对痢疾志贺氏菌8型的o－抗原特异的核苷酸的制作方法
专利名称：对痢疾志贺氏菌8型的o－抗原特异的核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及痢疾志贺氏菌8型(Shigella dysenteriae8)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及痢疾志贺氏菌8型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的痢疾志贺氏菌8型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“TheEscherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgeneclusters encoding the same colitose-containing O antigen are highlyconserved”.Journal of Bacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是志贺氏菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测志贺氏菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiologicalinvestigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused bydry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin producingEscherichia coli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111.Gene 16417-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，nichespecific selection and bacterial populations”.FEMSMicrobiol.Lett，100509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’sidentification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenic relationships between the enteroinvasive Escherichiacoli antigens O28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and andShigella O antigens”J.clin Microbiol，17(4)681-684]
本发明的次一目的是提供了痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供了构成痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的基因转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf1，orf4，orf5，orf7基因；糖合成路径基因，包括gne基因。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf1，orf4，orf5，orf7基因；源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因、源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原也是高度特异的。
本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定痢疾志贺氏菌8型的O-抗原及检测和鉴定痢疾志贺氏菌8型。
本发明的还一目的是提供了分离痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长9227个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其由7个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的基因是转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf1、orf4、orf5、orf7基因；其中所述的基因orf1是SEQ ID NO1中的1097至1912碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO1中的1899至3125碱基的核苷酸；wzx是SEQ IDNO1中的3180至4349碱基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO1中的4419至5285碱基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO1中的5282至5968碱基的核苷酸；orf7是SEQ ID NO1中的7004至7750碱基的核苷酸。
前述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其中它是源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf1、orf4、orf5、orf7基因；以及它们的混合或它们的重组。
前述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的源于orf1基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的1103至1120碱基的核苷酸和1877至1896碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1194至1213碱基的核苷酸和1763至1780碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1261至1279碱基的核苷酸和1686至1704碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的1976至1995碱基的核苷酸和3096至3114碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2145至2162碱基的核苷酸和2997至3014碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2249至2268碱基的核苷酸和2834至2850碱基的核苷酸；源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的3183至3191碱基的核苷酸和4261至4278碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3241至3257碱基的核苷酸和4091至4109碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3301至3318碱基的核苷酸和3991至4019碱基的核苷酸；源于orf4基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的4441至4460碱基的核苷酸和5201至5220碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的4501至4520碱基的核苷酸和5115至5132碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的4601至4620碱基的核苷酸和5072至5088碱基的核苷酸；源于orf5基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的5311至5330碱基的核苷酸和5947至5965碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5401至5420碱基的核苷酸和5895至5912碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5501至5520碱基的核苷酸和5828至5846碱基的核苷酸；源于orf7基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的7059至7076碱基的核苷酸和7651至7668碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7099至7106碱基的核苷酸和7521至7540碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7161至7180碱基的核苷酸和7481至7500碱基的核苷酸。
前述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达痢疾志贺氏菌8型的O-抗原，并成为细菌疫苗。
前述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其中它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
前述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤(1)基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养痢疾志贺氏菌8型，离心收集细胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃ 30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％7醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增痢疾志贺氏菌8型中的O-抗原基因簇以痢疾志贺氏菌8型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用BoehringerMannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用BiO-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5 a细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5a混合后，转到BiO-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨卞青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了痢疾志贺氏8型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到90％的覆盖率。剩余10％的序列再通过将部分序列反向测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medicai Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证1)对痢疾志贺氏菌8型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到痢疾志贺氏菌8型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到7个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因的筛选针对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因设计引物；在每个基因内各设计三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，即在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PDR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原都是高度特异的。
