培养基及其应用以及赖氨酸发酵菌株筛选和发酵方法
专利名称：培养基及其应用以及赖氨酸发酵菌株筛选和发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种特别适用于赖氨酸发酵的培养基及其在筛选赖氨酸发酵菌株中的应用，以及一种利用该培养基筛选赖氨酸发酵菌株的方法与赖氨酸发酵的方法。
背景技术：
目前，在赖氨酸发酵过程中，由于硫酸铵等营养物质的消耗，发酵液的pH值会不断下降，因此需要不断地往发酵液中添加氨水或液氨来控制pH。但是人工添加氨水或液氨控制PH耗费大量的劳力，且人为因素对发酵的影响大，进一步还会在一定程度上影响菌株筛选的结果。另外，高通量筛选仪器一般不能进行补料，也就不可以通过在发酵过程中添加氨水或液氨来控制pH，这就限制了赖氨酸试验中自动化仪器的使用，影响整个赖氨酸产业的自动化进程。因此，需要研发一种本身能够自动控制pH的培养基，以减少人为因素对发酵及菌株筛选造成的影响并促进高通量筛选仪器在赖氨酸发酵中的应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种适用于赖氨酸发酵的培养基及其在菌株筛选和赖氨酸发酵中的应用。为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种培养基，该培养基含有碳源、氮源、无机盐和水，其特征在于，该培养基还含有缓冲对，所述缓冲对在培养基中的浓度为O. 05-1. 5mol/L，所述缓冲对为含磷酸盐的缓冲对，所述培养基的pH为6. 8-7. 4。—方面，本发明提供一种上述培养基在筛选赖氨酸发酵菌株中的应用。另一方面，本发明提供一种筛选赖氨酸发酵菌株的方法，该方法包括在发酵制赖氨酸的条件下，将多株赖氨酸发酵菌株各自接种到赖氨酸发酵培养基中进行发酵，并测定发酵所得产物中赖氨酸的含量，选择产赖氨酸量高的菌株，其特征在于，所述赖氨酸发酵培养基为上述培养基。再一方面，本发明提供一种赖氨酸发酵的方法，该方法包括筛选赖氨酸发酵菌株，并在发酵制赖氨酸的条件下，将筛选得到的赖氨酸菌株接种到发酵培养基中进行发酵，其特征在于，筛选赖氨酸发酵菌株的方法为上述筛选赖氨酸发酵菌株的方法。在本发明的赖氨酸发酵中，培养基中的缓冲对不仅不能对赖氨酸的产量产生负面影响，还要能够很好地控制发酵过程中发酵液的pH维持在6. 8-7. 4，经过大量的试验后，本发明的发明人发现，含磷酸盐的缓冲对能够同时满足上述条件。使用添加了缓冲对的培养基使得赖氨酸发酵过程中发酵液的pH维持在一个较狭窄的范围内，从而实现了自动控制发酵过程中发酵液PH的目的。且本发明的发酵方法方便快捷，降低了操作人员的劳动强度，减少了人为因素对发酵的影响，增强了发酵的稳定性，使得菌株筛选的结果更可靠。并还为高通量筛选等自动化设备在赖氨酸发酵中的应用打下了基础。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式
部分予以详细说明。
具体实施例方式以下对本发明的具体实施方式
进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式
仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。本发明中，在未做相反说明的情况下，“磷酸氢盐”表示含有磷酸一氢根离子的盐；“磷酸二氢盐”表示含有磷酸二氢根离子的盐；“发酵液”是指接种了微生物菌种的液体发酵培养基，经过一段时间的培养后所得产物。本发明提供一种培养基，该培养基含有碳源、氮源、无机盐和水，其特征在于，该培养基还含有缓冲对，所述缓冲对在培养基中的浓度为O. 05-1. 5mol/L，优选为O. 4-0. 8mol/L，所述缓冲对为含磷酸盐的缓冲对，所述培养基的pH为6. 8-7. 4。当所述缓冲对在培养基中的浓度维持在上述优选的范围内时，能够更稳定地控制发酵过程中发酵液的pH。 根据本发明，所述含磷酸盐的缓冲对优选为磷酸氢盐-有机酸缓冲对、磷酸氢盐-磷酸二氢盐缓冲对和磷酸二氢盐-氢氧化物缓冲对中的一对或多对。