果糖-1，6-二磷酸及其制备方法和用途的制作方法
专利名称：果糖-1，6-二磷酸及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，更明确地说涉及果糖-1，6-二磷酸。本发明还涉及果糖-1，6-二磷酸的制备方法。本发明也涉及果糖-1，6-二磷酸的用途。
背景技术：
果糖-1，6-二磷酸(FDP)是人体正常功能代谢中维持人体必需的中间产物，能够透过受损伤细胞的细胞膜进入到细胞内部直接提高能量，能改善细胞能量代谢，加速细胞恢复正常功能，迅速缓解人体疲劳状态。
果糖-1，6-二磷酸之钠盐和钙盐，可迅速为细胞提供能量，具有调节糖代谢中若干酶活性、活化细胞、提高机体应变能力之功效。
药理上，外源性FDP通常无法跨越细胞膜，但可作用于细胞膜，通过刺激磷酸果糖激酶之活性，聚增细胞内高能磷酸池、细胞内ATP浓度，促进钾离子内流，恢复细胞极化状态，从而有益于休克、缺血、损伤、体内循环、输血等状态下的细胞能量代谢及对葡萄糖的利用，以促进修复，改善功能。
FDP可有效防止外循环对红细胞的损伤，并增加体内ATP的产生，改善缺氧细胞对葡萄糖的利用，有益于红细胞释放氧气，故而可增加缺血性下肢的节段供血，改善肌肉功能，减轻休息中及运动后的肢体疼痛。
FDP还可用于低血糖、胎儿缺氧、酒精中毒的抢救，心脏外科体外循环辅助治疗。糖尿病患者使用FDP具有良好的疗效，同时对各种肝炎引起的深度黄疸、转氨酶升高及低蛋白白血病也有较好的治疗作用。
用于健康人，FDP可消除疲劳、提高精力、提高视力。
该类产品是治疗心血管病的有效药物，有利用改善心肌缺血，对抢救出血性休克、心力衰竭、肝肾功能衰竭等危重病人有较好的效果。随着临床使用的扩大，国内市场销售量可从数吨增至上百吨。
西方发达国家心血系统疾病发病率及糖尿病发病率较中国为高，因此10余年来FDP首先在意大利、美国和日本等工业大国上市，1991年FDP获得美国FDA批准，国际需求很大。
目前，国内心力衰竭患者、低血糖患者、糖尿病患者在几千万人以上，当上述三种病人中若有30％的人使用FDP治疗，估计年使用量在几百吨，市场潜力很大。
自从1905年，英国科学家Harden-Young发现了FDP在人体中的重要生理功能和意义之后，意大利福斯卡玛公司首先成功开发了FDP注射液，但未见其有关FDP制备方法的报道。以往的果糖-1，6-二磷酸制备方法大多采用葡萄糖的磷酸化，例如参见中国专利申请93110528.5，该专利描述了使用干酵母将葡萄糖和无机磷转化为FDP。该方法使用的原料糖是纯葡萄糖，而且干酵母活性低且消耗量较大，总的来说成本较高。又在中国专利申请98112858.0中，描述到使用根霉、犁头霉、毛霉对含有葡萄糖、K2HPO4、MgCl2的溶液进行发酵获得FDP。同样地，该方法使用的原料糖是纯葡萄糖，成本较高；而且所使用的根霉、犁头霉、毛霉的细胞组分和代谢产物中的有些成分对人体有害。
因此，存在对于更有效、更安全的制备FDP的方法的需求。
本申请所使用的酵母可以在简单而又廉价的培养基上生长并达到高细胞浓度。更重要的是，酵母的细胞组分和代谢物对人体是无毒的。本发明中对酵母菌体进行了固定化处理，从而对酵母菌体的消耗较低，并且有利于连续化大规模生产，缩短了工艺时间，产品质量稳定性提高。设备投资较少，废液排放少，可以显著地降低生产成本和保护环境。而且，本发明使用的原料是果糖或果糖浆，导致转化率高于已有技术。
发明内容
本发明的第一个方面是关于一种生产方法，该方法采用酵母菌作为菌种来生物合成FDP。所述方法主要包括用酵母菌与果糖和无机磷作用，将果糖转化为果糖-1，6-二磷酸。
本发明的第二个方面是关于一种生产方法，该方法采用酵母菌作为菌种来生物合成FDP。所述方法主要包括两个阶段，第一阶段是制备果糖浆，第二阶段是将果糖转化为果糖-1，6-二磷酸。
本发明的第三个方面是果糖-1，6-二磷酸。该果糖-1，6-二磷酸采用酵母菌从果糖溶液或者多种来源的果糖浆转化而来，其中果糖-1，6-二磷酸含量较高，不含有对人体有害的成分。
本发明的第四个方面是关于果糖-1，6-二磷酸的用途。果糖-1，6-二磷酸不仅可以用作医药中间体添加到多种药品中，而且可以作为保健品的成分，还可以添加到一些化妆品或食品中。本发明的果糖-1，6-二磷酸也可以添加到动物饲料中。
在本发明所述方法的一个实施方案中，果糖-1，6-二磷酸是通过将含果糖的溶液与固定化酵母接触，使所述含果糖的溶液中的果糖转化得到。在此所用，“接触”是指将两种作用物质适当混合后，置于一定条件下作用一段时间。“含果糖的溶液”包括纯果糖溶液，含有果糖的浆液，例如用将葡萄糖溶液经过葡萄糖异构酶作用形成的果糖浆，或者含有果糖的发酵液。这些含果糖的溶液中含有1)果糖；2)磷酸根；3)镁离子；以及其它成分，包括有意添加的其它成分和自然存在的其它成分。
在所述含果糖的溶液中，果糖的含量为所述含果糖的溶液的10-25wt％，以所述含果糖的溶液的总重量为基准；磷酸根的含量为0.3-0.5mol/L，以所述含果糖的溶液的总体积为基准；镁离子的含量为0.01-0.03mol/L，以所述含果糖的溶液的总体积为基准。
所述含果糖的溶液可以通过在纯果糖溶液，含有果糖的浆液，例如用将葡萄糖溶液经过葡萄糖异构酶作用形成的果糖浆，或者含有果糖的发酵液中补充磷酸根和镁离子制备。
磷酸根是无机磷酸在水中电离形成，也可以是磷酸盐在水中溶解产生，这些磷酸盐可以是磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸镁等，也可以是它们中至少一种或任意至少二种的混合物。
镁离子是镁盐溶解形成，实例包括但不限于氯化镁、硫酸镁、磷酸镁等，也可以是它们中至少一种或任意至少二种的混合物。
所述固定化酵母是这样制备的1)培养酵母菌；2)将酵母菌吸附到树脂上，成为固定化酵母。其典型制备方式为将酵母菌接种于摇瓶中培养5-8h，每分钟以130-140次振荡，然后移入菌种罐扩大培养，培养基选用含糖3.5-4.5％的玉米粉糖化液，pH值6.2-6.4，温度为30-33℃，培养15-18h，收集发酵液，用阴离子交换树脂吸附发酵液，制备含有酵母菌的树脂。
本发明所述方法的另一个实施方案为首先是含淀粉物质转化果糖；然后是含果糖的溶液与固定化酵母接触，将含果糖的溶液中的果糖转化得到果糖-1，6-二磷酸。
所述“含淀粉物质”是指富含淀粉的材料，例如但不限于玉米、木薯、马铃薯、小麦、大麦等。这些材料可以以颗粒、粉状物等形式存在。优选为微细粉状物形式。它们的含水量可以有多种变化。
所述果糖是这样制备的1)将含淀粉物质转化为葡萄糖；2)葡萄糖异构化，形成果糖。其中在步骤1)中将多种原料中的多糖转化为果糖，该过程可以采用酶法、酸法或生物法，优选采用生物法。其中在步骤2)中利用了葡萄糖异构酶，有时本发明中也简称为异构酶。可以将该酶加入溶液中或者制成固定化酶使用。如果采用固定化葡萄糖异构酶，装柱后，称为固定化酶异构柱或者简称异构柱。
所述酸法是指酸水解法，是用盐酸之类的无机酸对淀粉进行水解。在稀淀粉悬浮液中，酸水解几乎将淀粉完全转化为葡萄糖。在实际工艺中，用稀淀粉悬浮液是不切实际的，这类酸水解通常在含20％淀粉悬浮液、pH2和140℃的条件下进行。用碳酸钠中和水解物(结果形成无机盐)，然后精制葡萄糖浆。通过将葡萄糖浆置于碱性条件和高温环境中，化学转化葡萄糖为果糖。
所述酶法是指利用酶获得果糖浆，可分为全酶法和混合法。全酶法指整个过程都使用酶，混合法指某个阶段使用酶。将淀粉转化为糊精和糖时可以使用三类淀粉水解酶，即α-淀粉水解酶，葡萄糖淀粉酶，支链淀粉酶和其它脱支酶。将葡萄糖转化为果糖浆时可以采用D-葡萄糖异构酶完成。这些方法可以与上述酸水解法结合使用，即混合法。也可以使用固定化酶。固定化酶，又称为水不溶酶或固相酶，是指水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物；在催化反应中它以固相状态作用于底物。
所述生物法是指利用生物体制备果糖浆。可以将分泌淀粉酶的微生物和分泌异构化酶的微生物，或者也可以使用工程菌，对含淀粉物质进行联合作用，使其转化为含有果糖的浆液。
