一种用于检测PDGFRα基因突变的引物、探针及试剂盒的制作方法
专利名称：一种用于检测PDGFRα基因突变的引物、探针及试剂盒的制作方法
技术领域：
血小板衍生生长因子受体(Platelet-derivedGrowth FactorReceptors, PDGFR)是一种调节细胞生长的跨膜蛋白，属于III型酪氨酸激酶家族，主要分布于平滑肌细胞，内皮组织细胞、成纤维细胞和胶质细胞。TOGFR由a和0两种亚型结构组成，分子量约为170-180kD，可以分为配体结合区，跨膜区、近膜区和酪氨酸激酶区四个结构功能区(Bauman et al. , Clin Cancer Res 2007，13; 4632)。PDGFR 在调节细胞增殖，分化和新血管形成等方面发挥重要调节作用。TOGFR通过与信号分子结合后形成受体配体复合物并活化TOGFR，进而激活磷脂酰肌醇及下游的RAS-MAPK和PIK3CA信号通路，通过各种信号转导通路将有丝分裂等信号传递入细胞核，诱导相应基因表达，进而调节肿瘤细胞的分裂和增殖(Kim et al.，J Biochem Mol Biol, 2003，3649-59)。Gleevec (格列卫)和Sutent (索坦)是针对TOGFR a靶点开发一类小分子肿瘤靶向药物，通过抑制TOGFR a激酶的磷酸化及其相关通路，从而阻断下游信号的传导，达到抑制肿瘤生长的目的。目前，Gleevec是胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor)和黑色素瘤(Melanoma)患者的一线治疗药物，然而，Gleevec治疗会易引起肿瘤化疗的耐药性。临床研究显示，PDGFR a的D842V突变是导致胃肠道间质瘤和黑色素瘤患者对Gleevec化疗原发耐药的主要原因(Heinrich, Corless et al. 2003J Clin Oncol. 21，4342-4349)。在含有TOGFRa D842V突变患者中，其Gleevec或Sutent化疗的客观有效率和缓解率显著低于I3DGFR a D842V非突变患者。因此，检测肿瘤患者的I3DGFR a基因D842V的突变情况可以有效用于Gleevec和Sutent化疗的预后。在实施化疗之前，通过高灵敏的方法对I3DGFRa基因突变检测对于延长肿瘤患者生存期，提高治疗效果和生存质量，避免过度化疗，指导临床科学用药有重要意义。目前检测I3DGFRa基因突变的检测方法主要为DNA直接测序法。然而，直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20-30% ;实验操作复杂，检测效率低、样品易污染、通常要1-2天才可出检测结果。特别是对于小样本的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量漏检及假阴性的发生。包括I3DGFR a基因在内的基因突变属体细胞稀有突变，具有稀少性、异质性、不稳定性的特点，而且临床检测样本多数为小样本检测。因此，直接测序等技术无法满足临床检测的实际需求，临床迫切需要开发一种高灵敏度，快速的TOGFR a基因突变检测技术，以实现采用高灵敏度检测方法对I3DGFRa基因驱动突变进行检测，从而为临床肿瘤的个体化治疗方案提供科学参考。本发明开发一种快速，高灵敏、操作简便的TOGFRa基因突变检测试剂盒及检测方法。该检测方法灵敏度高，检测时间只需90分钟即可完成，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测TOGGFRa基因突变的特异引物和探针，或 与其有同一性核苷酸序列，该检测试剂盒包含以下引物及探针序列
表I引物与探针核苷酸序列
权利要求
1.用于检测roGFRa基因突变的引物和探针，其特征在于，包括以下序列SEQ ID NOI-SEQ ID NO 7 DS42V-FI I CAAGCCGACAG i AGCCTAACG I CClCC rGGCACASEQ NO: I DH42V-P3 FAM-CTGGCCAGGCCAAAGTCACAG-BHQlSEQ N0:2 D842V-R2 GCAGTGACCTCCAGAGACAGTTCGAATCATGCATGATGASEQ NO: 3 Control E3-T-SI TCAAGCCGACAGTAGCCTAGAGACACGACAAGCTCACSEQ N0:4 E3-T-RI TCAAGCCGACAGTAGCCTAAACAAGGACACSEQ N0:5 r..l-P-n !「X-(T;ACTGrAGCTT AATAACCAACi-BHQlSP.Q N0:6 T2-primer TCAAGCCGACAGTAGCCTASEQ NO: I
2.用于检测PDGFRa基因突变的试剂盒，其特征在于，包括以下序列SEQID NO I-SEQID NO 7。
3.如权利要求2所述的检测TOGFRa基因突变的检测试剂盒，其特征在于包括如下的荧光PCR的反应体系 IXPCR缓冲液 模板4-8gL 各引物0. 1_1. 0 M mo I各探针0. 5-1. 0 pmol Taq _I. 0-2. 0 U dNTP0. 5-2. 0 mmol MgCL22. 0-9. 0 mmol 总体积10-60mL
