一种利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产2，3-丁二醇的方法
专利名称：一种利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产2，3-丁二醇的方法
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域，涉及ー种发酵生产2，3_ 丁ニ醇的方法。
背景技术：
2，3-丁ニ醇(2，3_butanediol，简称2，3_BD)广泛应用于化工、食品以及航空航天等众多领域。其热值为27200kJ/kg，与こ醇(29100kJ/kg)相近，可用作燃料，同时，还可用于制备聚合物、油墨、香水、防冻剂、香薰剂、增湿剂、炸药以及药物的手性载体等。随着石化资源的日益枯竭以及石化工业对环境的影响，可再生资源引来了越来越多的关注。由于石油价格的不断上涨及其不稳定性，利用可再生资源生产生物基大宗化学品如生物燃料等引起了人们极大的兴趣。利用可再生的生物质资源作为底物，将生物发酵和緑色化学エ业有机结合，可以建立起环境友好的、可持续发展的化学エ业。目前2，3- 丁ニ醇的生产方法有化学法和生物转化法。エ业上生产2，3- 丁ニ醇的化学法，主要是以石油裂解时产生的四碳类碳氢化合物在高温高压下水解得到，然而化学法生产2，3-丁ニ醇不仅成本高而且过程繁琐，因此エ业化生产较困难。生物发酵法合成2，3-丁ニ醇使用的生物质原料可再生，较化学法生产2，3-丁ニ醇エ艺更简单、更加环境友好，不仅可以避免化学法合成的困难，而且可以促进人类社会生产，由传统的石油炼制向以可再生资源为原料的生物炼制转型，逐渐减少对日益枯竭的石油资源的依赖。目前利用葡萄糖为底物占生物转化法生产2，3_ 丁ニ醇的大多数，但由于粮食危机的存在，利用丰富而且廉价的可再生资源木质纤维类物质为原料发酵生产2，3- 丁ニ醇成为必然趋势。木质纤维素原料，来源广泛，且再生迅速。玉米芯作为ー种木质纤维素原料，在我国有着极其广泛的资源。现阶段，我国大部分エ业生产的木糖是由玉米芯水解液提取得到，在木糖过程中产生了一种纤维素含量丰富的废弃物——玉米芯残渣。玉米芯残渣具有纤维素含量高，结构疏松的特点，是ー种理想的木质纤维素原料。因此利用玉米芯残渣生产高值平台产物2，3_ 丁ニ醇，以草代粮，不仅解决了与人争粮的问题，同时实现了ー种エ业副产物的高值利用，顺应了环境友好和可持续发展的潮流。
发明内容
本发明的目的是以木糖エ业废弃物玉米芯残渣为主要原料，利用生物工程技术生产高值平台化合物2，3- 丁ニ醇，实现资源的综合利用。鉴于纤维素酶解过程当中存在的葡萄糖阻遏，エ业上对纤维素酶解液的浓缩存在能耗过大的问题，因此本发明选择同步糖化发酵方式，避免了纤维素酶解后的浓缩过程。本发明对利用玉米芯残渣进行同步糖化发酵的发酵条件进行了探索，并对各种添加因子进行了响应面优化，最終得到了ー种利用玉米芯提取木糖后残渣同步糖化发酵生产2，3-丁ニ醇的方法。 具体步骤如下
第一歩、将玉米芯残渣原材料烘干粉碎后，按照玉米芯残渣与NaOH溶液重量体积比I : 8-1 12混合，在60-80°C条件下预处理l_3h，后将残渣洗涤至中性，烘干粉碎后过40目筛备用。所述NaOH溶液浓度为
第二歩、将处理后的残渣加入发酵液中，残渣与发酵液的重量体积比为1:8-1: 15，然后在 115°C下灭菌 20min。发酵液组成如下尿素I. 4-2. 2g/L，乳酸 l_3g/L，柠檬酸钠 0. 1-lg/L，EDTA0. 002-0. 006g/L,磷酸氢ニ钾l_5g/L，磷酸ニ氢钾4-20g/L，硫酸镁0. 05-0. 5g/L，硫酸钙0. 03-0. 06g/L,硫酸亚铁
0.1-0. 15g/L,氯化钴 0. 002-0. 006g/L,硫酸铜 0. 0025-0. 0075g/L,硫酸锌 0. 05-0. 15g/L,硫酸锰 0. 025-0. 05g/L。第四步、接入2%-10%的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC21518、多粘类芽抱杆菌(Bacillus polymyxa)CICC10010、阴沟肠杆菌(Bacillus cloacae)CICC10014菌液中的ー种或上述菌种的混合菌液，同时向发酵液中加入纤维素酶，所述发酵液中纤维素酶的添加量为每克玉米芯残渣加入300U-500U纤维素酶。于35-42°C同步糖化发酵36_84h后2，3- 丁ニ醇的产量为玉米芯残渣干重的19.59% -36. 13% (2，3-丁ニ醇/玉米芯残渣干重，W/W)。所述第四步中优选接入2%-10%的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC21518、多粘类芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)CICC10010 和阴沟肠杆菌(Bacillus cloacae)CICC10014 的混合菌液。