一种唾液乳杆菌及其冻干制剂与应用的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  15

专利名称:一种唾液乳杆菌及其冻干制剂与应用的制作方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,特别涉及一株猪源唾液乳杆菌菌株及其冻干制剂与应用。
背景技术
动物肠道内存在着约30个属500多种微生物,相互依赖,相互竞争,共同维持着肠道的微生态平衡。但长期以来,抗生素作为饲料添加剂的大量使用,在抑制和杀灭病原菌的同时也抑杀了动物机体内正常共生的菌群,使肠道长期处于失衡状态,对动物的健康甚至人类的健康构成直接的威胁。因此,加速开发安全、优质、高效的绿色饲料添加剂已迫在眉 睫。近年来的科学研究发现,在饲料中添加益生菌活菌制剂可以起到促进动物生长、抑制病原菌繁殖及提高机体免疫能力等功能,该类添加剂也越来越受到人们的关注。目前,美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料控制官员协会(AAFCO)公布了可以直接饲喂的微生物菌种有43种,我国对饲用微生物的研究起步较晚,可饲用菌种较少,农业部1126号公告中公布的允许使用的菌种仅有16种,因此,研究开发新型的益生菌菌种有着广阔的应用前景。研究表明,同源性菌群对宿主的益生作用优于异源菌群(Timmerman等,2006),即理想的菌株应该来自同种动物的消化道,同时,作为益生菌菌株还必须具有生长速度快,产酸能力强以及较强的耐胃酸、耐肠胆盐等特性,这样才能保证益生菌能够以足够活菌含量到达动物肠道后并快速生长繁殖,净化肠道环境,真正发挥其益生作用。依据上述筛选原贝U,本发明分离得到一株性能优良的乳酸杆菌-唾液乳杆菌,目前,国内关于唾液乳杆菌的研究主要集中于人类发酵食品方面,而作为动物饲用方面的报道较少,本发明对该菌进行了分离筛选、增殖培养、冻干工艺制备及动物应用试验等系统的研究,从而验证了其高效性和实用性,并为益生菌菌种的开发和推广应用奠定基础。

发明内容
本发明提供一株乳杆菌,该乳杆菌生长、产酸、耐酸耐胆盐等性能优良,并提供适合该菌株的冻干保护剂配方从而制备得到冻干制剂,使其能够应用于实际动物饲料中,并充分发挥其优良益生菌作用。一种唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株,名称为唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius ZLS006,其保藏号为=CGMCC No. 5761。本发明还提供一种唾液乳杆菌冻干制剂,其特征在于采用所述的唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius ZLS006 菌株,其保藏号为=CGMCC No. 5761。所述唾液乳杆菌活菌数为3. 5 X 109cfu/g。本发明还提供了所述唾液乳杆菌冻干制剂的制备方法,包括如下步骤将唾液乳杆菌菌种进行发酵培养,得到发酵液,将所述发酵液离心分离菌体,得到菌泥,向所述菌泥中加入冻干保护剂,混匀、冻干,即得到所述唾液乳杆菌冻干制剂。
所述发酵培养的培养基由如下质量百分比的物质组成以MRS培养基为基础,其中蛋白胨0. 6 I. 2%,酵母浸粉0. 3 0. 6%,牛肉膏0. 6 I. 2%,葡萄糖I. 6 2. 2%。所述发酵培养的培养基优选为由如下质量百分比的物质组成以MRS培养基为基础,其中蛋白胨I. 0%,酵母浸粉0. 6%,牛肉膏I. 2%,葡萄糖I. 6%。所述发酵培养的接种量为1% 3%,发酵温度为37°C,发酵时间为20 24h。所述发酵培养的发酵罐的装液量为50%,培养转速为100r/min,pH6. 5,罐压维持在0. 05MPa ;发酵结束后,采用管式离心机19000rpm连续离心,收取菌泥,加入冻干保护剂,冻干保护剂体积与离心前发酵液体积相等,混匀,置于冻干机中冻干23h,收取冻干粉。所述冻干保护剂由如下重量百分比的物质组成12%脱脂乳,5%糊精,2%聚乙烯吡咯烷酮,4%乳糖,0. 1%谷氨酸钠,0. 1%半胱氨酸,0. 3%乙酸钠,其余为水。所述唾液乳杆菌的冻干制剂在动物饲料添加剂中的应用也属于本发明的保护范围。