一株丙烯菊酯降解菌及其土壤修复应用的制作方法
专利名称：一株丙烯菊酯降解菌及其土壤修复应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株高效降解丙烯菊酯的细菌及其在土壤污染修复中的应用。
背景技术：
农药作为重要的农业生产资料，在保护农业生产、提高农业综合生产能力、促进粮食稳定增产和农民持续增收等方面发挥着极其重要的作用。中国既是农药生产大国，也是使用大国，年使用量和平均用量均位居世界第一。然而，农药的利用率却不足20%，其余部分全部进入土壤、水体和大气，形成了严重的污染和危害。统计数据显示，中国受农药残留污染的农田面积约为1500万公顷，占可耕面积的10%，近半数作物农药残留超标，每年因农残超标问题蒙受出口损失逾80亿美元。
拟除虫菊酯农药是一类人工合成的模拟天然除虫菊素的杀虫剂，其以神经钠离子通道为作用靶标，具有用量低、药效高、杀虫谱广等优点，广泛用于防治农业及家庭卫生害虫。目前，拟除虫菊酯农药品种数和使用量仅次于有机磷农药，位居杀虫剂市场的第二位，约占世界农药市场的四分之一。第二代以后的拟除虫菊酯农药具有对光和热稳定的特点，在环境中的半衰期较长，很难在自然条件下快速降解。拟除虫菌酯农药的大量使用带来了一系列环境和食品安全问题，如对部分有益昆虫的毒害，对鱼、蛘和沼虾等水生生物的高急性毒性。此外，某些拟除虫菊酯农药还具有神经毒性、生物富集毒性和生殖毒性，有致癌、致畸和致突变的“三致”危害。当前，如何有效清除环境中的拟除虫菊酯农药残留物成为了亟待解决的重大社会问题。丙烯菊酯(Allethrin)，又名烯丙菊酯，化学名称右旋-顺，反式_2，2_ 二甲基-3-(2-甲基-I-丙烯基)环丙烷羧酸_(R，S)-2-甲基-3-烯丙基-4-氧代-环戊-2-烯基酯。广泛应用于防治茶树、蔬菜、果树、棉花、花卉、林木和卫生害虫，用量较大；可扰乱钠离子通道，是皮肤和呼吸系统的过敏原；对ATP酶有明显抑制作用，具有抗雌激素活性，是一种环境激素；性质稳定，不易发生降解；对水生生物毒性较强，如研究显示其对虹鳟鱼和水蚤的LC5tl值分别为19iig/L和40mg/L。此外，越来越多的研究显示，丙烯菊酯在环境中会对其它鱼类、鸟类和老鼠等动物的内分泌系统产生干扰。近年来，随着人们对生物修复理论研究的不断深入，微生物环境修复技术以高效、廉价、安全和简便等特点，日益成为农药残留等多种有机污染物环境修复的核心技术。目前，已报道的拟除虫菊酯农药降解菌有芽孢杆菌、施氏假单胞菌、产碱杆菌、黑曲霉、酸单胞菌、克雷白色杆菌、鞘氨醇杆菌、微球菌和苍白杆菌，等等。然而，能够高效降解丙烯菊酯的菌株却极为有限。Paingankar等人报道过一株具备丙烯菊酯降解能力的酸单胞菌属(Acidomonassp.)菌株,该菌株能够在72小时降解70%左右的供试丙烯菊酯(初始浓度为 5g/L) (Paingankar M. , Jain M. , Deobagkar D. Biodegradation of allethrin,a pyrethroid insecticide， by an Acidomonas sp.Biotechnology Letters，2005，27 1909-1913)。李玉清通过富集驯化培养，获得了降解丙烯菊酯的混合微生物(李玉清.丙烯菊酯农药的微生物修复作用研究.襄樊学院学报，2008，29 :27-29，44)。在初始丙烯菊酯浓度为50mg/L条件下，在培养液中添加lg/L葡萄糖，72小时降解率可达76% ;而以丙烯菊酯为唯一碳源、氮源和能源时，72小时丙烯菊酯降解率仅为55%。此外，上述降解菌的抗生素抗性和重金属耐受性尚未探明，也没有进行过实际应用测试，存在环境施用风险。综上所述，筛选更为高效、对常用抗生素敏感且能够耐受多种重金属，并在实际土壤环境下具备丙烯菊酯降解能力的降解菌株成为了相关领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有丙烯菊酯微生物降解中存在的问题或不足，提供一种高效丙烯菊酯降解菌。本发明的另一个目的是提供上述菌种在修复丙烯菊酯污染土壤中的应用。
本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的
