一种高产γ-氨基丁酸的发酵乳杆菌及其应用的制作方法
专利名称：一种高产γ-氨基丁酸的发酵乳杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高产Y-氨基丁酸的天然菌株，特别一种高产Y-氨基丁酸的发酵乳杆菌。
背景技术：
y -氨基丁酸(Y -aminobutyric acid,简称GABA)，又称4-氨基丁酸、氨酪酸，是一种在自然界中广泛存在并具有重要的生理功能的非蛋白类氨基酸。在人体中GABA是中枢神经系统中三大抑制性神经递质之一，具有缓解焦虑、降低血压、安眠镇定等生理功效，因此在医疗保健方面应用广泛。
2009年9月27日，根据中华人民共和国卫生部第十二号令，以L-谷氨酸钠为原料经希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)发酵、加热杀菌、冷却、活性炭处理、过滤、加入调配辅料(淀粉)、喷雾干燥等步骤生产而成的GABA，可添加到饮料、可可制品、巧克力和巧克力制品、糖果、焙烤食品、膨化食品等中。饲料级及食品级GABA的成品要求纯度在20%以上，但因GABA高纯度提取在技术还不够成熟，纯化成本较高，因此，寻求高产GABA的乳酸菌在降低GABA的工业生产成本，在食品中的推广使用将具有非常重要的意义。目前，GABA的生产方法可分为化学合成法、植物富集法和微生物发酵法。化学合成法虽然纯度较高，但是反应需高温高压条件，能耗大，成本高，得率较低，并且在生产工艺中涉及到了有毒有害有机溶剂的使用，安全性差，是非天然的GABA，不能用作食品及饲料添加剂。生物法又包括植物富集和微生物发酵两种，植物富集法主要是从茶叶、稻米、米糠中对GABA进行富集提取，此法虽然取材广泛，但是生产周期长，得率也较低，一般为O. l-3mg/go而微生物发酵法生产GABA不受原料、环境和空间的限制，且条件温和，安全性好，设备要求相对简单，因此在三种方法中具有明显的优势。此外，乳酸菌被认为是安全的食品级生产菌株，乳酸菌以其生产GABA安全性佳，且产生的GABA不被降解的特点，在开发功能性食品具有巨大潜力。发酵法生产GABA主要是利用微生物自身的谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase, GAD, EC 4. I. I. 15),催化谷氨酸或谷氨酸钠发生脱羧反应生成Y-氨基丁酸。近年来，随着人们对食品安全重视，越来越多的研究开始聚焦于利用乳酸菌生产GABA上，目前，已筛选出多个属种的具有工业应用价值的GABA产生菌，如短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantanrum)、乳酸乳球菌(Lactoccus lactis)、乳酸链球菌(Sreptococcus lactis)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)等，但迄今为止尚未从自然界中发现具有工业化生产GABA潜力的发酵乳杆菌。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高产Y-氨基丁酸的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)MT133，于2011年11月I日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2011370，保藏地址为中国武汉大学。所述发酵乳杆菌CCTCC M 2011370，为Y -氨基丁酸高产菌，从无锡香肠中分离得到，为兼性厌氧型，在MRS固体培养基30 V有氧培养72h后，菌落扁平、中心有白色突起、边缘透明且不整齐，直径约l_3mm，革兰氏染色呈阳性，杆菌，大小可变，有时成对出现，经16SrDNA鉴定为发酵乳杆菌。本发明中的MRS培养基是l%(w/v，下同)蛋白胨，O. 5%酵母提取物，1%牛肉浸膏，2%葡萄糖，O. 3%无水乙酸钠，O. 2%柠檬酸三铵，O. 2%磷酸氢二钾，O. 01%无水硫酸镁，O. 025%一水硫酸锰，O. 1%吐温80，pH6. 8。本发明中的MRS固体培养基是在MRS培养基基础上添加I. 5-2. 0%琼脂。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种发酵生产Y-氨基丁酸的方法。将保藏于MRS琼脂平板的发酵乳杆菌，经于MRS液体培养基活化后，以1%_10%接 种量进行摇瓶或静态发酵培养，温度设定为30°C。本发明中的静态发酵培养基是1. 5%大豆蛋白胨，3%酵母提取物，3%葡萄糖，8% —水合谷氨酸钠，O. 3%无水乙酸钠，O. 2%柠檬酸三铵，O. 2%磷酸氢二钾，O. 01%无水硫酸镁，
