新的安丝菌素类化合物及其制备方法
专利名称：新的安丝菌素类化合物及其制备方法
新的安丝菌素类化合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种化合物，尤其涉及一种新的安丝菌素类化合物，本发明还涉及该安丝菌素类化合物的制备方法。
背景技术：
1972年Kupchan等从原产热带非洲的齿叶美登木(M. serrata)中首次分离出天然抗肿瘤活性成分——大环内酯类化合物美登素(Maytansine)，其后研究人员相继从高等植物矛卫科、鼠李科、大戟科植物、苔藓类植物中分离到美登木类化合物。最引人注意的是从 微生物中发现了这类化合物，1977年，Higashide及其同事在筛选抗癌活性成分的过程中，从分离自莎草科苔属植物叶子的橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)中得到六个美登素衍生物，命名为安丝菌素PO、PU P2、P3、P4、P4’。随后又从另一个橙色束丝放线菌亚种(A pretiosum ssp. Auranticum)中分离得到除上述六个化合物外的十五个新安丝菌素，其母核为19-C的大环内酰胺环，C-3连接不同长度的碳链，主要活性成分是P-3。上述所有这些安丝菌素均可以被还原分解成C-3美登木醇(P-O)，该醇是用于合成含硫醇美登木素生物碱的前体。安丝菌素已被化学转变成含硫醇的美登木素生物碱(maytansinoids),该生物碱以细胞结合剂-美登木素生物碱偶联物的形式体现出的医疗用途已被报道。随着对美登素类抗体结合物研究的不断深入，市场对美登木素类化合物的需求量逐步扩大。由于美登木类植物含美登素及其同系物的含量很低，大量砍伐美登木类植物会对生态造成严重破坏，且从野生植物中寻找原料难以满足工业生产的需要；采用化学合成，又因美登木素结构复杂存在全合成和半合成工艺复杂、过程繁琐、产率很低、反应专一性差等缺点。
发明内容本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种新的安丝菌素类化合物，所述新的安丝菌素类化合物具有抗肿瘤活性。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题之一的式(I)代表的新的安丝菌
素类化合物，
权利要求
1.式(I)代表的新的安丝菌素类化合物，
2.一种如权利要求I所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于其操作步骤如下 步骤一制备束丝放线菌菌株FIM06-0063 (Actinosynnema sp)发酵液； 步骤二 将步骤一所获得的束丝放线菌菌株FM06-0063发酵液进行大孔树脂吸附柱层析，得到粗提物； 步骤三将步骤二所获得的粗提物进行正相硅胶柱层析，并采用氯仿-甲醇梯度洗脱粗提物，然后分段收集各洗脱液； 步骤四将步骤三所获得的各洗脱液分别进行薄层层析，并采用高效液相色谱对各洗脱液分别进行检测分析，然后将薄层层析结果显橙红色、且高效液相色谱检测结果具有相同峰的洗脱液合并，并减压浓缩该合并后的洗脱液得到第一浓缩物； 步骤五将步骤四所获得的第一浓缩物进行中压反相硅胶柱层析以获得粗产物，进行中压反相硅胶柱层析时，先采用体积分数为10%甲醇水溶液为流动相平衡10分钟后，然后流动相采用体积比10°/Γ100% 1的甲醇-水溶剂系统梯度洗脱90min，流动相的流速为5ml/min ； 步骤六将步骤五所获得的粗产物进行Sephadex LH-20凝胶柱层析,所述SephadexLH-20凝胶柱层析采用体积比I: I的氯仿-甲醇溶剂系统洗脱，并根据流分与碘化铋钾显色反应分段收集各流分，然后将与碘化铋钾反应显色相同的流分合并，减压浓缩以获得第二浓缩物； 步骤七将步骤六所获得的第二浓缩物采用制备型高效液相色谱进行分离，得到3个组分；最后，将3个组分分别经过制备型硅胶板分离以获得安丝菌素类化合物；所述制备型高效液相色谱的分离条件为流动相为70%的甲醇水溶液，流动相的流速为I. 5ml/min，检测波长为254nm。
3.如权利要求2所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于所述束丝放线菌菌株FM06-0063的分离方法如下 步骤100 :取云南美登木的老叶和叶柄，用自来水冲洗30min后，再用蒸馏水洗净置于无菌培养皿中；接着将所述老叶和叶柄依次用75%酒精擦洗，无菌水冲洗后，转入质量分数为O. 1%的氯化汞溶液中浸泡3min，再用无菌水冲洗5次，除去消毒液；然后将所述老叶和叶柄剪成小片或小段，放入无菌的研钵中捣碎成糊状物； 步骤200 :用无菌的玻璃涂布棒沾取少量步骤100中得到的糊状物直接涂布于淀粉天冬素琼脂平板，然后将平板置于28°C下培养7 20天，得到放线菌单菌落；所述淀粉天冬素琼脂的组分可溶性淀粉2%，L-天冬素O. 05%, KNO3 O. 1%，K2HPO4 · 3H20 O. 05%, NaClO.05%，MgSO4 · 7H20 O. 05%, CaCO3O. 05%,琼脂I. 5%，蒸馏水配制，pH为7. 