酵母是真菌类生物中的一个类别，例如包括酵母属(Saccharomycesspp.)，如酿酒酵母(S.cerevisiae)，卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)，鲁氏酵母(S.rouxii)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces spp.)，例如脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)，乳酸克鲁维酵母(K.1actis)；假丝酵母属(Candida spp.)，例如假热带假丝酵母(C.pseudotropicalis)，热带假丝酵母(C.tropicalis)。
对于酵母菌的培养，可以采用固体发酵法和液体发酵法制备。
固体发酵法是采用固体培养基培养酵母菌，设备和投资较低，但是人员费用高。所用设备有发酵盘，锅炉，烘干机，接菌设备，分析化验仪器，搅拌机等。
液体发酵法是采用液体培养基培养酵母菌，设备和投资较高，但是人员费用较低。所用设备有发酵罐，种子罐，锅炉，烘干机，接菌设备，分析化验仪器，搅拌机等。
酵母菌的固定化是指将酵母菌利用物理或者化学的手段固定到支持物上的过程，所得酵母称为固定化酵母，本发明中有时也将其称为生物酵母固定化酶；装柱后，本发明将其称为“含有固定化酵母的固定化酶柱”。物理的方法有吸附、包埋等，化学的方法包括使用胶联剂等。支持物，也可以称为载体，例如树脂等。总之，只要这些方法和支持物对于酵母的生物活性，或者一定的生物活性没有影响，或者具有可以接受的影响，那么均可采用。所以酵母的固定化可以有各种变通方式，所用材料也可以有所变化，但是只要不背离本发明的宗旨，即利用固定化酵母从果糖制备出果糖-1，6-二磷酸，那么均是在本发明的范围内。
本发明所述酵母不仅包括上述种类，也包括实施例中使用的各种类，以及其它种类，只要这种酵母满足生产的需要，也即能够高效地将果糖转化为果糖-1，6-二磷酸。当然，对各种酵母进行诱变筛选、基因工程操作所得的菌种也可能用于本发明中。
镁离子可以促进异构酶的作用，所以在本发明的一个实施方案中，将步骤1)所得产物按照每立方米加入约0.1-0.8kg的含镁盐，并调整pH为7.5-8.2，通过流过含有固定化异构酶的异构柱，进行异构化。
所述含果糖的溶液可以间歇地流经含有固定化酵母的固定化酶柱，也可以连续地流经含有固定化酵母的固定化酶柱。
以含淀粉物质为原料生产FDP的方法用于工艺中时可以精确设计两个阶段的作用，使其发生协调作用，整合为一个完整工艺。
本发明所述制备果糖-1，6-二磷酸的方法还可以进一步包括对经过固定化酵母转化的溶液进行精制。
所述精制过程包括加入活性炭脱色，经过过滤除杂，经过离子交换层析柱。其中所述阴离子树脂吸附在温度为30-35℃，pH6.5-7.0下进行，吸附后经过洗脱，洗脱液中果糖-1，6-二磷酸的含量为2-3％，纯度达到99％以上。
本发明所述制备果糖-1，6-二磷酸的方法还可以进一步包括将上述精制产物转变为果糖-1，6-二磷酸的干燥品，其过程是将所得洗脱液经过浓缩，95％乙醇沉淀，用水再次溶解沉淀物，再次加入乙醇溶液得到无色晶体，过滤，结晶，干燥得到果糖-1，6-二磷酸的干燥品。再进行第一次结晶，用水溶解结晶物质，再次结晶，过滤，干燥，制得果糖-1，6-二磷酸成品。
本发明的优点在于1)本合成工艺的原料来源广泛，符合我国农产品深加工产业政策。生产设备投资低，有利投资回收。
2)由于采用固定化酵母柱进行连续化生产，无需购置发酵罐、酵母离心机、板框过滤机等昂贵设备。酵母最适生长pH值比大多细菌的要低一些，且对能抑制细菌生长的抗生素不敏感。因此，大量的酵母培养物可免遭生长迅速的细菌的污染，因为它们个体大，因此酵母菌比细菌更易收获且更便宜。目前用于工业生产的酵母菌并没出现公共健康危害问题。
3)产品转化率高，质量稳定采用固定化酵母连续化生产，生产过程稳定，易于控制，反应条件温和，转化率可达70％以上，现有工艺仅可达50％。工艺中由于多次采用离子交换技术，提高了产品质量。其中果糖-1，6-二磷酸的耐热性由原来的40℃提高到60℃有利于产品的储藏及其稳定性的提高。
4)生产成本低固定化酵母技术的应用，大大提高了工艺物料的干固物含量，减少蒸发程序，降低了蒸气消耗，与现有工艺比较，可节省生产成本约20％。
5)显著的环保效益连续性生产其中有用成分的提高，约增加一倍，同样的生产能力减少发酵废液排放量一半以上，有利于环境保护。
本发明所制备的果糖-1，6-二磷酸含有的菌体成分和代谢物较少，纯度较高，热稳定性有显著提高，可以用于制备药物，例如可以制成注射液、口服液、胶囊。它是急性心肌梗塞、心功能不全、冠心病、心肌缺血发作的急救良药。并且本发明所制备的果糖-1，6-二磷酸杂质较少，可以通过与其它盐分作用，制成钠盐、钙盐等，便于人体吸收和利用。本发明所述果糖-1，6-二磷酸也可以与其它物质混合使用，例如天冬氨酸钠盐、牛磺酸、氨基酸、珍珠粉、维生素、乳酸钙等配合使用。本发明所述果糖-1，6-二磷酸也可以与植物提取物，特别是一些中草药提取物结合使用。本发明的果糖-1，6-二磷酸也可以加入到食物或饮料中，补充健康人群或特殊人群的营养需求。本发明的果糖-1，6-二磷酸也可以加入到化妆品中。本发明的果糖-1，6-二磷酸也可以加入到动物饲料和药品中。在制成含有本发明所述果糖-1，6-二磷酸的制品时，可以加入多种添加剂，例如甜味剂、抗氧化剂和防腐剂。
本发明所述果糖-1，6-二磷酸尤其适合于制成针对亚健康人群的营养品。果糖-1，6-二磷酸是人体正常功能代谢中维持人体必需的中间产物，能够透过受损伤细胞的细胞膜进入到细胞内部直接提高能量，能改善细胞能量代谢，加速细胞恢复正常功能，迅速缓解人体疲劳状态。
具体实施例方式
在此所用，“原料”指工艺开始的材料，在本发明的一个实施方案中，是指“含果糖的溶液”，包括纯果糖溶液，含有果糖的浆液，例如用将葡萄糖溶液经过葡萄糖异构酶作用形成的果糖浆，或者含有果糖的发酵液。这些含果糖的溶液中含有1)果糖；2)磷酸根；3)镁离子；以及其它成分，包括有意添加的其它成分和自然存在的其它成分。在本发明的另一个实施方案中，“原料”包括各种富含淀粉的物质，例如土豆块茎、木薯和白薯，以及小麦、玉米、大麦和高粱的种子中的物质，也包括一些工艺的废物，只要其富含淀粉，满足本发明的需要即可；也指从其它厂商处购买的半成品，只要其经过一定工艺可以转化为果糖浆。上述举例并非限定性的。
在此所用，“淀粉”是指D-葡萄糖的线性或分支状均聚物的混合物。在植物中，淀粉作为碳水化合物的储存物而形成。不同植物来源的材料中，淀粉的类型和分支状况有所差异，将其转化为果糖浆的工艺过程应根据具体情况有所变化。本发明中的“淀粉”也指发生了一定的水解的淀粉衍生物。
在此所用，“果糖浆”是指用各种方法将原料转化为制备果糖-1，6-二磷酸的直接原料。根据工艺的不同，所述果糖浆中的果糖含量可有所变化，其酸碱度、盐含量及其它成分可有所变化。当然这种变化与最初所用的原材料有关。果糖浆在用于转化之前可以对其成分进行调节，以满足第二阶段工艺的需求。
在此所用，“果糖-1，6-二磷酸”是指FDP，也称为1，6-二磷酸果糖，英文为Fructose-1，6-diphophate。有些人也用新词“生物果糖”称呼。各种表述只要它们实质是指果糖-1，6-二磷酸，那么就应看作为本发明所述果糖-1，6-二磷酸。果糖-1，6-二磷酸的含量在最终产品中可以有所变化。本发明所述果糖-1，6-二磷酸是用生物体转化所得，具体而言是用酵母菌转化所得，有时也将利用生物体实现物质转变称为“生物合成”。
在此所用，“异构化”是指将葡萄糖异构化为果糖。
在此所用，“转化”是指一种物质经过一定的作用过程变成另外一种物质的过程。其涵义等同于“转变”、“变化”、“变成”“成为”等。在本发明中，“淀粉变成葡萄糖”、“葡萄糖变成果糖”、“果糖成为果糖-1，6-二磷酸”等均可以用上述各种同义说法表述。以及“生物体转化”等术语中，“转化”有同样的涵义；在此情形下，是指利用生物体实现物质的转变。