也就是，本发明的第一个方面，提供了痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全长9227个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通过本发明的方法得到了痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由7个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面，提供了痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf1，orf4，orf5，orf7基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括gne基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原是高度特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因，包括orf1，orf4，orf5，orf7基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以痢疾志贺氏菌8型为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物。所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原是高度特异的。
所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤1)基因组的提取；2)PCR扩增痢疾志贺氏菌8型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所用，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。更确切的说这些寡核苷酸是源于orf1基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的1097至1912碱基)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的1899至3125碱基)，wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的3180至4349碱基)，orf4基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的4419至5285碱基)，orf5基因(核苷酸位置是从SEQID NO1的5282至5968碱基)，orf7基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的7004至7750碱基)。源于以上基因内的寡核苷酸对痢疾志贺氏菌8型是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是痢疾志贺氏菌8型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明设计者考虑到以下情况当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由痢疾志贺氏菌8型表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是痢疾志贺氏菌8型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是痢疾志贺氏菌8型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达痢疾志贺氏菌8型的O-抗原，并成为有用的疫苗。
其次是感受态细胞的制备参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇文库。实施例4对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到90％的覆盖率。剩余10％的序列再通过将部分序列反向测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。实施例5核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证1)对痢疾志贺氏菌8型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到痢疾志贺氏菌8型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到7个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1与Escherichia coli O91的glycosyltransferase基因在265个氨基酸中有25％的氨基酸序列是一样的，即有17％的相同性，44％的相似性，说明它们之间有高度的同源性，可以推测orf1也为糖基转移酶基因，命名为orf1。orf2是一个预测带有10个跨膜片段的蛋白，它的内膜的拓扑结构具有众所周知的O-抗原聚合酶的典型特征，此外，它与E.coli的编码O-抗原聚合酶的wzy基因在370个氨基酸中有25％的相同性，45％的相似性，说明它们之间有高度的同源性，所以命名orf2为wzy基因。Orf3和E.coli的wzx基因在419个氨基酸中有23％的相同性，44％的相似性，此wzx基因有12个潜在的穿膜区，而通过Eisenberg等的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984)“Analysis of membrane and surfaceprotein sequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179125-142]发现orf3也有12个潜在的穿膜区，而且与许多wzx蛋白相似，orf3在wzx蛋白的氨基端有一个大约50个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf3是wzx基因，命名为wzx。orf4与Streptococcusagalactiae的CpsVN基因在295个氨基酸中有33％的相同性，56％的相似性，而CpsVN基因是糖基转移酶基因；另外orf4与Streptococcus pneumoniae的glycosyl transferase，family2基因在301个氨基酸中有24％的相同性，43％的相似性，所以推测orf4是一个糖基转移酶基因，命名为orf4。orf5与Streptococcus thermophilusEps10基因在246个氨基酸中有32％的相同性，52％的相似性，表现出较高的同源性，此基因编码糖基转移酶，所以推测orf5是糖基转移酶基因，命名为orf5。orf6与Yersinia enterocolitica(type 08)的gne基因在336个氨基酸中有59％的相同性，74％的相似性，所以命名orf6为gne基因。orf7与Bacillusanthracis中编码糖基转移酶的基因和Escherichia coli O157H7中编码糖基转移酶的基因在氨基酸水平上分别有42％和36％的相同性，所以推测orf7也是一个糖基转移酶基因，命名为orf7。
根据痢疾志贺氏菌8型的结构推测它应有四个糖基转移酶基因，分别转移五个糖以合成O-抗原的寡糖单位。需要wzx基因将寡糖单位转移到膜外，wzy基因将寡糖单位聚合成多糖，寡糖单位中的特殊单糖也由O-抗原基因簇合成，如GalNAc由gne基因合成，这些基因在痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇里都被发现。实施例6特异基因的筛选针对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
表1列出了痢疾志贺氏菌8型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了痢疾志贺氏菌8型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物#101(-TTC ATC CTAAAC TCC TTA TT)和#102(-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG)，然后从166株大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166株大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共27组，它们的来源都列于表中。
在第24组中含有痢疾志贺氏菌8型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR在94℃预变性2分钟后，94℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因，每个基因都有三对引物被检测，每对引物除了在第24组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因对痢疾志贺氏菌8型及其O-抗原是高度特异的。
最后，通过PCR从痢疾志贺氏菌8型中筛选到对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原高度特异的基因wzx、wzy和四个糖基转移酶基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对痢疾志贺氏菌8型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的痢疾志贺氏菌8型，并能鉴定它们的O-抗原。
表3是痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的结构，共由7个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在志贺氏菌中开放阅读框的起始密码子有两个ATG和GTG。序列列表<110>南开大学<120>对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸<130>对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>9227<212>DNA<213>Shigella dysenteriae<400>1attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc 60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgaactgcg cgtgaagcgc 120caactgttgg cggaagtaca gtccatctgt ccgcctggcg tgaccattat gaacgtgcgt 180cagggcgaac ctttaggttt aggccactcc attttatgtg cacgacccgc cattggcgac 240aacccatttg tcgtggtact gccagacgta gtgatcgacg acgccagcgc cgacccgctg 300cgctacaacc ttgctgccgt gattgcgcgc ttcaatgaaa cgggccgtag ccaggtgctg 360gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactccgtca ttcagaccaa agaaccgctg 420gaccgtgaag gcaaagtcag ccgcattgtt gaattcatcg aaaaaccgga tcagccacaa 480acgctggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg 540gaacttgaac gcactcaacc tggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgccattgct 600gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgca 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9227表1痢疾志贺氏菌8型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据
