一种以薄壁离心管为反应容器的聚合酶链式反应方法
专利名称：一种以薄壁离心管为反应容器的聚合酶链式反应方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，即一种以薄壁离心管为容器，使用带加热顶盖基因扩增仪的聚合酶链式反应方法。
背景技术：
PCR是一种简单，快速，专一，灵敏的扩增特定DNA片段的方法。PCR反应液由缓冲液，DNA聚合酶，镁离子，腺嘌呤脱氧核糖核苷酸dATP，鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸dCTP，胞嘧啶脱氧核糖核苷酸dGTP，胸嘧啶脱氧核糖核苷酸dTTP，正引物，反引物等近十种试剂和含模板DNA的样品组成，PCR反应每一个循环则由变性、退火和延伸三步组成，每步的反应温度不同，通常采用具有良好传热性能的薄壁塑料离心试管作为反应容器，反应试管容量为0.5或0.2毫升。反应液体积是PCR反应重要参数之一，它对传热过程、反应速度、反应稳定性，乃至反应的成败有重要影响。所以，尽管减少反应液体积的经济价值显而易见，但各种分子生物学实验技术指南和PCR试剂盒生产厂商至今仍推荐PCR使用50或100微升进行反应。限制PCR反应液体积大幅度调降有以下几个原因第一，为了防止在反复高温加热过程中水分蒸发和反应液浓缩，传统的PCR操作在反应液上要覆盖一层矿物油，如PCR反应液体积太小就无法在反应结束后取样分析。第二，在标准PCR反应参数条件下，PCR平坡或饱和期后的目标扩增产物的浓度较低，不能用通常的染色方法检测目标产物条带。第三，PCR反应液由近十种试剂组成，每种试剂的加量很小，如每管反应液总体积太小，就无法用商品加液枪来准确地配制单管反应液。但是，现行PCR采用50或100微升的反应体积不仅使试剂耗用量大，也极大地制约了完成PCR反应所需要的时间。对DNA变性和引物及模板退火过程的研究表明，一旦达到变性或退火温度，变性或退火能在瞬间或短短几秒钟内完成，而每个Taq DNA聚合酶分子每秒钟能延伸几十个核苷酸。所以，PCR的每一步反应时间理应很短。但是，现行的变性步骤通常为30秒钟，退火步骤通常为30秒钟，延伸时间通常为1至几分钟，取决于扩增产物的长短。这些数值大大高于根据理论分析所需要的时间，其主要原因在于采用离心管作反应容器、PCR反应液体积为50或100微升时，由于管壁与带加热顶盖基因扩增仪加热板接触部分的面积与反应液体积比值较小，需要有一定的时间才能完成热量从管壁到管中心的传递和交换、使管内反应液的各部分均达到所设定的温度。换言之，反应液体积较大、比表面积较小，传热过程较慢是PCR每一步反应速度的瓶颈。为了增加比表面积、提高PCR反应速度，人们试图采用细长的玻璃毛细管来代替离心管作为PCR反应的容器，使热传递过程加快，从而缩短完成每一循环所需时间。但是毛细管PCR不仅需要特制的PCR仪器，而且向毛细管内加样、起动反应和从中取样分析均很不方便，既花费时间又需操作经验和辅助设施，所以，尽管毛细管PCR发明至今已近二十年，但仍未被推广应用。
发明内容
本发明就是针对现有以薄壁离心管为容器、使用现有带加热顶盖基因扩增仪进行聚合酶链式反应方法存在试剂用量多、反应时间长的缺点，提供一种试剂用量少，整个PCR反应过程大大加快的聚合酶链式反应方法。
本发明聚合酶链式反应方法，仍以薄壁离心管为容器、使用普通带加热顶盖基因扩增仪。聚合酶链式反应的反应液体积为0.5-10微升，优选2-5微升。采用全预混试剂，全预混试剂包括缓冲液、DNA聚合酶、镁离子、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸dATP，鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸dCTP，胞嘧啶脱氧核糖核苷酸dGTP，胸嘧啶脱氧核糖核苷酸dTTP，正引物，反引物和与以上试剂总量等量的甘油。聚合酶链式反应的变性温度低、退火温度高、二者之差为10-20℃，其引物长度为31-50硷基，或19-30硷基，但G+C％＞55％。全预混试剂与样品的加量体积比为1∶1.5至1∶4，反应液中甘油的终浓度为10％-20％。聚合酶链式反应的变性时间，退火时间和延伸三者之和为2-30秒。