以下为本发明所述方法的一个实施方案所使用的原料、具体工艺和相关的测试数据，主要说明本发明所述方法利用含淀粉物质生产果糖-1，6-二磷酸的优越性，并不限定本发明所包括的范围，正如本技术领域的技术人员所理解的那样，这里的描述仅仅是例举性的，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。并且下面的叙述也同样说明了本发明的另外一个实施方案的优越性，也就是直接使用含果糖溶液的技术方案。
一、主要原料(按生产1.0t果糖-1，6-二磷酸计)1.优质玉米3.5-3.8t2.液化酶0.45-0.47kg3.糖化酶0.8-0.9kg4.异构酶0.09-0.11kg5.生物酵母菌0.1-0.12t二、果糖-1，6-二磷酸合成工艺介绍1.首先是原料果糖的制备原料玉米品质要求为淀粉含量≥74％，杂质≤1.0％，水份≤14.0，不完善粒≤10.0，霉变粒≤1.0。取优质玉米过筛，风选除杂，用0.3-0.5％亚硫酸溶液浸泡45-50h，经湿磨法处理分离出玉米蛋白、胚芽、玉米皮，得到玉米淀粉浆液。
调整玉米浆液为波美度17-22，pH值5.8-6.5，加入NOVO公司低钙、低pH液化酶，利用液化喷射器在温度105-110℃条件下喷射液化，并维持95-100℃、1.5-2h，达到液化DE值12-15％，经140℃高温灭酶后降温至58-62℃，调pH值为3.8-4.8，加入NOVO产复合糖化酶进行糖化，48-60h，达DE值95％以上，然后加入硅藻土、活性碳进行糖液脱脂、脱色处理，达到透光度≥99％，色度≤0.005，进入由阳树脂和阴树脂组成的树脂复床进行离子交换，除去无机盐灰分，达电导率10us/cm以下，进入蒸发系统浓度由30％-33％蒸发至于40-45％，并加入0.1kg/m3糖液的硫酸镁，pH值调整为7.5-8.2，进入由固定化异构酶装填的异构柱中进行连续异构化，将果糖含量提升到了42％以上，然后再加入活性碳进一步脱色处理后进入二次离子交换柱进行离子交换，电导率达到1cu/cm以下，然后进入果糖分离系统，由分离树脂填充的模拟移动床中进行色谱分离，分离温度75-80℃，分离后达到果糖含量≥95％以上的果糖溶液，将其浓度调整为10-30％，pH值6.5-7.5，作为生产果糖-1，6-二磷酸的原料备用。
2.固定化生物酵母酶的制备优选酵母菌种，例如将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candida)、球拟酵母(Torulopsis)、假丝酵母(Candida)等菌种选株接种于摇瓶中培养4-5h，每分钟以130-140次振荡，然后移入培养液中培养10-15h后，收集菌体，用甩干机分离出菌体，菌体中加入用于破壁处理的溶剂进行破壁处理后，加入纯水进行稀释，活化菌体3-4h，然后通过由阴离子交换树脂组成的离子交换柱，利用离子交换树脂的吸附作用将菌体吸附在树脂骨架上，这样就制备成了生物酵母固定化酶。
3.果糖-1，6-二磷酸制备将果糖溶液加入0.4mol/L磷酸钠，0.01mol/L硫酸镁，在40-45℃条件下，按0.1-0.15Bv/h流速自上而下通过生物酵母固定化酶柱，进行生物反应，得到含有果糖-1，6-二磷酸8-10％浓度的溶液。
4.果糖-1，6-二磷酸的精制、结晶工艺将上述溶液首先加入活性碳进行脱色除杂处理，处理后通过由氯型阴离子交换树脂树脂组成的离子交换树脂层析柱，这样果糖-1，6-二磷酸将被树脂吸附，其他杂质则留在溶液中，弃去，树脂吸附饱合后进行梯度洗脱，以增加果糖-1，6-二磷酸纯度。
吸附条件为温度为30-35℃，pH6.5-7.0，果糖-1，6-二磷酸含量5-7％，洗脱后果糖-1，6-二磷酸含量约2-3％，纯度达99％以上，然后进一步蒸发浓缩至15-20％，加入95％乙醇得到白色沉淀，过滤浮沉淀物，加水溶解沉淀，再次加入乙醇溶液，得无色晶体，过滤、结晶、干燥得果糖-1，6-二磷酸成品。
三、菌种的培养及提取、固定化第一组试验将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种于摇瓶培养4-5h，每分钟以130-140次振荡，后移入菌种罐扩大培养，培养基选用含糖3.5-4.5％的玉米粉糖化液，pH值为6.2-6.4，温度为30-33℃，培养10-14h后收集发酵液，用阴离子交换树脂吸附发酵液，菌体则被吸附在树脂骨架上，成为固定化酵母菌，测示其含菌量为121.1mg/g干树脂。
第二组试验将粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)接种于摇瓶中培养5-6h，每分钟以130-140次振荡，后移入菌种罐扩大培养，培养基选用3.5-4.5％的玉米粉糖化液，pH值为6.2-6.4，温度为30-33℃，培养12-15h后，收集发酵液用阴离子交换树脂吸附发酵液，吸附饱合后，测定树脂含菌量为113.8mg/g干树脂。
第三组试验将球拟酵母(Torulopsis)接种于摇瓶中培养5-6h，每分钟以130-140次振荡，后移入菌种罐扩大培养，培养基选用含糖3.5-4.5％的玉米粉糖化液，pH值6.2-6.4，温度为30-33℃，培养15-18h，收集发酵液，用阴离子交换树脂吸附发酵液，测示树脂含菌量为136.2mg/g干树脂。
第四组试验将假丝酵母(Candida)接种于摇瓶中培养5-6h，每分钟以130-140次振荡，后移入菌种罐扩大培养，培养基选用含糖3.5-4.5％的玉米粉糖化液，pH值6.2-6.4，温度为30-33℃，培养15-18h，收集发酵液，用阴离子交换树脂吸附发酵液，测示树脂含菌量为135.2mg/g干树脂。
四、产品性能比较 从上表可以看出，新工艺做出的果糖-1，6-二磷酸在含量高出市售产品3个百分点，且无机灰分含量明显低于市售产品，而耐热性远高于市售原工艺生产的产品。
五、产品转化率对比以投入1.0t玉米为基料，产出果糖-1，6-二磷酸量对比
从以上对比数据可以看出，原工艺平均收率为48.55％，新合成工艺为69.97％，新工艺较原工艺高出约20个百分点。
注解原工艺，即传统工艺，是以葡萄糖为直接原料，利用啤酒酵母进行转化的生产工艺。
实施例为了更明确的说明本发明，特别给出如下的实施例，但是本发明仅仅受所附权利要求的限制。这些实施例仅仅是用于说明的，正如本领域技术人员所理解的那样，它们不能用来限制本发明的范围。其中实施例1-4是有关本发明所述以含果糖的溶液为原料的技术方案，实施例5是有关本发明所述以含淀粉物质为原料的技术方案。
实施例1选用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，进行放大培养，12h后收集菌体，离子交换树脂固定化后，取20％果糖溶液加入0.38mol/LNa2HPO4，0.015mol/L MgSO4，调pH为6.8-7.1，在40-42℃以0.1Bv/h条件下通过固定化酵母柱，测定流出液中果糖-1，6-二磷酸含量为80.3g，按上述流程纯化后得果糖-1，6-二磷酸71.3g。
实施例2取假丝酵母(Candida)进行放大培养，10h后收集菌体离子交换树脂固定化后，取21.2％果糖溶液加0.36mol/L Na2HPO4，0.02mol/LMgSO4后调pH为6.5-7.0，38-40℃条件下，通过固定化酵母柱，测定流出液中果糖-1，6-二磷酸含量为78.3g，按上述流程精制后得果糖-1，6-二磷酸69.2g。
实施例3
取球拟酵母(Torulopsis)进行放大培养，18h后，收集菌体，离子交换树脂固定化后，取19.5％果糖溶液加入0.42mol/L Na2HPO4，0.013mol/L MgSO4，在pH6.8，温度43-45℃条件以0.1Bv/h通过固定化酵母柱，测定出液得果糖-1，6-二磷酸89.1g，按上述流程精制后，得果糖-1，6-二磷酸78.8g。
