一种生物毒素的制备方法
专利名称：一种生物毒素的制备方法
一种生物毒素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物领域物质的制备方法，尤其涉及一种生物毒素的制备方法。背景技术：
农作物生长过程受到害虫的危害，农药的防治是丰收的重要措施。无论是化学农药还是生物农药，害虫对之都能产生抗药性。其发展速度之快，要求在研究上能提供对农药特别是生物农药进行结构修饰和改造的方法，对付抗药性的发展，以扩大杀虫谱和提高杀虫效果。害虫对农药抗药性就是克服农药位点作用，使之失效、钝化。在实际应用中，农药轮换施用、农药混配施用、增加农药对害虫的接触面积、培育害虫的敏感品系、增加生态多样性以增加害虫的多样性等等，实质上是使农药作用位点保持足够的敏感性，寻求克服抗性的手段。每一种农药对害虫都有一个主要作用位点，每一种害虫都存在多个农药作用位点。害虫对含有单一作用位点的农药产生抗药性比含有多个作用位点的农药容易的多。两个以上作用位点的农药称之为多位点杀虫毒素，多位点杀虫毒素的研究是克服害虫抗药性 的有效途径。生物藕合技术是形成多位点杀虫毒素的有效方法，可以应用生物藕合技术，将两个杀虫毒素联结，或增加一个或多个基团，解除害虫的抗药性，为农药及其生物农药克服害虫的抗药性提供了有力的武器，生物藕合技术在多位点杀虫毒素的构建上显示出了广阔的应用前景。苏云金杆菌(Bacilus thuringiensis,简称Bt)是目前世界上生产量最大、应用最为广泛的一类微生物杀虫剂，其晶体蛋白对570余种鳞翅目害虫及双翅目、膜翅目和鞘翅目等数十种害虫有致病性。一般认为，昆虫在取食晶体蛋白后，通过自身的中肠蛋白酶将其酶解为活性的毒素蛋白，毒素蛋白再和中肠上皮细胞刷状缘膜(BBMVs)上的受体结合，并进一步插入膜内，形成孔洞或离子通道，引起离子渗漏，破坏肠壁上皮细胞，使肠道内溶物渗入血腔，引起败血症；虽然苏云金杆菌应用广泛，但其杀虫效果并不太理想。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种生物毒素的制备方法，以获得更好杀虫效果的生物毒素。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的一种生物毒素的制备方法，其操作如下通过将苏云金芽孢杆菌菌种活化、发酵培养并裂解、离心纯化以提取苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白；并采用琥珀酸酐法在阿维菌素c4"-oh处构建含有羧基的间隔臂；之后在交联剂EDC、NHS的共同作用下，C4--OH处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素与苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白相藕合，藕合合成的产物通过超滤离心纯化即得所述的生物毒素。进一步地，所述提取苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的具体操作如下步骤110 :取苏云金芽孢杆菌菌种并将其接种于LB固体培养基上，且将LB固体培养基置于30°C的恒温下培养24h以进行菌种活化；
步骤120 :之后挑取一环步骤110中活化后的菌种并将其接种于LB液体培养基中，且将其置于摇瓶发酵培养，转速180r/min，温度设定为30°C，并用孔雀绿和番红液进行芽胞染色观察发酵培养情况，待观察到LB液体培养基中有芽孢产生则结束发酵培养，将发酵培养获得的发酵液置于4°C、10000 X g条件下离心lOmin，离心结束后取沉淀并用水洗3次，取水洗后的沉淀并重悬于Na2CO3裂解液中且于4°C下裂解2h，将裂解后的溶液置于4°C、10000 X g离心30min,取上清液；步骤130 :用4mol/L HAc-NaAc将步骤120最终取得的上清液的pH值调至5. 0后于4°C下静置过夜，将静置后的溶液置于4°C、10000 X g离心30min，取该离心获得的沉淀并用水洗涤3次，取水洗后的沉淀并将其冷冻干燥得纯化的苏云金芽孢杆菌晶体即苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白，将获得的苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白置于_20°C下保存备用。进一步地，所述阿维菌素c4"-oh处构建含羧基的间隔臂的具体操作如下
步骤210 :在反应瓶中加入6. Ig阿维菌素、5ml无水四氢呋喃、3g咪唑和3. 2g叔丁基二甲基氯硅烷，之后将反应瓶置于25°C下避光搅拌反应，并通过薄层层析观察反应过程，当观察到反应中有新的产物点产生且原料点消失时则确定反应终点，此时将反应瓶置于冰水中冷浴至0°C并加入60ml水终止该反应；步骤220 :接着取一分液漏斗，用300ml乙酸乙酯和180ml水对步骤10已终止反应的反应瓶中的溶液进行萃取，取有机层，并将水层采用乙醚萃取4次，且每次水层萃取中乙醚的用量均为60ml ；步骤230 :合并步骤220获得的有机层并用水洗涤3次，每次洗涤用水量为60ml，加入无水硫酸钠干燥，然后再通过真空干燥浓缩得粗产品；步骤240 :用硅胶柱纯化该粗产品以获得中间产物I，该纯化过程采用的淋洗剂为二氯甲烷与四氢呋喃的混合液，该混合液中二氯甲烷与四氢呋喃的体积比为95:5 ；步骤250 :之后按摩尔质量比9:1:4分别称取丁二酸酐、中间产物I及催化剂三乙胺并溶解于无水四氢呋喃，常温、避光反应4h，且通过薄层层析检测，当有新的产物点产生时则确定反应终点；步骤260 :用水和乙酸乙酯萃取步骤250所获得的溶液,取有机层并采用无水硫酸钠干燥，接着利用硅胶柱纯化干燥后的物质得中间产物2，该纯化过程采用的淋洗剂为二氯甲烷与乙酸乙酯的混合液，该混合液中二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比为2:1 ;步骤270 :取0.3g中间产物2置于反应瓶中，并加入17ml甲醇，室温下搅拌反应瓶中溶液且边搅拌边逐滴加入IOml含I. 