本发明的主要特征列于表一表一 本发明主要特征
本发明使用普通的薄壁离心管以带加热顶盖的PCR仪进行扩增。通过采用全预混试剂来装配反应液及改进引物设计和其他反应参数，将PCR反应液体积减少到0.5-10微升，比目前通用的50或100微升降低了5-200倍，经济效果十分可观。而用现有常规方法制备超微体积反应液相当困难，因为PCR反应液试剂成份多，每种试剂加样量又小。近年来发展了部分试剂的预混技术，即将PCR反应缓冲液，镁离子，dATP，dCTP，dGTP和dTTP等试剂预先混合，以减少装配反应液的加样操作。本发明在此基础上发展了将正引物，反引物和DNA聚合酶也一起预先混合的全预混试剂方法。只需将全预混试剂与样品按1∶1.5至1∶4的比例混合即可制备PCR反应液，整个过程只需二次加样操作，最小加样量为0.2微升(见表二)，可用商品加样枪来完成。为了保持全预混试剂中DNA聚合酶的活性，全预混试剂含有50％的甘油。全预混试剂与样品以1∶1.5或1∶4混合后，最终反应液含20％或10％的甘油(见表二)。如以1∶1.5至1∶4之间的比例混合后甘油终浓度在10％与20％之间。虽然10％以上甘油会使引物与模板的最高允许退火温度显著降低，但由于本发明设计的引物具有极高的Tm，所以，仍能在68℃以上的高退火温度下完成扩增。
表二 全预混试剂超微体积PCR反应液的配制
表三以全预混试剂与样品加量为1∶1.5为例，进行全预混试剂的配制。(表中各种试剂的浓度可根据需要调整，如引物的终浓度可为10uM或更高)表三 全预混试剂的配制
作为PCR反应的重要参数之一，反应液体积长期以来未能作大幅度调降的另一重要原因，是因为在标准PCR条件下单位体积反应液内扩增产物的量较低。本发明通过改进引物和其他反应参数，提高了饱和期扩增产物的浓度。本发明选择的引物Tm值很高，而扩增产物Tm值较低，从而使PCR反应温度参数达到表一所示的要求。符合要求的引物通常是硷基数31-50的超常引物，也可以是G+C％高(大于55％)硷基数18-30的普通长引物。本发明采用的引物不仅能在72℃以上的高温下与模板退火，并且有很强的对模板自身退火的竞争力，使PCR的平坡期被推迟，饱和期扩增产物浓度得以提高，因此当反应液体积仅为0.5微升时，也能得到足够量的扩增产物，在电泳胶上能用普通DNA染色剂检出其条带。
当薄壁离心管的反应液体积为0.5-10微升时，液体内传热能迅速完成，使变性和退火步骤的持续反应时间可由通常的30秒钟缩短到1-5秒钟；延伸步骤的持续反应时间也可由通常的一分钟缩短至1-25秒。延伸反应最短时间取决于扩增产物的大小，如扩增产物较短可以仅仅用正常的坡道时间来完成。本发明超微体积PCR的变性，退火和延伸三步反应的总持续时间为2-30秒钟，而通常需要2分钟(见表四)。
表四 标准PCR和本发明PCR每一循环所需时间*
*升温速度以每秒2.5度计，降温以每秒2.0度计。
本发明设计的引物Tm值高，而扩增产物Tm低，退火和延伸二个反应步骤可以合二为一，变性温度与退火温度差值仅10-20℃，因此PCR反应每一循环的升降温坡道时间，可由通常的40多秒钟缩短到10-20秒左右。由于每一步反应的持续时间和坡道时间大大减少，完成30个循环PCR的总时间由通常的约1个半小时缩短到10-24分钟(见表四)，为快速临床PCR诊断开辟了一条新路。如上面所述和以下实施例所示，本发明的超微体积PCR方法突破了PCR在三个不同温度间循环的阶梯型传统模式，实现了在二个温度间来回穿梭的模式。反应模式的改变不仅仅使反应速度实现了飞跃，而且通过温度和时间的双重控制限制了非专一产物的扩增，提高了扩增产物的纯度。穿梭模式的实现对简化PCR仪的设计也会产生影响。