实施例4取假丝酵母(Candida)进行放大培养，18h后，收集菌体，离子交换树脂固定化后，取19.5％果糖溶液加入0.42mol/L Na2HPO4，0.013mol/L MgSO4，在pH6.8，温度43-45℃条件以0.1Bv/h通过固定化酵母柱，测定出液得果糖-1，6-二磷酸79.5g，按上述流程精制后，得果糖-1，6-二磷酸68.0g。
实施例5以玉米为原料生产果糖-1，6-二磷酸。
1).原料果糖的制备原料玉米品质要求为淀粉含量≥74％，杂质≤1.0％，水份≤14.0，不完善粒≤10.0，霉变粒≤1.0。取优质玉米过筛，风选除杂，用0.3-0.5％亚硫酸溶液浸泡45-50h，经湿磨法处理分离出玉米蛋白、胚芽、玉米皮，得到玉米淀粉浆液。
调整玉米浆液为波美度17-22，pH值5.8-6.5，加入NOVO公司低钙、低pH液化酶，利用液化喷射器在温度105-110℃条件下喷射液化，并维持95-100℃、1.5-2h，达到液化DE值12-15％，经140℃高温灭酶后降温至58-62℃，调pH值为3.8-4.8，加入NOVO产复合糖化酶进行糖化，48-60h，达DE值95％以上，然后加入硅藻土、活性碳进行糖液脱脂、脱色处理，达到透光度≥99％，色度≤0.005，进入由阳树脂和阴树脂组成的树脂复床进行离子交换，除去无机盐灰分，达电导率10us/cm以下，进入蒸发系统浓度由30％-33％蒸发至于40-45％，并加入0.1kg/m3糖液的硫酸镁，pH值调整为7.5-8.2，进入由固定化异构酶装填的异构柱中进行连续异构化，将果糖含量提升到了42％以上，然后再加入活性碳进一步脱色处理后进入二次离子交换柱进行离子交换，电导率达到1cu/cm以下，然后进入果糖分离系统，由分离树脂填充的模拟移动床中进行色谱分离，分离温度75-80℃，分离后达到果糖含量≥95％以上的果糖溶液，将其浓度调整为10-30％，pH值6.5-7.5，作为生产果糖-1，6-二磷酸的原料备用。
2).固定化生物酵母酶的制备酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)选株接种于摇瓶中培养4-5h，每分钟以130-140次振荡，然后移入培养液中培养10-15h后，收集菌体，用甩干机分离出菌体，菌体中加入溶剂(例如甲苯，Triton-X 100等)进行破壁处理后，加入纯水进行稀释，活化菌体3-4h，然后通过由阴离子交换树脂组成的离子交换柱，利用离子交换树脂的吸附作用将菌体吸附在树脂骨架上，这样就制备成了固定化酵母。
3).果糖-1，6-二磷酸制备将步骤1)所得的果糖溶液加入0.4mol/L磷酸钠，0.01mol/L硫酸镁，在40-45℃条件下，按0.1-0.15Bv/h流速自上而下通过填装固定化酵母树脂的层析柱，进行生物反应，得到含有果糖-1，6-二磷酸8-10％浓度的溶液。
4).果糖-1，6-二磷酸的精制、结晶工艺将上述步骤3)所得溶液首先加入活性碳进行脱色除杂处理，处理后通过由氯型阴离子交换树脂树脂组成的离子交换树脂层析柱，这样果糖-1，6-二磷酸将被树脂吸附，其他杂质则留在溶液中，弃去，树脂吸附饱合后进行梯度洗脱，以增加果糖-1，6-二磷酸纯度。
吸附条件为温度为30-35℃，pH6.5-7.0，果糖-1，6-二磷酸含量5-7％，洗脱后果糖-1，6-二磷酸含量约2-3％，纯度达99％以上，然后进一步蒸发浓缩至15-20％，加入95％乙醇得到白色沉淀，过滤浮沉淀物，加水溶解沉淀，再次加入乙醇溶液，得无色晶体，过滤、结晶、干燥得果糖-1，6-二磷酸成品。
权利要求
1.一种制备果糖-1，6-二磷酸的方法，其特征在于该方法包括将含果糖的溶液与固定化酵母接触，使所述含果糖的溶液中的果糖转化得到果糖-1，6-二磷酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含果糖的溶液包括1).果糖；2).磷酸根；3).镁离子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述含果糖的溶液中，其中所述果糖的含量在所述含果糖的溶液为10-25wt％，以所述含果糖的溶液的总重量为基准；所述磷酸根的含量为0.3-0.5mol/L，以所述含果糖的溶液的总体积为基准；所述镁离子的含量为0.01-0.03mol/L，以所述含果糖的溶液的总体积为基准。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述含果糖的溶液中的所述磷酸根是来自向含果糖的溶液中添加选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸镁、磷酸的至少一种或其任意至少二种的组合；所述镁离子是来自向含果糖的溶液中添加选自氯化镁、硫酸镁、磷酸镁的至少一种或其任意至少二种的组合。
5.一种制备果糖-1，6-二磷酸的方法，其特征在于该方法主要包括第一阶段是将含淀粉物质向果糖的转化；第二阶段是将含果糖的溶液与固定化酵母接触，将含果糖的溶液中的果糖转化得到果糖-1，6-二磷酸。
6.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于其中所述固定化酵母的制备包括如下步骤1).培养酵母菌；2).将酵母菌吸附到树脂上，成为固定化酵母。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述果糖的制备包括如下步骤1).将含淀粉物质转化为葡萄糖；2).葡萄糖异构化形成果糖。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤1)采用酸水解法和/或酶催化法；所述步骤2)是将异构酶固定化形成固定化酶异构柱；将步骤1)所得产物按照每立方米加入约0.1-0.8kg的含镁盐，并调整pH为7.5-8.2，通过异构柱，进行异构化。
9.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于所述的将含果糖的溶液与固定化酵母接触，是将所述含果糖的溶液间歇地或者连续地流经含有固定化酵母的固定化酶柱。
10.如权利要求5或7所述的方法，其特征在于所述含淀粉物质选自玉米、小麦、大麦、木薯中的至少一种或其任意至少二种的组合。
11.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于进一步可以包括将转化所得的含果糖-1，6-二磷酸的溶液进行精制。
12.如权利要求11所述方法，其特征在于所述精制过程包括脱色除杂，用氯型阴离子树脂吸附，其中所述阴离子树脂吸附在温度为30-35℃，pH为6.5-7.0下进行，吸附后经过洗脱，洗脱液中果糖-1，6-二磷酸的含量为2-3％，纯度达到99％以上。
13.如权利要求11所述方法，其特征在于进一步可以包括制备果糖-1，6-二磷酸的干燥品。
14.如权利要求13所述方法，其特征在于所述制备果糖-1，6-二磷酸的干燥品的过程是将所得洗脱液经过浓缩，95％乙醇沉淀，用水再次溶解沉淀物，再次加入乙醇溶液得到无色晶体，过滤，结晶，干燥得到果糖-1，6-二磷酸的干燥品。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法制备的含有果糖-1，6-二磷酸的物质。
16.如权利要求15所述的含有果糖-1，6-二磷酸的物质在用于制药、营养品添加剂、化妆品添加剂、食品添加剂等方面的用途。
全文摘要
本发明提供了一种制备果糖－1，6－二磷酸的方法，其特征在于该方法包括将含果糖的溶液与固定化酵母接触，使所述含果糖的溶液中的果糖转化得到果糖－1，6－二磷酸。本发明也涉及用该方法制备的果糖－1，6－二磷酸及其用途。
文档编号C12P19/02GK1519245SQ0310072
公开日2004年8月11日 申请日期2003年1月20日 优先权日2003年1月20日
发明者赵建安, 付海峰 申请人:赵建安, 付海峰