384mmol/L的对甲磺酸苯磺酸的甲醇溶液，之后继续搅拌反应25min，搅拌结束后采用乙酸乙酯和水对该反应得到的产物进行萃取，收集有机层并依次进行无水硫酸钠脱水、真空干燥、及过硅胶柱分离，最终获得4”-O-琥珀酰阿维菌素即阿维菌素C4"-OH处的羧基间隔臂得以构建。进一步地，所述藕合合成的具体操作如下先取适量苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白配置含lmg/ml苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的Na2CO3缓冲液，该Na2CO3缓冲液的PH值为10、物质的量浓度为0. 2mol/L ;接着取0. 5mol提取获得的C4"_0H处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素，采用IOml N，N-二甲基甲酰胺对其溶解，并依次加入0. 25mol NHS和0.25mol EDC,且在室温下搅拌1(T12小时以获得反应液；之后取该反应液60ml并在Ih内逐滴加至配置好的含lmg/ml苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的Na2CO3缓冲液中，滴加完毕后继续搅拌lh，然后转至4°C下再搅拌1(T12小时，搅拌后获得的产物经超滤离心纯化即得所述生物毒素，将获得的该生物毒素置于_20°C冻存。进一步地，所述步骤110中LB固体培养基的配置过程取蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠IOg及琼脂15g加水定容至1L，然后将定容后的溶液进行高压灭菌。进一步地，所述步骤120中Na2CO3裂解液的pH值为10 ;且每升该Na2CO3裂解液中含 5OmmoI Na2C03、50mmol EDTA、及 30mL 疏基乙醇。本发明一种生物毒素的制备方法的有益效果在于将苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白与c4〃-oh处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素相藕合以获得一种新的生物毒素，该生物毒素与苏云金芽孢杆菌的杀虫效果相比，其对小菜蛾具有更好的杀虫效果，对防治农业害虫上具有很好的应用前景。
具体实施方式本发明一种生物毒素的制备方法，通过将苏云金芽孢杆菌菌种活化、发酵培养并裂解、离心纯化以提取苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白；并采用琥珀酸酐法在阿维菌素C4〃-0H处构建含有羧基的间隔臂；之后在交联剂EDC、N-羟基琥珀酰亚胺(即NHS)的共同作用下，C4〃-0H处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素与苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白相藕合，藕合合成的产物通过超滤离心纯化即得所述的生物毒素。在本发明中阿维菌素的结构中不具有在温和条件下可直接与苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白结合的活性基团，如-COOH或NH2;但阿维菌素中存在3个可供衍生化的羟基C4〃-0H，C5-OH,C7-OH,因此，可采用琥珀酸酐法构建含有羧基的间隔臂以进行反应；而选择在C4"-0H处构建含羧基的间隔臂的原因如下一方面，根据Springer等人用计算机模拟出的阿维菌素的优势构象可知，其大环内脂部分为刚性的的近平面结构，而弯曲的双糖链恰似一个“勺柄”，采用C4"-0H与苏云金芽孢杆菌相连接能最大程度地保持并突出阿维菌素的优势构象；另一方面，根据阿维菌素构效关系研究的成果表明，阿维菌素的非糖部分对保持阿维菌素的抗虫活性最重要，因此对C4〃-0H的改造能较好的保持阿维菌素的生物活性，故在C4"-0H构建含有羧基的间隔臂。在交联剂的选择时，EDC能有效地活化阿维菌素的羧基形成活性酯中间体，能增强阿维菌素与苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的藕合；但EDC形成的活性酯中间体在水溶液中会被快速水解，而NHS的加入能够延长EDC活性酯中间体的半衰期及稳定性；因此，通过NHS联合EDC将C4〃-0H处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素的羧基固定在苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白上。一、制备所述生物毒素(I)提取苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白步骤110 :取苏云金芽孢杆菌菌种并将其接种于LB固体培养基上，且将LB固体培养基置于30°C的恒温下培养24h以进行菌种活化；步骤120 :之后挑取一环步骤110中活化后的菌种并将其接种于LB液体培养基中，且将其置于摇瓶发酵培养，转速180r/min，温度设定为30°C，并用孔雀绿和番红液进行芽胞染色观察发酵培养情况，待观察到LB液体培养基中有芽孢产生则结束发酵培养，将发酵培养获得的发酵液置于4°C、10000Xg条件下离心lOmin，离心结束后取沉淀并用水洗3次，取水洗后的沉淀并L Na2CO3裂解液中且于4°C下裂解此，将裂解后的溶液置于4°C、10000 X g离心30min,取上清液；步骤130 :用4mol/L HAc-NaAc将步骤120最终取得的上清液的pH值调至5. 