O.025% 一水硫酸锰，O. 1%吐温80。本发明中的摇瓶发酵培养基是1%蛋白胨，O. 5%酵母提取物，1%牛肉浸膏，2%葡萄糖，5% 一水合谷氨酸钠，O. 3%无水乙酸钠，O. 2%柠檬酸三铵，O. 2%磷酸氢二钾，O. 01%无水硫酸镁，O. 025% 一水硫酸锰，O. 1%吐温80。本发明还提供了一种优化的发酵策略，菌种经MRS液体培养基二次活化后，以10%的接种量接种于上罐发酵培养基，初始装液量1.5L，转速60rpm，无空气通入，30°C发酵96h,于40h和70h分别补加IOOml 80%和150ml 60% 一水合谷氨酸钠，在发酵24h至96h每4h流加75%葡萄糖和由18%酵母提取物和9%大豆蛋白胨组成的有机氮源10-15ml ;培养基配方为1. 5%大豆蛋白胨，3%酵母提取物，3%葡萄糖，6. 6%—水合谷氨酸钠，O. 3%无水乙酸钠，O. 2%柠檬酸三铵，O. 2%磷酸氢二钾，O. 01%无水硫酸镁，O. 025%—水硫酸锰，O. 1%吐温80。本发明所提供了一种发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum CCTCC M 2011370，是一株从发酵香肠中分得到的天然菌株，经初步优化后，其Y-氨基丁酸的产量约为38g/1，在本人知识范围内，这是目前乳酸菌产Y-氨基丁酸非罐上发酵的最高产量。此外，在上罐发酵中采取流加葡萄糖和有机氮源的策略可使产量达到75g/l。该菌高产Y-氨基丁酸的能力、对培养基及培养条件良好的适应性以及其天然菌株的来源等特性，赋予它良好的工业应用前景。
具体实施例方式实例I高产Y -氨基丁酸的发酵乳杆菌的筛选方法将保藏于MRS琼脂平板的乳酸菌，经于MRS液体培养基二次活化后，接种于含有1%谷氨酸的发酵培养基中静置培养72h，取1-2 μ I发酵液，用纸层析法对Y-氨基丁酸产生菌进行初步筛选。本发明中用于纸层析的展层剂是V(正丁醇)V(冰醋酸)V(水)=4:2:1，及O. 4%茚三酮。以5%的Y-氨基丁酸和5%的谷氨酸溶液作为对照。层析时间为4-6h，层析结束后将滤纸烘干看发酵液是否在Y-氨基丁酸标样对应位点处显现紫红色斑点。根据初步筛选结果，在添加1%的谷氨酸的MRS培养基中发酵72h，使用HPLC测定Y-氨基丁酸的含量，进行复筛。在复筛中，L. fermentum CCTCC M 2011370显示出高产
Y-氨基丁酸的能力，在添加1%的谷氨酸的情况下，谷氨酸几乎完全转化，Y -氨基丁酸的产量可达6. 12g/l。HPLC测定Y-氨基丁酸的具体方法如下将发酵液混匀，以5% (w/v)的三氯乙酸水溶液稀释25倍，并于4°C沉淀2h以上，IOOOOg离心IOmin后，采用邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生化-HPLC法精确测定发酵液中GABA的含量。色谱条件如下流动相由流动相A与流动动相B按体积比92:8组成。其中，流动相A为醋酸钠3. 01g/L,四氢呋喃5mL/L，三乙胺200 μ L，ρΗ=7. 20 ;流动相B为醋酸钠3. 01g/L,乙腈与甲醇各含400mL/L，水200mL/L, pH=7. 20,柱温 40°C，流速为 I. OmT,/mi η ,;检测柱为 Hypersil ODS (5 μ m, 4. OmmX 250mm),
检测器为紫外检测器，检测波长为338nm。洗脱程序如下表所示
权利要求
1.一种高产 Y -氨基丁酸的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum) MT133,于 2011年11月I日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:M 2011370。