优选地，所述有机酸为pKl值在2-7范围内的3-5元有机羧酸。所述有机酸更优选为朽1檬酸。优选地，所述磷酸氢盐为磷酸氢二钠和/或磷酸氢二钾。优选地，所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钠和/或磷酸二氢钾。优选地，所述氢氧化物为氢氧化钠和/或氢氧化钾。根据本发明，所述缓冲对优选为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲对、磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲对、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲对、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲对、磷酸氢二钾-磷酸二氢钠缓冲对、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲对、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲对、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲对、磷酸二氢钾-氢氧化钾缓冲对和磷酸二氢钠-氢氧化钾缓冲对中的一对或多对。当选用上述优选的缓冲对时，赖氨酸发酵过程中发酵液的pH得到了更好的控制。根据本发明，只要往培养基中添加缓冲对即可实现本发明的目的，对培养基的其他成分(碳源、氮源和无机盐)无特殊要求，可以采用本领域常规使用的物质，例如，可以用淀粉质原料糖化清液、糖蜜、玉米浆、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、苏氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等配制本发明的培养基。根据本发明，每升培养基中各原料的用量可以在很大范围内改变，优选情况下，相对于每升培养基，淀粉质原料糖化清液的用量可以为40-60克，糖蜜的用量可以为30-50克，玉米浆(干重为20-50重量％)的用量可以为20-40克，硫酸铵的用量可以为20-40克，磷酸氢二钾的用量可以为O. 5-1. 5克，硫酸镁的用量可以为O. 4-0. 6克，苏氨酸的用量可以为O. 1-0. 3克，蛋氨酸的用量可以为O. 1-0. 3克,谷氨酸的用量可以为O. 2-0. 4 克。其中，所述淀粉质原料糖化清液既可以采用干法制糖工艺制备，也可以采用湿法制糖工艺制备。从工艺简单、设备投资少，生产成本较低的方面考虑，优选通过干法制糖工艺制备。干法制糖工艺是指淀粉质原料不经浸泡直接进行破碎和酶解。干法制糖工艺可以包括将淀粉质原料粉碎，将淀粉质原料粉碎后的产物调浆，并加入淀粉酶对淀粉进行第一次水解；对第一次水解产物进行固液分离，并在得到的液相组分中加入糖化酶进行第二次水解，得到淀粉质原料糖化清液。其中，所述调浆的方法为本领域技术人员所熟知，优选地，调浆的方法可以包括将淀粉质原料粉碎后的产物加入到水中混合均匀，水的加入量使得到的浆液的波美度可以为9-17波美度(波美度是表示溶液浓度的一种方法，是通过波美比重计检测溶液得到的度数)；所述淀粉质原料可以为本领域公知的各种可以用于酶解、发酵制备赖氨酸的含有淀粉的原料，例如，可以为选自玉米、薯类(如木薯)和小麦中的一种或几种。本发明中，所述淀粉质原料糖化清液中的葡萄糖含量为96-98重量％。上述培养基中，所述淀粉质原料糖化清液可以由葡萄糖代替，相对于每升种子培养基，葡萄糖的添加量为28-39. 5克；相对于每升培养基，葡萄糖的添加量为38-60克。