*在痢疾志贺氏菌8型中得到正确的一条带表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源组号 该组中含有的菌株来源1 野生型大肠杆菌O1，O2，O3，O4，O10，O16，O18，O39IMVSu2 野生型大肠杆菌O40，O41，O48，O49，O71，O73，O88，O100 IMVS3 野生型大肠杆菌O102，O109，O119，O120，O121，O125，O126，O137IMVS4 野生型大肠杆菌O138，O139，O149，O7，O5，O6，O11，O12IMVS5 野生型大肠杆菌O13，O14，O15，O17，O19ab，O20，O21，O22 IMVS6 野生型大肠杆菌O23，O24，O25，O26，O27，O28，O29，O30IMVS7 野生型大肠杆菌O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O42IMVS8 野生型大肠杆菌O43，O44，O45，O46，O50，O51，O52，O53IMVS9 野生型大肠杆菌O54，O55，O56，O57，O58，O59，O60，O61IMVS10 野生型大肠杆菌O62，O63，O64，O65，O66，O68，O69，O70IMVS11 野生型大肠杆菌O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81IMVS12 野生型大肠杆菌O82，O83，O84，O85，O86，O87，O89，O90IMVS13 野生型大肠杆菌O91，O92，O95，O96，O97，O98，O99，O101 IMVS14 野生型大肠杆菌O112，O162，O113，O114，O115，O116，O117，O118IMVS15 野生型大肠杆菌O123，O165，O166，O167，O168，O169，O170，O171Seeb16 野生型大肠杆菌O172，O173，O127，O128，O129，O130，O131，O132， Seec17 野生型大肠杆菌O133，O134，O135，O136，O140，O141，O142，O143IMVS18 野生型大肠杆菌O144，O145，O146，O147，O148，O150，O151，O152IMVS19 野生型大肠杆菌O153，0154，O155，O156，O157，O158，O159，IMVS20 野生型大肠杆菌O160，O161，O163，O8，O9，O124，O111 IMVS21 野生型大肠杆菌O103，O104，O105，O106，O107，O108，O110 IMVS22 鲍氏志贺氏菌血清型B4，B5，B6，B8，B9，B11，B12，B14 Seed23 鲍氏志贺氏菌血清型B1，B3，B7，B8，B10，B13，B15，B16，B17，B18 Seed24 痢疾志贺氏菌血清型D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8Seed25 痢疾志贺氏菌血清D9，D10，D11，D12，D13 Seed26 弗氏志贺氏菌F6a，F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v7)F5(v4) Seed27 宋内氏志贺氏菌D5，DRSeeda. Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australiab. O123 from IMVS；the rest from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc. 172 and 173 from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，the rest from IMVSd. 中国预防医学科学院流行病学研究所表3痢疾志贺氏菌8型O抗原基因结构图 表4痢疾志贺氏菌8型O抗原基因簇基因位置attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc 60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgaactgcg cgtgaagcgc 120caactgttgg cggaagtaca gtccatctgt ccgcctggcg tgaccattat gaacgtgcgt 180cagggcgaac ctttaggttt aggccactcc attttatgtg cacgacccgc cattggcgac 240aacccatttg tcgtggtact gccagacgta gtgatcgacg acgccagcgc cgacccgctg 300cgctacaacc ttgctgccgt gattgcgcgc ttcaatgaaa cgggccgtag ccaggtgctg 360gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactccgtca ttcagaccaa agaaccgctg 420gaccgtgaag gcaaagtcag ccgcattgtt gaattcatcg aaaaaccgga tcagccacaa 480acgctggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg 540gaacttgaac gcactcaacc tggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgccattgct 600gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgca atgctgatga ctggtgaaag ctacgactgc 660ggtaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttt gtgaagtatg gattgcgcaa cctgaaagaa 720ggggcgaagt tccgtaaagg gattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccgg 780atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cagtgaggat tcgtggcgaa agtaatttgt 840tgcgaatatt cctgccgttg ttttatataa acaatcagaa taacaacgag ttagcaatag 900gattttagtc aaagttttcc aggattttcc ttgtttccag agcgaattgg taagacaatt 960agcgtttgaa tttttcgagt taagcgcgag tgggtaacgc tcgtcacatc gtagacatgc1020atgcagtgct ctggtagctg taaagccagg ggcggtagcg ttatttatat tcataggtct1080orf1起始aaaatagata accgagatga aaatagctat aggtatatca acattaaata atggaataaa1140tcaggtttgg gaaaaaataa aaaatatacc agatgaattt ttaataataa tttcacatca1200agtgactgat aagcaaaaac aacatgggga tatttgtaag aaaaacaatg tgataataat1260aacgacatac tgtaaagggt taagtaaaag cagaaatatt ttattggcta ctgcatttca1320aaaaagcgtt gattatatga ttataagtga tgatgatgtc gcttaccttg ttaatggact1380ttatgaacta aaagatagaa taatcgaaga tagaggcaag tatcattatc aaattcaaag1440ttgtacgcaa gacggaagac taaggaaaaa atatccgcta atgaggaaaa ggctaaatag1500attgtcagca tttaacattt cttcaataga aatgtgcctt aatgtgaatc 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2400attttcttcg acaggtttta tctgtggttg tttttctgta tgctataaat gagcgttcat 2460ttaaaaaata tatctttttt ttgttgagtg ttttttttca catgtctgca gttgttaatg 2520tttttatata tgcagtttat atgatctttg gttcaaaaaa atacccatat gcaaaaattg 2580ttttttctat tcttattgga cttttagttg tgttttttgt ggtttataat acgccaattt 2640attctgtgct attatcgaaa ttcacttcag tttctgggaa cgataaattc acacgtttgc 2700cgttaaatta tattatcatt acagttgtaa atatatgctt tattataatg atagggaaga 2760gaagtaaatg tgatgatttt aataagattt tattttgcaa ggagtgtttt ctattcttaa 2820tattattacc tttcccagca ctttcgaata gattgggtat gattattttt ggtttttatc 2880cctactttat cttaccctat ctaaaagctt ttgagagaaa aggtaagagt aaatatgccc 2940tacttatttg tttatatgta gtaaatttag tgcctttttt gtatttaatg tataatgtgt 3000ctttagggaa taacatgttt actttcctaa ataatcatcc atttactgag ggtgtgtatg 3060gtatgattga ttacatattg gaggcaattg ataaaggtgt taactatatc aatgaaggta 3120orf2终止 orf3起始actagcacgt gaaaaaatac ttaagtaacc tattttggtt gttgagtgac cgagtgttca3180tgctggtatt tcagttgtca ctttttgctt ctatcaaaag aatctatggg ttagatatct 3240tgggtagttg ggcaacgata atgaatatct cacaaatatt actatcgtta tttttatttg 3300gcattgatat agtcgtagtt aaaagaattg ttgaaaatcc atcatcaacg ggcactgaga 3360ttggatgtgc attattctta cagtttttag gactgttatt atatgcatct gcttttatta 3420ccattgttat ttatttttac tatgatatac cgttcgcttt tatattcgtg gcgatattaa 3480tcgttgctaa tttttttagc ttgtatgcta aagtaatatt ttttcattat tcggcattgg 3540ttgaatcaaa atatcgtgct atcacaattc taagtagtgt ggccgtttca tatggttatc 3600tttggtgttg tatatatttt ggttggcatg tcttttatgc ttatgttttc ttttatttaa 3660ttcaagctct ttttagtttt actatataca aattctattt cccttattca gcaaaatgga 3720cgattgattt agaattagtc aaaatgtatt tttttatggg gagtaaactc attgtatcaa 3780ctattagtgt atcactattt acacagtgtg atgtgatctt attagagtct cttacaggta 3840caaaagaggc tggggcattt agtgcagctc ttaggttatc agccatctgg tttatgtgtg 3900gaggtttgat agcgaacgct ttttttccaa aaattgttca gcttgaaaaa ataggagagg 3960aagaatcatt tatctttttg aaatggatat gcggagttgt aagtgtaatc tctatatatg 4020gtgcaattat tatgattgct ctgtcaccta taattataaa aatactatat ggcgataata 4080tggatttatc ggcgcaagta ttaatggttc atatgtggag tggtgttttt gtttttttag 4140gatcattttc atctaaatgg ttatttagta agaattatat taatttagaa gtgataaaaa 4200ccattattgc tgcaattttg aatataactt tgaatatcat tgttatacca aaatatggag 