具体实施例方式
本发明选择甘油-3-磷酸脱氢酶，肌动蛋白和腺苷酸环化酶为实施例的目标基因。引物和PCR产物特性及引物顺序分别列于表五和表六。
表五 引物和PCR产物的特性
表六 所用引物顺序
实施例1，应用代号为“A”的引物对进行PCR试验，用扩增结果，而不是以往根据几何学或物理学的分析推断，来说明反应液体积对产物扩增的影响。PCR按常规方法分变性，退火和延伸三步进行。PCR反应液的最终浓度为缓冲液40mM Tricine KOH，pH8.7，150mM KOAc，35mM Mg(OAc)2DNA聚合酶用量为每50微升反应液15U，dATP，dCTP，dGTP，和dTTP均为0.2mM，每50微升反应液含5微升模板c-DNA，c-DNA由商品人组织总RNA经反转录合成，正，反引物浓度为1mM。本实施例分二个试验，第一个试验设定反应液总体积为5微升，测试退火时间对最高允许退火温度的影响。变性95℃30秒，延伸80℃1分半钟，反应35循环，退火时间试验范围从1秒钟至1分钟，退火温度试验范围从74至80℃。反应结束后每反应管加10微升加样缓冲液，混合后取出全部液体走电泳。电泳结束后用常规的溴乙锭染色方法检测目标扩增产物。试验结果列于表六。
表七 退火时间对最高退火温度的影响
结果表明当退火时间超过30秒钟时，所有测试管均能在78.5退火温度下完成目标产物的扩增，说明当PCR体积为5微升，在设定退火温度下维持30秒钟，管壁及管中心的温度能达到均衡。但是，当退火时间小于30秒钟时最高表观退火温度随退火时间减少而降低，这说明在退火时间较短的情况下管壁温度达到了指定的退火温度，但管内液体还未充分冷却，其实际温度还高于78.5℃，因而未能完成退火。本反应试验的第二部分固定退火时间为30秒钟，测试分析不同反应体积对最高表观退火温度的影响。反应参数与检测方法与第一部分相同，反应体积试验从5微升至100微升，结果见表八。
表八 反应体积对最高退火温度的影响
结果表明当反应液体积为5和10微升时最高退火温度高达78.5℃。但是，反应体积超过10微升时，最高表观退火温度随反应体积增大而降低，说明反应体积越大管内液体温度达到均衡所需的时间越长。说明采用超微量反应体积不仅大大节约了试剂，也使反应体系在极短的时间内达到匀一的温度，从而缩短循环每一步的时间。
实施例2，用代号为“B”的引物对进行“超速穿梭式”PCR。第一个试验测试变性温度和退火延伸温度对“超速穿梭式”PCR的影响。反应中所有试验的各管的反应体积均为1微升，变性时间1秒钟，退火延伸时间也为1秒钟，引物浓度为5uM，反应30循环。各种试剂和样品的用量及产物检测方法与实施例1相同。测试结果列于表九。
表九 不同变性和退火延伸温度下的超速穿梭式PCR反应
结果表明当变性温度大于88℃，退火温度低于76℃，在此前提下应用1微升的超微量反应体积，能利用1秒钟的反应加上坡道时间即能完成扩增。全部反应时间包括30个循环，PCR仪预热，首次变性及最后一次后延伸少于15分钟。
第二个试验测试不同反应体积时的“超微超速穿梭式”PCR反应的影响。反应条件与第一个试验相同，所有试验的变性温度为88℃、时间1秒钟，退火延伸温度为72℃、时间1秒钟，反应体积分别为0.5，1，2.5，5和10微升，结果表明，经30个循环扩增所有测试管均显示强的目标产物条带。
第三个试验测试不同浓度甘油对PCR反应的影响。所有反应体积均为1微升，引物浓度为1uM，变性和退火延伸时间均为5秒钟，反应数32个循环，其他参数和检测方法与上相同。试验结果列于表十。
表十 不同浓度甘油时对产物扩增的影响
