一种重组禽流感细胞源灭活疫苗抗原病毒含量的测定方法
专利名称：一种重组禽流感细胞源灭活疫苗抗原病毒含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及采用MDCK细胞(犬肾细胞)毒含量测定，联合红细胞凝集试验，对重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原病毒含量实施测定，降低主观判断误差，具有重要的应用价值。
背景技术：
由于现行的禽流感H5N1灭活疫苗主要是在鸡胚上进行培养，收获尿囊液，灭活后制备成成品疫苗，其抗原的病毒含量是用鸡胚半数感染量和血凝价进行检测，但用鸡胚分离流感病毒或传代易引起病毒变异，而且鸡胚残留物还可引起过敏性反应，鸡胚作为疫苗生产基质，还存在大规模生产时供给和潜在外源病毒污染问题，因此，细胞疫苗技术成为目前值得发展的新兴技术。而传统的细胞源疫苗仅用细胞病毒含量测定方法，但常常出现细胞阴性对照在判读时已有大量细胞圆缩，已起不到对照的作用，或者有些细胞病变不明显而观察不到等，出现主观错误。
文献检索披露中国农业科学院哈尔滨兽医研究所刘明等人进行了重组H5N3禽流感疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖条件研究，文章未涉及对禽流感鸡胚毒在MDCK细胞上的驯化。本发明构思是将病毒抗原接种在MDCK细胞进行病毒含量测定，为了防止观察细胞病变时出现主观错误，又引入红细胞凝集试验，100%红细胞凝集的孔即与细胞病变的孔相对应，100%红细胞凝集的孔数根据Reed-Muench法计算TCID5tl ;与传统的方法比较，该方法更为客观和准确，大大降低了主观判断的误差。
发明内容
本发明的目的在于提供的测定方法，即建立用MDCK细胞联合红细胞凝集试验对重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原病毒含量测定方法，使病毒含量测定更准确、更客观。本发明的目的是这样实现的一种重组禽流感细胞源灭活疫苗抗原病毒含量的测定方法，采用MDCK细胞测定重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗病毒抗原TCID5tl的方法，分步骤实施
其I MDCK细胞的制备
抽取密度为2. 0 X IO6的MDCK冻存细胞I. 5ml，置于37°C水浴中，晃动溶解2_3分钟，在1000rmp/min条件下,离心5分钟,弃去上清,加入10_15ml细胞培养液,转入75cm2培养瓶中，置于37°C、5%的CO2培养箱中，培养72小时，用浓度0. 25%的EDTA-胰酶消化液，再用细胞营养液稀释成4. 0 X IO5的MDCK细胞悬液，以40000个/孔的细胞密度，0. Iml/孔细胞悬液铺到96孔细胞板上，置于37°C、5%的CO2培养箱中培养，培养24小时，成致密单层备用；接种病毒抗原之前弃去细胞营养液，用PH7. 2的PBS溶液清洗两遍；
其2重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原的接种抽取不同批次的重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗，用细胞维持液；做10倍的梯度稀释，取10_3-10_7的滴度样，分别加入上述的致密单层中，每孔IOOul ;同时设对照每孔加细胞维持液；IOOul，放入37°C、5 %的CO2培养箱中，培养至第4天，计算TCID5tl值；
其3红细胞凝集，计算TCID5tl值 将病变后的96孔板按照原有顺序,每孔吸取培养液25-50ul,置于96孔V型血凝板中，然后每孔再加入25-50ull%红细胞悬液，在微量板振荡器上摇匀，其温度20 30°C，时间15 30分钟，其中100%红细胞凝集的孔与细胞病变的孔相对应，依据Reed-Muench法，获得 TCID50 值；
上述细胞营养液由13. 54gDMEM干粉培养基，用注射用水配制成1000ml，加入胎牛血清IOOml而成；
上述细胞维持液由13. 54gDMEM干粉培养基，用注射用水配制成1000ml，加入2mg/mlTPCK而成，其终浓度为2ug/mlTPCK ；
上述1%红细胞悬液取2-4只2-6月龄SPF鸡血液，与等量阿氏液混合，在1500r/min下离心10分钟，用0. 85%生理盐水离心洗涤3-4次，每次1500r/min，离心10分钟，将沉积的红细胞用0. 85%生理盐水制成1%悬液。所述的方法，选用的MDCK细胞购自美国ATCC即美国模式培养物集存库(Americantype culture collection) ；DMEM(高糖)干粉培养基为Hyclone公司生产，货号SH30003. 04. OlB ;胎牛血清为兰州百灵公司生产，货号SV20091116 ;EDTA_胰酶消化液为GIBCO生产，货号400660 ；TPCK为Sigma公司生产，货号T8802 ;其他试剂均为国产分析纯试剂由市场采购。本发明采用MDCK细胞(犬肾细胞)毒含量测定联合红细胞凝集试验对重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原病毒含量测定方法用MDCK细胞联合红细胞凝集试验对重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原病毒含量测定比单纯用细胞进行病毒含量测定方法更为客观和准确，大大降低了主观判断的误差，即使新手操作也同样基准可靠，彰显技术进步。