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，更明确地说涉及果糖-1，6-二磷酸。本发明还涉及果糖-1，6-二磷酸的制备方法。本发明也涉及果糖-1，6-二磷酸的用途。
背景技术：
果糖-1，6-二磷酸(FDP)是人体正常功能代谢中维持人体必需的中间产物，能够透过受损伤细胞的细胞膜进入到细胞内部直接提高能量，能改善细胞能量代谢，加速细胞恢复正常功能，迅速缓解人体疲劳状态。
果糖-1，6-二磷酸之钠盐和钙盐，可迅速为细胞提供能量，具有调节糖代谢中若干酶活性、活化细胞、提高机体应变能力之功效。
药理上，外源性FDP通常无法跨越细胞膜，但可作用于细胞膜，通过刺激磷酸果糖激酶之活性，聚增细胞内高能磷酸池、细胞内ATP浓度，促进钾离子内流，恢复细胞极化状态，从而有益于休克、缺血、损伤、体内循环、输血等状态下的细胞能量代谢及对葡萄糖的利用，以促进修复，改善功能。
FDP可有效防止外循环对红细胞的损伤，并增加体内ATP的产生，改善缺氧细胞对葡萄糖的利用，有益于红细胞释放氧气，故而可增加缺血性下肢的节段供血，改善肌肉功能，减轻休息中及运动后的肢体疼痛。
FDP还可用于低血糖、胎儿缺氧、酒精中毒的抢救，心脏外科体外循环辅助治疗。糖尿病患者使用FDP具有良好的疗效，同时对各种肝炎引起的深度黄疸、转氨酶升高及低蛋白白血病也有较好的治疗作用。
用于健康人，FDP可消除疲劳、提高精力、提高视力。
该类产品是治疗心血管病的有效药物，有利用改善心肌缺血，对抢救出血性休克、心力衰竭、肝肾功能衰竭等危重病人有较好的效果。随着临床使用的扩大，国内市场销售量可从数吨增至上百吨。
西方发达国家心血系统疾病发病率及糖尿病发病率较中国为高，因此10余年来FDP首先在意大利、美国和日本等工业大国上市，1991年FDP获得美国FDA批准，国际需求很大。
目前，国内心力衰竭患者、低血糖患者、糖尿病患者在几千万人以上，当上述三种病人中若有30％的人使用FDP治疗，估计年使用量在几百吨，市场潜力很大。
自从1905年，英国科学家Harden-Young发现了FDP在人体中的重要生理功能和意义之后，意大利福斯卡玛公司首先成功开发了FDP注射液，但未见其有关FDP制备方法的报道。以往的果糖-1，6-二磷酸制备方法大多采用葡萄糖的磷酸化，例如参见中国专利申请93110528.5，该专利描述了使用干酵母将葡萄糖和无机磷转化为FDP。该方法使用的原料糖是纯葡萄糖，而且干酵母活性低且消耗量较大，总的来说成本较高。又在中国专利申请98112858.0中，描述到使用根霉、犁头霉、毛霉对含有葡萄糖、K2HPO4、MgCl2的溶液进行发酵获得FDP。同样地，该方法使用的原料糖是纯葡萄糖，成本较高；而且所使用的根霉、犁头霉、毛霉的细胞组分和代谢产物中的有些成分对人体有害。
因此，存在对于更有效、更安全的制备FDP的方法的需求。
本申请所使用的酵母可以在简单而又廉价的培养基上生长并达到高细胞浓度。更重要的是，酵母的细胞组分和代谢物对人体是无毒的。本发明中对酵母菌体进行了固定化处理，从而对酵母菌体的消耗较低，并且有利于连续化大规模生产，缩短了工艺时间，产品质量稳定性提高。设备投资较少，废液排放少，可以显著地降低生产成本和保护环境。而且，本发明使用的原料是果糖或果糖浆，导致转化率高于已有技术。
发明内容
本发明的第一个方面是关于一种生产方法，该方法采用酵母菌作为菌种来生物合成FDP。所述方法主要包括用酵母菌与果糖和无机磷作用，将果糖转化为果糖-1，6-二磷酸。
本发明的第二个方面是关于一种生产方法，该方法采用酵母菌作为菌种来生物合成FDP。所述方法主要包括两个阶段，第一阶段是制备果糖浆，第二阶段是将果糖转化为果糖-1，6-二磷酸。
本发明的第三个方面是果糖-1，6-二磷酸。该果糖-1，6-二磷酸采用酵母菌从果糖溶液或者多种来源的果糖浆转化而来，其中果糖-1，6-二磷酸含量较高，不含有对人体有害的成分。
本发明的第四个方面是关于果糖-1，6-二磷酸的用途。果糖-1，6-二磷酸不仅可以用作医药中间体添加到多种药品中，而且可以作为保健品的成分，还可以添加到一些化妆品或食品中。本发明的果糖-1，6-二磷酸也可以添加到动物饲料中。
在本发明所述方法的一个实施方案中，果糖-1，6-二磷酸是通过将含果糖的溶液与固定化酵母接触，使所述含果糖的溶液中的果糖转化得到。在此所用，“接触”是指将两种作用物质适当混合后，置于一定条件下作用一段时间。“含果糖的溶液”包括纯果糖溶液，含有果糖的浆液，例如用将葡萄糖溶液经过葡萄糖异构酶作用形成的果糖浆，或者含有果糖的发酵液。这些含果糖的溶液中含有1)果糖；2)磷酸根；3)镁离子；以及其它成分，包括有意添加的其它成分和自然存在的其它成分。
在所述含果糖的溶液中，果糖的含量为所述含果糖的溶液的10-25wt％，以所述含果糖的溶液的总重量为基准；磷酸根的含量为0.3-0.5mol/L，以所述含果糖的溶液的总体积为基准；镁离子的含量为0.01-0.03mol/L，以所述含果糖的溶液的总体积为基准。
所述含果糖的溶液可以通过在纯果糖溶液，含有果糖的浆液，例如用将葡萄糖溶液经过葡萄糖异构酶作用形成的果糖浆，或者含有果糖的发酵液中补充磷酸根和镁离子制备。
磷酸根是无机磷酸在水中电离形成，也可以是磷酸盐在水中溶解产生，这些磷酸盐可以是磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸镁等，也可以是它们中至少一种或任意至少二种的混合物。
镁离子是镁盐溶解形成，实例包括但不限于氯化镁、硫酸镁、磷酸镁等，也可以是它们中至少一种或任意至少二种的混合物。
所述固定化酵母是这样制备的1)培养酵母菌；2)将酵母菌吸附到树脂上，成为固定化酵母。其典型制备方式为将酵母菌接种于摇瓶中培养5-8h，每分钟以130-140次振荡，然后移入菌种罐扩大培养，培养基选用含糖3.5-4.5％的玉米粉糖化液，pH值6.2-6.4，温度为30-33℃，培养15-18h，收集发酵液，用阴离子交换树脂吸附发酵液，制备含有酵母菌的树脂。
本发明所述方法的另一个实施方案为首先是含淀粉物质转化果糖；然后是含果糖的溶液与固定化酵母接触，将含果糖的溶液中的果糖转化得到果糖-1，6-二磷酸。
所述“含淀粉物质”是指富含淀粉的材料，例如但不限于玉米、木薯、马铃薯、小麦、大麦等。这些材料可以以颗粒、粉状物等形式存在。优选为微细粉状物形式。它们的含水量可以有多种变化。
所述果糖是这样制备的1)将含淀粉物质转化为葡萄糖；2)葡萄糖异构化，形成果糖。其中在步骤1)中将多种原料中的多糖转化为果糖，该过程可以采用酶法、酸法或生物法，优选采用生物法。其中在步骤2)中利用了葡萄糖异构酶，有时本发明中也简称为异构酶。可以将该酶加入溶液中或者制成固定化酶使用。如果采用固定化葡萄糖异构酶，装柱后，称为固定化酶异构柱或者简称异构柱。
所述酸法是指酸水解法，是用盐酸之类的无机酸对淀粉进行水解。在稀淀粉悬浮液中，酸水解几乎将淀粉完全转化为葡萄糖。在实际工艺中，用稀淀粉悬浮液是不切实际的，这类酸水解通常在含20％淀粉悬浮液、pH2和140℃的条件下进行。用碳酸钠中和水解物(结果形成无机盐)，然后精制葡萄糖浆。通过将葡萄糖浆置于碱性条件和高温环境中，化学转化葡萄糖为果糖。
所述酶法是指利用酶获得果糖浆，可分为全酶法和混合法。全酶法指整个过程都使用酶，混合法指某个阶段使用酶。将淀粉转化为糊精和糖时可以使用三类淀粉水解酶，即α-淀粉水解酶，葡萄糖淀粉酶，支链淀粉酶和其它脱支酶。将葡萄糖转化为果糖浆时可以采用D-葡萄糖异构酶完成。这些方法可以与上述酸水解法结合使用，即混合法。也可以使用固定化酶。固定化酶，又称为水不溶酶或固相酶，是指水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物；在催化反应中它以固相状态作用于底物。
所述生物法是指利用生物体制备果糖浆。可以将分泌淀粉酶的微生物和分泌异构化酶的微生物，或者也可以使用工程菌，对含淀粉物质进行联合作用，使其转化为含有果糖的浆液。