所述混合菌液中，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011优选体积百分比为25-30%，产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC21518优选体积百分比为20-30%，多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)CICC10010优选体积百分比为10_20%，阴沟肠杆菌(Bacillus cloacae) CICC10014 体积百分比为 25-35%。本发明所产生的技术效果本发明利用玉米芯生产木糖的废料——玉米芯残渣生产2，3_ 丁ニ醇，实现了ー种エ业废料的高值利用，即使原料利用不完全，废液中固液分离容易，剰余残渣可循环利用。本发明以草代粮、变废为宝，减小环境污染的同时降低了 2，3- 丁ニ醇的生产成本；而且利用优选的菌种采用科学筛选的添加比例进行发酵，从而使发酵エ艺效率更好，并实现更加良好的糖化发酵，使发酵产率有了较大提高。
具体实施例方式实施例I将玉米芯生产木糖エ业的废弃物玉米芯残渣粉碎后按固液比I : 8(纤维素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液当中，80°C条件下预处理3h，处理结束后将残渣洗涤至中性，烘干后粉碎，测得预处理后的残渣含纤维素88. 92%、木质素3. 35%。影响纤维素水解的木质素含量明显降低。将处理后及未处理的玉米芯残渣按照纤维素比发酵液I : 8(W/V)的比例加入至含有1.61g/L尿素的发酵液当中，装液量50mL/250mL，初始pH 5.0，灭菌后按每克玉米芯残洛400U的比例加入纤维素酶,接入10%肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011菌液，35°C，150r/min摇瓶发酵36h，发酵液中2，3- 丁ニ醇与こ偶姻浓度和分别为8. 525g/L (未处理)和28. 482g/L (处理)，经碱法预处理的玉米芯残渣较未处理残渣单位时间内产量提高3. 34倍。发酵液组成为尿素I. 6g/L，乳酸2g/L，柠檬酸钠0. 3g/L，EDTAO. 003g/L,磷酸氢ニ钾3g/L，磷酸ニ氢钾8g/L，硫酸镁0. 2g/L，硫酸钙0. 04g/L,硫酸亚铁0. lg/L，氯化钴
0.004g/L，硫酸铜 0. 0045g/L，硫酸锌 0. lg/L，硫酸锰 0. 04g/L。实施例2将玉米芯生产木糖エ业的废弃物玉米芯残渣粉碎后按固液比I : 10 (纤维素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液当中，80°C条件下预处理3h，处理结束后将残渣洗涤至中性，烘干后粉碎。将处理后的玉米芯残渣按固液比I : 10(纤维素原料干重发酵液，W V)加入至含有尿素I. 61g/L，乳酸2g/L，柠檬酸钠lg/L，EDTAO. 006g/L，磷酸氢ニ钾5g/L，磷酸ニ氢钾20g/L,硫酸镁0. 25g/L，硫酸钙0. 05g/L,硫酸亚铁0. 15g/L，氯化钴0. 005g/L,硫酸铜0. 0075g/L,硫酸锌0. 15g/L，硫酸锰0. 05g/L的发酵液中，装液量50mL/250mL，初始PH 5. 0，灭菌后按每克玉米芯残渣400U的比例加入纤维素酶，接入5 %肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC10011 菌液,35°C，150r/min 摇瓶发酵 36h,发酵液中 2, 3-丁ニ醇浓度为23. 484g/L，2，3-丁ニ醇与こ偶姻浓度和为25. 041g/L,占玉米芯残渣干重的25. 04%。实施例3将玉米芯生产木糖エ业的废弃物玉米芯残渣粉碎后按固液比I : 12 (纤维素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液当中，80°C条件下预处理3h，处理结束后将残渣洗涤至中性，烘干后粉碎。将处理后的玉米芯残渣按固液比I : 12(纤维素原料干重发酵液，W V)加入至含有尿素I. 61g/L，乳酸2g/L，柠檬酸钠lg/L，EDTAO. 006g/L，磷酸氢ニ钾5g/L，磷酸ニ氢钾20g/L,硫酸镁0. 25g/L，硫酸钙0. 05g/L,硫酸亚铁0. 15g/L，氯化钴0. 005g/L,硫酸铜0. 0075g/L,硫酸锌0. 15g/L，硫酸锰0. 05g/L的发酵液中，装液量50mL/250mL，初始PH 5. 0，灭菌后按每克玉米芯残渣400U的比例加入纤维素酶，接入5 %产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) CICC21913 菌液，35 °C，150r/min 摇瓶发酵 36h,发酵液中 2,3- 丁ニ醇浓度为17.618g/L，2，3-丁ニ醇与こ偶姻浓度和为18. 548g/L，占玉米芯残渣干重的22. 26%。实施例4将玉米芯生产木糖エ业的废弃物玉米芯残渣粉碎后按固液比I : 15 (纤维素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液当中，80°C条件下预处理3h，处理结束后将残渣洗涤至中性，烘干后粉碎。将处理后的玉米芯残渣按固液比I : 15 (纤维素原料干重发酵液，W V)加入至含有尿素L 61g/L，乳酸2g/L，柠檬酸钠lg/L，EDTAO. 006g/L,磷酸氢ニ钾5g/L，磷酸ニ氢钾20g/L，硫酸镁0. 25g/L，硫酸钙0. 05g/L，硫酸亚铁0. 15g/L，氯化钴0. 005g/L，硫酸铜