4260cggttggcgc tgcttctgta tcattgcttt cttattttat tgctaacttt ttcattttta 4320orf3终止tatttatacc aaaaactaaa aatgtttaaa atgcaattac agagtttgaa gtatattatt 4380orf4起始tttccatggc gtttgattaa tgattttgga agggttagat gtcaatttca gtaattactc 4440ctgtattcaa tcgagctttg ttagtctatg aattatatga atccttaatg tcacaacaat 4500cttatgattt tgaatgggtg ataattgatg atggttctac tgataattta aaagaggtta 4560ttgacaaaat agcgtcgaca tccccattta aaatcatata tagatataag aagaacggtg 4620gaaaacacac agccttaaat atagggatag aaatgtcatc gtttaactgg atatttattg 4680ttgatagtga tgatatatta acgcccaacg ctattgctct agccaatgaa aaaatccagg 4740caattgttga tgataaatgt aaagggatgg ttttcctgag ggggtataaa actacaaaag 4800agattgtagg taaagcggaa acaattgaaa atatttctct ggaaaagttt gcaggtacaa 4860agggagataa agcattaatc ataaaacgtg attctttact taaaaatcaa tttcctgttt 4920ttgatggtga aaattttata actgaggcat tggtttggaa ttcaatttta gaaaatggct 4980actttaaata tttcaatgag atcatctatt atagtgaata tttaccagga ggtttaactt 5040ctaattatac tgatcttttg cggaaaaata tcaatggcac gatggctttt gttatcaata 5100acttgaatct aaaaggtctt ggtattaatg tcattaaaca aaccgttttt cattttattc 5160ccatttttaa tattagtaat ctaatagttg taaagaaaaa gacaaagttt actgttttcg 5220ttttatttat tacatgtctt tttcttgtaa aaatcaagaa taaagttaaa ggaaaatcgt 5280orf5起始，orf4终止tatgataccg gcaataattc attatatttg gcttggtaaa agtgaaatcc ctaaaatata 5340tttagattgt atggagtcgt ggaaagaaca tgctgtaaat tacgattgct atttatggaa 5400tgaggattct tatagaaagg aatttggtca gaatgatttt gttgaagaaa tgatccaaag 5460gaaaaagttt gcatttgctg cagatttgat ccgatgtgat gtattatatc gttttggtgg 5520tatatatctc gatactgata tggaattagt tcgggatatt tctgcattgc gaaaaaatat 5580tgcatttatc ggcgaagaag atattgatac gcctagttgt ggtattttgg gttgtgaacc 5640caaattttgg cttttccaag agctaaaagc agctgtcata aaagcaaatg gtatgcaaac 5700aattcctttt cttttaaaga atattttgga cttacatggt gtaaaaaaaa tagattcaca 5760agatatttct actattaaag atatcacaat atactctgat aagtattttt atccatataa 5820cccttatggt agtgccaaac gatcacaatt actttataga tatataacaa aagattgtta 5880tgctatacat cattgggcta aaagttggaa gctttctttt ttagagagaa ttaaaagaaa 5940orf5终止，orf6起始aattatcatg cgatatcgta aggagtaata tgaatatcct agtaacaggt ggtgctggtt 6000atattggttc gcatacggta cttcgcttat tagaaaatga aaatgaaatt actgttgtgg 6060ataatttggt taattcttca tctgaggtaa ttaagcgtgt agagaatatc acgcaaaaaa 6120gcatttgctt tatcgaaatg gatatactta acacagaatt attacacgaa gtaattatta 6180ataaagatat tgatgcggtc attcattttg ctgggttgaa atctgtttct gagtcaatca 6240gtaggcctct tgaatattat aagaataatg ttcagggaac aattagtgtc cttagtgcta 6300tgataaatag caaagccaag aaaattattt ttagttcttc tgcaacggtt tatggtgagc 6360ctgaacaaat tccattaaat gaaaaatgta aagtaggtgg tacaacaaat ccttatggca 6420cttcgaaatt aatggcagaa caaatccttt gtgattttgc aaaagcaaat tatggttttg 6480atattatttc attacgatac tttaatccgg taggagcaca tcccagtgga atgataggtg 6540aggctccgaa tgggattcct aataatcttg taccatatct cactaaggtt gctataggcg 6600aattagattc attgaaaata tttgggaatg attatcctac cagggacgga tatggagttc 6660gggattttat tcatgttatg gatcttgccg atggacatat tgctgctttg aatgcagagt 6720ttaaagaaaa ttctatcagg atatataatt taggtacagg taaaggatat tcagtattag 6780agttggttga tactttcgag agaattatag ctagaaaaat aaataagtgt gttatatcaa 6840ggcgagatgg agatatagca gaatgctggt ctgatccaat gttagccttc aatgaactcg 6900gttggtcagc caaattcaat ttagaggata tgctacgaga ttcttggaat tggcaaataa 6960orf6终止，orf7起始aaaacccgaa aggctacgat caaaataaag ggaggaaata ataatggatt atcttgtgtc 7020aattattatg cccagttata attctgaatt cacaattaag gaaagtataa aatcggtaat 7080agaacaaaca tattctaatt gggagttgtt aattactgat gactgctcaa cagatagaac 7140ttgtcagata gttaaagaat ttgttgagca agatgacagg ataaaacttt ttgtttcaga 7200taaaaataaa ggcgcaggcg cagcaagaaa caactcaata aaagagtcta gtggacgatt 7260tttggctttt ttagatagtg atgatctatg ggcacccgat aaactaaaag agcagattaa 7320ttatatgatt atgaatggct acgcccttac ttatactgca tatagtaaaa ttgatgcata 7380tggtaatatt aaaaaagata ttcagccccc atcaaaagtc gatttttctt ctttactgaa 7440atccaatgtt 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gccgctgcgg ttgcctatta tgacagctac 9180cgtgccgctg ttctgcctgc gaacctaatc caggcccagc gcgacta 9227以上所述，仅是本发明较佳实施例，并非对本发明作任何形式限制，凡依本发明技术实质对以上实施例作任何简单修改、等同变化与修饰，仍属本发明技术方案范围。
权利要求
1.一种对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长9227个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是由7个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
3.按照权利要求2所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的基因是转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf1、orf4、orf5、orf7基因；其中所述的基因orf1是SEQ IDNO1中的1097至1912碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO1中的1899至3125碱基的核苷酸；wzx是SEQ ID NO1中的3180至4349碱基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO1中的4419至5285碱基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO1中的5282至5968碱基的核苷酸；orf7是SEQ ID NO1中的7004至7750碱基的核苷酸。
4.按照权利要求1或2所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，它是源于所述的wz基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf1、orf4、orf5、orf7基因；以及它们的混合或它们的重组。
5.按照权利要求4所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于orf1基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的1103至1120碱基的核苷酸和1877至1896碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1194至1213碱基的核苷酸和1763至1780碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1261至1279碱基的核苷酸和1686至1704碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的1976至1995碱基的核苷酸和3096至3114碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2145至2162碱基的核苷酸和2997至3014碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2249至2268碱基的核苷酸和2834至2850碱基的核苷酸；源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的3183至3191碱基的核苷酸和4261至4278碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3241至3257碱基的核苷酸和4091至4109碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3301至3318碱基的核苷酸和3991至4019碱基的核苷酸；源于orf4基因的寡核苷酸对是SEQID NO1中的4441至4460碱基的核苷酸和5201至5220碱基的核苷酸；SEQ IDNO1中的4501至4520碱基的核苷酸和5115至5132碱基的核苷酸；SEQ IDNO1中的4601至4620碱基的核苷酸和5072至5088碱基的核苷酸；源于orf5基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的5311至5330碱基的核苷酸和5947至5965碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5401至5420碱基的核苷酸和5895至5912碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5501至5520碱基的核苷酸和5828至5846碱基的核苷酸；源于orf7基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的7059至7076碱基的核苷酸和7651至7668碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7099至7106碱基的核苷酸和7521至7540碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7161至7180碱基的核苷酸和7481至7500碱基的核苷酸。