0后于4°C下静置过夜，将静置后的溶液置于4°C、10000 X g离心30min，取该离心获得的沉淀并用水洗涤3次，取水洗后的沉淀并将其冷冻干燥得纯化的苏云金芽孢杆菌晶体即苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白，将获得的苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白置于_20°C下保存备用。其中LB固体培养基的配置过程取蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠IOg及琼脂15g加水定容至1L，然后将定容后的溶液进行高压灭菌；所采用的Na2CO3S解液的pH值为10 ;且每升该Na2CO3裂解液中含50mmol Na2CO3>50mmoI EDTA、及30mL巯基乙醇。(2)在阿维菌素C4〃-0H处构建含羧酸的间隔臂
步骤210 :在反应瓶中加入6. Ig阿维菌素、5ml无水四氢呋喃、3g咪唑和3. 2g叔丁基二甲基氯硅烷，之后将反应瓶置于25°C下避光搅拌反应，并通过薄层层析观察反应过程，当观察到反应中有新的产物点产生且原料点消失时则确定反应终点，此时将反应瓶置于冰水中冷浴至0°C并加入60ml水终止该反应；步骤220 :接着取一分液漏斗，用300ml乙酸乙酯和180ml水对步骤10已终止反应的反应瓶中的溶液进行萃取，取有机层，并将水层采用乙醚萃取4次，且每次水层萃取中乙醚的用量均为60ml ；步骤230 :合并步骤220获得的有机层并用水洗涤3次，每次洗涤用水量为60ml，加入无水硫酸钠干燥，然后再通过真空干燥浓缩得粗产品；步骤240 :用硅胶柱纯化该粗产品以获得中间产物I，该纯化过程采用的淋洗剂为二氯甲烷与四氢呋喃的混合液，该混合液中二氯甲烷与四氢呋喃的体积比为95:5 ；步骤250 :之后按摩尔质量比9:1:4分别称取丁二酸酐、中间产物I及催化剂三乙胺并溶解于无水四氢呋喃，常温、避光反应4h，且通过薄层层析检测，当有新的产物点产生时则确定反应终点；步骤260 :用水和乙酸乙酯萃取步骤250所获得的溶液,取有机层并采用无水硫酸钠干燥，接着利用硅胶柱纯化干燥后的物质得中间产物2，该纯化过程采用的淋洗剂为二氯甲烷与乙酸乙酯的混合液，该混合液中二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比为2:1 ;步骤270 :取0.3g中间产物2置于反应瓶中，并加入17ml甲醇，室温下搅拌反应瓶中溶液且边搅拌边逐滴加入IOml含I. 384mmol/L的对甲磺酸苯磺酸的甲醇溶液，之后继续搅拌反应25min，搅拌结束后采用乙酸乙酯和水对该反应得到的产物进行萃取，收集有机层并依次进行无水硫酸钠脱水、真空干燥、及过硅胶柱分离，最终获得4"-0_琥珀酰阿维菌素即阿维菌素C4"-0H处的羧基间隔臂得以构建。(3)藕合合成的操作先取适量苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白配置含lmg/ml苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的Na2CO3缓冲液，该Na2CO3缓冲液的PH值为10、物质的量浓度为0. 2mol/L ;接着取0. 5mol提取获得的C4"-0H处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素，采用IOml N，N-二甲基甲酰胺对其溶解，并依次加入0. 25mol NHS和0. 25mol EDC,且在室温下搅拌10 12小时以获得反应液；之后取该反应液60ml并在Ih内逐滴加至配置好的含lmg/ml苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的Na2C03缓冲液中，滴加完毕后继续搅拌lh，然后转至4°C下再搅拌l(Tl2小时，搅拌后获得的产物经超滤离心纯化即得所述生物毒素，将获得的该生物毒素置于_20°C冻存。另外，为了后续阐述的方便，申请人将该生物毒素命名为BtA。二、所述生物毒素杀虫毒力的验证(I)小菜蛾的准备采集室内种群的小菜蛾蛹，羽化，收集成虫产卵，每24小时收集一次小菜蛾卵，收集的同批的小菜蛾卵在人工气候箱内饲养以备LC5tl测定，该人工气候箱内的条件为温度25°C、相对湿度70%、光周期16 8 (L :D)。
权利要求
1.ー种生物毒素的制备方法，其特征在于通过将苏云金芽孢杆菌菌种活化、发酵培养并裂解、离心纯化以提取苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白；并采用琥珀酸酐法在阿维菌素C4〃-OH处构建含有羧基的间隔臂；之后在交联剂EDC、NHS的共同作用下，C4〃-OH处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素与苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的藕合，藕合产物通过超滤离心纯化即得所述的生物毒素。