0.0075g/L，硫酸锌0. 15g/L，硫酸锰0. 05g/L的发酵液中，装液量50mL/250mL，初始pH 5. 0，灭菌后按每克玉米芯残渣400U的比例加入纤维素酶，接入5%多粘类芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa) CICC10010菌液，35 °C，150r/min摇瓶发酵48h，发酵液中2,3- 丁ニ醇浓度为、12. 238g/L，2，3-丁ニ醇与こ偶姻浓度和为13. 062g/L,占玉米芯残渣干重的19. 59%。实施例5将玉米芯生产木糖エ业的废弃物玉米芯残渣粉碎后按固液比I : 15(纤维素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液当中，80°C条件下预处理3h，处理结束后 将残渣洗涤至中性，烘干后粉碎。将处理后的玉米芯残渣按固液比I : 15(纤维素原料干重发酵液，W : V)加入至含有尿素I. 61g/L，乳酸2g/L，柠檬酸钠lg/L，EDTAO. 006g/L，磷酸氢ニ钾5g/L，磷酸ニ氢钾20g/L，硫酸镁0. 25g/L，硫酸钙0. 05g/L，硫酸亚铁0. 15g/L，氯化钴0. 005g/L，硫酸铜0. 0075g/L,硫酸锌0. 15g/L，硫酸锰0. 05g/L的发酵液中，装液量50mL/250mL，初始pH5.0，灭菌后按每克玉米芯残渣400U的比例加入纤维素酶，接入5%阴沟肠杆菌(Bacilluscloacae) CICC10014菌液，40°C，150r/min摇瓶发酵48h，发酵液中2，3- 丁ニ醇浓度为15. 295g/L，2，3-丁ニ醇与こ偶姻浓度和为16. 259g/L，占玉米芯残渣干重的24. 39%。实施例6将玉米芯生产木糖エ业的废弃物玉米芯残渣粉碎后按固液比I : 10 (纤维素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液当中，80°C条件下预处理3h，处理结束后将残渣洗涤至中性，烘干后粉碎。将处理后的玉米芯残渣按固液比I : 10(纤维素原料干重发酵液，W : V)加入至含有尿素I. 61g/L，乳酸2g/L，柠檬酸钠0. 5g/L，EDTAO. 004g/L,磷酸氢ニ钾lg/L，磷酸ニ氢钾4g/L，硫酸镁0. 25g/L，硫酸钙0. 034g/L,硫酸亚铁0. 136g/L，氯化钴0. 0044g/L，硫酸铜0. 005g/L，硫酸锌0. 096g/L，硫酸锰0. 0275g/L的发酵液中，于5L发酵罐中发酵，装液量3L，按每克玉米芯残渣400U的比例加入纤维素酶，接入2 %肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC10011 菌液,发酵过程中控制 pH5. 0,揽拌奖转速 400r/min,通气量I. 4Vvm0 38°C发酵84小时后，发酵液中2，3- 丁ニ醇浓度为31. 857g/L，2，3- 丁ニ醇与こ偶姻浓度和为33. 754g/L，占玉米芯残渣干重的33. 75%。实施例7将玉米芯生产木糖エ业的废弃物玉米芯残渣粉碎后按固液比I : 10 (纤维素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液当中，80°C条件下预处理3h，处理结束后将残渣洗涤至中性，烘干后粉碎。将处理后的玉米芯残渣按固液比I : 10 (纤维素原料干重发酵液，W V)加入至含有尿素I. 61g/L,乳酸2g/L，柠檬酸钠0. 5g/L，EDTAO. 004g/L,磷酸氢ニ钾lg/L，磷酸ニ氢钾4g/L，硫酸镁0. 25g/L，硫酸钙0. 034g/L，硫酸亚铁0. 136g/L，氯化钴0. 0044g/L，硫酸铜0. 005g/L，硫酸锌0. 096g/L，硫酸锰0. 0275g/L的发酵液中，于5L发酵罐中发酵，装液量3L，按每克玉米芯残渣400U的比例加入纤维素酶，接入6 %的混合菌液，所述混合菌液中含有体积百分比为26%的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC10011、体积百分比为24%的产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC21518、体积百分比为23%的多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)CICC10010、体积百分比为27%的阴沟肠杆菌(Bacilluscloacae) CICC10014。发酵过程中控制pH5. 0，搅拌桨转速400r/min，通气量I. 4vvm。42°C发酵72小时后，发酵液中2，3-丁ニ醇浓度为34. 879g/L，2，3-丁ニ醇与こ偶姻浓度和为36. 128g/L，占玉米芯残渣干重的36. 13%。