一株丙烯菊酯降解菌，该菌是产碱菌属(Alcaligenes sp.)的菌株A_6,于2012年4月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No. 6011，该菌具有降解丙烯菊酯的能力。保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，该菌的分类命名为产碱菌Alcaligenes sp.。一种所述丙烯菊酯降解菌在受丙烯菊酯污染土壤修复中的应用。
作为优选，将所述菌株CGMCC No. 6011接种至含丙烯菊酯l_6g/L的基础无机盐液体培养基中，150r/min震荡培养48h以上，所述的基础无机盐液体培养基成份为(g/L)MgCl2 0.2，NH4NO3 I, KH2PO4 2, K2HPO4 7. 5，NaCl 1，去离子水 1L。作为优选，所述的液体培养温度为25_30°C，基础无机盐液体培养基的pH为
6.0-7. 4。更为优选的方案是，所述的液体培养温度为30°C，基础无机盐液体培养基的pH为 7.4。作为优选，将所述菌株CGMCC No. 6011接种至发酵培养基中30°C恒温培养32小时以上，得到菌体发酵液，对受丙烯菊酯污染的土壤喷施菌体发酵液进行降解；发酵培养基的成份为(g/L):玉米粉 10，豆柏粉 8，(NH4)2SO4 6，玉米浆 6，MgSO4 7H20 1，K2HPO4 3H202，MnSO4 0. 05，pH 7. 4。本发明所提供的丙烯菊酯降解菌Alcaligenes sp. A-6源自浙江省临安市污水处理厂活性污泥池的活性污泥，经人工富集培养、压力筛选和分离纯化得到。该菌属产碱菌属，其生物学特征在于接触酶阳性，氧化酶阳性，V. P.试验阴性，吲哚试验阴性，专性好氧，菌体形态为短杆状，菌落呈乳黄色、圆形、边缘齐整、光滑湿润，具体参见表I。菌株于2012年4月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.6011。
表I、Alcaligenes sp. A-6的生理生化特征
权利要求
1.一株丙烯菊酯降解菌，该菌是产碱菌属(Alcaligenes sp.)的菌株A_6,于2012年4月13日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，编号为CGMCC No. 6011，该菌具有降解丙烯菊酯的能力。
2.权利要求I所述丙烯菊酯降解菌在受丙烯菊酯污染土壤修复中的应用。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于将所述菌株CGMCCNo. 6011接种至含丙烯菊酯1-6 g/L的基础无机盐液体培养基中，150 r/min震荡培养48h以上，所述的基础无机盐液体培养基成份为(g/L) =MgCl2 0.2，NH4NO3 LKH2PO4 2，K2HPO4 7. 5，NaCl 1，去离子水 IL0
4.权利要求3所述的应用，其特征在于所述的液体培养温度为25-30°C，基础无机盐液体培养基的PH为6. 0-7.4。
5.权利要求3所述的应用，其特征在于所述的液体培养温度为30°C，基础无机盐液体 培养基的PH为7.4。
6.权利要求2所述的应用，其特征在于将所述菌株CGMCCNo. 6011接种至发酵培养基中30°C恒温培养32小时以上，得到菌体发酵液，对受丙烯菊酯污染的土壤喷施菌体发酵液进行降解；发酵培养基的成份为(g/L):玉米粉10，豆柏粉8，(NH4)2SO4 6，玉米浆6，MgSO4 7H20 1，K2HPO4 3H20 2，MnSO4 0. 05，pH 7. 4。
全文摘要
本发明公开了一株丙烯菊酯降解菌及其土壤修复应用。本发明所提供的丙烯菊酯降解菌是产碱菌属(Alcaligenessp.)的菌株A-6，该菌可在好氧条件下，48小时内实现对6g/L丙烯菊酯的完全降解；菌株A-6对氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、卡那霉素和四环素呈不同程度敏感反应，对13种供试重金属呈现耐受性；具备在实际土壤环境下高效降解丙烯菊酯的能力，能够显著缩短丙烯菊酯降解时长，具备实际应用意义和价值。
文档编号C12N1/20GK102747010SQ20121014188
公开日2012年10月24日 申请日期2012年5月9日 优先权日2012年5月9日
发明者单胜道, 戴朝卿, 管莉菠, 虞方伯 申请人:浙江农林大学
技术领域：