5，且该淀粉天冬素琼脂组分中的百分数均为质量分数； 步骤300 :将经过步骤200处理获得的放线菌单菌落转接于无机盐淀粉琼脂斜面，获得束丝放线菌菌株FM06-0063的斜面培养物；所述无机盐淀粉琼脂斜面的组分为可溶性淀粉 IOg ；K2HPO4 · 3H20 Ig ；MgS04 · 7H20 Ig ；NaCl Ig ； (NH4)2SO4 2g ；CaCO3 2g ；FeS04 · 7H200.OOlg ；MnCl2 · 4H20 0. OOlg ；ZnSO4 · 7H20 0. OOlg ;琼脂 20g ;蒸馏水 IOOOmL, pH 为 7. 0 7. 4。
4.如权利要求2所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于所述步骤一具体为、 (O制备种子液将束丝放线菌菌株FM06-0063斜面培养成熟后接种于种子培养基中，并将其置于恒温摇床中振荡培养40 48h，温度28°C，转速220r/in ； (2)制备发酵液按10%的移种量将步骤(I)所获得的种子液转接入已消毒灭菌的发酵培养基培养96 120h，温度28°C，转速220r/min。
5.如权利要求4所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于 所述种子培养基的组分可溶性淀粉I. 5%，葡萄糖O. 5%，黄豆粉1%，氯化钠O. I %，蛋白胨O. 5%，酵母提取物O. 5%，碳酸钙O. 5%，pH为7. 0，且该种子培养基组分中的百分数均为质量分数。
6.如权利要求4所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于 所述发酵培养基的组分糊精1%，甘油3 %，黄豆粉2%，玉米浆干粉I %，磷酸二氢钾O.05%,氯化氨0.05%，碳酸钙O. 5%，pH为7. O，且该发酵培养基组分中的百分数均为质量分数。
7.如权利要求2所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于所述步骤二具体为将束丝放线菌菌株FM06-0063发酵液在转速为3000r/min下离心15min，并取上清液；接着将上清液上样于大孔吸附树脂，再用甲醇洗脱获得混合液；混合液经减压浓缩除去甲醇以获得浓缩液；将浓缩液用与该浓缩液相等体积的乙酸乙酯萃取三次，然后合并乙酸乙酯萃取液；乙酸乙酯萃取液经减压浓缩后到得粗提物。
8.如权利要求2所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于所述步骤三中的氯仿-甲醇梯度洗脱粗提物是指用体积比100 0,98 2,95 5,90 10,85 15，80 20,70 30，60 40,50 50的氯仿-甲醇溶剂系统对粗提物进行梯度洗脱。
9.如权利要求2所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于所述步骤四中的薄层层析的展层剂为体积比15 I的三氯甲烷-甲醇溶剂，显色剂为碘化铋钾显色剂。
10.如权利要求2所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于所述步骤四中的高效液相色谱检测条件为流动相为体积比35 65的含0.1%三氟乙酸的水-甲醇，洗脱20min,流速lmL/min,检测波长254nm,柱温40°C。
11.如权利要求2、3、4或6所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于所述束丝放线菌菌株FIM06-0063 (Actinosynnema sp),于2011年12月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 5677。
全文摘要
本发明涉及一种新的安丝菌素类化合物及其制备方法，该新的安丝菌素类化合物的结构式如下所示其中R为CH2CH3或CH2CH(CH3)2；所述安丝菌素类化合物的制备方法是通过大孔树脂吸附柱层析、硅胶柱层析等方法从束丝放线菌菌株FIM06-0063的发酵产物中，分离纯化获得两个新的安丝菌素类化合物，并对其结构通过质谱、核磁共振波谱、紫外光谱等技术进行表征。本发明制得的安丝菌素类化合物具有较强的抗肿瘤活性；本发明通过微生物发酵方法制备安丝菌素类化合物，具有工艺简单、生产成本低的优点。
文档编号C12R1/01GK102731526SQ201210148068
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者张祝兰, 杨煌建, 王传喜, 谢颖, 贾纬, 郑卫, 陈丽, 陈宏 , 陈晓明, 黄维 申请人:福建省微生物研究所