本发明还提供上述培养基在筛选赖氨酸发酵菌株中的应用。本发明还提供一种筛选赖氨酸发酵菌株的方法，该方法包括在发酵制赖氨酸的条件下，将多株赖氨酸发酵菌株各自接种到赖氨酸发酵培养基中进行发酵，并测定发酵所得产物中赖氨酸的含量，选择产赖氨酸量高的菌株，其特征在于，所述赖氨酸发酵培养基为上述培养基。本发明中，只要利用本发明的培养基进行筛选即可实现本发明的目的，其他步骤可以参照现有技术进行。例如，所述多株赖氨酸发酵菌株一般为至少10株赖氨酸发酵菌株，所述产赖氨酸量高的菌株为所述多株赖氨酸发酵菌株中产生赖氨酸的量最高的一株菌。本发明还提供一种赖氨酸发酵的方法，该方法包括筛选赖氨酸发酵菌株，并在发酵制赖氨酸的条件下，将筛选得到的赖氨酸菌株接种到发酵培养基中进行发酵，其特征在于，筛选赖氨酸发酵菌株的方法为上述筛选赖氨酸发酵菌株的方法。其中，所述发酵培养基可以选用本发明的培养基，也可以选用常规的赖氨酸发酵培养基。当利用发酵罐进行发酵时，由于发酵罐都带有PH自动控制系统，所述发酵培养基可以为不含磷酸盐缓冲对的赖氨酸发酵培养基即本领域常规使用的赖氨酸发酵培养基。本发明的发明人发现，在筛选赖氨酸发酵菌株的过程中，在其他条件相同的情况下，使用本发明提供的培养基筛选赖氨酸发酵菌株使得筛选结果更加可靠。究其原因，可能是因为利用缓冲对控制发酵过程中发酵液的PH，排除了人为因素对发酵过程的影响，使发酵液的PH更稳定，进而使得筛选过程中菌株的发酵水平更稳定。因此，本发明提供的筛选赖氨酸发酵菌株的方法或赖氨酸发酵的方法中，只要保证筛选菌株用的培养基为上述培养基即可实现本发明的目的，其他操作和条件均可参照现有技术进行。本发明所用菌株为本领域常用的赖氨酸发酵菌株，如谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、大肠杆菌等。菌种培养条件包括温度为34-37°C，时间为15-20h，通气量为O. 5-2vvm (vvm即立方米/ (立方米·分钟)，表示每分钟通气体积与发酵液体积的比值)；发酵的条件包括温度为30-38°C，时间为28-60h，通气量为O. 5_2vvm。本领域技术人员应该理解的是，赖氨酸发酵菌株在被接种至培养基中之前，采用常规方法将赖氨酸发酵菌株依次经过菌株活化和种子培养。种子培养的培养程度可以通过取样显微镜镜检、OD (optical density)值测定对产赖氨酸微生物的生长进行观察，当通过上述方法观察菌体形态正常、测定OD值达到O. 08以上时停止培养，将此时的种子液称为成熟种子液。然后再将成熟种子液接入培养基中。因此，本发明中，赖氨酸发酵菌株的接种量为12-18体积％，指的是接入发酵培养基中的成熟种子液的体积占接入成熟种子液后发酵培养基体积的12-18%。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，成熟种子液的培养方法包括配制种子培养基(具体组成为相对于每升培养基，葡萄糖的用量为35克，玉米浆(干重为35重量％)的用量为80克，磷酸氢二钾的用量为I. O克，硫酸镁的用量为O. 5克，硫酸铵的用量为10克，苏氨酸的用量为O. 2克，蛋氨酸的用量为O. 2克)，121°C、102. 9kPa灭菌30分钟，将活化后的黄色短杆菌菌种(菌株原种FB42购自江南大学)接入冷却后的种子培养基中进行培养，培养过程中120分钟后，根据菌体生长情况每隔60分钟取样镜检并测定OD值，当镜检菌体形态正常且OD值达到O. 8时停止培养，得到成熟种子液。赖氨酸发酵培养基的配方为相对于每升发酵培养基，淀粉质原料糖化清液的用量为50克，糖蜜(产地新疆)的用量为40克，玉米浆(干重为35重量％)的用量为30克，硫酸铵的用量为30克,磷酸氢二钾的用量为I. O克,硫酸镁的用量为O. 5克,苏氨酸的用量为
O.2克，蛋氨酸的用量为O. 2克，谷氨酸的用量为O. 3克，调节pH值为6. 8。以下实施例中，所用缓冲对的配方及编号如表I所示，表I中，“添加量”表示相对于IL的培养基，缓冲对各成分加入的摩尔量，“pH”表示将缓冲对添加到培养基中后培养基的PH值；按照GB10794-89标准检测发酵液中的赖氨酸含量(以赖氨酸盐酸盐计);按照GB/T5009. 7-2008的方法测定发酵液中还原性糖的浓度；pH值的检测使用梅特勒DeLTA320pH计；转化率(％)=产酸量/耗糖量X100%，其中，产酸量等于发酵终点发酵液中的赖氨酸含量X发酵终点体积；耗糖量等于发酵培养基中还原性糖质量减去发酵终点发酵液中还原性糖质量；赖氨酸摇瓶发酵的稳定性通过计算发酵结束后三个发酵罐中发酵液中产酸量的标准差来判断，该标准差值越小，表明摇瓶发酵的稳定性越高，标准差的计算公式为
