南瓜蛋白在制备治疗胃癌药物中的应用的制作方法

专利名称：：南瓜蛋白在制备治疗胃癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗肿瘤药物领域，尤其涉及南瓜蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病，目前临床常用的化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也很大地损伤了正常组织和细胞，这就限制了它的应用。寻找高效、低毒的治疗肿瘤的药物已成为当前抗癌药物研究的方向和迫切任务。从天然物质中寻找抗肿瘤药物已被认为是一种有效的途径，对天然活性物质进行抗肿瘤作用的研究，尤其在抑制增殖及诱导凋亡和分化方面进行探索，将有助于获得理想的抗肿瘤药物。核糖体失活蛋白(ribosome-inactivatingprotein,RIP)广泛存在于高等植物中，迄今分离到的植物RIP约80余种。植物RIP通常按结构不同分为两型1型RIP为单链蛋白，如天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)，在植物RIP中占多数；II型RIP是通过二硫键连接的双链蛋白，如蓖麻毒素(ricin)。它们是一类RNAN-糖苷酶或多核苷酸腺苷糖苷酶，具有抗生育、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学活性。植物RIP抗肿瘤方面的研究早就引起人们的兴趣RIP对肿瘤细胞的杀伤作用远比对正常细胞的强，尤其是与单克隆抗体交联成的免疫毒素对肿瘤细胞具有靶向性和高杀伤效应。而有关RIP抗肿瘤的机制，最初认为在于RIP的细胞毒作用所致的肿瘤细胞坏死，后来发现是通过诱导肿瘤细胞凋亡产生的。CN1263107A提供了从南瓜中分离出的类型1RIP-南瓜蛋白(Cucurmosin)，并公开了它的制备方法。SDS-PAGE显示它的分子量为27kDa，等电点pi>9，具有强烈抑制细胞内核糖体蛋白质合成的活性。南瓜蛋白已长出可供X-射线衍射用的单晶，晶体结构分析结果指出，南瓜蛋白与天花粉蛋白具有结构同源性[Chenetal.ActaCryst.D562000,665-666；ShietalChineseJ.struct,chem.2003，22(2)，165-168]。CN1603340A提供了南瓜蛋白具有RNAN糖苷酶活性和体外抑制白血病细胞增殖的抗肿瘤活性。本发明是基于上述现有技术基础，通过实验证实了南瓜蛋白对体外培养的实体瘤细胞(胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤等)及小鼠移植瘤(黑色素瘤、宫颈癌和肺癌等)具有显著的抑制作用，而对人正常肝细胞株L02及外周血淋巴细胞的影响小，表现出明显的选择性。通过细胞形态观察、细胞增殖周期分析及琼脂糖凝胶电泳测定等研究发现，南瓜蛋白对胃癌、肝癌和黑色素瘤等实体瘤细胞具有诱导凋亡的作用。此外，以黑色素瘤B16细胞为模型，通过细胞形态观察、流式细胞仪分析及黑色素含量测定等研究发现，南瓜蛋白对黑色素瘤细胞尚具有诱导分化的作用；对肿瘤细胞的诱导凋亡和诱导分化作用同时存在，但低浓度时以诱导分化为主，而高浓度时则具有显著的诱导凋亡的作用。我们首次发现南瓜蛋白能诱导肿瘤细胞分化，诱导分化是其抗肿瘤的新机制。南瓜蛋白对肿瘤细胞的诱导凋亡和诱导分化作用是其抗肿瘤活性的重要机制。
发明内容本发明的目的是通过研究南瓜蛋白在体内外的抗肿瘤活性，提供南瓜蛋白在抗肿瘤制药中的应用采用温和的分离纯化方法，包括盐溶液抽提、DEAE-纤维素过滤、CM-纤维素或SP-琼脂糖等强或弱的阳离子凝胶介质二次离子交换层析分离，可以从南瓜果肉中分离到南瓜蛋白，SDS-PAGE检测分子量为27kDa。层析纯的南瓜蛋白(纯度>97%)经过滤除菌后用于实验。本发明提供了南瓜蛋白作为制备治疗肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、黑色素瘤药物的应用。