新的安丝菌素类化合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种化合物，尤其涉及一种新的安丝菌素类化合物，本发明还涉及该安丝菌素类化合物的制备方法。
背景技术：
1972年Kupchan等从原产热带非洲的齿叶美登木(M. serrata)中首次分离出天然抗肿瘤活性成分——大环内酯类化合物美登素(Maytansine)，其后研究人员相继从高等植物矛卫科、鼠李科、大戟科植物、苔藓类植物中分离到美登木类化合物。最引人注意的是从 微生物中发现了这类化合物，1977年，Higashide及其同事在筛选抗癌活性成分的过程中，从分离自莎草科苔属植物叶子的橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)中得到六个美登素衍生物，命名为安丝菌素PO、PU P2、P3、P4、P4’。随后又从另一个橙色束丝放线菌亚种(A pretiosum ssp. Auranticum)中分离得到除上述六个化合物外的十五个新安丝菌素，其母核为19-C的大环内酰胺环，C-3连接不同长度的碳链，主要活性成分是P-3。上述所有这些安丝菌素均可以被还原分解成C-3美登木醇(P-O)，该醇是用于合成含硫醇美登木素生物碱的前体。安丝菌素已被化学转变成含硫醇的美登木素生物碱(maytansinoids),该生物碱以细胞结合剂-美登木素生物碱偶联物的形式体现出的医疗用途已被报道。随着对美登素类抗体结合物研究的不断深入，市场对美登木素类化合物的需求量逐步扩大。由于美登木类植物含美登素及其同系物的含量很低，大量砍伐美登木类植物会对生态造成严重破坏，且从野生植物中寻找原料难以满足工业生产的需要；采用化学合成，又因美登木素结构复杂存在全合成和半合成工艺复杂、过程繁琐、产率很低、反应专一性差等缺点。
发明内容本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种新的安丝菌素类化合物，所述新的安丝菌素类化合物具有抗肿瘤活性。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题之一的式(I)代表的新的安丝菌
素类化合物，
权利要求
1.式(I)代表的新的安丝菌素类化合物，
2.一种如权利要求I所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于其操作步骤如下 步骤一制备束丝放线菌菌株FIM06-0063 (Actinosynnema sp)发酵液； 步骤二 将步骤一所获得的束丝放线菌菌株FM06-0063发酵液进行大孔树脂吸附柱层析，得到粗提物； 步骤三将步骤二所获得的粗提物进行正相硅胶柱层析，并采用氯仿-甲醇梯度洗脱粗提物，然后分段收集各洗脱液； 步骤四将步骤三所获得的各洗脱液分别进行薄层层析，并采用高效液相色谱对各洗脱液分别进行检测分析，然后将薄层层析结果显橙红色、且高效液相色谱检测结果具有相同峰的洗脱液合并，并减压浓缩该合并后的洗脱液得到第一浓缩物； 步骤五将步骤四所获得的第一浓缩物进行中压反相硅胶柱层析以获得粗产物，进行中压反相硅胶柱层析时，先采用体积分数为10%甲醇水溶液为流动相平衡10分钟后，然后流动相采用体积比10°/Γ100% 1的甲醇-水溶剂系统梯度洗脱90min，流动相的流速为5ml/min ； 步骤六将步骤五所获得的粗产物进行Sephadex LH-20凝胶柱层析,所述SephadexLH-20凝胶柱层析采用体积比I: I的氯仿-甲醇溶剂系统洗脱，并根据流分与碘化铋钾显色反应分段收集各流分，然后将与碘化铋钾反应显色相同的流分合并，减压浓缩以获得第二浓缩物； 步骤七将步骤六所获得的第二浓缩物采用制备型高效液相色谱进行分离，得到3个组分；最后，将3个组分分别经过制备型硅胶板分离以获得安丝菌素类化合物；所述制备型高效液相色谱的分离条件为流动相为70%的甲醇水溶液，流动相的流速为I. 5ml/min，检测波长为254nm。
3.如权利要求2所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于所述束丝放线菌菌株FM06-0063的分离方法如下 步骤100 :取云南美登木的老叶和叶柄，用自来水冲洗30min后，再用蒸馏水洗净置于无菌培养皿中；接着将所述老叶和叶柄依次用75%酒精擦洗，无菌水冲洗后，转入质量分数为O. 1%的氯化汞溶液中浸泡3min，再用无菌水冲洗5次，除去消毒液；然后将所述老叶和叶柄剪成小片或小段，放入无菌的研钵中捣碎成糊状物； 步骤200 :用无菌的玻璃涂布棒沾取少量步骤100中得到的糊状物直接涂布于淀粉天冬素琼脂平板，然后将平板置于28°C下培养7 20天，得到放线菌单菌落；所述淀粉天冬素琼脂的组分可溶性淀粉2%，L-天冬素O. 05%, KNO3 O. 1%，K2HPO4 · 3H20 O. 05%, NaClO.05%，MgSO4 · 7H20 O. 05%, CaCO3O. 05%,琼脂I. 5%，蒸馏水配制，pH为7. 