酵母是真菌类生物中的一个类别，例如包括酵母属(Saccharomycesspp.)，如酿酒酵母(S.cerevisiae)，卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)，鲁氏酵母(S.rouxii)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces spp.)，例如脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)，乳酸克鲁维酵母(K.1actis)；假丝酵母属(Candida spp.)，例如假热带假丝酵母(C.pseudotropicalis)，热带假丝酵母(C.tropicalis)。
对于酵母菌的培养，可以采用固体发酵法和液体发酵法制备。
固体发酵法是采用固体培养基培养酵母菌，设备和投资较低，但是人员费用高。所用设备有发酵盘，锅炉，烘干机，接菌设备，分析化验仪器，搅拌机等。
液体发酵法是采用液体培养基培养酵母菌，设备和投资较高，但是人员费用较低。所用设备有发酵罐，种子罐，锅炉，烘干机，接菌设备，分析化验仪器，搅拌机等。
酵母菌的固定化是指将酵母菌利用物理或者化学的手段固定到支持物上的过程，所得酵母称为固定化酵母，本发明中有时也将其称为生物酵母固定化酶；装柱后，本发明将其称为“含有固定化酵母的固定化酶柱”。物理的方法有吸附、包埋等，化学的方法包括使用胶联剂等。支持物，也可以称为载体，例如树脂等。总之，只要这些方法和支持物对于酵母的生物活性，或者一定的生物活性没有影响，或者具有可以接受的影响，那么均可采用。所以酵母的固定化可以有各种变通方式，所用材料也可以有所变化，但是只要不背离本发明的宗旨，即利用固定化酵母从果糖制备出果糖-1，6-二磷酸，那么均是在本发明的范围内。
本发明所述酵母不仅包括上述种类，也包括实施例中使用的各种类，以及其它种类，只要这种酵母满足生产的需要，也即能够高效地将果糖转化为果糖-1，6-二磷酸。当然，对各种酵母进行诱变筛选、基因工程操作所得的菌种也可能用于本发明中。
镁离子可以促进异构酶的作用，所以在本发明的一个实施方案中，将步骤1)所得产物按照每立方米加入约0.1-0.8kg的含镁盐，并调整pH为7.5-8.2，通过流过含有固定化异构酶的异构柱，进行异构化。
所述含果糖的溶液可以间歇地流经含有固定化酵母的固定化酶柱，也可以连续地流经含有固定化酵母的固定化酶柱。
以含淀粉物质为原料生产FDP的方法用于工艺中时可以精确设计两个阶段的作用，使其发生协调作用，整合为一个完整工艺。
本发明所述制备果糖-1，6-二磷酸的方法还可以进一步包括对经过固定化酵母转化的溶液进行精制。
所述精制过程包括加入活性炭脱色，经过过滤除杂，经过离子交换层析柱。其中所述阴离子树脂吸附在温度为30-35℃，pH6.5-7.0下进行，吸附后经过洗脱，洗脱液中果糖-1，6-二磷酸的含量为2-3％，纯度达到99％以上。
本发明所述制备果糖-1，6-二磷酸的方法还可以进一步包括将上述精制产物转变为果糖-1，6-二磷酸的干燥品，其过程是将所得洗脱液经过浓缩，95％乙醇沉淀，用水再次溶解沉淀物，再次加入乙醇溶液得到无色晶体，过滤，结晶，干燥得到果糖-1，6-二磷酸的干燥品。再进行第一次结晶，用水溶解结晶物质，再次结晶，过滤，干燥，制得果糖-1，6-二磷酸成品。
本发明的优点在于1)本合成工艺的原料来源广泛，符合我国农产品深加工产业政策。生产设备投资低，有利投资回收。
2)由于采用固定化酵母柱进行连续化生产，无需购置发酵罐、酵母离心机、板框过滤机等昂贵设备。酵母最适生长pH值比大多细菌的要低一些，且对能抑制细菌生长的抗生素不敏感。因此，大量的酵母培养物可免遭生长迅速的细菌的污染，因为它们个体大，因此酵母菌比细菌更易收获且更便宜。目前用于工业生产的酵母菌并没出现公共健康危害问题。
3)产品转化率高，质量稳定采用固定化酵母连续化生产，生产过程稳定，易于控制，反应条件温和，转化率可达70％以上，现有工艺仅可达50％。工艺中由于多次采用离子交换技术，提高了产品质量。其中果糖-1，6-二磷酸的耐热性由原来的40℃提高到60℃有利于产品的储藏及其稳定性的提高。
4)生产成本低固定化酵母技术的应用，大大提高了工艺物料的干固物含量，减少蒸发程序，降低了蒸气消耗，与现有工艺比较，可节省生产成本约20％。
5)显著的环保效益连续性生产其中有用成分的提高，约增加一倍，同样的生产能力减少发酵废液排放量一半以上，有利于环境保护。
本发明所制备的果糖-1，6-二磷酸含有的菌体成分和代谢物较少，纯度较高，热稳定性有显著提高，可以用于制备药物，例如可以制成注射液、口服液、胶囊。它是急性心肌梗塞、心功能不全、冠心病、心肌缺血发作的急救良药。并且本发明所制备的果糖-1，6-二磷酸杂质较少，可以通过与其它盐分作用，制成钠盐、钙盐等，便于人体吸收和利用。本发明所述果糖-1，6-二磷酸也可以与其它物质混合使用，例如天冬氨酸钠盐、牛磺酸、氨基酸、珍珠粉、维生素、乳酸钙等配合使用。本发明所述果糖-1，6-二磷酸也可以与植物提取物，特别是一些中草药提取物结合使用。本发明的果糖-1，6-二磷酸也可以加入到食物或饮料中，补充健康人群或特殊人群的营养需求。本发明的果糖-1，6-二磷酸也可以加入到化妆品中。本发明的果糖-1，6-二磷酸也可以加入到动物饲料和药品中。在制成含有本发明所述果糖-1，6-二磷酸的制品时，可以加入多种添加剂，例如甜味剂、抗氧化剂和防腐剂。
本发明所述果糖-1，6-二磷酸尤其适合于制成针对亚健康人群的营养品。果糖-1，6-二磷酸是人体正常功能代谢中维持人体必需的中间产物，能够透过受损伤细胞的细胞膜进入到细胞内部直接提高能量，能改善细胞能量代谢，加速细胞恢复正常功能，迅速缓解人体疲劳状态。
具体实施例方式
在此所用，“原料”指工艺开始的材料，在本发明的一个实施方案中，是指“含果糖的溶液”，包括纯果糖溶液，含有果糖的浆液，例如用将葡萄糖溶液经过葡萄糖异构酶作用形成的果糖浆，或者含有果糖的发酵液。这些含果糖的溶液中含有1)果糖；2)磷酸根；3)镁离子；以及其它成分，包括有意添加的其它成分和自然存在的其它成分。在本发明的另一个实施方案中，“原料”包括各种富含淀粉的物质，例如土豆块茎、木薯和白薯，以及小麦、玉米、大麦和高粱的种子中的物质，也包括一些工艺的废物，只要其富含淀粉，满足本发明的需要即可；也指从其它厂商处购买的半成品，只要其经过一定工艺可以转化为果糖浆。上述举例并非限定性的。
在此所用，“淀粉”是指D-葡萄糖的线性或分支状均聚物的混合物。在植物中，淀粉作为碳水化合物的储存物而形成。不同植物来源的材料中，淀粉的类型和分支状况有所差异，将其转化为果糖浆的工艺过程应根据具体情况有所变化。本发明中的“淀粉”也指发生了一定的水解的淀粉衍生物。
在此所用，“果糖浆”是指用各种方法将原料转化为制备果糖-1，6-二磷酸的直接原料。根据工艺的不同，所述果糖浆中的果糖含量可有所变化，其酸碱度、盐含量及其它成分可有所变化。当然这种变化与最初所用的原材料有关。果糖浆在用于转化之前可以对其成分进行调节，以满足第二阶段工艺的需求。
在此所用，“果糖-1，6-二磷酸”是指FDP，也称为1，6-二磷酸果糖，英文为Fructose-1，6-diphophate。有些人也用新词“生物果糖”称呼。各种表述只要它们实质是指果糖-1，6-二磷酸，那么就应看作为本发明所述果糖-1，6-二磷酸。果糖-1，6-二磷酸的含量在最终产品中可以有所变化。本发明所述果糖-1，6-二磷酸是用生物体转化所得，具体而言是用酵母菌转化所得，有时也将利用生物体实现物质转变称为“生物合成”。
在此所用，“异构化”是指将葡萄糖异构化为果糖。
在此所用，“转化”是指一种物质经过一定的作用过程变成另外一种物质的过程。其涵义等同于“转变”、“变化”、“变成”“成为”等。在本发明中，“淀粉变成葡萄糖”、“葡萄糖变成果糖”、“果糖成为果糖-1，6-二磷酸”等均可以用上述各种同义说法表述。以及“生物体转化”等术语中，“转化”有同样的涵义；在此情形下，是指利用生物体实现物质的转变。