权利要求
1.ー种利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产2，3- 丁ニ醇的方法，包括如下步骤 第一歩、将含有纤维素玉米芯残渣原材料粉碎，烘干备用； 第二步、粉碎后玉米芯残渣与NaOH溶液按照重量体积比I : 8-1 12混合，在60-80°C条件下预处理l_3h，后将残渣洗涤至中性，烘干粉碎后过40目筛备用； 第三步、将烘干粉碎后残渣加入发酵液中，烘干粉碎后残渣与发酵液的重量体积比为1:8-1: 15，然后在 115°C下灭菌 20min ; 第四步、接入2%-10%的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC 10011、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC 21518、多粘类芽抱杆菌(Bacillus polymyxa)CICC 10010、阴沟肠杆菌(Bacillus cloacae)CICC10014菌液中的ー种或上述菌种的混合液，同时向发酵液中加入纤维素酶，所述发酵液中纤维素酶的添加量为每克玉米芯残渣加入300U-500U纤维素酶，于35-42°C同步糖化发酵36_84h。
2.根据权利要求I所述ー种利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产2，3_丁ニ醇的方法，其特征在于，所述第四步中接入2% -10%的混合菌液，所述混合菌液中肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC 10011体积百分比为25-30 %，产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) CICC21518 体积百分比为 20-30 %,多粘类芽抱杆菌(Bacilluspolymyxa)CICC 10010 体积百分比为 10-20%,阴沟肠杆菌(Bacillus cloacae)CICC10014体积百分比为25-35%。
3.根据权利要求I所述ー种利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产2，3_丁ニ醇的方法，其特征在于，所述发酵液组成为尿素1.4-2. 2g/L，乳酸l_3g/L，柠檬酸钠0. I-Ig/L，EDTA0. 002-0. 006g/L,磷酸氢ニ钾ト5g/L，磷酸ニ氢钾 4_20g/L，硫酸镁 0. 05-0. 5g/L,硫酸钙 0. 03-0. 06g/L,硫酸亚铁 0. 1-0. 15g/L，氯化钴 0. 002-0. 006g/L,硫酸铜0.0025-0. 0075g/L，硫酸锌 0. 05-0. 15g/L，硫酸锰 0. 025-0. 05g/L。
4.根据权利要求I或2所述ー种利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产2，3-丁ニ醇的方法，其特征在于，所述混合菌液中含有体积百分比为26%的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)CICC 10011、体积百分比为 24的产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC21518、体积百分比为23%的多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)CICC 10010、体积百分比为27%的阴沟肠杆菌(Bacillus cloacae)CICC10014。
5.根据权利要求I或2所述ー种利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产2，3-丁ニ醇的方法，其特征在于，所述发酵液中纤维素酶的添加量为每克玉米芯残渣加入400U纤维素酶。
全文摘要
本发明公开了利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产2，3-丁二醇的方法，属于属于生物化工技术领域，提供了以使用玉米芯提取木糖后的残渣为原料进行同步糖化发酵生产2，3-丁二醇的方法以玉米芯残渣为碳源，尿素为氮源，利用肺炎克雷伯氏菌CICC 10011、产酸克雷伯氏菌CICC 21518、多粘类芽孢杆菌CICC 10010、阴沟肠杆菌CICC 10014及其混合菌液进行同步糖化发酵，2，3-丁二醇与乙偶姻达到玉米芯残渣干重的19.59％-36.13％。本发明以玉米芯残渣为碳源，有效降低了生产成本，实现资源的高值利用，具有巨大的经济效益和社会效益。
文档编号C12P7/18GK102643869SQ20121013493