6.权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
7.权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达痢疾志贺氏菌8型的O-抗原，并成为细菌疫苗。
8.按照权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
9.权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤(1)基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养痢疾志贺氏菌8型，离心收集细胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃ 30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增痢疾志贺氏菌8型中的O-抗原基因簇以痢疾志贺氏菌8型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(5’-ATT GTG GCTGCA GGG ATC AAA GAA AT-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C-3’)；用BoehringerMannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用BiO-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5a细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5a混合后，转到BiO-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨卞青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了痢疾志贺氏8型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到90％的覆盖率。剩余10％的序列再通过将部分序列反向测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证1)对痢疾志贺氏菌8型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到痢疾志贺氏菌8型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到7个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因的筛选针对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因设计引物；在每个基因内各设计三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，即在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PDR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原都是高度特异的。
全文摘要
本发明提供一种对痢疾志贺氏菌8型(Shigelladysenteriae 8)的O－抗原特异的核苷酸，它是痢疾志贺氏菌8型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ IDNO1所示的分离的核苷酸，全长9227个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸；还包括源于痢疾志贺氏菌8型的O－抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对痢疾志贺氏菌8型的O－抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的痢疾志贺氏菌8型的方法。
文档编号C12Q1/68GK1429833SQ03100539
公开日2003年7月16日 申请日期2003年1月20日 优先权日2003年1月20日
发明者王磊, 郭宏杰, 冯露 申请人:南开大学
技术领域：
本发明涉及痢疾志贺氏菌8型(Shigella dysenteriae8)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及痢疾志贺氏菌8型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的痢疾志贺氏菌8型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“TheEscherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgeneclusters encoding the same colitose-containing O antigen are highlyconserved”.Journal of Bacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是志贺氏菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测志贺氏菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiologicalinvestigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused bydry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin producingEscherichia coli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111.Gene 16417-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，nichespecific selection and bacterial populations”.FEMSMicrobiol.Lett，100509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’sidentification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenic relationships between the enteroinvasive Escherichiacoli antigens O28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and andShigella O antigens”J.clin Microbiol，17(4)681-684]
本发明的次一目的是提供了痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供了构成痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的基因转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf1，orf4，orf5，orf7基因；糖合成路径基因，包括gne基因。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf1，orf4，orf5，orf7基因；源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因、源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原也是高度特异的。
本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定痢疾志贺氏菌8型的O-抗原及检测和鉴定痢疾志贺氏菌8型。
本发明的还一目的是提供了分离痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长9227个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其由7个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的基因是转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf1、orf4、orf5、orf7基因；其中所述的基因orf1是SEQ ID NO1中的1097至1912碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO1中的1899至3125碱基的核苷酸；wzx是SEQ IDNO1中的3180至4349碱基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO1中的4419至5285碱基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO1中的5282至5968碱基的核苷酸；orf7是SEQ ID NO1中的7004至7750碱基的核苷酸。
前述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其中它是源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf1、orf4、orf5、orf7基因；以及它们的混合或它们的重组。
前述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的源于orf1基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的1103至1120碱基的核苷酸和1877至1896碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1194至1213碱基的核苷酸和1763至1780碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1261至1279碱基的核苷酸和1686至1704碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的1976至1995碱基的核苷酸和3096至3114碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2145至2162碱基的核苷酸和2997至3014碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2249至2268碱基的核苷酸和2834至2850碱基的核苷酸；源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的3183至3191碱基的核苷酸和4261至4278碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3241至3257碱基的核苷酸和4091至4109碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3301至3318碱基的核苷酸和3991至4019碱基的核苷酸；源于orf4基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的4441至4460碱基的核苷酸和5201至5220碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的4501至4520碱基的核苷酸和5115至5132碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的4601至4620碱基的核苷酸和5072至5088碱基的核苷酸；源于orf5基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的5311至5330碱基的核苷酸和5947至5965碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5401至5420碱基的核苷酸和5895至5912碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5501至5520碱基的核苷酸和5828至5846碱基的核苷酸；源于orf7基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的7059至7076碱基的核苷酸和7651至7668碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7099至7106碱基的核苷酸和7521至7540碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7161至7180碱基的核苷酸和7481至7500碱基的核苷酸。