结果表明最低允许变性温度随甘油浓度增加而降低，甘油浓度为20％时能在82至83℃变性温度下完成扩增。虽然，最高允许退火温度也随甘油浓度增加而降低。但当甘油浓度为20％时仍能在68度高温下完成扩增，在此温度下TaqDNA聚合酶显示高的活力，退火和延伸仍能合为一步。
实施例3，用代号为“C”的引物测试超微反应条件下的最小允许变性温度与退火温度的差值，所有试验反应液的总体积均为2微升，镁离子浓度为6mM，变性84℃5秒钟，测试分析的退火温度范围为74-80℃，退火时间为15秒，结果见表十一。
表十一 不同变性和退火温度下的扩增结果
结果表明在超微体积和超速条件下，能完成扩增的最高退火温度为79℃，与变性温度仅差5℃。这种超小温差的PCR反应不仅缩短了PCR反应的坡道时间，而且通过低变性温度，高退火温度，延伸时间三重机制有效的限制非专一扩增产物的形成。
权利要求
1.一种以薄壁离心管为反应容器的聚合酶链式反应方法，使用带加热顶盖基因扩增仪，其特征在于所说的聚合酶链式反应的反应液总体积为0.5-10微升。
2.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于所说的反应液总体积为2-5微升。
3.根据权利要求1或2所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于采用全预混试剂，全预混试剂包括缓冲液、DNA聚合酶、镁离子、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸dATP，鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸dCTP，胞嘧啶脱氧核糖核苷酸dGTP，胸嘧啶脱氧核糖核苷酸dTTP，正、反引物和与以上试剂总量相等的甘油。
4.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于所说的变性温度低，退火温度高，二者之差为10-20℃。
5.根据权利要求1或3所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于所说的引物长度为31-50硷基。
6.根据权利要求1或3所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于所说的引物长度为18-30硷基、但G+C＞55％。
7.根据权利要求3所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于所说的全预混试剂与样品的加量体积比为1∶1.5至1∶4，反应液中甘油的终浓度为10％-20％。
8.根据权利要求1或5或6所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于所说的变性时间，退火时间和延伸时间三者之和为2-30秒。
全文摘要
本发明是对以薄壁离心管为反应容器、使用带加热顶盖基因扩增仪的聚合酶链式反应的改进。其特点是PCR的反应液总体积为0.5－10微升。采用全预混试剂，全预混试剂与样品的加量体积比为1∶1.5至1∶4，反应液中甘油的终浓度为10－20％。PCR的变性温度低，退火温度高，二者之差为10－20℃。变性时间、退火时间和延伸时间三者之和为2－30秒。其引物长度为31－50硷基。本发明PCR反应液体积的超微化和随之的超速化，能通过温度和时间的双重机制来限制非专一产物的扩增，从而提高PCR的稳定性和扩增产物的纯度。在分子生物学研究和临床快速诊断上有广阔的应用和实际意义。
文档编号C12P19/34GK1515677SQ0310002
公开日2004年7月28日 申请日期2003年1月6日 优先权日2003年1月6日