权利要求
1.一种培养基，该培养基含有碳源、氮源、无机盐和水，其特征在于，该培养基还含有缓冲对，所述缓冲对在培养基中的浓度为O. 05-1. 5mol/L，所述缓冲对为含磷酸盐的缓冲对，所述培养基的PH为6. 8-7. 4。
2.根据权利要求I所述的培养基，其中，所述缓冲对在培养基中的浓度为O.4-0. 8mol/L0
3.根据权利要求I所述的培养基，其中，所述含磷酸盐的缓冲对为磷酸氢盐-有机酸缓冲对、磷酸氢盐-磷酸二氢盐缓冲对和磷酸二氢盐-氢氧化物缓冲对中的一对或多对。
4.根据权利要求3所述的培养基，其中，所述有机酸为pKl值在2-7范围内的3-5元有机羧酸。
5.根据权利要求3或4所述的培养基，其中，所述有机酸为柠檬酸；所述磷酸氢盐为磷酸氢二钠和/或磷酸氢二钾；所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钠和/或磷酸二氢钾；所述氢氧化物为氢氧化钠和/或氢氧化钾。
6.根据权利要求1-5中的任意一项所述的培养基，其中，所述缓冲对为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲对、磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲对、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲对、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲对、磷酸氢二钾-磷酸二氢钠缓冲对、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲对、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲对、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲对、磷酸二氢钾-氢氧化钾缓冲对或磷酸二氢钠-氢氧化钾缓冲对中的一对或多对。
7.权利要求1-6中的任意一项所述的培养基在筛选赖氨酸发酵菌株中的应用。
8.一种筛选赖氨酸发酵菌株的方法，该方法包括在发酵制赖氨酸的条件下，将多株赖氨酸发酵菌株各自接种到赖氨酸发酵培养基中进行发酵，并测定发酵所得产物中赖氨酸的含量，选择产赖氨酸量高的菌株，其特征在于，所述赖氨酸发酵培养基为权利要求1-6中任意一项所述的培养基。
9.一种赖氨酸发酵的方法，该方法包括筛选赖氨酸发酵菌株，并在发酵制赖氨酸的条件下，将筛选得到的赖氨酸菌株接种到发酵培养基中进行发酵，其特征在于，筛选赖氨酸发酵菌株的方法为权利要求8所述的方法。
全文摘要
本发明公开了一种培养基及其应用以及赖氨酸发酵菌株筛选和发酵方法，本发明的培养基含有碳源、氮源、无机盐和水，其特征在于，该培养基还含有缓冲对，所述缓冲对在培养基中的浓度为0.05-1.5mol/L，所述缓冲对为含磷酸盐的缓冲对，所述培养基的pH为6.8-7.4。使用添加了缓冲对的培养基使得赖氨酸发酵过程中发酵液的pH维持在一个较狭窄的范围内，从而实现了自动控制发酵过程中发酵液pH的目的。且本发明的发酵方法方便快捷，降低了操作人员的劳动强度，减少了人为因素对发酵的影响，增强了发酵的稳定性，使得菌株筛选的结果更加可靠。并还为高通量筛选等自动化设备在赖氨酸发酵中的应用打下了基础。
文档编号C12P13/08GK102703536SQ20121013697
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者亓振国, 卢宗梅, 吴晓艳, 熊结青, 钟华 申请人:中粮生物化学(安徽)股份有限公司