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者张翠英, 彭晓培, 杜丽平, 肖冬光, 董健, 郭学武, 陈叶福 申请人:天津科技大学
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域，涉及ー种发酵生产2，3_ 丁ニ醇的方法。
背景技术：
2，3-丁ニ醇(2，3_butanediol，简称2，3_BD)广泛应用于化工、食品以及航空航天等众多领域。其热值为27200kJ/kg，与こ醇(29100kJ/kg)相近，可用作燃料，同时，还可用于制备聚合物、油墨、香水、防冻剂、香薰剂、增湿剂、炸药以及药物的手性载体等。随着石化资源的日益枯竭以及石化工业对环境的影响，可再生资源引来了越来越多的关注。由于石油价格的不断上涨及其不稳定性，利用可再生资源生产生物基大宗化学品如生物燃料等引起了人们极大的兴趣。利用可再生的生物质资源作为底物，将生物发酵和緑色化学エ业有机结合，可以建立起环境友好的、可持续发展的化学エ业。目前2，3- 丁ニ醇的生产方法有化学法和生物转化法。エ业上生产2，3- 丁ニ醇的化学法，主要是以石油裂解时产生的四碳类碳氢化合物在高温高压下水解得到，然而化学法生产2，3-丁ニ醇不仅成本高而且过程繁琐，因此エ业化生产较困难。生物发酵法合成2，3-丁ニ醇使用的生物质原料可再生，较化学法生产2，3-丁ニ醇エ艺更简单、更加环境友好，不仅可以避免化学法合成的困难，而且可以促进人类社会生产，由传统的石油炼制向以可再生资源为原料的生物炼制转型，逐渐减少对日益枯竭的石油资源的依赖。目前利用葡萄糖为底物占生物转化法生产2，3_ 丁ニ醇的大多数，但由于粮食危机的存在，利用丰富而且廉价的可再生资源木质纤维类物质为原料发酵生产2，3- 丁ニ醇成为必然趋势。木质纤维素原料，来源广泛，且再生迅速。玉米芯作为ー种木质纤维素原料，在我国有着极其广泛的资源。现阶段，我国大部分エ业生产的木糖是由玉米芯水解液提取得到，在木糖过程中产生了一种纤维素含量丰富的废弃物——玉米芯残渣。玉米芯残渣具有纤维素含量高，结构疏松的特点，是ー种理想的木质纤维素原料。因此利用玉米芯残渣生产高值平台产物2，3_ 丁ニ醇，以草代粮，不仅解决了与人争粮的问题，同时实现了ー种エ业副产物的高值利用，顺应了环境友好和可持续发展的潮流。
发明内容
本发明的目的是以木糖エ业废弃物玉米芯残渣为主要原料，利用生物工程技术生产高值平台化合物2，3- 丁ニ醇，实现资源的综合利用。鉴于纤维素酶解过程当中存在的葡萄糖阻遏，エ业上对纤维素酶解液的浓缩存在能耗过大的问题，因此本发明选择同步糖化发酵方式，避免了纤维素酶解后的浓缩过程。本发明对利用玉米芯残渣进行同步糖化发酵的发酵条件进行了探索，并对各种添加因子进行了响应面优化，最終得到了ー种利用玉米芯提取木糖后残渣同步糖化发酵生产2，3-丁ニ醇的方法。 具体步骤如下
第一歩、将玉米芯残渣原材料烘干粉碎后，按照玉米芯残渣与NaOH溶液重量体积比I : 8-1 12混合，在60-80°C条件下预处理l_3h，后将残渣洗涤至中性，烘干粉碎后过40目筛备用。所述NaOH溶液浓度为
第二歩、将处理后的残渣加入发酵液中，残渣与发酵液的重量体积比为1:8-1: 15，然后在 115°C下灭菌 20min。发酵液组成如下尿素I. 4-2. 2g/L，乳酸 l_3g/L，柠檬酸钠 0. 1-lg/L，EDTA0. 002-0. 006g/L,磷酸氢ニ钾l_5g/L，磷酸ニ氢钾4-20g/L，硫酸镁0. 05-0. 5g/L，硫酸钙0. 03-0. 06g/L,硫酸亚铁
0.1-0. 15g/L,氯化钴 0. 002-0. 006g/L,硫酸铜 0. 0025-0. 0075g/L,硫酸锌 0. 05-0. 15g/L,硫酸锰 0. 025-0. 05g/L。第四步、接入2%-10%的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC21518、多粘类芽抱杆菌(Bacillus polymyxa)CICC10010、阴沟肠杆菌(Bacillus cloacae)CICC10014菌液中的ー种或上述菌种的混合菌液，同时向发酵液中加入纤维素酶，所述发酵液中纤维素酶的添加量为每克玉米芯残渣加入300U-500U纤维素酶。于35-42°C同步糖化发酵36_84h后2，3- 丁ニ醇的产量为玉米芯残渣干重的19.59% -36. 13% (2，3-丁ニ醇/玉米芯残渣干重，W/W)。所述第四步中优选接入2%-10%的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC21518、多粘类芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)CICC10010 和阴沟肠杆菌(Bacillus cloacae)CICC10014 的混合菌液。