前述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达痢疾志贺氏菌8型的O-抗原，并成为细菌疫苗。
前述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其中它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
前述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤(1)基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养痢疾志贺氏菌8型，离心收集细胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃ 30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％7醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增痢疾志贺氏菌8型中的O-抗原基因簇以痢疾志贺氏菌8型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用BoehringerMannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用BiO-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5 a细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5a混合后，转到BiO-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨卞青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了痢疾志贺氏8型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到90％的覆盖率。剩余10％的序列再通过将部分序列反向测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medicai Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证1)对痢疾志贺氏菌8型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到痢疾志贺氏菌8型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到7个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因的筛选针对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因设计引物；在每个基因内各设计三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，即在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PDR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原都是高度特异的。
也就是，本发明的第一个方面，提供了痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全长9227个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通过本发明的方法得到了痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由7个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面，提供了痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf1，orf4，orf5，orf7基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括gne基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原是高度特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因，包括orf1，orf4，orf5，orf7基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以痢疾志贺氏菌8型为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物。所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原是高度特异的。
所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤1)基因组的提取；2)PCR扩增痢疾志贺氏菌8型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所用，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。更确切的说这些寡核苷酸是源于orf1基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的1097至1912碱基)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的1899至3125碱基)，wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的3180至4349碱基)，orf4基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的4419至5285碱基)，orf5基因(核苷酸位置是从SEQID NO1的5282至5968碱基)，orf7基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的7004至7750碱基)。源于以上基因内的寡核苷酸对痢疾志贺氏菌8型是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是痢疾志贺氏菌8型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明设计者考虑到以下情况当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由痢疾志贺氏菌8型表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是痢疾志贺氏菌8型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是痢疾志贺氏菌8型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达痢疾志贺氏菌8型的O-抗原，并成为有用的疫苗。
其次是感受态细胞的制备参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇文库。实施例4对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到90％的覆盖率。剩余10％的序列再通过将部分序列反向测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。实施例5核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证1)对痢疾志贺氏菌8型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到痢疾志贺氏菌8型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到7个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1与Escherichia coli O91的glycosyltransferase基因在265个氨基酸中有25％的氨基酸序列是一样的，即有17％的相同性，44％的相似性，说明它们之间有高度的同源性，可以推测orf1也为糖基转移酶基因，命名为orf1。orf2是一个预测带有10个跨膜片段的蛋白，它的内膜的拓扑结构具有众所周知的O-抗原聚合酶的典型特征，此外，它与E.coli的编码O-抗原聚合酶的wzy基因在370个氨基酸中有25％的相同性，45％的相似性，说明它们之间有高度的同源性，所以命名orf2为wzy基因。Orf3和E.coli的wzx基因在419个氨基酸中有23％的相同性，44％的相似性，此wzx基因有12个潜在的穿膜区，而通过Eisenberg等的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984)“Analysis of membrane and surfaceprotein sequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179125-142]发现orf3也有12个潜在的穿膜区，而且与许多wzx蛋白相似，orf3在wzx蛋白的氨基端有一个大约50个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf3是wzx基因，命名为wzx。orf4与Streptococcusagalactiae的CpsVN基因在295个氨基酸中有33％的相同性，56％的相似性，而CpsVN基因是糖基转移酶基因；另外orf4与Streptococcus pneumoniae的glycosyl transferase，family2基因在301个氨基酸中有24％的相同性，43％的相似性，所以推测orf4是一个糖基转移酶基因，命名为orf4。orf5与Streptococcus thermophilusEps10基因在246个氨基酸中有32％的相同性，52％的相似性，表现出较高的同源性，此基因编码糖基转移酶，所以推测orf5是糖基转移酶基因，命名为orf5。orf6与Yersinia enterocolitica(type 08)的gne基因在336个氨基酸中有59％的相同性，74％的相似性，所以命名orf6为gne基因。orf7与Bacillusanthracis中编码糖基转移酶的基因和Escherichia coli O157H7中编码糖基转移酶的基因在氨基酸水平上分别有42％和36％的相同性，所以推测orf7也是一个糖基转移酶基因，命名为orf7。
根据痢疾志贺氏菌8型的结构推测它应有四个糖基转移酶基因，分别转移五个糖以合成O-抗原的寡糖单位。需要wzx基因将寡糖单位转移到膜外，wzy基因将寡糖单位聚合成多糖，寡糖单位中的特殊单糖也由O-抗原基因簇合成，如GalNAc由gne基因合成，这些基因在痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇里都被发现。实施例6特异基因的筛选针对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