具体实施例方式下面用具体的实施例来说明南瓜蛋白的药效作用和有益效果实施例1南瓜蛋白对体外培养的肿瘤细胞的增殖抑制作用及对人正常细胞的影响取对数生长期的肿瘤细胞(胃癌细胞SGC■，肝癌细胞IfepG2、Bel74(14，非小细胞肺癌细胞A549，乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞B16)和人正常肝细胞L02接种于96孔培养板上，每孔接种量分别为30004000个/100iiL和6000个/100uL；无菌采集健康献血者静脉血15mL，肝素抗凝，用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640配制单个细胞悬夜，调细胞浓度为2X105个/mL，接种于96孔培养板，每孔100PL。上述各培养板细胞培养24h后，实验组加不同浓度的南瓜蛋白lOOiiL，每个浓度做三个复孔；阴性对照组加营养液100yl，空白对照孔加营养液100yL，用于仪器调零。作用不同时间(48h和72h)后，每孔加5mg/mL的MTT20uL，继续培养4h，甩去上清，每孔加二甲亚砜150iiL。用酶标仪(BI0-RAD产品)测定570nm各孔的吸光度值(A57C1)，各组取平均值，计算抑制率抑制率=(1-实验组A57Q/对照组A57Q)X100%。用SPSS12.0进行统计学分析，并计算IC5(I。结果南瓜蛋白对上述胃癌、肝癌、乳腺癌、非小细胞肺癌及黑色素瘤细胞均具有明显的增殖抑制作用，并呈剂量依赖性和时间依赖性，其48h的IC5(I从9.77到36.91ug/mL,72h的IC5(1从1.94ug/mL到13.54ug/mL；而南瓜蛋白对人正常肝细胞和外周血淋巴细胞抑制作用较小，其48h的IC50分别>80ug/mL和>40yg/mL,72h的IC50分别为27.30ii40yg/mL(表1)。可见南瓜蛋白对肿瘤细胞具有明显的选择性抑制作用。表1南瓜蛋白对肿瘤细胞及正常细胞的半数抑制浓度4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例2南瓜蛋白对SGC79Q1、IfepG2、Bel74(14、A549、MCF-7及B16细胞的诱导凋亡作用(1)南瓜蛋白对上述肿瘤细胞形态的影响①荧光显微镜观察上述肿瘤细胞分别接种于多个盖玻片上，12h后加入不同浓度的南瓜蛋白处理24、48和72h，用吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)混合荧光染料染色后，倒扣于载玻片上，在荧光显微镜下观察细胞的形态学变。结果上述细胞均可观察到早、中期凋亡细胞的细胞核或细胞质内有浓染致密的颗粒状黄绿色荧光，核染色质浓缩，核破裂，凋亡小体释放等典型的凋亡细胞形态学改变；同时凋亡有时间及剂量依赖关系。②电子显微镜观察上述肿瘤细胞分别用20yg/mL南瓜蛋白作用48h为实验组，同时以正常培养的上述细胞为对照组，各组细胞经0.25%胰酶消化后，离心收集细胞沉淀，用4°C预冷的2.5%戊二醛-1%多聚甲醛混合液固定，锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬铅染色，透射电子显微镜(HITACHIHu-12A型)观察并拍照。结果上述肿瘤细胞经南瓜蛋白作用后均出现典型的凋亡形态学改变，细胞变小，细胞质浓缩，内质网扩张，核仁消失，细胞核内染色质边聚于核膜下，可见核固缩、核碎裂和凋亡小体；凋亡细胞约占15-20%0(2)流式细胞仪分析以2X105/mL接种于培养瓶中培养12h后，加入不同浓度南瓜蛋白溶液继续培养24、48和72h，收集细胞，2000r/min离心5分钟，PBS洗1次后，倾去上清。以70%乙醇在4°C固定30min以上，离心除去固定液，PBS洗1次后用碘化丙啶(PI)溶液(含0.005%PI、0.TritonX_100、0.lmmol/LEDTA和0.01%RNaseA)在室温避光染色30min，上机分析。结果上述肿瘤细胞经不同浓度南瓜蛋白处理24、48和72h后，在h/A峰的前面，都有高度不同的亚二倍体峰，且呈明显的时间和剂量依赖性。(3)琼脂糖凝胶电泳检测细胞DNA分别收集经20ug/mL南瓜蛋白处理的上述肿瘤细胞12X106个，同时以正常培养的上述细胞为对照。