发明者徐定邦, 朱德芬, 徐文慧, 黄贞华 申请人:徐定邦, 徐文慧
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，即一种以薄壁离心管为容器，使用带加热顶盖基因扩增仪的聚合酶链式反应方法。
背景技术：
PCR是一种简单，快速，专一，灵敏的扩增特定DNA片段的方法。PCR反应液由缓冲液，DNA聚合酶，镁离子，腺嘌呤脱氧核糖核苷酸dATP，鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸dCTP，胞嘧啶脱氧核糖核苷酸dGTP，胸嘧啶脱氧核糖核苷酸dTTP，正引物，反引物等近十种试剂和含模板DNA的样品组成，PCR反应每一个循环则由变性、退火和延伸三步组成，每步的反应温度不同，通常采用具有良好传热性能的薄壁塑料离心试管作为反应容器，反应试管容量为0.5或0.2毫升。反应液体积是PCR反应重要参数之一，它对传热过程、反应速度、反应稳定性，乃至反应的成败有重要影响。所以，尽管减少反应液体积的经济价值显而易见，但各种分子生物学实验技术指南和PCR试剂盒生产厂商至今仍推荐PCR使用50或100微升进行反应。限制PCR反应液体积大幅度调降有以下几个原因第一，为了防止在反复高温加热过程中水分蒸发和反应液浓缩，传统的PCR操作在反应液上要覆盖一层矿物油，如PCR反应液体积太小就无法在反应结束后取样分析。第二，在标准PCR反应参数条件下，PCR平坡或饱和期后的目标扩增产物的浓度较低，不能用通常的染色方法检测目标产物条带。第三，PCR反应液由近十种试剂组成，每种试剂的加量很小，如每管反应液总体积太小，就无法用商品加液枪来准确地配制单管反应液。但是，现行PCR采用50或100微升的反应体积不仅使试剂耗用量大，也极大地制约了完成PCR反应所需要的时间。对DNA变性和引物及模板退火过程的研究表明，一旦达到变性或退火温度，变性或退火能在瞬间或短短几秒钟内完成，而每个Taq DNA聚合酶分子每秒钟能延伸几十个核苷酸。所以，PCR的每一步反应时间理应很短。但是，现行的变性步骤通常为30秒钟，退火步骤通常为30秒钟，延伸时间通常为1至几分钟，取决于扩增产物的长短。这些数值大大高于根据理论分析所需要的时间，其主要原因在于采用离心管作反应容器、PCR反应液体积为50或100微升时，由于管壁与带加热顶盖基因扩增仪加热板接触部分的面积与反应液体积比值较小，需要有一定的时间才能完成热量从管壁到管中心的传递和交换、使管内反应液的各部分均达到所设定的温度。换言之，反应液体积较大、比表面积较小，传热过程较慢是PCR每一步反应速度的瓶颈。为了增加比表面积、提高PCR反应速度，人们试图采用细长的玻璃毛细管来代替离心管作为PCR反应的容器，使热传递过程加快，从而缩短完成每一循环所需时间。但是毛细管PCR不仅需要特制的PCR仪器，而且向毛细管内加样、起动反应和从中取样分析均很不方便，既花费时间又需操作经验和辅助设施，所以，尽管毛细管PCR发明至今已近二十年，但仍未被推广应用。
发明内容
本发明就是针对现有以薄壁离心管为容器、使用现有带加热顶盖基因扩增仪进行聚合酶链式反应方法存在试剂用量多、反应时间长的缺点，提供一种试剂用量少，整个PCR反应过程大大加快的聚合酶链式反应方法。
本发明聚合酶链式反应方法，仍以薄壁离心管为容器、使用普通带加热顶盖基因扩增仪。聚合酶链式反应的反应液体积为0.5-10微升，优选2-5微升。采用全预混试剂，全预混试剂包括缓冲液、DNA聚合酶、镁离子、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸dATP，鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸dCTP，胞嘧啶脱氧核糖核苷酸dGTP，胸嘧啶脱氧核糖核苷酸dTTP，正引物，反引物和与以上试剂总量等量的甘油。聚合酶链式反应的变性温度低、退火温度高、二者之差为10-20℃，其引物长度为31-50硷基，或19-30硷基，但G+C％＞55％。全预混试剂与样品的加量体积比为1∶1.5至1∶4，反应液中甘油的终浓度为10％-20％。聚合酶链式反应的变性时间，退火时间和延伸三者之和为2-30秒。