其中动物包括但不限于猪、牛、羊、鸡等动物,其优选猪。本发明还提供一种唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)冻干保护剂,由如下重量百分比的物质组成12 16%脱脂乳,5 10%糊精,2 4%聚乙烯吡咯烷酮,4飞%乳糖,0. I 0. 5%谷氨酸钠,0. I 0. 5%半胱氨酸,0. 3 0. 8%乙酸钠,其余为水。本发明所提供的唾液乳杆菌(LactobaciIIus salivarius)冻干保护剂,优选为由如下重量百分比的物质组成12%脱脂乳、5%糊精、2%聚乙烯吡咯烷酮、4%乳糖、0. 1%谷氨酸钠、0. 1%半胱氨酸和0. 3%乙酸钠,其余为水。本发明从健康仔猪盲肠黏膜分离筛选得到一个唾液乳杆菌菌株,保藏号为CGMCCNo. 5761。该菌株能够提高猪群饲料转化效率;增加猪群粪便中有益菌活菌数,降低有害菌含量,并具有刺激机体特异性免疫应答,加强机体免疫力的功能,是优良的益生菌候选材料。基于对唾液乳杆菌在动物肠道中的益生功能,为了使唾液乳杆菌在动物饲料中得到良好的应用并充分发挥其益生菌的作用,本发明提供了一种制备唾液乳杆菌冻干制剂的保护剂配方。该冻干菌保护剂对唾液乳杆菌的冻干保护率达到85. 16% ;使其在常温保存3个月后,菌存活率达到80. 35%。本发明进一步提供了制备唾液乳杆菌冻干制剂的方法,特别是中式生产的参数。本发明提供的菌剂在动物饲喂试验中发挥出优良的益生作用,见实施例2的数据。由于本发明提供的唾液乳杆菌冻干制剂,虽然仅仅对猪做了试验,但是由于该菌种广泛存在于动物肠道的有益乳酸杆菌,因此,该菌冻干制剂在动物饲料中都可以添加,并不限于添加于猪饲料中。生物保藏存活信息存活菌株命名唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius ZLS006保藏号CGMCCNo. 5761保藏日期2012年02月16日保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码:100101
具体实施方法实施例I、猪源优良乳杆菌的制备I. I猪源乳酸菌的分离、筛选及鉴定仔猪剖杀,无菌刮取黏膜lg,置于盛有9ml无菌生理盐水的带有玻璃珠的三角瓶中,充分震荡摇匀,然后吸取1.0ml菌液于盛有9. Oml无菌生理盐水的试管中,此稀释度为10—1,重复以上过程,依次制成10_2、10' 10_4、10_5、10_6的菌液。选择10_4、10_5、10_6三个稀释度,吸取0. Iml菌液分别滴于MRS培养基平板上,置于厌氧罐中于37°C培养24 48h,挑取形态不同的菌落在MRS培养基上划线接种做纯培养,而后置于4°C冰箱保存备用。 然后挑取纯培养物进行染色,镜检,选取无芽孢革兰氏阳性杆菌进行接触酶、硝酸盐还原、明胶液化等生化实验,以及糖醇发酵试验,结果与《常见细菌系统鉴定手册》、《乳酸细菌分类及实验方法》对照,以初步确定乳酸菌属,经试验,初步筛选出80株乳酸菌。菌株是决定乳酸菌制剂使用效果的关键因素,其中,菌株生长速度快可以使得菌株到达肠道后能够快速生长繁殖,而产酸则可以达到抑制有害菌,净化肠道环境的效果,另夕卜,益生菌在进入肠道后还应具有较强的耐胃酸、耐肠胆盐性能,以保证乳酸菌能够以足够活菌数到达肠道而真正发挥益生作用。依据上述筛选原则,本发明对80株菌进行生长、产酸及耐酸耐胆盐抗逆性试验,筛选出一株性能优良的乳酸菌菌株,筛选结果见表I。(I)生长试验筛选菌株活化后,接种于MRS液体培养基中,培养24h后取一定量菌液测定OD6tltol值,以不接菌为对照,观察菌株生长性能;(2)产酸试验菌株活化后,接种于含有溴甲酚蓝指示剂的MRS液体培养基中,分别培养24、48h测定OD45tlnm值,通过菌株产酸使培养基颜色变黄而使OD45tol值变化来判定菌株产酸情况;( 3 )耐酸耐胆盐性能试验菌种活化后,接种于MRS液体培养基中培养24h,取3ml发酵液于3000rpm离心5分钟,加入3ml含有0. 2%胆盐pH=3的液体培养基中,保温2h,而后以10%接种于新鲜培养基中保温4h,测定OD6tltlnm值,观察菌株耐酸耐胆盐性能。 经过筛选,Y29生长OD6tltol值、产酸OD45tlnm值、及耐酸耐胆盐抗逆性能较好,因此,确定此菌为目的菌株,送至确定菌种为并送至中国工业微生物菌种保藏中心进行鉴定检验。