技术领域：
本发明涉及一种特别适用于赖氨酸发酵的培养基及其在筛选赖氨酸发酵菌株中的应用，以及一种利用该培养基筛选赖氨酸发酵菌株的方法与赖氨酸发酵的方法。
背景技术：
目前，在赖氨酸发酵过程中，由于硫酸铵等营养物质的消耗，发酵液的pH值会不断下降，因此需要不断地往发酵液中添加氨水或液氨来控制pH。但是人工添加氨水或液氨控制PH耗费大量的劳力，且人为因素对发酵的影响大，进一步还会在一定程度上影响菌株筛选的结果。另外，高通量筛选仪器一般不能进行补料，也就不可以通过在发酵过程中添加氨水或液氨来控制pH，这就限制了赖氨酸试验中自动化仪器的使用，影响整个赖氨酸产业的自动化进程。因此，需要研发一种本身能够自动控制pH的培养基，以减少人为因素对发酵及菌株筛选造成的影响并促进高通量筛选仪器在赖氨酸发酵中的应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种适用于赖氨酸发酵的培养基及其在菌株筛选和赖氨酸发酵中的应用。为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种培养基，该培养基含有碳源、氮源、无机盐和水，其特征在于，该培养基还含有缓冲对，所述缓冲对在培养基中的浓度为O. 05-1. 5mol/L，所述缓冲对为含磷酸盐的缓冲对，所述培养基的pH为6. 8-7. 4。—方面，本发明提供一种上述培养基在筛选赖氨酸发酵菌株中的应用。另一方面，本发明提供一种筛选赖氨酸发酵菌株的方法，该方法包括在发酵制赖氨酸的条件下，将多株赖氨酸发酵菌株各自接种到赖氨酸发酵培养基中进行发酵，并测定发酵所得产物中赖氨酸的含量，选择产赖氨酸量高的菌株，其特征在于，所述赖氨酸发酵培养基为上述培养基。再一方面，本发明提供一种赖氨酸发酵的方法，该方法包括筛选赖氨酸发酵菌株，并在发酵制赖氨酸的条件下，将筛选得到的赖氨酸菌株接种到发酵培养基中进行发酵，其特征在于，筛选赖氨酸发酵菌株的方法为上述筛选赖氨酸发酵菌株的方法。在本发明的赖氨酸发酵中，培养基中的缓冲对不仅不能对赖氨酸的产量产生负面影响，还要能够很好地控制发酵过程中发酵液的pH维持在6. 8-7. 4，经过大量的试验后，本发明的发明人发现，含磷酸盐的缓冲对能够同时满足上述条件。使用添加了缓冲对的培养基使得赖氨酸发酵过程中发酵液的pH维持在一个较狭窄的范围内，从而实现了自动控制发酵过程中发酵液PH的目的。且本发明的发酵方法方便快捷，降低了操作人员的劳动强度，减少了人为因素对发酵的影响，增强了发酵的稳定性，使得菌株筛选的结果更可靠。并还为高通量筛选等自动化设备在赖氨酸发酵中的应用打下了基础。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式
部分予以详细说明。
具体实施例方式以下对本发明的具体实施方式
进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式
仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。本发明中，在未做相反说明的情况下，“磷酸氢盐”表示含有磷酸一氢根离子的盐；“磷酸二氢盐”表示含有磷酸二氢根离子的盐；“发酵液”是指接种了微生物菌种的液体发酵培养基，经过一段时间的培养后所得产物。本发明提供一种培养基，该培养基含有碳源、氮源、无机盐和水，其特征在于，该培养基还含有缓冲对，所述缓冲对在培养基中的浓度为O. 05-1. 5mol/L，优选为O. 4-0. 8mol/L，所述缓冲对为含磷酸盐的缓冲对，所述培养基的pH为6. 8-7. 4。当所述缓冲对在培养基中的浓度维持在上述优选的范围内时，能够更稳定地控制发酵过程中发酵液的pH。 根据本发明，所述含磷酸盐的缓冲对优选为磷酸氢盐-有机酸缓冲对、磷酸氢盐-磷酸二氢盐缓冲对和磷酸二氢盐-氢氧化物缓冲对中的一对或多对。优选地，所述有机酸为pKl值在2-7范围内的3-5元有机羧酸。所述有机酸更优选为朽1檬酸。