2.根据权利要求I所述的ー种生物毒素的制备方法，其特征在于所述提取苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的具体操作如下 步骤110 :取苏云金芽孢杆菌菌种并将其接种于LB固体培养基上，且将LB固体培养基置于30°C的恒温下培养24h以进行菌种活化； 步骤120 :之后挑取一环步骤110中活化后的菌种并将其接种于LB液体培养基中，且将其置于摇瓶发酵培养，转速180r/min，温度设定为30°C，并用孔雀绿和番红液进行芽胞染色观察发酵培养情况，待观察到LB液体培养基中有芽孢产生则结束发酵培养，将发酵培养获得的发酵液置于4°C、10000 Xg条件下离心lOmin，离心结束后取沉淀并用水洗3次，取水洗后的沉淀并重悬于Na2CO3裂解液中且于4°C下裂解2h，将裂解后的溶液置于4°C、10000 X g离心30min,取上清液； 步骤130 :用4mol/L HAc-NaAc将步骤120最终取得的上清液的pH值调至5. O后于4°C下静置过夜，将静置后的溶液置于4°C、10000Xg离心30min，取该离心获得的沉淀并用水洗涤3次，取水洗后的沉淀并将其冷冻干燥得纯化的苏云金芽孢杆菌晶体即苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白，将获得的苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白置于-20°C下保存备用。
3.根据权利要求I所述的ー种生物毒素的制备方法，其特征在于所述阿维菌素C4^-OH处构建含羧基的间隔臂的具体操作如下 步骤210 :在反应瓶中加入6. Ig阿维菌素、5ml无水四氢呋喃、3g咪唑和3. 2g叔丁基ニ甲基氯硅烷，之后将反应瓶置于25°C下避光搅拌反应，并通过薄层层析观察反应过程，当观察到反应中有新的产物点产生且原料点消失时则确定反应终点，此时将反应瓶置于冰水中冷浴至0°C并加入60ml水终止该反应； 步骤220 :接着取一分液漏斗，用300mlこ酸こ酯和180ml水对步骤210已终止反应的反应瓶中的溶液进行萃取，取有机层，并将水层采用こ醚萃取4次，且每次水层萃取中こ醚的用量均为60ml ； 步骤230 :合并步骤220获得的有机层并用水洗涤3次，每次洗涤用水量为60ml，加入无水硫酸钠干燥，然后再通过真空干燥浓缩得粗产品； 步骤240 :用硅胶柱纯化该粗产品以获得中间产物I，该纯化过程采用的淋洗剂为ニ氯甲烷与四氢呋喃的混合液，该混合液中二氯甲烷与四氢呋喃的体积比为95:5 ； 步骤250 :之后按摩尔质量比9:1:4分别称取丁ニ酸酐、中间产物I及催化剂三こ胺并溶解于无水四氢呋喃，常温、避光反应4h，且通过薄层层析检测，当有新的产物点产生时则确定反应终点； 步骤260 :用水和こ酸こ酯萃取步骤250所获得的溶液，取有机层并采用无水硫酸钠干燥，接着利用硅胶柱纯化干燥后的物质得中间产物2，该纯化过程采用的淋洗剂为ニ氯甲烷与こ酸こ酯的混合液，该混合液中二氯甲烷与こ酸こ酯的体积比为2:1 ; 步骤270 :取O. 3g中间产物2置于反应瓶中，并加入17ml甲醇，室温下搅拌反应瓶中溶液且边搅拌边逐滴加入IOml含I. 384mmol/L的对甲磺酸苯磺酸的甲醇溶液，之后继续搅拌反应25min，搅拌结束后采用こ酸こ酯和水对该反应得到的产物进行萃取，收集有机层并依次进行无水硫酸钠脱水、真空干燥、及过硅胶柱分离，最終获得4"-0_琥珀酰阿维菌素即阿维菌素C4"-OH处的羧基间隔臂得以构建。
4.根据权利要求I所述的ー种生物毒素的制备方法，其特征在于所述藕合合成的具体操作如下 先取适量苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白配置含lmg/ml苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的Na2CO3缓冲液，该Na2CO3缓冲液的PH值为10、物质的量浓度为O. 2mol/L ;接着取O. 5mol提取获得的C4"-0H处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素，采用IOml N，N-ニ甲基甲酰胺对其溶解，并依次加入O. 25mol NHS和O. 25mol EDC,且在室温下搅拌10 12小时以获得反应液；之后取该反应液60ml并在Ih内逐滴加至配置好的含lmg/ml苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的Na2CO3缓冲液中，滴加完毕后继续搅拌lh，然后转至4°C下再搅拌1(Γ12小时，搅拌后获得的产物经超滤离心纯化即得所述生物毒素BtA，将获得的该生物毒素置于-20°C冻存。
5.根据权利要求2所述的ー种生物毒素的制备方法，其特征在于所述步骤110中LB固体培养基的配置过程取蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠IOg及琼脂15g加水定容至1L，然后将定容后的溶液进行高压灭菌。
6.根据权利要求2所述的ー种生物毒素的制备方法，其特征在于所述步骤120中Na2CO3裂解液的pH值为10 ;且每升该Na2CO3裂解液中含50mmoINa2CO3、50mmoI EDTA、及30mL巯基こ醇。
全文摘要
本发明提供一种生物毒素的制备方法，通过将苏云金芽孢杆菌菌种活化、发酵培养并裂解、离心纯化苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白；并采用琥珀酸酐法在阿维菌素C4"-OH处构建含有羧基的间隔臂；之后在交联剂EDC、NHS的共同作用下，实现阿维菌素与苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的藕合，藕合产物通过超滤离心纯化即得所述的生物毒素。本发明的优点在于获得一种具有更好杀虫效果的生物毒素，在防治农业害虫上具有很好的应用前景。
文档编号C12P21/00GK102675411SQ201210140220
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日 公开号201210140220.发明者刘波, 刘芸, 唐建阳, 朱育菁, 潘志针, 阮传清 申请人:福建省农业科学院农业生物资源研究所