2.权利要求I所述的发酵乳杆菌应用于发酵生产Y-氨基丁酸的方法，其特征在于所述发酵乳杆菌经MRS液体培养基二次活化后，以10%的接种量接种于上罐发酵培养基，初始装液量I. 5L，转速60rpm，无空气通入，30°C发酵96h，于40h和70h分别补加IOOml 80%和150ml 60% 一水合谷氨酸钠，在发酵24h至96h每4h流加75%葡萄糖和由18%酵母提取物和9%大豆蛋白胨组成的有机氮源10-15ml ;发酵培养基配方为1. 5%大豆蛋白胨，3%酵母提取物，3%葡萄糖，6. 6% 一水合谷氨酸钠，O. 3%无水こ酸钠，O. 2%柠檬酸三铵，O. 2%磷酸氢ニ钾，O. 01%无水硫酸镁，O. 025% 一水硫酸锰，O. 1%吐温80。
3.权利要求I所述的发酵乳杆菌应用于静态发酵生产Y-氨基丁酸的方法，其特征在于将保藏于MRS琼脂平板的发酵乳杆菌，经于MRS液体培养基二次活化后，以10%的接种量接种于静态发酵培养基，30°C静态发酵96h，发酵液中Y -氨基丁酸的含量约为38g/l。静态发酵培养基配方为1. 5%大豆蛋白胨，3%酵母提取物，3%葡萄糖，8%—水合谷氨酸钠，O. 3%无水こ酸钠，O. 2%柠檬酸三铵，O. 2%磷酸氢ニ钾，O. 01%无水硫酸镁，O. 025% 一水硫酸锰，O.1% 吐温 80。
全文摘要
本发明所公开了一种发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum CCTCC NO:M2011370，是一株从发酵香肠中分得到的天然菌株，经初步优化后，其γ-氨基丁酸的产量约为38g/l，这是目前乳酸菌产γ-氨基丁酸非罐上发酵的最高产量。此外，在上罐发酵中采取流加葡萄糖和有机氮源的策略可使产量达到75g/l。该菌高产γ-氨基丁酸的能力、对培养基及培养条件良好的适应性以及其天然菌株的来源等特性，赋予它良好的工业应用前景。
文档编号C12N1/20GK102839135SQ20121013669
公开日2012年12月26日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者王小元, 赵安琪, 胡晓清, 潘露 申请人:江南大学
技术领域：
本发明涉及一种高产Y-氨基丁酸的天然菌株，特别一种高产Y-氨基丁酸的发酵乳杆菌。
背景技术：
y -氨基丁酸(Y -aminobutyric acid,简称GABA)，又称4-氨基丁酸、氨酪酸，是一种在自然界中广泛存在并具有重要的生理功能的非蛋白类氨基酸。在人体中GABA是中枢神经系统中三大抑制性神经递质之一，具有缓解焦虑、降低血压、安眠镇定等生理功效，因此在医疗保健方面应用广泛。
2009年9月27日，根据中华人民共和国卫生部第十二号令，以L-谷氨酸钠为原料经希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)发酵、加热杀菌、冷却、活性炭处理、过滤、加入调配辅料(淀粉)、喷雾干燥等步骤生产而成的GABA，可添加到饮料、可可制品、巧克力和巧克力制品、糖果、焙烤食品、膨化食品等中。饲料级及食品级GABA的成品要求纯度在20%以上，但因GABA高纯度提取在技术还不够成熟，纯化成本较高，因此，寻求高产GABA的乳酸菌在降低GABA的工业生产成本，在食品中的推广使用将具有非常重要的意义。目前，GABA的生产方法可分为化学合成法、植物富集法和微生物发酵法。化学合成法虽然纯度较高，但是反应需高温高压条件，能耗大，成本高，得率较低，并且在生产工艺中涉及到了有毒有害有机溶剂的使用，安全性差，是非天然的GABA，不能用作食品及饲料添加剂。生物法又包括植物富集和微生物发酵两种，植物富集法主要是从茶叶、稻米、米糠中对GABA进行富集提取，此法虽然取材广泛，但是生产周期长，得率也较低，一般为O. l-3mg/go而微生物发酵法生产GABA不受原料、环境和空间的限制，且条件温和，安全性好，设备要求相对简单，因此在三种方法中具有明显的优势。此外，乳酸菌被认为是安全的食品级生产菌株，乳酸菌以其生产GABA安全性佳，且产生的GABA不被降解的特点，在开发功能性食品具有巨大潜力。发酵法生产GABA主要是利用微生物自身的谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase, GAD, EC 4. I. I. 15),催化谷氨酸或谷氨酸钠发生脱羧反应生成Y-氨基丁酸。