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株高效降解丙烯菊酯的细菌及其在土壤污染修复中的应用。
背景技术：
农药作为重要的农业生产资料，在保护农业生产、提高农业综合生产能力、促进粮食稳定增产和农民持续增收等方面发挥着极其重要的作用。中国既是农药生产大国，也是使用大国，年使用量和平均用量均位居世界第一。然而，农药的利用率却不足20%，其余部分全部进入土壤、水体和大气，形成了严重的污染和危害。统计数据显示，中国受农药残留污染的农田面积约为1500万公顷，占可耕面积的10%，近半数作物农药残留超标，每年因农残超标问题蒙受出口损失逾80亿美元。
拟除虫菊酯农药是一类人工合成的模拟天然除虫菊素的杀虫剂，其以神经钠离子通道为作用靶标，具有用量低、药效高、杀虫谱广等优点，广泛用于防治农业及家庭卫生害虫。目前，拟除虫菊酯农药品种数和使用量仅次于有机磷农药，位居杀虫剂市场的第二位，约占世界农药市场的四分之一。第二代以后的拟除虫菊酯农药具有对光和热稳定的特点，在环境中的半衰期较长，很难在自然条件下快速降解。拟除虫菌酯农药的大量使用带来了一系列环境和食品安全问题，如对部分有益昆虫的毒害，对鱼、蛘和沼虾等水生生物的高急性毒性。此外，某些拟除虫菊酯农药还具有神经毒性、生物富集毒性和生殖毒性，有致癌、致畸和致突变的“三致”危害。当前，如何有效清除环境中的拟除虫菊酯农药残留物成为了亟待解决的重大社会问题。丙烯菊酯(Allethrin)，又名烯丙菊酯，化学名称右旋-顺，反式_2，2_ 二甲基-3-(2-甲基-I-丙烯基)环丙烷羧酸_(R，S)-2-甲基-3-烯丙基-4-氧代-环戊-2-烯基酯。广泛应用于防治茶树、蔬菜、果树、棉花、花卉、林木和卫生害虫，用量较大；可扰乱钠离子通道，是皮肤和呼吸系统的过敏原；对ATP酶有明显抑制作用，具有抗雌激素活性，是一种环境激素；性质稳定，不易发生降解；对水生生物毒性较强，如研究显示其对虹鳟鱼和水蚤的LC5tl值分别为19iig/L和40mg/L。此外，越来越多的研究显示，丙烯菊酯在环境中会对其它鱼类、鸟类和老鼠等动物的内分泌系统产生干扰。近年来，随着人们对生物修复理论研究的不断深入，微生物环境修复技术以高效、廉价、安全和简便等特点，日益成为农药残留等多种有机污染物环境修复的核心技术。目前，已报道的拟除虫菊酯农药降解菌有芽孢杆菌、施氏假单胞菌、产碱杆菌、黑曲霉、酸单胞菌、克雷白色杆菌、鞘氨醇杆菌、微球菌和苍白杆菌，等等。然而，能够高效降解丙烯菊酯的菌株却极为有限。Paingankar等人报道过一株具备丙烯菊酯降解能力的酸单胞菌属(Acidomonassp.)菌株,该菌株能够在72小时降解70%左右的供试丙烯菊酯(初始浓度为 5g/L) (Paingankar M. , Jain M. , Deobagkar D. Biodegradation of allethrin,a pyrethroid insecticide， by an Acidomonas sp.Biotechnology Letters，2005，27 1909-1913)。李玉清通过富集驯化培养，获得了降解丙烯菊酯的混合微生物(李玉清.丙烯菊酯农药的微生物修复作用研究.襄樊学院学报，2008，29 :27-29，44)。在初始丙烯菊酯浓度为50mg/L条件下，在培养液中添加lg/L葡萄糖，72小时降解率可达76% ;而以丙烯菊酯为唯一碳源、氮源和能源时，72小时丙烯菊酯降解率仅为55%。此外，上述降解菌的抗生素抗性和重金属耐受性尚未探明，也没有进行过实际应用测试，存在环境施用风险。综上所述，筛选更为高效、对常用抗生素敏感且能够耐受多种重金属，并在实际土壤环境下具备丙烯菊酯降解能力的降解菌株成为了相关领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有丙烯菊酯微生物降解中存在的问题或不足，提供一种高效丙烯菊酯降解菌。本发明的另一个目的是提供上述菌种在修复丙烯菊酯污染土壤中的应用。
本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的