一种生物毒素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物领域物质的制备方法，尤其涉及一种生物毒素的制备方法。背景技术：
农作物生长过程受到害虫的危害，农药的防治是丰收的重要措施。无论是化学农药还是生物农药，害虫对之都能产生抗药性。其发展速度之快，要求在研究上能提供对农药特别是生物农药进行结构修饰和改造的方法，对付抗药性的发展，以扩大杀虫谱和提高杀虫效果。害虫对农药抗药性就是克服农药位点作用，使之失效、钝化。在实际应用中，农药轮换施用、农药混配施用、增加农药对害虫的接触面积、培育害虫的敏感品系、增加生态多样性以增加害虫的多样性等等，实质上是使农药作用位点保持足够的敏感性，寻求克服抗性的手段。每一种农药对害虫都有一个主要作用位点，每一种害虫都存在多个农药作用位点。害虫对含有单一作用位点的农药产生抗药性比含有多个作用位点的农药容易的多。两个以上作用位点的农药称之为多位点杀虫毒素，多位点杀虫毒素的研究是克服害虫抗药性 的有效途径。生物藕合技术是形成多位点杀虫毒素的有效方法，可以应用生物藕合技术，将两个杀虫毒素联结，或增加一个或多个基团，解除害虫的抗药性，为农药及其生物农药克服害虫的抗药性提供了有力的武器，生物藕合技术在多位点杀虫毒素的构建上显示出了广阔的应用前景。苏云金杆菌(Bacilus thuringiensis,简称Bt)是目前世界上生产量最大、应用最为广泛的一类微生物杀虫剂，其晶体蛋白对570余种鳞翅目害虫及双翅目、膜翅目和鞘翅目等数十种害虫有致病性。一般认为，昆虫在取食晶体蛋白后，通过自身的中肠蛋白酶将其酶解为活性的毒素蛋白，毒素蛋白再和中肠上皮细胞刷状缘膜(BBMVs)上的受体结合，并进一步插入膜内，形成孔洞或离子通道，引起离子渗漏，破坏肠壁上皮细胞，使肠道内溶物渗入血腔，引起败血症；虽然苏云金杆菌应用广泛，但其杀虫效果并不太理想。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种生物毒素的制备方法，以获得更好杀虫效果的生物毒素。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的一种生物毒素的制备方法，其操作如下通过将苏云金芽孢杆菌菌种活化、发酵培养并裂解、离心纯化以提取苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白；并采用琥珀酸酐法在阿维菌素c4"-oh处构建含有羧基的间隔臂；之后在交联剂EDC、NHS的共同作用下，C4--OH处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素与苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白相藕合，藕合合成的产物通过超滤离心纯化即得所述的生物毒素。进一步地，所述提取苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的具体操作如下步骤110 :取苏云金芽孢杆菌菌种并将其接种于LB固体培养基上，且将LB固体培养基置于30°C的恒温下培养24h以进行菌种活化；
步骤120 :之后挑取一环步骤110中活化后的菌种并将其接种于LB液体培养基中，且将其置于摇瓶发酵培养，转速180r/min，温度设定为30°C，并用孔雀绿和番红液进行芽胞染色观察发酵培养情况，待观察到LB液体培养基中有芽孢产生则结束发酵培养，将发酵培养获得的发酵液置于4°C、10000 X g条件下离心lOmin，离心结束后取沉淀并用水洗3次，取水洗后的沉淀并重悬于Na2CO3裂解液中且于4°C下裂解2h，将裂解后的溶液置于4°C、10000 X g离心30min,取上清液；步骤130 :用4mol/L HAc-NaAc将步骤120最终取得的上清液的pH值调至5. 0后于4°C下静置过夜，将静置后的溶液置于4°C、10000 X g离心30min，取该离心获得的沉淀并用水洗涤3次，取水洗后的沉淀并将其冷冻干燥得纯化的苏云金芽孢杆菌晶体即苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白，将获得的苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白置于_20°C下保存备用。进一步地，所述阿维菌素c4"-oh处构建含羧基的间隔臂的具体操作如下
步骤210 :在反应瓶中加入6. Ig阿维菌素、5ml无水四氢呋喃、3g咪唑和3. 2g叔丁基二甲基氯硅烷，之后将反应瓶置于25°C下避光搅拌反应，并通过薄层层析观察反应过程，当观察到反应中有新的产物点产生且原料点消失时则确定反应终点，此时将反应瓶置于冰水中冷浴至0°C并加入60ml水终止该反应；步骤220 :接着取一分液漏斗，用300ml乙酸乙酯和180ml水对步骤10已终止反应的反应瓶中的溶液进行萃取，取有机层，并将水层采用乙醚萃取4次，且每次水层萃取中乙醚的用量均为60ml ；步骤230 :合并步骤220获得的有机层并用水洗涤3次，每次洗涤用水量为60ml，加入无水硫酸钠干燥，然后再通过真空干燥浓缩得粗产品；步骤240 :用硅胶柱纯化该粗产品以获得中间产物I，该纯化过程采用的淋洗剂为二氯甲烷与四氢呋喃的混合液，该混合液中二氯甲烷与四氢呋喃的体积比为95:5 ；步骤250 :之后按摩尔质量比9:1:4分别称取丁二酸酐、中间产物I及催化剂三乙胺并溶解于无水四氢呋喃，常温、避光反应4h，且通过薄层层析检测，当有新的产物点产生时则确定反应终点；步骤260 :用水和乙酸乙酯萃取步骤250所获得的溶液,取有机层并采用无水硫酸钠干燥，接着利用硅胶柱纯化干燥后的物质得中间产物2，该纯化过程采用的淋洗剂为二氯甲烷与乙酸乙酯的混合液，该混合液中二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比为2:1 ;步骤270 :取0.3g中间产物2置于反应瓶中，并加入17ml甲醇，室温下搅拌反应瓶中溶液且边搅拌边逐滴加入IOml含I. 