精密加入2. 5mg/ml的纤维蛋白原溶液0. 5ml，置370C ±0. 5°C水浴中保温约3分钟，加入2. 5BP单位/ml的凝血酶溶液0. 5ml,同时精密加入步骤(二)所述标准品溶液或步骤(一)所述供试品溶液各0. 2ml，立即摇匀并计时。反应系统应在10秒内凝结，当凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时作为反应终点，立即记时。每种浓度测3次，3次测定中最大值与最小值的差不得超过平均值的10%，求平均值。以纤溶酶标准品浓度的对数为横坐标，以反应终点时间的对数为纵坐标，进行线性回归，用线性回归方程求得供试品溶液的效价。
3.根据权利要求I所述的气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其特征在于所述PH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液配制方法为取三羟甲基氨基甲烷适量，加水500毫升溶解后，加0. I摩尔/升盐酸溶液适量，混匀，调节pH至6-9，再加水稀释至1000毫升。
4.根据权利要求I所述的气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其特征在于所述1-10BP单位/毫升的凝血酶溶液的配制方法为取凝血酶，加入PH6-9三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液溶解并稀释成每I毫升中含1-10BP单位的溶液。
5.根据权利要求I所述的气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其特征在于所述1-10毫克/毫升的纤维蛋白原溶液的配制方法为取纤维蛋白原，加PH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解并稀释成每I毫升中含可凝固蛋白1-10毫克的溶液。
全文摘要
本发明涉及制药技术领域，具体公开了一种气泡上升法检测纤溶酶效价的方法。所述方法选用pH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液作溶剂，用1-10BP单位/毫升的凝血酶溶液与1-10毫克/毫升的纤维蛋白原溶液制备底物，纤溶酶标准品用pH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液稀释成每1毫升中10-1000单位的标准品溶液，按所述方法制备制成标准回归曲线。供试品用pH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液稀释成每1毫升中约含10-1000单位的供试品溶液，同法测定，依据标准曲线计算供试品的效价。本发明消除了不同来源纤维蛋白原对纤溶酶效价测定的干扰，检验操作简便快速，测定结果准确可靠，解决了纤溶酶质量控制的关键技术方法，从而使纤溶酶产业化过程质量控制准确、稳定、可行。
文档编号C12Q1/34GK102703575SQ201210132470
公开日2012年10月3日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者吴丹, 彭兴华, 蒲丽萍, 马骉 申请人:北京赛升药业股份有限公司
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