具体结果如下中国工业微生物菌种保藏管理中心对该乳酸杆菌为猪源唾液乳杆菌(Lactobacillus saliarius)的鉴定结果为该猪源唾液乳杆菌生理生化特征如表2所示,其分子生物学鉴定结果见表3和序列表I。将该菌株于2012年02月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码100101)进行了保藏,菌株名称为唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius ZLS006,其保藏号为 CGMCC No. 5761。表I乳酸菌筛选试验结果
权利要求
1.一种唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株,名称为唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius ZLS006,其保藏号为=CGMCC No. 5761。
2.—种唾液乳杆菌冻干制剂,其特征在于采用权利要求I所述的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株。
3.权利要求2所述的唾液乳杆菌冻干制剂的制备方法,包括如下步骤 将唾液乳杆菌菌种进行发酵培养,得到发酵液,将所述发酵液离心分离菌体,得到菌泥,向所述菌泥中加入冻干保护剂,混勻、冻干,即得到所述唾液乳杆菌冻干制剂。
4.根据权利要求3所述的方法,所述发酵培养的培养基由如下质量百分比的物质组成以MRS培养基为基础,其中蛋白胨0. 6 I. 2%,酵母浸粉0. 3 0. 6%,牛肉膏0. 6 I. 2%,葡萄糖I. 6 2. 2%o
5.根据权利要求4所述的方法,所述发酵培养的接种量为19T3%,发酵温度为37°C,发酵时间为20 24h。
6.根据权利要求5所述的方法,所述发酵培养的发酵罐的装液量为50%,培养转速为100r/min, pH6. 5,罐压维持在0. 05MPa ;发酵结束后,采用管式离心机19000rpm连续离心,收取菌泥,加入冻干保护剂,冻干保护剂体积与离心前发酵液体积相等,混匀,置于冻干机中冻干23h,收取冻干粉。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于所述冻干保护剂由如下重量百分比的物质组成12%脱脂乳,5%糊精,2%聚乙烯吡咯烷酮,4%乳糖,0. 1%谷氨酸钠,0. 1%半胱氨酸,0.3%乙酸钠,其余为水。
8.权利要求2所述唾液乳杆菌冻干制剂在动物饲料添加剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于所述动物指猪。
10.一种唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)冻干保护剂,由如下重量百分比的物质组成12 16%脱脂乳,5 10%糊精,2 4%聚乙烯吡咯烷酮,4 6%乳糖,0. 1 0. 5%谷氨酸钠,0. I 0. 5%半胱氨酸,0. 3 0. 8%乙酸钠,其余为水。
全文摘要
本发明公开了唾液乳杆菌及其冻干制剂与应用,涉及动物益生菌菌株及其冻干制剂。本发明所提供的唾液乳杆菌名称为唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius ZLS006,其保藏号为CGMCC No.5761。本发明还提供了一种由唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius ZLS006制备得到的冻干制剂,该冻干制剂经试验证明能够提高猪群饲料转化效率,增加猪群粪中乳酸菌活菌数,降低大肠杆菌含量,并具有提高机体免疫力的作用。
文档编号C12N1/20GK102660478SQ20121014458
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者刘辉, 单达聪, 季海峰, 张董燕, 王四新, 王晶, 王雅民 申请人:北京市农林科学院

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