384mmol/L的对甲磺酸苯磺酸的甲醇溶液，之后继续搅拌反应25min，搅拌结束后采用乙酸乙酯和水对该反应得到的产物进行萃取，收集有机层并依次进行无水硫酸钠脱水、真空干燥、及过硅胶柱分离，最终获得4”-O-琥珀酰阿维菌素即阿维菌素C4"-OH处的羧基间隔臂得以构建。进一步地，所述藕合合成的具体操作如下先取适量苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白配置含lmg/ml苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的Na2CO3缓冲液，该Na2CO3缓冲液的PH值为10、物质的量浓度为0. 2mol/L ;接着取0. 5mol提取获得的C4"_0H处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素，采用IOml N，N-二甲基甲酰胺对其溶解，并依次加入0. 25mol NHS和0.25mol EDC,且在室温下搅拌1(T12小时以获得反应液；之后取该反应液60ml并在Ih内逐滴加至配置好的含lmg/ml苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的Na2CO3缓冲液中，滴加完毕后继续搅拌lh，然后转至4°C下再搅拌1(T12小时，搅拌后获得的产物经超滤离心纯化即得所述生物毒素，将获得的该生物毒素置于_20°C冻存。进一步地，所述步骤110中LB固体培养基的配置过程取蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠IOg及琼脂15g加水定容至1L，然后将定容后的溶液进行高压灭菌。进一步地，所述步骤120中Na2CO3裂解液的pH值为10 ;且每升该Na2CO3裂解液中含 5OmmoI Na2C03、50mmol EDTA、及 30mL 疏基乙醇。本发明一种生物毒素的制备方法的有益效果在于将苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白与c4〃-oh处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素相藕合以获得一种新的生物毒素，该生物毒素与苏云金芽孢杆菌的杀虫效果相比，其对小菜蛾具有更好的杀虫效果，对防治农业害虫上具有很好的应用前景。
具体实施方式本发明一种生物毒素的制备方法，通过将苏云金芽孢杆菌菌种活化、发酵培养并裂解、离心纯化以提取苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白；并采用琥珀酸酐法在阿维菌素C4〃-0H处构建含有羧基的间隔臂；之后在交联剂EDC、N-羟基琥珀酰亚胺(即NHS)的共同作用下，C4〃-0H处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素与苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白相藕合，藕合合成的产物通过超滤离心纯化即得所述的生物毒素。在本发明中阿维菌素的结构中不具有在温和条件下可直接与苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白结合的活性基团，如-COOH或NH2;但阿维菌素中存在3个可供衍生化的羟基C4〃-0H，C5-OH,C7-OH,因此，可采用琥珀酸酐法构建含有羧基的间隔臂以进行反应；而选择在C4"-0H处构建含羧基的间隔臂的原因如下一方面，根据Springer等人用计算机模拟出的阿维菌素的优势构象可知，其大环内脂部分为刚性的的近平面结构，而弯曲的双糖链恰似一个“勺柄”，采用C4"-0H与苏云金芽孢杆菌相连接能最大程度地保持并突出阿维菌素的优势构象；另一方面，根据阿维菌素构效关系研究的成果表明，阿维菌素的非糖部分对保持阿维菌素的抗虫活性最重要，因此对C4〃-0H的改造能较好的保持阿维菌素的生物活性，故在C4"-0H构建含有羧基的间隔臂。在交联剂的选择时，EDC能有效地活化阿维菌素的羧基形成活性酯中间体，能增强阿维菌素与苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的藕合；但EDC形成的活性酯中间体在水溶液中会被快速水解，而NHS的加入能够延长EDC活性酯中间体的半衰期及稳定性；因此，通过NHS联合EDC将C4〃-0H处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素的羧基固定在苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白上。一、制备所述生物毒素(I)提取苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白步骤110 :取苏云金芽孢杆菌菌种并将其接种于LB固体培养基上，且将LB固体培养基置于30°C的恒温下培养24h以进行菌种活化；步骤120 :之后挑取一环步骤110中活化后的菌种并将其接种于LB液体培养基中，且将其置于摇瓶发酵培养，转速180r/min，温度设定为30°C，并用孔雀绿和番红液进行芽胞染色观察发酵培养情况，待观察到LB液体培养基中有芽孢产生则结束发酵培养，将发酵培养获得的发酵液置于4°C、10000Xg条件下离心lOmin，离心结束后取沉淀并用水洗3次，取水洗后的沉淀并L Na2CO3裂解液中且于4°C下裂解此，将裂解后的溶液置于4°C、10000 X g离心30min,取上清液；步骤130 :用4mol/L HAc-NaAc将步骤120最终取得的上清液的pH值调至5. 