用PBS重悬浮一遍，加入200iiL裂解液(含10mmol/LTris、50mmol/LEDTA、0.5%SDS)，同时加入1ii1蛋白酶K溶液(20mg/mL)，于55°C消化4小时，经酚氯仿异戊醇(25241)和氯仿异戊醇(241)各抽提一次，用无水乙醇沉淀、TE溶解，加入RNase,37°C30分钟，加入上样缓冲液后，于90V、1.2%琼脂糖凝胶电泳2h。电泳完毕，于紫外观察仪上观察并拍照。结果上述肿瘤细胞经20iig/mL南瓜蛋白处理72h，均可见明显的DNALadder条带。而对照组仅见一基因组DNA条带。结果表明，南瓜蛋白对胃癌，肝癌和黑色素瘤细胞均具有显著的诱导凋亡作用。实施例3南瓜蛋白对肿瘤细胞的诱导分化作用(以黑色素瘤B16细胞为模型)(1)细胞形态观察将对照组及实验组B16细胞培养72h后，分别用相差显微镜和透射电子显微镜观察细胞形态并拍照。结果如下①光学显微镜观察对照组B16细胞呈多层不规则生长，具有重叠的圆形细胞；南瓜蛋白作用后，细胞呈一定的极性生长，平行排列，不重叠；3d后，南瓜蛋白浓度在2.5yg/mL以上者，细胞极性明显，多数细胞体积变大，具有树突状结构，细胞间连成网状，生长缓慢，细胞数变少。②电镜观察对照组B16细胞表面可见较多微绒毛，细胞核多数较大且为椭圆形，核内以常染色质为主，胞浆内细胞器较少，黑色素颗粒少见；20ug/mL南瓜蛋白处理3d后，B16细胞体积多数变大，表面较光滑，微绒毛减少，细胞核减小且不规则，核内异染色质增多，胞浆内细胞器丰富，可见大量不同成熟期的黑色素小体，部分细胞大量黑色素小体聚集成团。(2)南瓜蛋白对黑色素瘤细胞增殖周期的影响收集经10yg/mL南瓜蛋白处理24小时的B16细胞，1500r/min离心lOmin，沉淀经70%乙醇固定12小时，PBS洗涤2遍后重悬，用300目尼龙网过滤，以碘化丙啶(PI)溶液在室温避光染色30min，流式细胞仪分析。结果B16细胞经10iig/mL南瓜蛋白处理24h后，G2/M期细胞减少，S期细胞明显减少，而G/h期细胞增多。提示南瓜蛋白可阻止B16细胞由&期向S期过渡从而停滞于&期。(3)南瓜蛋白对黑色素瘤细胞黑色素含量的影响接种对数生长期的B16细胞至6孔板，每孔1.5X105，每组3孔，d2加入南瓜蛋白，终浓度分别为1.25,2.5、5和10yg/mL，作用72h后用PBS洗涤3次，0.25%胰酶消化、计数，1000r/min离心lOmin，细胞沉淀溶于1MNa0H-10%DMS0溶液lmL中，室温放置30min，于400nm波长测定吸收度值(A4J，将结果换算成106细胞的吸收度。结果对照组B16细胞黑色素含量为0.040士0.002(A4(K1/106细胞)，而1.25、2.5、5和10iig/mL南瓜蛋白组黑色素含量分别为0.088士0.007,0.165士0.003、0.225士0.006和0.309士0.008(A400/106细胞)。可见，经南瓜蛋白处理后B16细胞黑色素含量明显增加。结果表明，南瓜蛋白对黑色素瘤细胞具有明显的诱导分化作用。实施例4南瓜蛋白对动物移植瘤的抑制作用(1)南瓜蛋白对宫颈癌U14的抑制作用选择肿瘤生长良好、全身状态较好的荷瘤小鼠，颈椎脱白处死，固定后碘酒酒精消毒，无菌条件下取出瘤块，将肿瘤(g)和生理盐水(mL)以14比例勻浆后，于皮下接种ICR小鼠(合格证号SCXK(闽)2004-0002)，每只0.2mL。将动物随机分组并于接种24h后腹腔注射给药，设0.25、0.5和lmg/kg三个剂量组，同时设环磷酰胺组和生理盐水对照组，每2天给药1次，共5次后，颈椎脱白处死，分别称取体重和瘤重。计算肿瘤生长抑制率(％)肿瘤生长抑制率％=(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)X100；并将结果进行统计学处理。结果南瓜蛋白0.25,0.5和lmg/kg对宫颈癌U14均具有明显的抑制作用，抑制率分别为22.57%、41.17%和58.26%(表2)。(2)南瓜蛋白对黑色素瘤B16的抑制作用将黑色素瘤B16于皮下接种纯系小鼠C57(合格证号SCXK(沪)2003-0003)按上述方法测定南瓜蛋白对黑色素瘤B16的抑制作用。