优选地，所述磷酸氢盐为磷酸氢二钠和/或磷酸氢二钾。优选地，所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钠和/或磷酸二氢钾。优选地，所述氢氧化物为氢氧化钠和/或氢氧化钾。根据本发明，所述缓冲对优选为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲对、磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲对、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲对、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲对、磷酸氢二钾-磷酸二氢钠缓冲对、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲对、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲对、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲对、磷酸二氢钾-氢氧化钾缓冲对和磷酸二氢钠-氢氧化钾缓冲对中的一对或多对。当选用上述优选的缓冲对时，赖氨酸发酵过程中发酵液的pH得到了更好的控制。根据本发明，只要往培养基中添加缓冲对即可实现本发明的目的，对培养基的其他成分(碳源、氮源和无机盐)无特殊要求，可以采用本领域常规使用的物质，例如，可以用淀粉质原料糖化清液、糖蜜、玉米浆、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、苏氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等配制本发明的培养基。根据本发明，每升培养基中各原料的用量可以在很大范围内改变，优选情况下，相对于每升培养基，淀粉质原料糖化清液的用量可以为40-60克，糖蜜的用量可以为30-50克，玉米浆(干重为20-50重量％)的用量可以为20-40克，硫酸铵的用量可以为20-40克，磷酸氢二钾的用量可以为O. 5-1. 5克，硫酸镁的用量可以为O. 4-0. 6克，苏氨酸的用量可以为O. 1-0. 3克，蛋氨酸的用量可以为O. 1-0. 3克,谷氨酸的用量可以为O. 2-0. 4 克。其中，所述淀粉质原料糖化清液既可以采用干法制糖工艺制备，也可以采用湿法制糖工艺制备。从工艺简单、设备投资少，生产成本较低的方面考虑，优选通过干法制糖工艺制备。干法制糖工艺是指淀粉质原料不经浸泡直接进行破碎和酶解。干法制糖工艺可以包括将淀粉质原料粉碎，将淀粉质原料粉碎后的产物调浆，并加入淀粉酶对淀粉进行第一次水解；对第一次水解产物进行固液分离，并在得到的液相组分中加入糖化酶进行第二次水解，得到淀粉质原料糖化清液。其中，所述调浆的方法为本领域技术人员所熟知，优选地，调浆的方法可以包括将淀粉质原料粉碎后的产物加入到水中混合均匀，水的加入量使得到的浆液的波美度可以为9-17波美度(波美度是表示溶液浓度的一种方法，是通过波美比重计检测溶液得到的度数)；所述淀粉质原料可以为本领域公知的各种可以用于酶解、发酵制备赖氨酸的含有淀粉的原料，例如，可以为选自玉米、薯类(如木薯)和小麦中的一种或几种。本发明中，所述淀粉质原料糖化清液中的葡萄糖含量为96-98重量％。上述培养基中，所述淀粉质原料糖化清液可以由葡萄糖代替，相对于每升种子培养基，葡萄糖的添加量为28-39. 5克；相对于每升培养基，葡萄糖的添加量为38-60克。