近年来，随着人们对食品安全重视，越来越多的研究开始聚焦于利用乳酸菌生产GABA上，目前，已筛选出多个属种的具有工业应用价值的GABA产生菌，如短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantanrum)、乳酸乳球菌(Lactoccus lactis)、乳酸链球菌(Sreptococcus lactis)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)等，但迄今为止尚未从自然界中发现具有工业化生产GABA潜力的发酵乳杆菌。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高产Y-氨基丁酸的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)MT133，于2011年11月I日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2011370，保藏地址为中国武汉大学。所述发酵乳杆菌CCTCC M 2011370，为Y -氨基丁酸高产菌，从无锡香肠中分离得到，为兼性厌氧型，在MRS固体培养基30 V有氧培养72h后，菌落扁平、中心有白色突起、边缘透明且不整齐，直径约l_3mm，革兰氏染色呈阳性，杆菌，大小可变，有时成对出现，经16SrDNA鉴定为发酵乳杆菌。本发明中的MRS培养基是l%(w/v，下同)蛋白胨，O. 5%酵母提取物，1%牛肉浸膏，2%葡萄糖，O. 3%无水乙酸钠，O. 2%柠檬酸三铵，O. 2%磷酸氢二钾，O. 01%无水硫酸镁，O. 025%一水硫酸锰，O. 1%吐温80，pH6. 8。本发明中的MRS固体培养基是在MRS培养基基础上添加I. 5-2. 0%琼脂。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种发酵生产Y-氨基丁酸的方法。将保藏于MRS琼脂平板的发酵乳杆菌，经于MRS液体培养基活化后，以1%_10%接 种量进行摇瓶或静态发酵培养，温度设定为30°C。本发明中的静态发酵培养基是1. 5%大豆蛋白胨，3%酵母提取物，3%葡萄糖，8% —水合谷氨酸钠，O. 3%无水乙酸钠，O. 2%柠檬酸三铵，O. 2%磷酸氢二钾，O. 01%无水硫酸镁，
O.025% 一水硫酸锰，O. 1%吐温80。本发明中的摇瓶发酵培养基是1%蛋白胨，O. 5%酵母提取物，1%牛肉浸膏，2%葡萄糖，5% 一水合谷氨酸钠，O. 3%无水乙酸钠，O. 2%柠檬酸三铵，O. 2%磷酸氢二钾，O. 01%无水硫酸镁，O. 025% 一水硫酸锰，O. 1%吐温80。本发明还提供了一种优化的发酵策略，菌种经MRS液体培养基二次活化后，以10%的接种量接种于上罐发酵培养基，初始装液量1.5L，转速60rpm，无空气通入，30°C发酵96h,于40h和70h分别补加IOOml 80%和150ml 60% 一水合谷氨酸钠，在发酵24h至96h每4h流加75%葡萄糖和由18%酵母提取物和9%大豆蛋白胨组成的有机氮源10-15ml ;培养基配方为1. 5%大豆蛋白胨，3%酵母提取物，3%葡萄糖，6. 6%—水合谷氨酸钠，O. 3%无水乙酸钠，O. 2%柠檬酸三铵，O. 2%磷酸氢二钾，O. 01%无水硫酸镁，O. 025%—水硫酸锰，O. 1%吐温80。本发明所提供了一种发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum CCTCC M 2011370，是一株从发酵香肠中分得到的天然菌株，经初步优化后，其Y-氨基丁酸的产量约为38g/1，在本人知识范围内，这是目前乳酸菌产Y-氨基丁酸非罐上发酵的最高产量。此外，在上罐发酵中采取流加葡萄糖和有机氮源的策略可使产量达到75g/l。该菌高产Y-氨基丁酸的能力、对培养基及培养条件良好的适应性以及其天然菌株的来源等特性，赋予它良好的工业应用前景。