5，且该淀粉天冬素琼脂组分中的百分数均为质量分数； 步骤300 :将经过步骤200处理获得的放线菌单菌落转接于无机盐淀粉琼脂斜面，获得束丝放线菌菌株FM06-0063的斜面培养物；所述无机盐淀粉琼脂斜面的组分为可溶性淀粉 IOg ；K2HPO4 · 3H20 Ig ；MgS04 · 7H20 Ig ；NaCl Ig ； (NH4)2SO4 2g ；CaCO3 2g ；FeS04 · 7H200.OOlg ；MnCl2 · 4H20 0. OOlg ；ZnSO4 · 7H20 0. OOlg ;琼脂 20g ;蒸馏水 IOOOmL, pH 为 7. 0 7. 4。
4.如权利要求2所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于所述步骤一具体为、 (O制备种子液将束丝放线菌菌株FM06-0063斜面培养成熟后接种于种子培养基中，并将其置于恒温摇床中振荡培养40 48h，温度28°C，转速220r/in ； (2)制备发酵液按10%的移种量将步骤(I)所获得的种子液转接入已消毒灭菌的发酵培养基培养96 120h，温度28°C，转速220r/min。
5.如权利要求4所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于 所述种子培养基的组分可溶性淀粉I. 5%，葡萄糖O. 5%，黄豆粉1%，氯化钠O. I %，蛋白胨O. 5%，酵母提取物O. 5%，碳酸钙O. 5%，pH为7. 0，且该种子培养基组分中的百分数均为质量分数。
6.如权利要求4所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于 所述发酵培养基的组分糊精1%，甘油3 %，黄豆粉2%，玉米浆干粉I %，磷酸二氢钾O.05%,氯化氨0.05%，碳酸钙O. 5%，pH为7. O，且该发酵培养基组分中的百分数均为质量分数。
7.如权利要求2所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于所述步骤二具体为将束丝放线菌菌株FM06-0063发酵液在转速为3000r/min下离心15min，并取上清液；接着将上清液上样于大孔吸附树脂，再用甲醇洗脱获得混合液；混合液经减压浓缩除去甲醇以获得浓缩液；将浓缩液用与该浓缩液相等体积的乙酸乙酯萃取三次，然后合并乙酸乙酯萃取液；乙酸乙酯萃取液经减压浓缩后到得粗提物。
8.如权利要求2所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于所述步骤三中的氯仿-甲醇梯度洗脱粗提物是指用体积比100 0,98 2,95 5,90 10,85 15，80 20,70 30，60 40,50 50的氯仿-甲醇溶剂系统对粗提物进行梯度洗脱。
9.如权利要求2所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于所述步骤四中的薄层层析的展层剂为体积比15 I的三氯甲烷-甲醇溶剂，显色剂为碘化铋钾显色剂。
10.如权利要求2所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于所述步骤四中的高效液相色谱检测条件为流动相为体积比35 65的含0.1%三氟乙酸的水-甲醇，洗脱20min,流速lmL/min,检测波长254nm,柱温40°C。
11.如权利要求2、3、4或6所述的新的安丝菌素类化合物的制备方法，其特征在于所述束丝放线菌菌株FIM06-0063 (Actinosynnema sp),于2011年12月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 5677。
全文摘要
本发明涉及一种新的安丝菌素类化合物及其制备方法，该新的安丝菌素类化合物的结构式如下所示其中R为CH2CH3或CH2CH(CH3)2；所述安丝菌素类化合物的制备方法是通过大孔树脂吸附柱层析、硅胶柱层析等方法从束丝放线菌菌株FIM06-0063的发酵产物中，分离纯化获得两个新的安丝菌素类化合物，并对其结构通过质谱、核磁共振波谱、紫外光谱等技术进行表征。本发明制得的安丝菌素类化合物具有较强的抗肿瘤活性；本发明通过微生物发酵方法制备安丝菌素类化合物，具有工艺简单、生产成本低的优点。
文档编号C12R1/01GK102731526SQ201210148068
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者张祝兰, 杨煌建, 王传喜, 谢颖, 贾纬, 郑卫, 陈丽, 陈宏 , 陈晓明, 黄维 申请人:福建省微生物研究所
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