本发明的主要特征列于表一表一 本发明主要特征
本发明使用普通的薄壁离心管以带加热顶盖的PCR仪进行扩增。通过采用全预混试剂来装配反应液及改进引物设计和其他反应参数，将PCR反应液体积减少到0.5-10微升，比目前通用的50或100微升降低了5-200倍，经济效果十分可观。而用现有常规方法制备超微体积反应液相当困难，因为PCR反应液试剂成份多，每种试剂加样量又小。近年来发展了部分试剂的预混技术，即将PCR反应缓冲液，镁离子，dATP，dCTP，dGTP和dTTP等试剂预先混合，以减少装配反应液的加样操作。本发明在此基础上发展了将正引物，反引物和DNA聚合酶也一起预先混合的全预混试剂方法。只需将全预混试剂与样品按1∶1.5至1∶4的比例混合即可制备PCR反应液，整个过程只需二次加样操作，最小加样量为0.2微升(见表二)，可用商品加样枪来完成。为了保持全预混试剂中DNA聚合酶的活性，全预混试剂含有50％的甘油。全预混试剂与样品以1∶1.5或1∶4混合后，最终反应液含20％或10％的甘油(见表二)。如以1∶1.5至1∶4之间的比例混合后甘油终浓度在10％与20％之间。虽然10％以上甘油会使引物与模板的最高允许退火温度显著降低，但由于本发明设计的引物具有极高的Tm，所以，仍能在68℃以上的高退火温度下完成扩增。
表二 全预混试剂超微体积PCR反应液的配制
表三以全预混试剂与样品加量为1∶1.5为例，进行全预混试剂的配制。(表中各种试剂的浓度可根据需要调整，如引物的终浓度可为10uM或更高)表三 全预混试剂的配制
作为PCR反应的重要参数之一，反应液体积长期以来未能作大幅度调降的另一重要原因，是因为在标准PCR条件下单位体积反应液内扩增产物的量较低。本发明通过改进引物和其他反应参数，提高了饱和期扩增产物的浓度。本发明选择的引物Tm值很高，而扩增产物Tm值较低，从而使PCR反应温度参数达到表一所示的要求。符合要求的引物通常是硷基数31-50的超常引物，也可以是G+C％高(大于55％)硷基数18-30的普通长引物。本发明采用的引物不仅能在72℃以上的高温下与模板退火，并且有很强的对模板自身退火的竞争力，使PCR的平坡期被推迟，饱和期扩增产物浓度得以提高，因此当反应液体积仅为0.5微升时，也能得到足够量的扩增产物，在电泳胶上能用普通DNA染色剂检出其条带。
当薄壁离心管的反应液体积为0.5-10微升时，液体内传热能迅速完成，使变性和退火步骤的持续反应时间可由通常的30秒钟缩短到1-5秒钟；延伸步骤的持续反应时间也可由通常的一分钟缩短至1-25秒。延伸反应最短时间取决于扩增产物的大小，如扩增产物较短可以仅仅用正常的坡道时间来完成。本发明超微体积PCR的变性，退火和延伸三步反应的总持续时间为2-30秒钟，而通常需要2分钟(见表四)。
表四 标准PCR和本发明PCR每一循环所需时间*
*升温速度以每秒2.5度计，降温以每秒2.0度计。
本发明设计的引物Tm值高，而扩增产物Tm低，退火和延伸二个反应步骤可以合二为一，变性温度与退火温度差值仅10-20℃，因此PCR反应每一循环的升降温坡道时间，可由通常的40多秒钟缩短到10-20秒左右。由于每一步反应的持续时间和坡道时间大大减少，完成30个循环PCR的总时间由通常的约1个半小时缩短到10-24分钟(见表四)，为快速临床PCR诊断开辟了一条新路。如上面所述和以下实施例所示，本发明的超微体积PCR方法突破了PCR在三个不同温度间循环的阶梯型传统模式，实现了在二个温度间来回穿梭的模式。反应模式的改变不仅仅使反应速度实现了飞跃，而且通过温度和时间的双重控制限制了非专一产物的扩增，提高了扩增产物的纯度。穿梭模式的实现对简化PCR仪的设计也会产生影响。