4.如权利要求2所述的TOGFRa基因突变检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤 (1)提供权利要求I所述的7条引物和探针序列； (2)待测样品的处理和模板DNA的提取； (3)配制荧光PCR扩增反应体系； (4)用步骤(I)的引物和探针扩增待测基因突变靶序列； 检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值大于或等于29为阴性；Ct值小于29为阳性。
5.如权利要求4所述的一种TOGFRa基因突变检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)所述的待检测样品包括手术切除的新鲜病理组织，石蜡包埋病理组织，石蜡切片，血浆和血清。
6.一种用于检测I3DGFR a基因突变的引物及探针，其特征在于，包括与SEQ ID NO: I SEQ ID NO:7的寡核苷酸具有至少60%同一性核苷酸序列探针或引物。
7.一种用于检测I3DGFRa基因突变的引物及探针，其特征在于，包括与SEQ ID NO: I SEQ ID NO:7的寡核苷酸具有至少80%同一性核苷酸序列探针或引物。
8.一种用于检测I3DGFR a基因突变的引物及探针，其特征在于，包括与SEQ ID NO: I SEQ ID NO:7的寡核苷酸具有至少90%同一性核苷酸序列探针或引物。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测PDGFRα的引物、探针及试剂盒。本发明主要包括以下序列SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 7。本发明采用特异引物和探针技术，建立了用于检测PDGFRα基因突变的实时荧光PCR体系。该方法(1)灵敏度高，可检出5-10拷贝的突变DNA；(2)特异性强，10ng的野生型基因组DNA不会产生非特异性信号；(3)检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。本方法可检测胃肠道间质瘤和黑色素瘤等肿瘤组织中的PDGFRα基因突变。
文档编号C12Q1/68GK102719530SQ20121013871
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月7日 优先权日2012年5月7日
发明者周细武, 张海龙, 罗捷敏, 郑立谋, 阮力 申请人:厦门艾德生物医药科技有限公司
技术领域：
血小板衍生生长因子受体(Platelet-derivedGrowth FactorReceptors, PDGFR)是一种调节细胞生长的跨膜蛋白，属于III型酪氨酸激酶家族，主要分布于平滑肌细胞，内皮组织细胞、成纤维细胞和胶质细胞。TOGFR由a和0两种亚型结构组成，分子量约为170-180kD，可以分为配体结合区，跨膜区、近膜区和酪氨酸激酶区四个结构功能区(Bauman et al. , Clin Cancer Res 2007，13; 4632)。PDGFR 在调节细胞增殖，分化和新血管形成等方面发挥重要调节作用。TOGFR通过与信号分子结合后形成受体配体复合物并活化TOGFR，进而激活磷脂酰肌醇及下游的RAS-MAPK和PIK3CA信号通路，通过各种信号转导通路将有丝分裂等信号传递入细胞核，诱导相应基因表达，进而调节肿瘤细胞的分裂和增殖(Kim et al.，J Biochem Mol Biol, 2003，3649-59)。Gleevec (格列卫)和Sutent (索坦)是针对TOGFR a靶点开发一类小分子肿瘤靶向药物，通过抑制TOGFR a激酶的磷酸化及其相关通路，从而阻断下游信号的传导，达到抑制肿瘤生长的目的。目前，Gleevec是胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor)和黑色素瘤(Melanoma)患者的一线治疗药物，然而，Gleevec治疗会易引起肿瘤化疗的耐药性。临床研究显示，PDGFR a的D842V突变是导致胃肠道间质瘤和黑色素瘤患者对Gleevec化疗原发耐药的主要原因(Heinrich, Corless et al. 2003J Clin Oncol. 21，4342-4349)。在含有TOGFRa D842V突变患者中，其Gleevec或Sutent化疗的客观有效率和缓解率显著低于I3DGFR a D842V非突变患者。因此，检测肿瘤患者的I3DGFR a基因D842V的突变情况可以有效用于Gleevec和Sutent化疗的预后。在实施化疗之前，通过高灵敏的方法对I3DGFRa基因突变检测对于延长肿瘤患者生存期，提高治疗效果和生存质量，避免过度化疗，指导临床科学用药有重要意义。目前检测I3DGFRa基因突变的检测方法主要为DNA直接测序法。然而，直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20-30% ;实验操作复杂，检测效率低、样品易污染、通常要1-2天才可出检测结果。