结果南瓜蛋白0.25、0.5和lmg/kg对黑色素瘤B16均具有明显的抑制作用，抑制率分别为22.26%,36.55%和52.21%(表3)。(3)南瓜蛋白对肺癌Lewis的抑制作用将肺癌Lewis于皮下接种纯系小鼠C57(合格证号SCXK(沪)2003-0003)按上述方法测定南瓜蛋白对肺癌Lewis的抑制作用。结果南瓜蛋白0.25、0.5和lmg/kg对肺癌Lewis均具有明显的抑制作用，抑制率分别为30.80%、50.76%和65.54%(表4)表2南瓜蛋白对小鼠U14瘤重的影响(x+s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注与对照组比较，<0.01表3南瓜蛋白对小鼠B16瘤重的影响(x+s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注与对照组比较，**ρ<0.01广ρ<0.001表4南瓜蛋白对小鼠Lewis瘤重的影响(x+s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注与对照组比较，**p<0.01广ρ<0.001从上述实验结果可得出，本发明的南瓜蛋白的有益效果在于南瓜蛋白显著抑制体外培养的胃癌细胞SGC79tll，肝癌细胞!fepG2、Bel7404,非小细胞肺癌细胞A549，乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞B16的增殖，而对人正常肝细胞和外周血淋巴细胞抑制作用较小，表现出明显的选择性，南瓜蛋白亦能在体内明显抑制宫颈癌U14、黑色素瘤B16和肺癌Lewis等动物移植瘤。因此，本发明证实南瓜蛋白具良好的体内外抗实体瘤作用。过细胞形态观察、细胞增殖周期分析及琼脂糖凝胶电泳测定等研究发现，南瓜蛋白对胃癌、肝癌和黑色素瘤等实体瘤细胞具有诱导凋亡的作用；此外，以黑色素瘤B16细胞为模型，通过细胞形态观察、流式细胞仪分析及黑色素含量测定等研究发现，南瓜蛋白对黑色素瘤细胞尚具有诱导分化的作用。对肿瘤细胞的诱导凋亡和诱导分化作用同时存在，但低浓度时以诱导分化为主，而高浓度时则具有显著的诱导凋亡的作用。因此，本发明证实南瓜蛋白具有诱导肿瘤细胞分化和凋亡的作用机制。实施例5南瓜蛋白和天花粉蛋白对胃癌、肝癌及黑色素瘤细胞的增殖抑制作用的比较分别取对数生长期的胃癌SGC79m、肝癌Bel74tl4和黑色素瘤B16细胞，接种于96孔培养板上，每孔接种量30004000个/100μ1。培养隔夜后，实验组加不同浓度的南瓜蛋白或天花粉蛋白100μ1，每个浓度做三个复孔；阴性对照组加营养液100μ1，空白对照孔加营养液100μ1，用于仪器调零。作用不同时间(24、48、72小时)后，每孔加5mg/ml的ΜΤΤ20μ1，继续培养4小时，甩去上清，每孔加二甲亚砜150μ1。用酶标仪(BI0-RAD产品)测定570nm各孔的吸光度值，各组取平均值，并计算抑制率。抑制率=(1_实验组OD值/对照组OD值)XlOO%结果见表5:表5<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求南瓜蛋白作为制备治疗胃癌药物的应用。全文摘要南瓜蛋白在制药中的应用，能够从南瓜果肉中分离出一种核糖体失活蛋白——南瓜蛋白，该蛋白显示了良好的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。南瓜蛋白能显著抑制体外培养的胃癌细胞SGC7901，肝癌细胞HepG2、Bel7404，非小细胞肺癌细胞A549，乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞B16，而对人正常肝细胞和外周血淋巴细胞的抑制作用较小，表现出明显的选择性；南瓜蛋白亦能在小鼠体内明显抑制宫颈癌U14、黑色素瘤B16和肺癌Lewis等动物移植瘤。此外，本发明也证实了南瓜蛋白对肿瘤细胞的诱导凋亡和诱导分化作用是其抗肿瘤活性的重要机制。文档编号A61P35/00GK101822819SQ201010166688公开日2010年9月8日申请日期2005年11月3日优先权日2004年11月5日发明者谢捷明,陈明晃申请人:中国科学院福建物质结构研究所;福建医科大学