所述混合菌液中，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011优选体积百分比为25-30%，产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC21518优选体积百分比为20-30%，多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)CICC10010优选体积百分比为10_20%，阴沟肠杆菌(Bacillus cloacae) CICC10014 体积百分比为 25-35%。本发明所产生的技术效果本发明利用玉米芯生产木糖的废料——玉米芯残渣生产2，3_ 丁ニ醇，实现了ー种エ业废料的高值利用，即使原料利用不完全，废液中固液分离容易，剰余残渣可循环利用。本发明以草代粮、变废为宝，减小环境污染的同时降低了 2，3- 丁ニ醇的生产成本；而且利用优选的菌种采用科学筛选的添加比例进行发酵，从而使发酵エ艺效率更好，并实现更加良好的糖化发酵，使发酵产率有了较大提高。
具体实施例方式实施例I将玉米芯生产木糖エ业的废弃物玉米芯残渣粉碎后按固液比I : 8(纤维素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液当中，80°C条件下预处理3h，处理结束后将残渣洗涤至中性，烘干后粉碎，测得预处理后的残渣含纤维素88. 92%、木质素3. 35%。影响纤维素水解的木质素含量明显降低。将处理后及未处理的玉米芯残渣按照纤维素比发酵液I : 8(W/V)的比例加入至含有1.61g/L尿素的发酵液当中，装液量50mL/250mL，初始pH 5.0，灭菌后按每克玉米芯残洛400U的比例加入纤维素酶,接入10%肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC10011菌液，35°C，150r/min摇瓶发酵36h，发酵液中2，3- 丁ニ醇与こ偶姻浓度和分别为8. 525g/L (未处理)和28. 482g/L (处理)，经碱法预处理的玉米芯残渣较未处理残渣单位时间内产量提高3. 34倍。发酵液组成为尿素I. 6g/L，乳酸2g/L，柠檬酸钠0. 3g/L，EDTAO. 003g/L,磷酸氢ニ钾3g/L，磷酸ニ氢钾8g/L，硫酸镁0. 2g/L，硫酸钙0. 04g/L,硫酸亚铁0. lg/L，氯化钴
0.004g/L，硫酸铜 0. 0045g/L，硫酸锌 0. lg/L，硫酸锰 0. 04g/L。实施例2将玉米芯生产木糖エ业的废弃物玉米芯残渣粉碎后按固液比I : 10 (纤维素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液当中，80°C条件下预处理3h，处理结束后将残渣洗涤至中性，烘干后粉碎。将处理后的玉米芯残渣按固液比I : 10(纤维素原料干重发酵液，W V)加入至含有尿素I. 61g/L，乳酸2g/L，柠檬酸钠lg/L，EDTAO. 006g/L，磷酸氢ニ钾5g/L，磷酸ニ氢钾20g/L,硫酸镁0. 25g/L，硫酸钙0. 05g/L,硫酸亚铁0. 15g/L，氯化钴0. 005g/L,硫酸铜0. 0075g/L,硫酸锌0. 15g/L，硫酸锰0. 05g/L的发酵液中，装液量50mL/250mL，初始PH 5. 0，灭菌后按每克玉米芯残渣400U的比例加入纤维素酶，接入5 %肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC10011 菌液,35°C，150r/min 摇瓶发酵 36h,发酵液中 2, 3-丁ニ醇浓度为23. 484g/L，2，3-丁ニ醇与こ偶姻浓度和为25. 041g/L,占玉米芯残渣干重的25. 04%。实施例3将玉米芯生产木糖エ业的废弃物玉米芯残渣粉碎后按固液比I : 12 (纤维素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液当中，80°C条件下预处理3h，处理结束后将残渣洗涤至中性，烘干后粉碎。将处理后的玉米芯残渣按固液比I : 12(纤维素原料干重发酵液，W V)加入至含有尿素I. 61g/L，乳酸2g/L，柠檬酸钠lg/L，EDTAO. 006g/L，磷酸氢ニ钾5g/L，磷酸ニ氢钾20g/L,硫酸镁0. 25g/L，硫酸钙0. 05g/L,硫酸亚铁0. 15g/L，氯化钴0. 005g/L,硫酸铜0. 0075g/L,硫酸锌0. 15g/L，硫酸锰0. 05g/L的发酵液中，装液量50mL/250mL，初始PH 5. 0，灭菌后按每克玉米芯残渣400U的比例加入纤维素酶，接入5 %产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) CICC21913 菌液，35 °C，150r/min 摇瓶发酵 36h,发酵液中 2,3- 丁ニ醇浓度为17.618g/L，2，3-丁ニ醇与こ偶姻浓度和为18. 548g/L，占玉米芯残渣干重的22. 26%。实施例4将玉米芯生产木糖エ业的废弃物玉米芯残渣粉碎后按固液比I : 15 (纤维素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液当中，80°C条件下预处理3h，处理结束后将残渣洗涤至中性，烘干后粉碎。将处理后的玉米芯残渣按固液比I : 15 (纤维素原料干重发酵液，W V)加入至含有尿素L 61g/L，乳酸2g/L，柠檬酸钠lg/L，EDTAO. 006g/L,磷酸氢ニ钾5g/L，磷酸ニ氢钾20g/L，硫酸镁0. 25g/L，硫酸钙0. 05g/L，硫酸亚铁0. 15g/L，氯化钴0. 005g/L，硫酸铜