0后于4°C下静置过夜，将静置后的溶液置于4°C、10000 X g离心30min，取该离心获得的沉淀并用水洗涤3次，取水洗后的沉淀并将其冷冻干燥得纯化的苏云金芽孢杆菌晶体即苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白，将获得的苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白置于_20°C下保存备用。其中LB固体培养基的配置过程取蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠IOg及琼脂15g加水定容至1L，然后将定容后的溶液进行高压灭菌；所采用的Na2CO3S解液的pH值为10 ;且每升该Na2CO3裂解液中含50mmol Na2CO3>50mmoI EDTA、及30mL巯基乙醇。(2)在阿维菌素C4〃-0H处构建含羧酸的间隔臂
步骤210 :在反应瓶中加入6. Ig阿维菌素、5ml无水四氢呋喃、3g咪唑和3. 2g叔丁基二甲基氯硅烷，之后将反应瓶置于25°C下避光搅拌反应，并通过薄层层析观察反应过程，当观察到反应中有新的产物点产生且原料点消失时则确定反应终点，此时将反应瓶置于冰水中冷浴至0°C并加入60ml水终止该反应；步骤220 :接着取一分液漏斗，用300ml乙酸乙酯和180ml水对步骤10已终止反应的反应瓶中的溶液进行萃取，取有机层，并将水层采用乙醚萃取4次，且每次水层萃取中乙醚的用量均为60ml ；步骤230 :合并步骤220获得的有机层并用水洗涤3次，每次洗涤用水量为60ml，加入无水硫酸钠干燥，然后再通过真空干燥浓缩得粗产品；步骤240 :用硅胶柱纯化该粗产品以获得中间产物I，该纯化过程采用的淋洗剂为二氯甲烷与四氢呋喃的混合液，该混合液中二氯甲烷与四氢呋喃的体积比为95:5 ；步骤250 :之后按摩尔质量比9:1:4分别称取丁二酸酐、中间产物I及催化剂三乙胺并溶解于无水四氢呋喃，常温、避光反应4h，且通过薄层层析检测，当有新的产物点产生时则确定反应终点；步骤260 :用水和乙酸乙酯萃取步骤250所获得的溶液,取有机层并采用无水硫酸钠干燥，接着利用硅胶柱纯化干燥后的物质得中间产物2，该纯化过程采用的淋洗剂为二氯甲烷与乙酸乙酯的混合液，该混合液中二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比为2:1 ;步骤270 :取0.3g中间产物2置于反应瓶中，并加入17ml甲醇，室温下搅拌反应瓶中溶液且边搅拌边逐滴加入IOml含I. 384mmol/L的对甲磺酸苯磺酸的甲醇溶液，之后继续搅拌反应25min，搅拌结束后采用乙酸乙酯和水对该反应得到的产物进行萃取，收集有机层并依次进行无水硫酸钠脱水、真空干燥、及过硅胶柱分离，最终获得4"-0_琥珀酰阿维菌素即阿维菌素C4"-0H处的羧基间隔臂得以构建。(3)藕合合成的操作先取适量苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白配置含lmg/ml苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的Na2CO3缓冲液，该Na2CO3缓冲液的PH值为10、物质的量浓度为0. 2mol/L ;接着取0. 5mol提取获得的C4"-0H处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素，采用IOml N，N-二甲基甲酰胺对其溶解，并依次加入0. 25mol NHS和0. 25mol EDC,且在室温下搅拌10 12小时以获得反应液；之后取该反应液60ml并在Ih内逐滴加至配置好的含lmg/ml苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的Na2C03缓冲液中，滴加完毕后继续搅拌lh，然后转至4°C下再搅拌l(Tl2小时，搅拌后获得的产物经超滤离心纯化即得所述生物毒素，将获得的该生物毒素置于_20°C冻存。另外，为了后续阐述的方便，申请人将该生物毒素命名为BtA。二、所述生物毒素杀虫毒力的验证(I)小菜蛾的准备采集室内种群的小菜蛾蛹，羽化，收集成虫产卵，每24小时收集一次小菜蛾卵，收集的同批的小菜蛾卵在人工气候箱内饲养以备LC5tl测定，该人工气候箱内的条件为温度25°C、相对湿度70%、光周期16 8 (L :D)。
权利要求
1.ー种生物毒素的制备方法，其特征在于通过将苏云金芽孢杆菌菌种活化、发酵培养并裂解、离心纯化以提取苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白；并采用琥珀酸酐法在阿维菌素C4〃-OH处构建含有羧基的间隔臂；之后在交联剂EDC、NHS的共同作用下，C4〃-OH处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素与苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的藕合，藕合产物通过超滤离心纯化即得所述的生物毒素。