具体实施例方式下面将结合实施例对发明作进一步说明。检测流程复苏、培养MDCK细胞步骤；病毒液稀释、接种、红细胞凝集；计算TCID5tl步骤；
(I) MDCK细胞的制备
抽取密度为2. OX IO6的MDCK冻存细胞I. 5ml，置于37°C水浴中，晃动溶解3分钟，在1000rmp/min条件下，离心5分钟，弃去上清，加入15ml细胞培养液，转入75cm2培养瓶中，置于37°C、5%的CO2培养箱中，培养72小时后，用浓度0. 25%的EDTA-胰酶消化细胞，再用细胞营养液(10%胎牛血清+DMEM)稀释成4. OX IO5的MDCK细胞悬液，以40000个/孔(0. Iml/孔)的细胞密度铺到96孔细胞板上，置于37°C、5%的CO2培养箱中，培养24小时成致密单层备用；接种病毒抗原之前弃去细胞营养液(10%胎牛血清+DMEM)，用pH7. 2的PBS溶液清洗两遍。(2)重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原的接种
抽取不同批次(2010001批-2010010批)重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原，用细胞维持液(2ug/mlTPCK+DMEM溶液)作10倍的梯度稀释，取10_3_10_7的滴度样，分别加入上述准备好的细胞致密单层中，每孔lOOul，同时设对照，每孔加细胞维持液(2ug/mlTPCK+DMEM溶液)100ul，放入37°C、5%的CO2培养箱中，期间2次/天观察细胞病变，培养至第4天，以出现细胞病变的孔数，根据Reed-Muench法，计算TCID5tl值。(3)红细胞凝集，计算TCID5011
为了防止观察细胞病变时出现主观错误，就将观察病变后的96孔板按照原有顺序，每 孔吸取培养液50ul (吸液前要充分混匀)置于96孔V型血凝板中(包括阴性对照)，然后每孔再加入50ul的1%红细胞悬液，立即在微量板振荡器上摇匀，其温度为30°C，时间30分钟，将100%红细胞凝集的孔与细胞病变的孔相对应，以100%红细胞凝集的孔数，根据Reed-Muench 法，获得 TCID5tl 值。(4)依据Reed-Muench法，接种量为O. Iml ;计算病毒致死(感染)量，以TCID5tl为列，见表I.
权利要求
1.一种重组禽流感细胞源灭活疫苗抗原病毒含量的测定方法，其特征在于采用MDCK细胞测定重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗病毒抗原TCID5tl的方法，分步骤实施； 其I MDCK细胞的制备 抽取密度为2. OX IO6的MDCK冻存细胞I. 5ml，置于37°C水浴中，晃动溶解2_3分钟，在1000rmp/min条件下，离心5分钟，弃去上清，加入10_15ml细胞培养液，转入75cm2培养瓶中，置于37°C、5%的CO2培养箱中，培养72小时，用浓度0. 25%的EDTA-胰酶消化细胞，再用细胞营养液稀释成4. 0 X IO5的MDCK细胞悬液，以40000个/孔的细胞密度，0. Iml/孔细胞悬液铺到96孔细胞板上，置于37°C、5%的CO2培养箱中培养，培养24小时，成致密单层备用；接种病毒抗原之前弃去细胞营养液，用PH7. 2的PBS溶液清洗两遍； 其2重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原的接种 抽取不同批次的重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗，用细胞维持液；做10倍的梯度稀释，取10_3-10_7的滴度样，分别加入上述的致密单层中，每孔IOOul ;同时设对照每孔加细胞维持液；IOOul，放入37°C、5 %的CO2培养箱中，培养至第4天，计算TCID5tl值； 其3红细胞凝集，计算TCID5tl值 将病变后的96孔板按照原有顺序,每孔吸取培养液25-50ul,置于96孔V型血凝板中，然后每孔再加入25-50ull%红细胞悬液，在微量板振荡器上摇匀，其温度20 30°C，时间15 30分钟，其中100%红细胞凝集的孔与细胞病变的孔相对应，依据Reed-Muench法，获得精准的TCID5tl值； 上述细胞营养液由13. 54gDMEM干粉培养基，用注射用水配制成1000ml，加入胎牛血清IOOml而成； 上述细胞维持液由13. 54gDMEM干粉培养基，用注射用水配制成1000ml，加入2mg/mlTPCK而成，其终浓度为2ug/mlTPCK ； 上述1%红细胞悬液取SPF鸡血液，与等量阿氏液混合，在1500r/min下离心10分钟，用0. 85%生理盐水离心洗涤3-4次，每次1500r/min，离心10分钟，将沉积的红细胞用0. 85%生理盐水制成1%悬液。
