一种采用固定化菌株高效生产l-山梨糖的方法

xiaoxiao2020-6-24  18

专利名称:一种采用固定化菌株高效生产l-山梨糖的方法
技术领域
本发明涉及一种固定化G. oxydans高效生产L-山梨糖的方法,特别是利用海藻酸钠作为固定化载体包埋G. oxydans,并在发酵过程中以油酸作为氧载体提高溶氧,以实现菌体的重复利用、连续的生产操作、方便的分离纯化,从而提高生产强度和产品质量稳定性、降低生产成本。
背景技术
L-山梨糖,一种己酮糖,为D-果糖的C-2位和C-3位差向异构体。是工业发酵生产维生素C(VC)的中间体,目前工业上主要用“莱氏法”和“两步发酵法”生产VC,二法初始均经发酵将D-山梨醇转化为L-山梨糖。其中,以D-山梨醇为底物的发酵工艺是唯一用于工业生产的方法。目前国内外L-山梨糖的发酵方式都是游离细胞批式生产工艺,生产成本相对较高,由于固定化细胞具有细胞密度大、反应速度快、重复利用率高、能实现连续操作、耐毒害能力强、产物品质稳定且易于分离纯化等优点,成为了许多实验室研究的热点,已见报道的有采用PVA、海藻酸钙、聚丙烯酰胺固定化的微生物细胞转化D-山梨醇成为L-山梨糖,但均未大规模生产。其主要困难是好氧菌活细胞的固定化方法和氧的传递较难,固定化细胞机械强度较低。鉴于此,一种成本低廉、固定化凝珠机械强度好、发酵过程中保证溶氧充足的固定化方法应该是在发酵法生产山梨糖工艺中降低成本的有效策略。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种固定化G. oxydans ATCC 9937发酵生产L-山梨糖的方法,通过选择合适的固定化载体,保持细胞的活性,同时增加其重复利用率,发酵过程中选择添加适当的氧载体,解决固定化细胞的传氧限制,实现生产山梨糖工艺的高强度、低成本要求。以下是本发明技术方案的详细描述。固定化载体浓度的选择与固定化细胞的制备根据海藻酸钠可在CaCl2溶液中钙化凝固的原理,采用电子蠕动泵将海藻酸钠与G. oxydans的混合溶液泵入CaCl2中,形成直径为的固定化细胞颗粒,4° C静置2h,使颗粒稳定成型,再用无菌水洗涤2次,即得固定化细胞。将采用不同浓度的海藻酸钠制备的固定化细胞在增殖培养基中增殖24h后接入发酵培养基,采用摇瓶发酵,每隔3-4h取样检测山梨醇的转化率,得到最佳的海藻酸钠浓度为2%。利用2%的海藻酸钠固定化细胞,通过不同直径的蠕动泵泵管制备不同直径的固定化凝珠,增殖后进行发酵,得到最佳的固定化凝珠直径为2mm。氧载体的选择与浓度确定将正己烷、正十六烷、油酸三种氧载体加入发酵培养基后,利用海藻酸钠浓度为2%,直径为2mm的固定化细胞进行发酵,得到相同发酵时间内能使山梨醇转化率最高的氧载体为油酸。再通过油酸的添加浓度优化得到最佳的添加浓度为4%(v/v)。用所得最佳条件进行发酵,42h内山梨糖的产量达到133g/L,比游离菌发酵缩短了 6h。固定化细胞的增殖培养与发酵增殖培养基山梨醇150g,酵母膏6g,CaCO3 2g,pH4. 8 5. 1,自来水定容至1L。
发酵培养基山梨醇150g,酵母膏2g,CaCO3 2g,pH4. 8 5. 1,自来水定容至1L。增殖培养基和发酵培养基的灭菌温度为115-121° C,15min。海藻酸钠灭菌温度为110° C,20min。油酸等氧载体经0. 22 y m膜过滤除菌,接种前加入。15mL种子液制备的固定化凝珠接入增殖培养基,5OOmL锥形瓶中种子培养基为50mL,温度为30° C,转速200rpm,培养时间为20_24h。将发酵培养基加入到完成增殖的固定化种子中,500mL锥形瓶中发酵培养基为50mL,同时加入2mL油酸,30° C、200rpm条件下每批培养42h。D-山梨醇与L-山梨糖浓度的测定高效液相色谱(HPLC)仪器=Agilent 1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)。色谱柱AminexHPX-87H (Bio-Rad);流动相0.005mol/L H2SO4 ;流速0.6mL/min ;柱温35°C ;进样量5uL;检测器为示差折光检测器。样品制备500 u L发酵液在8000rpm下离心lOmin,取上清液250 u L移入5mL容量瓶中,超纯水定容至刻度线,经0. 22 y m滤膜过滤,滤液供液相色谱分析。本发明的有益效果本发明的特点是以一株能以山梨醇为唯一碳源,高效积累L-山梨糖的G. oxydans为出发菌株,通过作为固定化载体的海藻酸钠的浓度优化以及固定化凝珠体积的优化制备了活性稳定且能重复利用的固定化细胞。发酵过程中通过添加氧载体强化了氧的传递,促进了 L-山梨糖的高效生产,同时也利于下游的处理。在发酵42h后山梨糖产量能达到133g/L,比游离菌的发酵时间缩短6h。这一固定化发酵方法的建立,为工业生物技术特别是采用发酵工程手段优化发酵条件来提高目的产物的生成提供了可行的技术思路。