以下为本发明所述方法的一个实施方案所使用的原料、具体工艺和相关的测试数据，主要说明本发明所述方法利用含淀粉物质生产果糖-1，6-二磷酸的优越性，并不限定本发明所包括的范围，正如本技术领域的技术人员所理解的那样，这里的描述仅仅是例举性的，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。并且下面的叙述也同样说明了本发明的另外一个实施方案的优越性，也就是直接使用含果糖溶液的技术方案。
一、主要原料(按生产1.0t果糖-1，6-二磷酸计)1.优质玉米3.5-3.8t2.液化酶0.45-0.47kg3.糖化酶0.8-0.9kg4.异构酶0.09-0.11kg5.生物酵母菌0.1-0.12t二、果糖-1，6-二磷酸合成工艺介绍1.首先是原料果糖的制备原料玉米品质要求为淀粉含量≥74％，杂质≤1.0％，水份≤14.0，不完善粒≤10.0，霉变粒≤1.0。取优质玉米过筛，风选除杂，用0.3-0.5％亚硫酸溶液浸泡45-50h，经湿磨法处理分离出玉米蛋白、胚芽、玉米皮，得到玉米淀粉浆液。
调整玉米浆液为波美度17-22，pH值5.8-6.5，加入NOVO公司低钙、低pH液化酶，利用液化喷射器在温度105-110℃条件下喷射液化，并维持95-100℃、1.5-2h，达到液化DE值12-15％，经140℃高温灭酶后降温至58-62℃，调pH值为3.8-4.8，加入NOVO产复合糖化酶进行糖化，48-60h，达DE值95％以上，然后加入硅藻土、活性碳进行糖液脱脂、脱色处理，达到透光度≥99％，色度≤0.005，进入由阳树脂和阴树脂组成的树脂复床进行离子交换，除去无机盐灰分，达电导率10us/cm以下，进入蒸发系统浓度由30％-33％蒸发至于40-45％，并加入0.1kg/m3糖液的硫酸镁，pH值调整为7.5-8.2，进入由固定化异构酶装填的异构柱中进行连续异构化，将果糖含量提升到了42％以上，然后再加入活性碳进一步脱色处理后进入二次离子交换柱进行离子交换，电导率达到1cu/cm以下，然后进入果糖分离系统，由分离树脂填充的模拟移动床中进行色谱分离，分离温度75-80℃，分离后达到果糖含量≥95％以上的果糖溶液，将其浓度调整为10-30％，pH值6.5-7.5，作为生产果糖-1，6-二磷酸的原料备用。
2.固定化生物酵母酶的制备优选酵母菌种，例如将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candida)、球拟酵母(Torulopsis)、假丝酵母(Candida)等菌种选株接种于摇瓶中培养4-5h，每分钟以130-140次振荡，然后移入培养液中培养10-15h后，收集菌体，用甩干机分离出菌体，菌体中加入用于破壁处理的溶剂进行破壁处理后，加入纯水进行稀释，活化菌体3-4h，然后通过由阴离子交换树脂组成的离子交换柱，利用离子交换树脂的吸附作用将菌体吸附在树脂骨架上，这样就制备成了生物酵母固定化酶。
3.果糖-1，6-二磷酸制备将果糖溶液加入0.4mol/L磷酸钠，0.01mol/L硫酸镁，在40-45℃条件下，按0.1-0.15Bv/h流速自上而下通过生物酵母固定化酶柱，进行生物反应，得到含有果糖-1，6-二磷酸8-10％浓度的溶液。
4.果糖-1，6-二磷酸的精制、结晶工艺将上述溶液首先加入活性碳进行脱色除杂处理，处理后通过由氯型阴离子交换树脂树脂组成的离子交换树脂层析柱，这样果糖-1，6-二磷酸将被树脂吸附，其他杂质则留在溶液中，弃去，树脂吸附饱合后进行梯度洗脱，以增加果糖-1，6-二磷酸纯度。
吸附条件为温度为30-35℃，pH6.5-7.0，果糖-1，6-二磷酸含量5-7％，洗脱后果糖-1，6-二磷酸含量约2-3％，纯度达99％以上，然后进一步蒸发浓缩至15-20％，加入95％乙醇得到白色沉淀，过滤浮沉淀物，加水溶解沉淀，再次加入乙醇溶液，得无色晶体，过滤、结晶、干燥得果糖-1，6-二磷酸成品。
三、菌种的培养及提取、固定化第一组试验将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种于摇瓶培养4-5h，每分钟以130-140次振荡，后移入菌种罐扩大培养，培养基选用含糖3.5-4.5％的玉米粉糖化液，pH值为6.2-6.4，温度为30-33℃，培养10-14h后收集发酵液，用阴离子交换树脂吸附发酵液，菌体则被吸附在树脂骨架上，成为固定化酵母菌，测示其含菌量为121.1mg/g干树脂。
第二组试验将粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)接种于摇瓶中培养5-6h，每分钟以130-140次振荡，后移入菌种罐扩大培养，培养基选用3.5-4.5％的玉米粉糖化液，pH值为6.2-6.4，温度为30-33℃，培养12-15h后，收集发酵液用阴离子交换树脂吸附发酵液，吸附饱合后，测定树脂含菌量为113.8mg/g干树脂。
第三组试验将球拟酵母(Torulopsis)接种于摇瓶中培养5-6h，每分钟以130-140次振荡，后移入菌种罐扩大培养，培养基选用含糖3.5-4.5％的玉米粉糖化液，pH值6.2-6.4，温度为30-33℃，培养15-18h，收集发酵液，用阴离子交换树脂吸附发酵液，测示树脂含菌量为136.2mg/g干树脂。
第四组试验将假丝酵母(Candida)接种于摇瓶中培养5-6h，每分钟以130-140次振荡，后移入菌种罐扩大培养，培养基选用含糖3.5-4.5％的玉米粉糖化液，pH值6.2-6.4，温度为30-33℃，培养15-18h，收集发酵液，用阴离子交换树脂吸附发酵液，测示树脂含菌量为135.2mg/g干树脂。
四、产品性能比较 从上表可以看出，新工艺做出的果糖-1，6-二磷酸在含量高出市售产品3个百分点，且无机灰分含量明显低于市售产品，而耐热性远高于市售原工艺生产的产品。
五、产品转化率对比以投入1.0t玉米为基料，产出果糖-1，6-二磷酸量对比
从以上对比数据可以看出，原工艺平均收率为48.55％，新合成工艺为69.97％，新工艺较原工艺高出约20个百分点。
注解原工艺，即传统工艺，是以葡萄糖为直接原料，利用啤酒酵母进行转化的生产工艺。
实施例为了更明确的说明本发明，特别给出如下的实施例，但是本发明仅仅受所附权利要求的限制。这些实施例仅仅是用于说明的，正如本领域技术人员所理解的那样，它们不能用来限制本发明的范围。其中实施例1-4是有关本发明所述以含果糖的溶液为原料的技术方案，实施例5是有关本发明所述以含淀粉物质为原料的技术方案。
实施例1选用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，进行放大培养，12h后收集菌体，离子交换树脂固定化后，取20％果糖溶液加入0.38mol/LNa2HPO4，0.015mol/L MgSO4，调pH为6.8-7.1，在40-42℃以0.1Bv/h条件下通过固定化酵母柱，测定流出液中果糖-1，6-二磷酸含量为80.3g，按上述流程纯化后得果糖-1，6-二磷酸71.3g。
实施例2取假丝酵母(Candida)进行放大培养，10h后收集菌体离子交换树脂固定化后，取21.2％果糖溶液加0.36mol/L Na2HPO4，0.02mol/LMgSO4后调pH为6.5-7.0，38-40℃条件下，通过固定化酵母柱，测定流出液中果糖-1，6-二磷酸含量为78.3g，按上述流程精制后得果糖-1，6-二磷酸69.2g。
实施例3
取球拟酵母(Torulopsis)进行放大培养，18h后，收集菌体，离子交换树脂固定化后，取19.5％果糖溶液加入0.42mol/L Na2HPO4，0.013mol/L MgSO4，在pH6.8，温度43-45℃条件以0.1Bv/h通过固定化酵母柱，测定出液得果糖-1，6-二磷酸89.1g，按上述流程精制后，得果糖-1，6-二磷酸78.8g。