0.0075g/L，硫酸锌0. 15g/L，硫酸锰0. 05g/L的发酵液中，装液量50mL/250mL，初始pH 5. 0，灭菌后按每克玉米芯残渣400U的比例加入纤维素酶，接入5%多粘类芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa) CICC10010菌液，35 °C，150r/min摇瓶发酵48h，发酵液中2,3- 丁ニ醇浓度为、12. 238g/L，2，3-丁ニ醇与こ偶姻浓度和为13. 062g/L,占玉米芯残渣干重的19. 59%。实施例5将玉米芯生产木糖エ业的废弃物玉米芯残渣粉碎后按固液比I : 15(纤维素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液当中，80°C条件下预处理3h，处理结束后 将残渣洗涤至中性，烘干后粉碎。将处理后的玉米芯残渣按固液比I : 15(纤维素原料干重发酵液，W : V)加入至含有尿素I. 61g/L，乳酸2g/L，柠檬酸钠lg/L，EDTAO. 006g/L，磷酸氢ニ钾5g/L，磷酸ニ氢钾20g/L，硫酸镁0. 25g/L，硫酸钙0. 05g/L，硫酸亚铁0. 15g/L，氯化钴0. 005g/L，硫酸铜0. 0075g/L,硫酸锌0. 15g/L，硫酸锰0. 05g/L的发酵液中，装液量50mL/250mL，初始pH5.0，灭菌后按每克玉米芯残渣400U的比例加入纤维素酶，接入5%阴沟肠杆菌(Bacilluscloacae) CICC10014菌液，40°C，150r/min摇瓶发酵48h，发酵液中2，3- 丁ニ醇浓度为15. 295g/L，2，3-丁ニ醇与こ偶姻浓度和为16. 259g/L，占玉米芯残渣干重的24. 39%。实施例6将玉米芯生产木糖エ业的废弃物玉米芯残渣粉碎后按固液比I : 10 (纤维素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液当中，80°C条件下预处理3h，处理结束后将残渣洗涤至中性，烘干后粉碎。将处理后的玉米芯残渣按固液比I : 10(纤维素原料干重发酵液，W : V)加入至含有尿素I. 61g/L，乳酸2g/L，柠檬酸钠0. 5g/L，EDTAO. 004g/L,磷酸氢ニ钾lg/L，磷酸ニ氢钾4g/L，硫酸镁0. 25g/L，硫酸钙0. 034g/L,硫酸亚铁0. 136g/L，氯化钴0. 0044g/L，硫酸铜0. 005g/L，硫酸锌0. 096g/L，硫酸锰0. 0275g/L的发酵液中，于5L发酵罐中发酵，装液量3L，按每克玉米芯残渣400U的比例加入纤维素酶，接入2 %肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC10011 菌液,发酵过程中控制 pH5. 0,揽拌奖转速 400r/min,通气量I. 4Vvm0 38°C发酵84小时后，发酵液中2，3- 丁ニ醇浓度为31. 857g/L，2，3- 丁ニ醇与こ偶姻浓度和为33. 754g/L，占玉米芯残渣干重的33. 75%。实施例7将玉米芯生产木糖エ业的废弃物玉米芯残渣粉碎后按固液比I : 10 (纤维素原料干重NaOH溶液，W V)加入至I. 5% NaOH溶液当中，80°C条件下预处理3h，处理结束后将残渣洗涤至中性，烘干后粉碎。将处理后的玉米芯残渣按固液比I : 10 (纤维素原料干重发酵液，W V)加入至含有尿素I. 61g/L,乳酸2g/L，柠檬酸钠0. 5g/L，EDTAO. 004g/L,磷酸氢ニ钾lg/L，磷酸ニ氢钾4g/L，硫酸镁0. 25g/L，硫酸钙0. 034g/L，硫酸亚铁0. 136g/L，氯化钴0. 0044g/L，硫酸铜0. 005g/L，硫酸锌0. 096g/L，硫酸锰0. 0275g/L的发酵液中，于5L发酵罐中发酵，装液量3L，按每克玉米芯残渣400U的比例加入纤维素酶，接入6 %的混合菌液，所述混合菌液中含有体积百分比为26%的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC10011、体积百分比为24%的产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC21518、体积百分比为23%的多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)CICC10010、体积百分比为27%的阴沟肠杆菌(Bacilluscloacae) CICC10014。发酵过程中控制pH5. 0，搅拌桨转速400r/min，通气量I. 4vvm。42°C发酵72小时后，发酵液中2，3-丁ニ醇浓度为34. 879g/L，2，3-丁ニ醇与こ偶姻浓度和为36. 128g/L，占玉米芯残渣干重的36. 13%。