具体实施例方式
本发明选择甘油-3-磷酸脱氢酶，肌动蛋白和腺苷酸环化酶为实施例的目标基因。引物和PCR产物特性及引物顺序分别列于表五和表六。
表五 引物和PCR产物的特性
表六 所用引物顺序
实施例1，应用代号为“A”的引物对进行PCR试验，用扩增结果，而不是以往根据几何学或物理学的分析推断，来说明反应液体积对产物扩增的影响。PCR按常规方法分变性，退火和延伸三步进行。PCR反应液的最终浓度为缓冲液40mM Tricine KOH，pH8.7，150mM KOAc，35mM Mg(OAc)2DNA聚合酶用量为每50微升反应液15U，dATP，dCTP，dGTP，和dTTP均为0.2mM，每50微升反应液含5微升模板c-DNA，c-DNA由商品人组织总RNA经反转录合成，正，反引物浓度为1mM。本实施例分二个试验，第一个试验设定反应液总体积为5微升，测试退火时间对最高允许退火温度的影响。变性95℃30秒，延伸80℃1分半钟，反应35循环，退火时间试验范围从1秒钟至1分钟，退火温度试验范围从74至80℃。反应结束后每反应管加10微升加样缓冲液，混合后取出全部液体走电泳。电泳结束后用常规的溴乙锭染色方法检测目标扩增产物。试验结果列于表六。
表七 退火时间对最高退火温度的影响
结果表明当退火时间超过30秒钟时，所有测试管均能在78.5退火温度下完成目标产物的扩增，说明当PCR体积为5微升，在设定退火温度下维持30秒钟，管壁及管中心的温度能达到均衡。但是，当退火时间小于30秒钟时最高表观退火温度随退火时间减少而降低，这说明在退火时间较短的情况下管壁温度达到了指定的退火温度，但管内液体还未充分冷却，其实际温度还高于78.5℃，因而未能完成退火。本反应试验的第二部分固定退火时间为30秒钟，测试分析不同反应体积对最高表观退火温度的影响。反应参数与检测方法与第一部分相同，反应体积试验从5微升至100微升，结果见表八。
表八 反应体积对最高退火温度的影响
结果表明当反应液体积为5和10微升时最高退火温度高达78.5℃。但是，反应体积超过10微升时，最高表观退火温度随反应体积增大而降低，说明反应体积越大管内液体温度达到均衡所需的时间越长。说明采用超微量反应体积不仅大大节约了试剂，也使反应体系在极短的时间内达到匀一的温度，从而缩短循环每一步的时间。
实施例2，用代号为“B”的引物对进行“超速穿梭式”PCR。第一个试验测试变性温度和退火延伸温度对“超速穿梭式”PCR的影响。反应中所有试验的各管的反应体积均为1微升，变性时间1秒钟，退火延伸时间也为1秒钟，引物浓度为5uM，反应30循环。各种试剂和样品的用量及产物检测方法与实施例1相同。测试结果列于表九。
表九 不同变性和退火延伸温度下的超速穿梭式PCR反应
结果表明当变性温度大于88℃，退火温度低于76℃，在此前提下应用1微升的超微量反应体积，能利用1秒钟的反应加上坡道时间即能完成扩增。全部反应时间包括30个循环，PCR仪预热，首次变性及最后一次后延伸少于15分钟。
第二个试验测试不同反应体积时的“超微超速穿梭式”PCR反应的影响。反应条件与第一个试验相同，所有试验的变性温度为88℃、时间1秒钟，退火延伸温度为72℃、时间1秒钟，反应体积分别为0.5，1，2.5，5和10微升，结果表明，经30个循环扩增所有测试管均显示强的目标产物条带。
第三个试验测试不同浓度甘油对PCR反应的影响。所有反应体积均为1微升，引物浓度为1uM，变性和退火延伸时间均为5秒钟，反应数32个循环，其他参数和检测方法与上相同。试验结果列于表十。
表十 不同浓度甘油时对产物扩增的影响