2.按照权利要求I所述的方法，其特征在于该方法适用于红细胞凝集试验测定病毒含量的细胞源疫苗，即不同的病毒使用对应的敏感细胞。
3.按照权利要求I所述的方法，其特征在于选用的MDCK细胞购自美国ATCC即美国模式培养物集存库，即为American type culture collection ;选用试剂为国产分析纯试剂由市场采购。
全文摘要
本发明提供的一种新的重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原病毒含量测定方法，包括(1)MDCK细胞的制备抽取密度为2.0×106的MDCK冻存细胞1.5ml，置于37℃水浴中，加入10-15ml细胞培养液，培养72小时后，用浓度0.25%的EDTA-胰酶消化细胞，再用细胞营养液稀释成4.0×105的MDCK细胞悬液，以40000个/孔(0.1ml/孔)的细胞密度铺到96孔细胞板上，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，培养24小时成致密单层备用；(2)重组禽流感H5N1抗原的接种抽取不同批次重组禽流感H5N1细胞源抗原，分别加入上述的致密单层中，每孔100ul，加细胞维持液100ul，培养至第4天,以细胞病变的孔数，用Reed-Muench法，计算TCID50值。该方法适用于红细胞凝集试验测定病毒含量的细胞源疫苗，即不同的病毒使用对应的敏感细胞。
文档编号C12Q1/02GK102703602SQ20121013996
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者刘淑梅, 张先锋, 李延涛, 李莉, 潘毅平, 王玉红, 袁萍, 赵海源, 黄炯 申请人:新疆天康畜牧生物技术股份有限公司
技术领域：
本发明涉及采用MDCK细胞(犬肾细胞)毒含量测定，联合红细胞凝集试验，对重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原病毒含量实施测定，降低主观判断误差，具有重要的应用价值。
背景技术：
由于现行的禽流感H5N1灭活疫苗主要是在鸡胚上进行培养，收获尿囊液，灭活后制备成成品疫苗，其抗原的病毒含量是用鸡胚半数感染量和血凝价进行检测，但用鸡胚分离流感病毒或传代易引起病毒变异，而且鸡胚残留物还可引起过敏性反应，鸡胚作为疫苗生产基质，还存在大规模生产时供给和潜在外源病毒污染问题，因此，细胞疫苗技术成为目前值得发展的新兴技术。而传统的细胞源疫苗仅用细胞病毒含量测定方法，但常常出现细胞阴性对照在判读时已有大量细胞圆缩，已起不到对照的作用，或者有些细胞病变不明显而观察不到等，出现主观错误。
文献检索披露中国农业科学院哈尔滨兽医研究所刘明等人进行了重组H5N3禽流感疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖条件研究，文章未涉及对禽流感鸡胚毒在MDCK细胞上的驯化。本发明构思是将病毒抗原接种在MDCK细胞进行病毒含量测定，为了防止观察细胞病变时出现主观错误，又引入红细胞凝集试验，100%红细胞凝集的孔即与细胞病变的孔相对应，100%红细胞凝集的孔数根据Reed-Muench法计算TCID5tl ;与传统的方法比较，该方法更为客观和准确，大大降低了主观判断的误差。
发明内容
本发明的目的在于提供的测定方法，即建立用MDCK细胞联合红细胞凝集试验对重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原病毒含量测定方法，使病毒含量测定更准确、更客观。本发明的目的是这样实现的一种重组禽流感细胞源灭活疫苗抗原病毒含量的测定方法，采用MDCK细胞测定重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗病毒抗原TCID5tl的方法，分步骤实施
其I MDCK细胞的制备
抽取密度为2. 0 X IO6的MDCK冻存细胞I. 5ml，置于37°C水浴中，晃动溶解2_3分钟，在1000rmp/min条件下,离心5分钟,弃去上清,加入10_15ml细胞培养液,转入75cm2培养瓶中，置于37°C、5%的CO2培养箱中，培养72小时，用浓度0. 25%的EDTA-胰酶消化液，再用细胞营养液稀释成4. 0 X IO5的MDCK细胞悬液，以40000个/孔的细胞密度，0. Iml/孔细胞悬液铺到96孔细胞板上，置于37°C、5%的CO2培养箱中培养，培养24小时，成致密单层备用；接种病毒抗原之前弃去细胞营养液，用PH7. 2的PBS溶液清洗两遍；