本发明还提供上述培养基在筛选赖氨酸发酵菌株中的应用。本发明还提供一种筛选赖氨酸发酵菌株的方法，该方法包括在发酵制赖氨酸的条件下，将多株赖氨酸发酵菌株各自接种到赖氨酸发酵培养基中进行发酵，并测定发酵所得产物中赖氨酸的含量，选择产赖氨酸量高的菌株，其特征在于，所述赖氨酸发酵培养基为上述培养基。本发明中，只要利用本发明的培养基进行筛选即可实现本发明的目的，其他步骤可以参照现有技术进行。例如，所述多株赖氨酸发酵菌株一般为至少10株赖氨酸发酵菌株，所述产赖氨酸量高的菌株为所述多株赖氨酸发酵菌株中产生赖氨酸的量最高的一株菌。本发明还提供一种赖氨酸发酵的方法，该方法包括筛选赖氨酸发酵菌株，并在发酵制赖氨酸的条件下，将筛选得到的赖氨酸菌株接种到发酵培养基中进行发酵，其特征在于，筛选赖氨酸发酵菌株的方法为上述筛选赖氨酸发酵菌株的方法。其中，所述发酵培养基可以选用本发明的培养基，也可以选用常规的赖氨酸发酵培养基。当利用发酵罐进行发酵时，由于发酵罐都带有PH自动控制系统，所述发酵培养基可以为不含磷酸盐缓冲对的赖氨酸发酵培养基即本领域常规使用的赖氨酸发酵培养基。本发明的发明人发现，在筛选赖氨酸发酵菌株的过程中，在其他条件相同的情况下，使用本发明提供的培养基筛选赖氨酸发酵菌株使得筛选结果更加可靠。究其原因，可能是因为利用缓冲对控制发酵过程中发酵液的PH，排除了人为因素对发酵过程的影响，使发酵液的PH更稳定，进而使得筛选过程中菌株的发酵水平更稳定。因此，本发明提供的筛选赖氨酸发酵菌株的方法或赖氨酸发酵的方法中，只要保证筛选菌株用的培养基为上述培养基即可实现本发明的目的，其他操作和条件均可参照现有技术进行。本发明所用菌株为本领域常用的赖氨酸发酵菌株，如谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、大肠杆菌等。菌种培养条件包括温度为34-37°C，时间为15-20h，通气量为O. 5-2vvm (vvm即立方米/ (立方米·分钟)，表示每分钟通气体积与发酵液体积的比值)；发酵的条件包括温度为30-38°C，时间为28-60h，通气量为O. 5_2vvm。本领域技术人员应该理解的是，赖氨酸发酵菌株在被接种至培养基中之前，采用常规方法将赖氨酸发酵菌株依次经过菌株活化和种子培养。种子培养的培养程度可以通过取样显微镜镜检、OD (optical density)值测定对产赖氨酸微生物的生长进行观察，当通过上述方法观察菌体形态正常、测定OD值达到O. 08以上时停止培养，将此时的种子液称为成熟种子液。然后再将成熟种子液接入培养基中。因此，本发明中，赖氨酸发酵菌株的接种量为12-18体积％，指的是接入发酵培养基中的成熟种子液的体积占接入成熟种子液后发酵培养基体积的12-18%。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，成熟种子液的培养方法包括配制种子培养基(具体组成为相对于每升培养基，葡萄糖的用量为35克，玉米浆(干重为35重量％)的用量为80克，磷酸氢二钾的用量为I. O克，硫酸镁的用量为O. 5克，硫酸铵的用量为10克，苏氨酸的用量为O. 2克，蛋氨酸的用量为O. 2克)，121°C、102. 9kPa灭菌30分钟，将活化后的黄色短杆菌菌种(菌株原种FB42购自江南大学)接入冷却后的种子培养基中进行培养，培养过程中120分钟后，根据菌体生长情况每隔60分钟取样镜检并测定OD值，当镜检菌体形态正常且OD值达到O. 8时停止培养，得到成熟种子液。赖氨酸发酵培养基的配方为相对于每升发酵培养基，淀粉质原料糖化清液的用量为50克，糖蜜(产地新疆)的用量为40克，玉米浆(干重为35重量％)的用量为30克，硫酸铵的用量为30克,磷酸氢二钾的用量为I. O克,硫酸镁的用量为O. 5克,苏氨酸的用量为
O.2克，蛋氨酸的用量为O. 2克，谷氨酸的用量为O. 3克，调节pH值为6. 8。以下实施例中，所用缓冲对的配方及编号如表I所示，表I中，“添加量”表示相对于IL的培养基，缓冲对各成分加入的摩尔量，“pH”表示将缓冲对添加到培养基中后培养基的PH值；按照GB10794-89标准检测发酵液中的赖氨酸含量(以赖氨酸盐酸盐计);按照GB/T5009. 7-2008的方法测定发酵液中还原性糖的浓度；pH值的检测使用梅特勒DeLTA320pH计；转化率(％)=产酸量/耗糖量X100%，其中，产酸量等于发酵终点发酵液中的赖氨酸含量X发酵终点体积；耗糖量等于发酵培养基中还原性糖质量减去发酵终点发酵液中还原性糖质量；赖氨酸摇瓶发酵的稳定性通过计算发酵结束后三个发酵罐中发酵液中产酸量的标准差来判断，该标准差值越小，表明摇瓶发酵的稳定性越高，标准差的计算公式为