特别是对于小样本的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量漏检及假阴性的发生。包括I3DGFR a基因在内的基因突变属体细胞稀有突变，具有稀少性、异质性、不稳定性的特点，而且临床检测样本多数为小样本检测。因此，直接测序等技术无法满足临床检测的实际需求，临床迫切需要开发一种高灵敏度，快速的TOGFR a基因突变检测技术，以实现采用高灵敏度检测方法对I3DGFRa基因驱动突变进行检测，从而为临床肿瘤的个体化治疗方案提供科学参考。本发明开发一种快速，高灵敏、操作简便的TOGFRa基因突变检测试剂盒及检测方法。该检测方法灵敏度高，检测时间只需90分钟即可完成，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测TOGGFRa基因突变的特异引物和探针，或 与其有同一性核苷酸序列，该检测试剂盒包含以下引物及探针序列
表I引物与探针核苷酸序列
权利要求
1.用于检测roGFRa基因突变的引物和探针，其特征在于，包括以下序列SEQ ID NOI-SEQ ID NO 7 DS42V-FI I CAAGCCGACAG i AGCCTAACG I CClCC rGGCACASEQ NO: I DH42V-P3 FAM-CTGGCCAGGCCAAAGTCACAG-BHQlSEQ N0:2 D842V-R2 GCAGTGACCTCCAGAGACAGTTCGAATCATGCATGATGASEQ NO: 3 Control E3-T-SI TCAAGCCGACAGTAGCCTAGAGACACGACAAGCTCACSEQ N0:4 E3-T-RI TCAAGCCGACAGTAGCCTAAACAAGGACACSEQ N0:5 r..l-P-n !「X-(T;ACTGrAGCTT AATAACCAACi-BHQlSP.Q N0:6 T2-primer TCAAGCCGACAGTAGCCTASEQ NO: I
2.用于检测PDGFRa基因突变的试剂盒，其特征在于，包括以下序列SEQID NO I-SEQID NO 7。
3.如权利要求2所述的检测TOGFRa基因突变的检测试剂盒，其特征在于包括如下的荧光PCR的反应体系 IXPCR缓冲液 模板4-8gL 各引物0. 1_1. 0 M mo I各探针0. 5-1. 0 pmol Taq _I. 0-2. 0 U dNTP0. 5-2. 0 mmol MgCL22. 0-9. 0 mmol 总体积10-60mL
4.如权利要求2所述的TOGFRa基因突变检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤 (1)提供权利要求I所述的7条引物和探针序列； (2)待测样品的处理和模板DNA的提取； (3)配制荧光PCR扩增反应体系； (4)用步骤(I)的引物和探针扩增待测基因突变靶序列； 检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值大于或等于29为阴性；Ct值小于29为阳性。
5.如权利要求4所述的一种TOGFRa基因突变检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤(2)所述的待检测样品包括手术切除的新鲜病理组织，石蜡包埋病理组织，石蜡切片，血浆和血清。
6.一种用于检测I3DGFR a基因突变的引物及探针，其特征在于，包括与SEQ ID NO: I SEQ ID NO:7的寡核苷酸具有至少60%同一性核苷酸序列探针或引物。
7.一种用于检测I3DGFRa基因突变的引物及探针，其特征在于，包括与SEQ ID NO: I SEQ ID NO:7的寡核苷酸具有至少80%同一性核苷酸序列探针或引物。
8.一种用于检测I3DGFR a基因突变的引物及探针，其特征在于，包括与SEQ ID NO: I SEQ ID NO:7的寡核苷酸具有至少90%同一性核苷酸序列探针或引物。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测PDGFRα的引物、探针及试剂盒。本发明主要包括以下序列SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 7。本发明采用特异引物和探针技术，建立了用于检测PDGFRα基因突变的实时荧光PCR体系。该方法(1)灵敏度高，可检出5-10拷贝的突变DNA；(2)特异性强，10ng的野生型基因组DNA不会产生非特异性信号；(3)检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。本方法可检测胃肠道间质瘤和黑色素瘤等肿瘤组织中的PDGFRα基因突变。
文档编号C12Q1/68GK102719530SQ20121013871
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月7日 优先权日2012年5月7日
发明者周细武, 张海龙, 罗捷敏, 郑立谋, 阮力 申请人:厦门艾德生物医药科技有限公司
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