一株丙烯菊酯降解菌，该菌是产碱菌属(Alcaligenes sp.)的菌株A_6,于2012年4月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No. 6011，该菌具有降解丙烯菊酯的能力。保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，该菌的分类命名为产碱菌Alcaligenes sp.。一种所述丙烯菊酯降解菌在受丙烯菊酯污染土壤修复中的应用。
作为优选，将所述菌株CGMCC No. 6011接种至含丙烯菊酯l_6g/L的基础无机盐液体培养基中，150r/min震荡培养48h以上，所述的基础无机盐液体培养基成份为(g/L)MgCl2 0.2，NH4NO3 I, KH2PO4 2, K2HPO4 7. 5，NaCl 1，去离子水 1L。作为优选，所述的液体培养温度为25_30°C，基础无机盐液体培养基的pH为
6.0-7. 4。更为优选的方案是，所述的液体培养温度为30°C，基础无机盐液体培养基的pH为 7.4。作为优选，将所述菌株CGMCC No. 6011接种至发酵培养基中30°C恒温培养32小时以上，得到菌体发酵液，对受丙烯菊酯污染的土壤喷施菌体发酵液进行降解；发酵培养基的成份为(g/L):玉米粉 10，豆柏粉 8，(NH4)2SO4 6，玉米浆 6，MgSO4 7H20 1，K2HPO4 3H202，MnSO4 0. 05，pH 7. 4。本发明所提供的丙烯菊酯降解菌Alcaligenes sp. A-6源自浙江省临安市污水处理厂活性污泥池的活性污泥，经人工富集培养、压力筛选和分离纯化得到。该菌属产碱菌属，其生物学特征在于接触酶阳性，氧化酶阳性，V. P.试验阴性，吲哚试验阴性，专性好氧，菌体形态为短杆状，菌落呈乳黄色、圆形、边缘齐整、光滑湿润，具体参见表I。菌株于2012年4月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.6011。
表I、Alcaligenes sp. A-6的生理生化特征
权利要求
1.一株丙烯菊酯降解菌，该菌是产碱菌属(Alcaligenes sp.)的菌株A_6,于2012年4月13日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，编号为CGMCC No. 6011，该菌具有降解丙烯菊酯的能力。
2.权利要求I所述丙烯菊酯降解菌在受丙烯菊酯污染土壤修复中的应用。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于将所述菌株CGMCCNo. 6011接种至含丙烯菊酯1-6 g/L的基础无机盐液体培养基中，150 r/min震荡培养48h以上，所述的基础无机盐液体培养基成份为(g/L) =MgCl2 0.2，NH4NO3 LKH2PO4 2，K2HPO4 7. 5，NaCl 1，去离子水 IL0
4.权利要求3所述的应用，其特征在于所述的液体培养温度为25-30°C，基础无机盐液体培养基的PH为6. 0-7.4。
5.权利要求3所述的应用，其特征在于所述的液体培养温度为30°C，基础无机盐液体 培养基的PH为7.4。
6.权利要求2所述的应用，其特征在于将所述菌株CGMCCNo. 6011接种至发酵培养基中30°C恒温培养32小时以上，得到菌体发酵液，对受丙烯菊酯污染的土壤喷施菌体发酵液进行降解；发酵培养基的成份为(g/L):玉米粉10，豆柏粉8，(NH4)2SO4 6，玉米浆6，MgSO4 7H20 1，K2HPO4 3H20 2，MnSO4 0. 05，pH 7. 4。
全文摘要
本发明公开了一株丙烯菊酯降解菌及其土壤修复应用。本发明所提供的丙烯菊酯降解菌是产碱菌属(Alcaligenessp.)的菌株A-6，该菌可在好氧条件下，48小时内实现对6g/L丙烯菊酯的完全降解；菌株A-6对氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、卡那霉素和四环素呈不同程度敏感反应，对13种供试重金属呈现耐受性；具备在实际土壤环境下高效降解丙烯菊酯的能力，能够显著缩短丙烯菊酯降解时长，具备实际应用意义和价值。
文档编号C12N1/20GK102747010SQ20121014188
公开日2012年10月24日 申请日期2012年5月9日 优先权日2012年5月9日
发明者单胜道, 戴朝卿, 管莉菠, 虞方伯 申请人:浙江农林大学
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