其2重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原的接种抽取不同批次的重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗，用细胞维持液；做10倍的梯度稀释，取10_3-10_7的滴度样，分别加入上述的致密单层中，每孔IOOul ;同时设对照每孔加细胞维持液；IOOul，放入37°C、5 %的CO2培养箱中，培养至第4天，计算TCID5tl值；
其3红细胞凝集，计算TCID5tl值 将病变后的96孔板按照原有顺序,每孔吸取培养液25-50ul,置于96孔V型血凝板中，然后每孔再加入25-50ull%红细胞悬液，在微量板振荡器上摇匀，其温度20 30°C，时间15 30分钟，其中100%红细胞凝集的孔与细胞病变的孔相对应，依据Reed-Muench法，获得 TCID50 值；
上述细胞营养液由13. 54gDMEM干粉培养基，用注射用水配制成1000ml，加入胎牛血清IOOml而成；
上述细胞维持液由13. 54gDMEM干粉培养基，用注射用水配制成1000ml，加入2mg/mlTPCK而成，其终浓度为2ug/mlTPCK ；
上述1%红细胞悬液取2-4只2-6月龄SPF鸡血液，与等量阿氏液混合，在1500r/min下离心10分钟，用0. 85%生理盐水离心洗涤3-4次，每次1500r/min，离心10分钟，将沉积的红细胞用0. 85%生理盐水制成1%悬液。所述的方法，选用的MDCK细胞购自美国ATCC即美国模式培养物集存库(Americantype culture collection) ；DMEM(高糖)干粉培养基为Hyclone公司生产，货号SH30003. 04. OlB ;胎牛血清为兰州百灵公司生产，货号SV20091116 ;EDTA_胰酶消化液为GIBCO生产，货号400660 ；TPCK为Sigma公司生产，货号T8802 ;其他试剂均为国产分析纯试剂由市场采购。本发明采用MDCK细胞(犬肾细胞)毒含量测定联合红细胞凝集试验对重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原病毒含量测定方法用MDCK细胞联合红细胞凝集试验对重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原病毒含量测定比单纯用细胞进行病毒含量测定方法更为客观和准确，大大降低了主观判断的误差，即使新手操作也同样基准可靠，彰显技术进步。
具体实施例方式下面将结合实施例对发明作进一步说明。检测流程复苏、培养MDCK细胞步骤；病毒液稀释、接种、红细胞凝集；计算TCID5tl步骤；
(I) MDCK细胞的制备
抽取密度为2. OX IO6的MDCK冻存细胞I. 5ml，置于37°C水浴中，晃动溶解3分钟，在1000rmp/min条件下，离心5分钟，弃去上清，加入15ml细胞培养液，转入75cm2培养瓶中，置于37°C、5%的CO2培养箱中，培养72小时后，用浓度0. 25%的EDTA-胰酶消化细胞，再用细胞营养液(10%胎牛血清+DMEM)稀释成4. OX IO5的MDCK细胞悬液，以40000个/孔(0. Iml/孔)的细胞密度铺到96孔细胞板上，置于37°C、5%的CO2培养箱中，培养24小时成致密单层备用；接种病毒抗原之前弃去细胞营养液(10%胎牛血清+DMEM)，用pH7. 2的PBS溶液清洗两遍。(2)重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原的接种
抽取不同批次(2010001批-2010010批)重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原，用细胞维持液(2ug/mlTPCK+DMEM溶液)作10倍的梯度稀释，取10_3_10_7的滴度样，分别加入上述准备好的细胞致密单层中，每孔lOOul，同时设对照，每孔加细胞维持液(2ug/mlTPCK+DMEM溶液)100ul，放入37°C、5%的CO2培养箱中，期间2次/天观察细胞病变，培养至第4天，以出现细胞病变的孔数，根据Reed-Muench法，计算TCID5tl值。(3)红细胞凝集，计算TCID5011
为了防止观察细胞病变时出现主观错误，就将观察病变后的96孔板按照原有顺序，每 孔吸取培养液50ul (吸液前要充分混匀)置于96孔V型血凝板中(包括阴性对照)，然后每孔再加入50ul的1%红细胞悬液，立即在微量板振荡器上摇匀，其温度为30°C，时间30分钟，将100%红细胞凝集的孔与细胞病变的孔相对应，以100%红细胞凝集的孔数，根据Reed-Muench 法，获得 TCID5tl 值。(4)依据Reed-Muench法，接种量为O. Iml ;计算病毒致死(感染)量，以TCID5tl为列，见表I.