具体实施例方式实例I高产Y -氨基丁酸的发酵乳杆菌的筛选方法将保藏于MRS琼脂平板的乳酸菌，经于MRS液体培养基二次活化后，接种于含有1%谷氨酸的发酵培养基中静置培养72h，取1-2 μ I发酵液，用纸层析法对Y-氨基丁酸产生菌进行初步筛选。本发明中用于纸层析的展层剂是V(正丁醇)V(冰醋酸)V(水)=4:2:1，及O. 4%茚三酮。以5%的Y-氨基丁酸和5%的谷氨酸溶液作为对照。层析时间为4-6h，层析结束后将滤纸烘干看发酵液是否在Y-氨基丁酸标样对应位点处显现紫红色斑点。根据初步筛选结果，在添加1%的谷氨酸的MRS培养基中发酵72h，使用HPLC测定Y-氨基丁酸的含量，进行复筛。在复筛中，L. fermentum CCTCC M 2011370显示出高产
Y-氨基丁酸的能力，在添加1%的谷氨酸的情况下，谷氨酸几乎完全转化，Y -氨基丁酸的产量可达6. 12g/l。HPLC测定Y-氨基丁酸的具体方法如下将发酵液混匀，以5% (w/v)的三氯乙酸水溶液稀释25倍，并于4°C沉淀2h以上，IOOOOg离心IOmin后，采用邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生化-HPLC法精确测定发酵液中GABA的含量。色谱条件如下流动相由流动相A与流动动相B按体积比92:8组成。其中，流动相A为醋酸钠3. 01g/L,四氢呋喃5mL/L，三乙胺200 μ L，ρΗ=7. 20 ;流动相B为醋酸钠3. 01g/L,乙腈与甲醇各含400mL/L，水200mL/L, pH=7. 20,柱温 40°C，流速为 I. OmT,/mi η ,;检测柱为 Hypersil ODS (5 μ m, 4. OmmX 250mm),
检测器为紫外检测器，检测波长为338nm。洗脱程序如下表所示
权利要求
1.一种高产 Y -氨基丁酸的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum) MT133,于 2011年11月I日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:M 2011370。
2.权利要求I所述的发酵乳杆菌应用于发酵生产Y-氨基丁酸的方法，其特征在于所述发酵乳杆菌经MRS液体培养基二次活化后，以10%的接种量接种于上罐发酵培养基，初始装液量I. 5L，转速60rpm，无空气通入，30°C发酵96h，于40h和70h分别补加IOOml 80%和150ml 60% 一水合谷氨酸钠，在发酵24h至96h每4h流加75%葡萄糖和由18%酵母提取物和9%大豆蛋白胨组成的有机氮源10-15ml ;发酵培养基配方为1. 5%大豆蛋白胨，3%酵母提取物，3%葡萄糖，6. 6% 一水合谷氨酸钠，O. 3%无水こ酸钠，O. 2%柠檬酸三铵，O. 2%磷酸氢ニ钾，O. 01%无水硫酸镁，O. 025% 一水硫酸锰，O. 1%吐温80。
3.权利要求I所述的发酵乳杆菌应用于静态发酵生产Y-氨基丁酸的方法，其特征在于将保藏于MRS琼脂平板的发酵乳杆菌，经于MRS液体培养基二次活化后，以10%的接种量接种于静态发酵培养基，30°C静态发酵96h，发酵液中Y -氨基丁酸的含量约为38g/l。静态发酵培养基配方为1. 5%大豆蛋白胨，3%酵母提取物，3%葡萄糖，8%—水合谷氨酸钠，O. 3%无水こ酸钠，O. 2%柠檬酸三铵，O. 2%磷酸氢ニ钾，O. 01%无水硫酸镁，O. 025% 一水硫酸锰，O.1% 吐温 80。
全文摘要
本发明所公开了一种发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum CCTCC NO:M2011370，是一株从发酵香肠中分得到的天然菌株，经初步优化后，其γ-氨基丁酸的产量约为38g/l，这是目前乳酸菌产γ-氨基丁酸非罐上发酵的最高产量。此外，在上罐发酵中采取流加葡萄糖和有机氮源的策略可使产量达到75g/l。该菌高产γ-氨基丁酸的能力、对培养基及培养条件良好的适应性以及其天然菌株的来源等特性，赋予它良好的工业应用前景。
文档编号C12N1/20GK102839135SQ20121013669
公开日2012年12月26日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者王小元, 赵安琪, 胡晓清, 潘露 申请人:江南大学
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