2.根据权利要求I所述的ー种生物毒素的制备方法，其特征在于所述提取苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的具体操作如下 步骤110 :取苏云金芽孢杆菌菌种并将其接种于LB固体培养基上，且将LB固体培养基置于30°C的恒温下培养24h以进行菌种活化； 步骤120 :之后挑取一环步骤110中活化后的菌种并将其接种于LB液体培养基中，且将其置于摇瓶发酵培养，转速180r/min，温度设定为30°C，并用孔雀绿和番红液进行芽胞染色观察发酵培养情况，待观察到LB液体培养基中有芽孢产生则结束发酵培养，将发酵培养获得的发酵液置于4°C、10000 Xg条件下离心lOmin，离心结束后取沉淀并用水洗3次，取水洗后的沉淀并重悬于Na2CO3裂解液中且于4°C下裂解2h，将裂解后的溶液置于4°C、10000 X g离心30min,取上清液； 步骤130 :用4mol/L HAc-NaAc将步骤120最终取得的上清液的pH值调至5. O后于4°C下静置过夜，将静置后的溶液置于4°C、10000Xg离心30min，取该离心获得的沉淀并用水洗涤3次，取水洗后的沉淀并将其冷冻干燥得纯化的苏云金芽孢杆菌晶体即苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白，将获得的苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白置于-20°C下保存备用。
3.根据权利要求I所述的ー种生物毒素的制备方法，其特征在于所述阿维菌素C4^-OH处构建含羧基的间隔臂的具体操作如下 步骤210 :在反应瓶中加入6. Ig阿维菌素、5ml无水四氢呋喃、3g咪唑和3. 2g叔丁基ニ甲基氯硅烷，之后将反应瓶置于25°C下避光搅拌反应，并通过薄层层析观察反应过程，当观察到反应中有新的产物点产生且原料点消失时则确定反应终点，此时将反应瓶置于冰水中冷浴至0°C并加入60ml水终止该反应； 步骤220 :接着取一分液漏斗，用300mlこ酸こ酯和180ml水对步骤210已终止反应的反应瓶中的溶液进行萃取，取有机层，并将水层采用こ醚萃取4次，且每次水层萃取中こ醚的用量均为60ml ； 步骤230 :合并步骤220获得的有机层并用水洗涤3次，每次洗涤用水量为60ml，加入无水硫酸钠干燥，然后再通过真空干燥浓缩得粗产品； 步骤240 :用硅胶柱纯化该粗产品以获得中间产物I，该纯化过程采用的淋洗剂为ニ氯甲烷与四氢呋喃的混合液，该混合液中二氯甲烷与四氢呋喃的体积比为95:5 ； 步骤250 :之后按摩尔质量比9:1:4分别称取丁ニ酸酐、中间产物I及催化剂三こ胺并溶解于无水四氢呋喃，常温、避光反应4h，且通过薄层层析检测，当有新的产物点产生时则确定反应终点； 步骤260 :用水和こ酸こ酯萃取步骤250所获得的溶液，取有机层并采用无水硫酸钠干燥，接着利用硅胶柱纯化干燥后的物质得中间产物2，该纯化过程采用的淋洗剂为ニ氯甲烷与こ酸こ酯的混合液，该混合液中二氯甲烷与こ酸こ酯的体积比为2:1 ; 步骤270 :取O. 3g中间产物2置于反应瓶中，并加入17ml甲醇，室温下搅拌反应瓶中溶液且边搅拌边逐滴加入IOml含I. 384mmol/L的对甲磺酸苯磺酸的甲醇溶液，之后继续搅拌反应25min，搅拌结束后采用こ酸こ酯和水对该反应得到的产物进行萃取，收集有机层并依次进行无水硫酸钠脱水、真空干燥、及过硅胶柱分离，最終获得4"-0_琥珀酰阿维菌素即阿维菌素C4"-OH处的羧基间隔臂得以构建。
4.根据权利要求I所述的ー种生物毒素的制备方法，其特征在于所述藕合合成的具体操作如下 先取适量苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白配置含lmg/ml苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的Na2CO3缓冲液，该Na2CO3缓冲液的PH值为10、物质的量浓度为O. 2mol/L ;接着取O. 5mol提取获得的C4"-0H处羧基间隔臂得以构建的阿维菌素，采用IOml N，N-ニ甲基甲酰胺对其溶解，并依次加入O. 25mol NHS和O. 25mol EDC,且在室温下搅拌10 12小时以获得反应液；之后取该反应液60ml并在Ih内逐滴加至配置好的含lmg/ml苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的Na2CO3缓冲液中，滴加完毕后继续搅拌lh，然后转至4°C下再搅拌1(Γ12小时，搅拌后获得的产物经超滤离心纯化即得所述生物毒素BtA，将获得的该生物毒素置于-20°C冻存。
5.根据权利要求2所述的ー种生物毒素的制备方法，其特征在于所述步骤110中LB固体培养基的配置过程取蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠IOg及琼脂15g加水定容至1L，然后将定容后的溶液进行高压灭菌。
6.根据权利要求2所述的ー种生物毒素的制备方法，其特征在于所述步骤120中Na2CO3裂解液的pH值为10 ;且每升该Na2CO3裂解液中含50mmoINa2CO3、50mmoI EDTA、及30mL巯基こ醇。
全文摘要
本发明提供一种生物毒素的制备方法，通过将苏云金芽孢杆菌菌种活化、发酵培养并裂解、离心纯化苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白；并采用琥珀酸酐法在阿维菌素C4"-OH处构建含有羧基的间隔臂；之后在交联剂EDC、NHS的共同作用下，实现阿维菌素与苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的藕合，藕合产物通过超滤离心纯化即得所述的生物毒素。本发明的优点在于获得一种具有更好杀虫效果的生物毒素，在防治农业害虫上具有很好的应用前景。
文档编号C12P21/00GK102675411SQ201210140220
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日 公开号201210140220.发明者刘波, 刘芸, 唐建阳, 朱育菁, 潘志针, 阮传清 申请人:福建省农业科学院农业生物资源研究所
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