权利要求
1.一种培养基，该培养基含有碳源、氮源、无机盐和水，其特征在于，该培养基还含有缓冲对，所述缓冲对在培养基中的浓度为O. 05-1. 5mol/L，所述缓冲对为含磷酸盐的缓冲对，所述培养基的PH为6. 8-7. 4。
2.根据权利要求I所述的培养基，其中，所述缓冲对在培养基中的浓度为O.4-0. 8mol/L0
3.根据权利要求I所述的培养基，其中，所述含磷酸盐的缓冲对为磷酸氢盐-有机酸缓冲对、磷酸氢盐-磷酸二氢盐缓冲对和磷酸二氢盐-氢氧化物缓冲对中的一对或多对。
4.根据权利要求3所述的培养基，其中，所述有机酸为pKl值在2-7范围内的3-5元有机羧酸。
5.根据权利要求3或4所述的培养基，其中，所述有机酸为柠檬酸；所述磷酸氢盐为磷酸氢二钠和/或磷酸氢二钾；所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钠和/或磷酸二氢钾；所述氢氧化物为氢氧化钠和/或氢氧化钾。
6.根据权利要求1-5中的任意一项所述的培养基，其中，所述缓冲对为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲对、磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲对、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲对、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲对、磷酸氢二钾-磷酸二氢钠缓冲对、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲对、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲对、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲对、磷酸二氢钾-氢氧化钾缓冲对或磷酸二氢钠-氢氧化钾缓冲对中的一对或多对。
7.权利要求1-6中的任意一项所述的培养基在筛选赖氨酸发酵菌株中的应用。
8.一种筛选赖氨酸发酵菌株的方法，该方法包括在发酵制赖氨酸的条件下，将多株赖氨酸发酵菌株各自接种到赖氨酸发酵培养基中进行发酵，并测定发酵所得产物中赖氨酸的含量，选择产赖氨酸量高的菌株，其特征在于，所述赖氨酸发酵培养基为权利要求1-6中任意一项所述的培养基。
9.一种赖氨酸发酵的方法，该方法包括筛选赖氨酸发酵菌株，并在发酵制赖氨酸的条件下，将筛选得到的赖氨酸菌株接种到发酵培养基中进行发酵，其特征在于，筛选赖氨酸发酵菌株的方法为权利要求8所述的方法。
全文摘要
本发明公开了一种培养基及其应用以及赖氨酸发酵菌株筛选和发酵方法，本发明的培养基含有碳源、氮源、无机盐和水，其特征在于，该培养基还含有缓冲对，所述缓冲对在培养基中的浓度为0.05-1.5mol/L，所述缓冲对为含磷酸盐的缓冲对，所述培养基的pH为6.8-7.4。使用添加了缓冲对的培养基使得赖氨酸发酵过程中发酵液的pH维持在一个较狭窄的范围内，从而实现了自动控制发酵过程中发酵液pH的目的。且本发明的发酵方法方便快捷，降低了操作人员的劳动强度，减少了人为因素对发酵的影响，增强了发酵的稳定性，使得菌株筛选的结果更加可靠。并还为高通量筛选等自动化设备在赖氨酸发酵中的应用打下了基础。
文档编号C12P13/08GK102703536SQ20121013697
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者亓振国, 卢宗梅, 吴晓艳, 熊结青, 钟华 申请人:中粮生物化学(安徽)股份有限公司
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