表1列出了痢疾志贺氏菌8型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了痢疾志贺氏菌8型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物#101(-TTC ATC CTAAAC TCC TTA TT)和#102(-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG)，然后从166株大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166株大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共27组，它们的来源都列于表中。
在第24组中含有痢疾志贺氏菌8型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR在94℃预变性2分钟后，94℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因，每个基因都有三对引物被检测，每对引物除了在第24组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因对痢疾志贺氏菌8型及其O-抗原是高度特异的。
最后，通过PCR从痢疾志贺氏菌8型中筛选到对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原高度特异的基因wzx、wzy和四个糖基转移酶基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对痢疾志贺氏菌8型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的痢疾志贺氏菌8型，并能鉴定它们的O-抗原。
表3是痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的结构，共由7个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在志贺氏菌中开放阅读框的起始密码子有两个ATG和GTG。序列列表<110>南开大学<120>对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸<130>对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>9227<212>DNA<213>Shigella dysenteriae<400>1attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc 60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgaactgcg cgtgaagcgc 120caactgttgg cggaagtaca gtccatctgt ccgcctggcg tgaccattat gaacgtgcgt 180cagggcgaac ctttaggttt aggccactcc attttatgtg cacgacccgc cattggcgac 240aacccatttg tcgtggtact gccagacgta gtgatcgacg acgccagcgc cgacccgctg 300cgctacaacc ttgctgccgt gattgcgcgc ttcaatgaaa cgggccgtag ccaggtgctg 360gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactccgtca ttcagaccaa agaaccgctg 420gaccgtgaag gcaaagtcag ccgcattgtt gaattcatcg aaaaaccgga tcagccacaa 480acgctggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg 540gaacttgaac gcactcaacc tggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgccattgct 600gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgca 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9227表1痢疾志贺氏菌8型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据
*在痢疾志贺氏菌8型中得到正确的一条带表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源组号 该组中含有的菌株来源1 野生型大肠杆菌O1，O2，O3，O4，O10，O16，O18，O39IMVSu2 野生型大肠杆菌O40，O41，O48，O49，O71，O73，O88，O100 IMVS3 野生型大肠杆菌O102，O109，O119，O120，O121，O125，O126，O137IMVS4 野生型大肠杆菌O138，O139，O149，O7，O5，O6，O11，O12IMVS5 野生型大肠杆菌O13，O14，O15，O17，O19ab，O20，O21，O22 IMVS6 野生型大肠杆菌O23，O24，O25，O26，O27，O28，O29，O30IMVS7 野生型大肠杆菌O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O42IMVS8 野生型大肠杆菌O43，O44，O45，O46，O50，O51，O52，O53IMVS9 野生型大肠杆菌O54，O55，O56，O57，O58，O59，O60，O61IMVS10 野生型大肠杆菌O62，O63，O64，O65，O66，O68，O69，O70IMVS11 野生型大肠杆菌O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81IMVS12 野生型大肠杆菌O82，O83，O84，O85，O86，O87，O89，O90IMVS13 野生型大肠杆菌O91，O92，O95，O96，O97，O98，O99，O101 IMVS14 野生型大肠杆菌O112，O162，O113，O114，O115，O116，O117，O118IMVS15 野生型大肠杆菌O123，O165，O166，O167，O168，O169，O170，O171Seeb16 野生型大肠杆菌O172，O173，O127，O128，O129，O130，O131，O132， Seec17 野生型大肠杆菌O133，O134，O135，O136，O140，O141，O142，O143IMVS18 野生型大肠杆菌O144，O145，O146，O147，O148，O150，O151，O152IMVS19 野生型大肠杆菌O153，0154，O155，O156，O157，O158，O159，IMVS20 野生型大肠杆菌O160，O161，O163，O8，O9，O124，O111 IMVS21 野生型大肠杆菌O103，O104，O105，O106，O107，O108，O110 IMVS22 鲍氏志贺氏菌血清型B4，B5，B6，B8，B9，B11，B12，B14 Seed23 鲍氏志贺氏菌血清型B1，B3，B7，B8，B10，B13，B15，B16，B17，B18 Seed24 痢疾志贺氏菌血清型D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8Seed25 痢疾志贺氏菌血清D9，D10，D11，D12，D13 Seed26 弗氏志贺氏菌F6a，F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v7)F5(v4) Seed27 宋内氏志贺氏菌D5，DRSeeda. Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australiab. O123 from IMVS；the rest from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc. 172 and 173 from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，the rest from IMVSd. 中国预防医学科学院流行病学研究所表3痢疾志贺氏菌8型O抗原基因结构图 表4痢疾志贺氏菌8型O抗原基因簇基因位置attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc 60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgaactgcg cgtgaagcgc 120caactgttgg cggaagtaca gtccatctgt ccgcctggcg tgaccattat gaacgtgcgt 180cagggcgaac ctttaggttt aggccactcc attttatgtg cacgacccgc cattggcgac 240aacccatttg tcgtggtact gccagacgta gtgatcgacg acgccagcgc cgacccgctg 300cgctacaacc ttgctgccgt gattgcgcgc ttcaatgaaa cgggccgtag ccaggtgctg 360gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactccgtca ttcagaccaa agaaccgctg 420gaccgtgaag gcaaagtcag ccgcattgtt gaattcatcg aaaaaccgga tcagccacaa 480acgctggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg 540gaacttgaac gcactcaacc tggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgccattgct 600gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgca atgctgatga ctggtgaaag ctacgactgc 660ggtaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttt gtgaagtatg gattgcgcaa cctgaaagaa 720ggggcgaagt tccgtaaagg gattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccgg 780atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cagtgaggat tcgtggcgaa agtaatttgt 840tgcgaatatt cctgccgttg ttttatataa acaatcagaa taacaacgag ttagcaatag 900gattttagtc aaagttttcc aggattttcc ttgtttccag agcgaattgg taagacaatt 960agcgtttgaa tttttcgagt taagcgcgag tgggtaacgc tcgtcacatc gtagacatgc1020atgcagtgct ctggtagctg taaagccagg ggcggtagcg ttatttatat tcataggtct1080orf1起始aaaatagata accgagatga aaatagctat aggtatatca acattaaata atggaataaa1140tcaggtttgg gaaaaaataa aaaatatacc agatgaattt ttaataataa tttcacatca1200agtgactgat aagcaaaaac aacatgggga tatttgtaag aaaaacaatg tgataataat1260aacgacatac tgtaaagggt taagtaaaag cagaaatatt ttattggcta ctgcatttca1320aaaaagcgtt gattatatga ttataagtga tgatgatgtc gcttaccttg ttaatggact1380ttatgaacta aaagatagaa taatcgaaga tagaggcaag