具体实施例方式实施例I固定化细胞的制备将活化的保藏菌种接种至斜面培养基上,30° C恒温静置培养48h。将1_2环斜面种子接入装有50mL液体种子培养基的500mL摇瓶中,30° C旋转式摇床振荡培养24h。按I比3的比例与2 %的海藻酸钠溶液混合均匀,用电子蠕动泵缓慢泵入IOOmL I. 5%的CaCl2溶液中,形成直径为2_-3_的固定化细胞颗粒,4° C静置2h,使颗粒稳定成型,再用无菌水洗涤2次,即得固定化凝胶珠。实施例2固定化载体浓度以及固定化凝珠体积的优化
在海藻酸钠浓度分别为1%、1. 5%、2%、2. 5%、3%的条件进行固定化,固定化细胞增殖后发酵培养,测定山梨醇的转化率。发现海藻酸钠浓度过低,固定化细胞容易破裂导致不能重复使用,而含量过高会影响固定化细胞的传质及固定化细胞本身对山梨醇的转化能力,综合山梨醇转化率和固定化凝珠机械强度这两个指标,海藻酸钠浓度为2%时的山梨醇转化率和重复性综合评价最好。利 用2%的海藻酸钠固定化细胞,通过不同直径的蠕动泵泵管制备得到直径为2mm、2. 5mm>3mm的固定化凝珠,增殖培养24h后,发酵培养42h,测定山梨醇的转化率和机械强度,综合得到直径为2mm的固定化凝珠性能最佳。实施例3氧载体的选择以及浓度优化利用实施例2得到的最佳的固定化凝珠进行发酵。发酵培养基中添加3%(v/v)的正十六烷、正己烷、油酸以提高溶氧,取42h内各阶段的发酵液测定各项参数,得到油酸作为氧载体效果最佳,通过进一步的优化油酸浓度并比较发酵42h后对山梨醇的转化率,发现4% (v/v)的油酸添加量对积累山梨糖最有利。实施例4固定化细胞与游离细胞发酵特性的比较利用实施例3得到的最佳条件进行固定化G. oxydans发酵,与游离菌发酵相比
(I)固定化细胞发酵将发酵时间缩短了 6h(达到相同的转化率游离细胞需要48h) ;(2)以获得的固定化凝珠进行重复发酵,连续发酵6批后山梨醇的转化率维持在80%以上,比游离菌批式发酵每批节约24h的做种时间同时省去了种子培养基,种子罐设备,相关人力等成本。可以理解的是,对本领域普通技术人员来说,可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种采用固定化菌株高效生产L-山梨糖的方法,其特征在于以固定化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans) ATCC 9937为发酵种子,以油酸为氧载体,30° C、200rpm条件下转化生产L-山梨糖。
2.权利要求I所述的方法,其特征在于所述固定化采用海藻酸钠为载体,固定化细胞直径为2mm。
3.权利要求2所述的方法,其特征在于具体步骤为接种发酵种子到增殖培养基中,500mL摇瓶装液50mL,于30° C、200rpm条件下培养20_24h ;再将发酵培养基转入完成增殖培养的固定化种子中,同时加入油酸,30° C、200rpm条件下每批培养42h,固定化细胞可重复使用6次以上。
4.权利要求3所述的方法,其特征在于所述油酸的添加浓度为4%(v/v)。
5.根据权利要求书I所述的方法,其特征在于所述固定化的方法为将1-2环斜面种子接入装有50mL液体种子培养基的500mL摇瓶中,于30° C、200rpm条件下培养20_24h,按I比3的比例与2%的海藻酸钠溶液混合均匀,用电子蠕动泵缓慢泵入IOOmLl. 5%的CaCl2溶液中,形成直径为2_-3_的固定化细胞颗粒,4° C静置2h,使颗粒稳定成型,再用无菌水洗涤2次,即得固定化细胞。
6.跟据权利要求书3所述的方法,其特征在于增殖培养基组成为山梨醇150g,酵母膏6g,CaCO3 2g,pH4. 8-5. 1,自来水定容至 1L。
7.跟据权利要求书3所述的方法,其特征在于发酵培养基组成为山梨醇150g,酵母膏2g,CaCO3 2g,pH4. 8-5. 1,自来水定容至 1L。
全文摘要
本发明公开了一种通过固定化氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)高效生产L-山梨糖的方法,采用固定化发酵的手段,以海藻酸钠作为固定化载体,将G.oxydans包埋,制备获得了大小适中的固定化凝珠,以油酸作为氧载体进行发酵生产L-山梨糖的方法。与游离细胞批式生产工艺相比(1)固定化细胞发酵将发酵时间缩短了6h(达到相同的转化率游离细胞需要48h);(2)以获得的固定化凝珠进行重复发酵,连续发酵6批后山梨醇的转化率维持在80%以上,比游离菌批式发酵每批节约24h的做种时间同时省去了种子培养基,种子罐设备,相关人力等成本。为今后利用固定化微生物发酵获得产品提供了一定的借鉴意义。
文档编号C12P19/02GK102660600SQ201210145609
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者周景文, 堵国成, 王小北, 陈坚 申请人:江南大学

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