结果表明最低允许变性温度随甘油浓度增加而降低，甘油浓度为20％时能在82至83℃变性温度下完成扩增。虽然，最高允许退火温度也随甘油浓度增加而降低。但当甘油浓度为20％时仍能在68度高温下完成扩增，在此温度下TaqDNA聚合酶显示高的活力，退火和延伸仍能合为一步。
实施例3，用代号为“C”的引物测试超微反应条件下的最小允许变性温度与退火温度的差值，所有试验反应液的总体积均为2微升，镁离子浓度为6mM，变性84℃5秒钟，测试分析的退火温度范围为74-80℃，退火时间为15秒，结果见表十一。
表十一 不同变性和退火温度下的扩增结果
结果表明在超微体积和超速条件下，能完成扩增的最高退火温度为79℃，与变性温度仅差5℃。这种超小温差的PCR反应不仅缩短了PCR反应的坡道时间，而且通过低变性温度，高退火温度，延伸时间三重机制有效的限制非专一扩增产物的形成。
权利要求
1.一种以薄壁离心管为反应容器的聚合酶链式反应方法，使用带加热顶盖基因扩增仪，其特征在于所说的聚合酶链式反应的反应液总体积为0.5-10微升。
2.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于所说的反应液总体积为2-5微升。
3.根据权利要求1或2所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于采用全预混试剂，全预混试剂包括缓冲液、DNA聚合酶、镁离子、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸dATP，鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸dCTP，胞嘧啶脱氧核糖核苷酸dGTP，胸嘧啶脱氧核糖核苷酸dTTP，正、反引物和与以上试剂总量相等的甘油。
4.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于所说的变性温度低，退火温度高，二者之差为10-20℃。
5.根据权利要求1或3所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于所说的引物长度为31-50硷基。
6.根据权利要求1或3所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于所说的引物长度为18-30硷基、但G+C＞55％。
7.根据权利要求3所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于所说的全预混试剂与样品的加量体积比为1∶1.5至1∶4，反应液中甘油的终浓度为10％-20％。
8.根据权利要求1或5或6所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于所说的变性时间，退火时间和延伸时间三者之和为2-30秒。
全文摘要
本发明是对以薄壁离心管为反应容器、使用带加热顶盖基因扩增仪的聚合酶链式反应的改进。其特点是PCR的反应液总体积为0.5－10微升。采用全预混试剂，全预混试剂与样品的加量体积比为1∶1.5至1∶4，反应液中甘油的终浓度为10－20％。PCR的变性温度低，退火温度高，二者之差为10－20℃。变性时间、退火时间和延伸时间三者之和为2－30秒。其引物长度为31－50硷基。本发明PCR反应液体积的超微化和随之的超速化，能通过温度和时间的双重机制来限制非专一产物的扩增，从而提高PCR的稳定性和扩增产物的纯度。在分子生物学研究和临床快速诊断上有广阔的应用和实际意义。
文档编号C12P19/34GK1515677SQ0310002
公开日2004年7月28日 申请日期2003年1月6日 优先权日2003年1月6日
发明者徐定邦, 朱德芬, 徐文慧, 黄贞华 申请人:徐定邦, 徐文慧
最新回复(0)