tatcattatc aaattcaaag1440ttgtacgcaa gacggaagac taaggaaaaa atatccgcta atgaggaaaa ggctaaatag1500attgtcagca tttaacattt cttcaataga aatgtgcctt aatgtgaatc 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3240tgggtagttg ggcaacgata atgaatatct cacaaatatt actatcgtta tttttatttg 3300gcattgatat agtcgtagtt aaaagaattg ttgaaaatcc atcatcaacg ggcactgaga 3360ttggatgtgc attattctta cagtttttag gactgttatt atatgcatct gcttttatta 3420ccattgttat ttatttttac tatgatatac cgttcgcttt tatattcgtg gcgatattaa 3480tcgttgctaa tttttttagc ttgtatgcta aagtaatatt ttttcattat tcggcattgg 3540ttgaatcaaa atatcgtgct atcacaattc taagtagtgt ggccgtttca tatggttatc 3600tttggtgttg tatatatttt ggttggcatg tcttttatgc ttatgttttc ttttatttaa 3660ttcaagctct ttttagtttt actatataca aattctattt cccttattca gcaaaatgga 3720cgattgattt agaattagtc aaaatgtatt tttttatggg gagtaaactc attgtatcaa 3780ctattagtgt atcactattt acacagtgtg atgtgatctt attagagtct cttacaggta 3840caaaagaggc tggggcattt agtgcagctc ttaggttatc agccatctgg tttatgtgtg 3900gaggtttgat agcgaacgct ttttttccaa aaattgttca gcttgaaaaa ataggagagg 3960aagaatcatt tatctttttg aaatggatat gcggagttgt aagtgtaatc tctatatatg 4020gtgcaattat tatgattgct ctgtcaccta taattataaa aatactatat ggcgataata 4080tggatttatc 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gccgctgcgg ttgcctatta tgacagctac 9180cgtgccgctg ttctgcctgc gaacctaatc caggcccagc gcgacta 9227以上所述，仅是本发明较佳实施例，并非对本发明作任何形式限制，凡依本发明技术实质对以上实施例作任何简单修改、等同变化与修饰，仍属本发明技术方案范围。
权利要求
1.一种对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长9227个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是由7个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
3.按照权利要求2所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的基因是转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf1、orf4、orf5、orf7基因；其中所述的基因orf1是SEQ IDNO1中的1097至1912碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO1中的1899至3125碱基的核苷酸；wzx是SEQ ID NO1中的3180至4349碱基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO1中的4419至5285碱基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO1中的5282至5968碱基的核苷酸；orf7是SEQ ID NO1中的7004至7750碱基的核苷酸。
4.按照权利要求1或2所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，它是源于所述的wz基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf1、orf4、orf5、orf7基因；以及它们的混合或它们的重组。
5.按照权利要求4所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于orf1基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的1103至1120碱基的核苷酸和1877至1896碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1194至1213碱基的核苷酸和1763至1780碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的1261至1279碱基的核苷酸和1686至1704碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的1976至1995碱基的核苷酸和3096至3114碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2145至2162碱基的核苷酸和2997至3014碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2249至2268碱基的核苷酸和2834至2850碱基的核苷酸；源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的3183至3191碱基的核苷酸和4261至4278碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3241至3257碱基的核苷酸和4091至4109碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3301至3318碱基的核苷酸和3991至4019碱基的核苷酸；源于orf4基因的寡核苷酸对是SEQID NO1中的4441至4460碱基的核苷酸和5201至5220碱基的核苷酸；SEQ IDNO1中的4501至4520碱基的核苷酸和5115至5132碱基的核苷酸；SEQ IDNO1中的4601至4620碱基的核苷酸和5072至5088碱基的核苷酸；源于orf5基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的5311至5330碱基的核苷酸和5947至5965碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5401至5420碱基的核苷酸和5895至5912碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5501至5520碱基的核苷酸和5828至5846碱基的核苷酸；源于orf7基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的7059至7076碱基的核苷酸和7651至7668碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7099至7106碱基的核苷酸和7521至7540碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7161至7180碱基的核苷酸和7481至7500碱基的核苷酸。
6.权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
7.权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达痢疾志贺氏菌8型的O-抗原，并成为细菌疫苗。
8.按照权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
9.权利要求1所述的对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤(1)基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养痢疾志贺氏菌8型，离心收集细胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃ 30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增痢疾志贺氏菌8型中的O-抗原基因簇以痢疾志贺氏菌8型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(5’-ATT GTG GCTGCA GGG ATC AAA GAA AT-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C-3’)；用BoehringerMannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用BiO-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5a细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5a混合后，转到BiO-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨卞青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了痢疾志贺氏8型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到90％的覆盖率。剩余10％的序列再通过将部分序列反向测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证1)对痢疾志贺氏菌8型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到痢疾志贺氏菌8型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到7个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因的筛选针对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因设计引物；在每个基因内各设计三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，即在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PDR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf1、orf4、orf5、orf7基因对痢疾志贺氏菌8型的O-抗原都是高度特异的。
全文摘要
本发明提供一种对痢疾志贺氏菌8型(Shigelladysenteriae 8)的O－抗原特异的核苷酸，它是痢疾志贺氏菌8型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ IDNO1所示的分离的核苷酸，全长9227个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸；还包括源于痢疾志贺氏菌8型的O－抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对痢疾志贺氏菌8型的O－抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的痢疾志贺氏菌8型的方法。
文档编号C12Q1/68GK1429833SQ03100539
公开日2003年7月16日 申请日期2003年1月20日 优先权日2003年1月20日
发明者王磊, 郭宏杰, 冯露 申请人:南开大学
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