权利要求
1.一种重组禽流感细胞源灭活疫苗抗原病毒含量的测定方法，其特征在于采用MDCK细胞测定重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗病毒抗原TCID5tl的方法，分步骤实施； 其I MDCK细胞的制备 抽取密度为2. OX IO6的MDCK冻存细胞I. 5ml，置于37°C水浴中，晃动溶解2_3分钟，在1000rmp/min条件下，离心5分钟，弃去上清，加入10_15ml细胞培养液，转入75cm2培养瓶中，置于37°C、5%的CO2培养箱中，培养72小时，用浓度0. 25%的EDTA-胰酶消化细胞，再用细胞营养液稀释成4. 0 X IO5的MDCK细胞悬液，以40000个/孔的细胞密度，0. Iml/孔细胞悬液铺到96孔细胞板上，置于37°C、5%的CO2培养箱中培养，培养24小时，成致密单层备用；接种病毒抗原之前弃去细胞营养液，用PH7. 2的PBS溶液清洗两遍； 其2重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原的接种 抽取不同批次的重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗，用细胞维持液；做10倍的梯度稀释，取10_3-10_7的滴度样，分别加入上述的致密单层中，每孔IOOul ;同时设对照每孔加细胞维持液；IOOul，放入37°C、5 %的CO2培养箱中，培养至第4天，计算TCID5tl值； 其3红细胞凝集，计算TCID5tl值 将病变后的96孔板按照原有顺序,每孔吸取培养液25-50ul,置于96孔V型血凝板中，然后每孔再加入25-50ull%红细胞悬液，在微量板振荡器上摇匀，其温度20 30°C，时间15 30分钟，其中100%红细胞凝集的孔与细胞病变的孔相对应，依据Reed-Muench法，获得精准的TCID5tl值； 上述细胞营养液由13. 54gDMEM干粉培养基，用注射用水配制成1000ml，加入胎牛血清IOOml而成； 上述细胞维持液由13. 54gDMEM干粉培养基，用注射用水配制成1000ml，加入2mg/mlTPCK而成，其终浓度为2ug/mlTPCK ； 上述1%红细胞悬液取SPF鸡血液，与等量阿氏液混合，在1500r/min下离心10分钟，用0. 85%生理盐水离心洗涤3-4次，每次1500r/min，离心10分钟，将沉积的红细胞用0. 85%生理盐水制成1%悬液。
2.按照权利要求I所述的方法，其特征在于该方法适用于红细胞凝集试验测定病毒含量的细胞源疫苗，即不同的病毒使用对应的敏感细胞。
3.按照权利要求I所述的方法，其特征在于选用的MDCK细胞购自美国ATCC即美国模式培养物集存库，即为American type culture collection ;选用试剂为国产分析纯试剂由市场采购。
全文摘要
本发明提供的一种新的重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原病毒含量测定方法，包括(1)MDCK细胞的制备抽取密度为2.0×106的MDCK冻存细胞1.5ml，置于37℃水浴中，加入10-15ml细胞培养液，培养72小时后，用浓度0.25%的EDTA-胰酶消化细胞，再用细胞营养液稀释成4.0×105的MDCK细胞悬液，以40000个/孔(0.1ml/孔)的细胞密度铺到96孔细胞板上，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养，培养24小时成致密单层备用；(2)重组禽流感H5N1抗原的接种抽取不同批次重组禽流感H5N1细胞源抗原，分别加入上述的致密单层中，每孔100ul，加细胞维持液100ul，培养至第4天,以细胞病变的孔数，用Reed-Muench法，计算TCID50值。该方法适用于红细胞凝集试验测定病毒含量的细胞源疫苗，即不同的病毒使用对应的敏感细胞。
文档编号C12Q1/02GK102703602SQ20121013996
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者刘淑梅, 张先锋, 李延涛, 李莉, 潘毅平, 王玉红, 袁萍, 赵海源, 黄炯 申请人:新疆天康畜牧生物技术股份有限公司
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