权利要求
1.ー种利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产2，3- 丁ニ醇的方法，包括如下步骤 第一歩、将含有纤维素玉米芯残渣原材料粉碎，烘干备用； 第二步、粉碎后玉米芯残渣与NaOH溶液按照重量体积比I : 8-1 12混合，在60-80°C条件下预处理l_3h，后将残渣洗涤至中性，烘干粉碎后过40目筛备用； 第三步、将烘干粉碎后残渣加入发酵液中，烘干粉碎后残渣与发酵液的重量体积比为1:8-1: 15，然后在 115°C下灭菌 20min ; 第四步、接入2%-10%的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC 10011、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC 21518、多粘类芽抱杆菌(Bacillus polymyxa)CICC 10010、阴沟肠杆菌(Bacillus cloacae)CICC10014菌液中的ー种或上述菌种的混合液，同时向发酵液中加入纤维素酶，所述发酵液中纤维素酶的添加量为每克玉米芯残渣加入300U-500U纤维素酶，于35-42°C同步糖化发酵36_84h。
2.根据权利要求I所述ー种利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产2，3_丁ニ醇的方法，其特征在于，所述第四步中接入2% -10%的混合菌液，所述混合菌液中肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) CICC 10011体积百分比为25-30 %，产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) CICC21518 体积百分比为 20-30 %,多粘类芽抱杆菌(Bacilluspolymyxa)CICC 10010 体积百分比为 10-20%,阴沟肠杆菌(Bacillus cloacae)CICC10014体积百分比为25-35%。
3.根据权利要求I所述ー种利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产2，3_丁ニ醇的方法，其特征在于，所述发酵液组成为尿素1.4-2. 2g/L，乳酸l_3g/L，柠檬酸钠0. I-Ig/L，EDTA0. 002-0. 006g/L,磷酸氢ニ钾ト5g/L，磷酸ニ氢钾 4_20g/L，硫酸镁 0. 05-0. 5g/L,硫酸钙 0. 03-0. 06g/L,硫酸亚铁 0. 1-0. 15g/L，氯化钴 0. 002-0. 006g/L,硫酸铜0.0025-0. 0075g/L，硫酸锌 0. 05-0. 15g/L，硫酸锰 0. 025-0. 05g/L。
4.根据权利要求I或2所述ー种利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产2，3-丁ニ醇的方法，其特征在于，所述混合菌液中含有体积百分比为26%的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)CICC 10011、体积百分比为 24的产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)CICC21518、体积百分比为23%的多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)CICC 10010、体积百分比为27%的阴沟肠杆菌(Bacillus cloacae)CICC10014。
5.根据权利要求I或2所述ー种利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产2，3-丁ニ醇的方法，其特征在于，所述发酵液中纤维素酶的添加量为每克玉米芯残渣加入400U纤维素酶。
全文摘要
本发明公开了利用玉米芯残渣同步糖化发酵生产2，3-丁二醇的方法，属于属于生物化工技术领域，提供了以使用玉米芯提取木糖后的残渣为原料进行同步糖化发酵生产2，3-丁二醇的方法以玉米芯残渣为碳源，尿素为氮源，利用肺炎克雷伯氏菌CICC 10011、产酸克雷伯氏菌CICC 21518、多粘类芽孢杆菌CICC 10010、阴沟肠杆菌CICC 10014及其混合菌液进行同步糖化发酵，2，3-丁二醇与乙偶姻达到玉米芯残渣干重的19.59％-36.13％。本发明以玉米芯残渣为碳源，有效降低了生产成本，实现资源的高值利用，具有巨大的经济效益和社会效益。
文档编号C12P7/18GK102643869SQ20121013493
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者张翠英, 彭晓培, 杜丽平, 肖冬光, 董健, 郭学武, 陈叶福 申请人:天津科技大学
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