实施例4取假丝酵母(Candida)进行放大培养，18h后，收集菌体，离子交换树脂固定化后，取19.5％果糖溶液加入0.42mol/L Na2HPO4，0.013mol/L MgSO4，在pH6.8，温度43-45℃条件以0.1Bv/h通过固定化酵母柱，测定出液得果糖-1，6-二磷酸79.5g，按上述流程精制后，得果糖-1，6-二磷酸68.0g。
实施例5以玉米为原料生产果糖-1，6-二磷酸。
1).原料果糖的制备原料玉米品质要求为淀粉含量≥74％，杂质≤1.0％，水份≤14.0，不完善粒≤10.0，霉变粒≤1.0。取优质玉米过筛，风选除杂，用0.3-0.5％亚硫酸溶液浸泡45-50h，经湿磨法处理分离出玉米蛋白、胚芽、玉米皮，得到玉米淀粉浆液。
调整玉米浆液为波美度17-22，pH值5.8-6.5，加入NOVO公司低钙、低pH液化酶，利用液化喷射器在温度105-110℃条件下喷射液化，并维持95-100℃、1.5-2h，达到液化DE值12-15％，经140℃高温灭酶后降温至58-62℃，调pH值为3.8-4.8，加入NOVO产复合糖化酶进行糖化，48-60h，达DE值95％以上，然后加入硅藻土、活性碳进行糖液脱脂、脱色处理，达到透光度≥99％，色度≤0.005，进入由阳树脂和阴树脂组成的树脂复床进行离子交换，除去无机盐灰分，达电导率10us/cm以下，进入蒸发系统浓度由30％-33％蒸发至于40-45％，并加入0.1kg/m3糖液的硫酸镁，pH值调整为7.5-8.2，进入由固定化异构酶装填的异构柱中进行连续异构化，将果糖含量提升到了42％以上，然后再加入活性碳进一步脱色处理后进入二次离子交换柱进行离子交换，电导率达到1cu/cm以下，然后进入果糖分离系统，由分离树脂填充的模拟移动床中进行色谱分离，分离温度75-80℃，分离后达到果糖含量≥95％以上的果糖溶液，将其浓度调整为10-30％，pH值6.5-7.5，作为生产果糖-1，6-二磷酸的原料备用。
2).固定化生物酵母酶的制备酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)选株接种于摇瓶中培养4-5h，每分钟以130-140次振荡，然后移入培养液中培养10-15h后，收集菌体，用甩干机分离出菌体，菌体中加入溶剂(例如甲苯，Triton-X 100等)进行破壁处理后，加入纯水进行稀释，活化菌体3-4h，然后通过由阴离子交换树脂组成的离子交换柱，利用离子交换树脂的吸附作用将菌体吸附在树脂骨架上，这样就制备成了固定化酵母。
3).果糖-1，6-二磷酸制备将步骤1)所得的果糖溶液加入0.4mol/L磷酸钠，0.01mol/L硫酸镁，在40-45℃条件下，按0.1-0.15Bv/h流速自上而下通过填装固定化酵母树脂的层析柱，进行生物反应，得到含有果糖-1，6-二磷酸8-10％浓度的溶液。
4).果糖-1，6-二磷酸的精制、结晶工艺将上述步骤3)所得溶液首先加入活性碳进行脱色除杂处理，处理后通过由氯型阴离子交换树脂树脂组成的离子交换树脂层析柱，这样果糖-1，6-二磷酸将被树脂吸附，其他杂质则留在溶液中，弃去，树脂吸附饱合后进行梯度洗脱，以增加果糖-1，6-二磷酸纯度。
吸附条件为温度为30-35℃，pH6.5-7.0，果糖-1，6-二磷酸含量5-7％，洗脱后果糖-1，6-二磷酸含量约2-3％，纯度达99％以上，然后进一步蒸发浓缩至15-20％，加入95％乙醇得到白色沉淀，过滤浮沉淀物，加水溶解沉淀，再次加入乙醇溶液，得无色晶体，过滤、结晶、干燥得果糖-1，6-二磷酸成品。
权利要求
1.一种制备果糖-1，6-二磷酸的方法，其特征在于该方法包括将含果糖的溶液与固定化酵母接触，使所述含果糖的溶液中的果糖转化得到果糖-1，6-二磷酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含果糖的溶液包括1).果糖；2).磷酸根；3).镁离子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述含果糖的溶液中，其中所述果糖的含量在所述含果糖的溶液为10-25wt％，以所述含果糖的溶液的总重量为基准；所述磷酸根的含量为0.3-0.5mol/L，以所述含果糖的溶液的总体积为基准；所述镁离子的含量为0.01-0.03mol/L，以所述含果糖的溶液的总体积为基准。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述含果糖的溶液中的所述磷酸根是来自向含果糖的溶液中添加选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸镁、磷酸的至少一种或其任意至少二种的组合；所述镁离子是来自向含果糖的溶液中添加选自氯化镁、硫酸镁、磷酸镁的至少一种或其任意至少二种的组合。
5.一种制备果糖-1，6-二磷酸的方法，其特征在于该方法主要包括第一阶段是将含淀粉物质向果糖的转化；第二阶段是将含果糖的溶液与固定化酵母接触，将含果糖的溶液中的果糖转化得到果糖-1，6-二磷酸。
6.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于其中所述固定化酵母的制备包括如下步骤1).培养酵母菌；2).将酵母菌吸附到树脂上，成为固定化酵母。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述果糖的制备包括如下步骤1).将含淀粉物质转化为葡萄糖；2).葡萄糖异构化形成果糖。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤1)采用酸水解法和/或酶催化法；所述步骤2)是将异构酶固定化形成固定化酶异构柱；将步骤1)所得产物按照每立方米加入约0.1-0.8kg的含镁盐，并调整pH为7.5-8.2，通过异构柱，进行异构化。
9.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于所述的将含果糖的溶液与固定化酵母接触，是将所述含果糖的溶液间歇地或者连续地流经含有固定化酵母的固定化酶柱。
10.如权利要求5或7所述的方法，其特征在于所述含淀粉物质选自玉米、小麦、大麦、木薯中的至少一种或其任意至少二种的组合。
11.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于进一步可以包括将转化所得的含果糖-1，6-二磷酸的溶液进行精制。
12.如权利要求11所述方法，其特征在于所述精制过程包括脱色除杂，用氯型阴离子树脂吸附，其中所述阴离子树脂吸附在温度为30-35℃，pH为6.5-7.0下进行，吸附后经过洗脱，洗脱液中果糖-1，6-二磷酸的含量为2-3％，纯度达到99％以上。
13.如权利要求11所述方法，其特征在于进一步可以包括制备果糖-1，6-二磷酸的干燥品。
14.如权利要求13所述方法，其特征在于所述制备果糖-1，6-二磷酸的干燥品的过程是将所得洗脱液经过浓缩，95％乙醇沉淀，用水再次溶解沉淀物，再次加入乙醇溶液得到无色晶体，过滤，结晶，干燥得到果糖-1，6-二磷酸的干燥品。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法制备的含有果糖-1，6-二磷酸的物质。
16.如权利要求15所述的含有果糖-1，6-二磷酸的物质在用于制药、营养品添加剂、化妆品添加剂、食品添加剂等方面的用途。
全文摘要
本发明提供了一种制备果糖－1，6－二磷酸的方法，其特征在于该方法包括将含果糖的溶液与固定化酵母接触，使所述含果糖的溶液中的果糖转化得到果糖－1，6－二磷酸。本发明也涉及用该方法制备的果糖－1，6－二磷酸及其用途。
文档编号C12P19/02GK1519245SQ0310072
公开日2004年8月11日 申请日期2003年1月20日 优先权日2003年1月20日
发明者赵建安, 付海峰 申请人:赵建安, 付海峰
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