Exendin-4衍生物的复合物及其制备方法和应用的制作方法
专利名称：Exendin-4衍生物的复合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种修饰的Exendin-4衍生物，确切的说，涉及一种单甲氧基聚乙二醇-Exendin-4衍生物的复合物及其制备方法和应用，属于肽或蛋白质的修饰复合物及其制备的技术领域。
背景技术：
糖尿病是一组由于胰岛素分泌缺陷及其生物学作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。目前我国糖尿病的患病率和病死率正在呈快速上升趋势，成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的另一个严重危害人民健康的慢性非传染性疾病，其中90%以上为II型糖尿病。目前，人们主要应用磺酰脲类和双胍类等药物来治疗II型糖尿病，但是这些药物的副作用较大，限制了其的临床应用。Exendin-4是希拉毒蜥进食后由唾液腺产生的一种39肽的内分泌激素，与哺乳动物胰高血糖素样肽-1 (GLP-I)有53%的氨基酸序列重叠。Exendin-4与GLP-I有许多共同的糖代谢调节作用，包括葡萄糖依赖性促进胰岛素分泌和抑制胰高血糖素过多分泌作用、 延缓胃排空、减少食物摄取等，Exendin-4与GLP-I相比的最大优点是抗二肽酰基肽酶IV降解。但是Exendin-4在体内也存在半衰期较短的问题，目前Exendin-4治疗糖尿病的研究方向之一是通过对Exendin-4的结构进行改变，得到Exendin-4衍生物，用该衍生物治疗糖尿病，达到延长药物在体内的药效时间的目的。
背景技术：
已经提出一种Exendin-4衍生物及其制备方法，见申请号和发明名称分别为“200910045187. 6”和“一种Exendin-4衍生物及其固相化学合成”的发明专利，该Exendin-4衍生物的体内降血糖活性较天然的Exendin-4 已有所提高。而本发明制备所得的Exendin-4衍生物的复合物在体内的有效降血糖活性要显著高于Exendin-4衍生物。蛋白/多肽类药物普遍存在体内半衰期短、稳定性差、易被各种蛋白酶降解等特性，使得这些药物需要在一天之内多次注射，给病人带来痛苦和不便。研究表明，从血浆中清除Exendin-4几乎全部通过肾脏滤过而不是主要通过蛋白酶降解，因此对Exendin-4或其衍生物进行聚乙二醇化或其它修饰以增加分子大小是一种降低肾脏清除率的方法。目前对Exendin-4的修饰大都是多点修饰，产物存在多态性，分离纯化产物较为困难，并且修饰产物的生物学活性有所降低。鉴于Exendin-4及其衍生物存在体内的降血糖活性的时间有待进一步延长，且普通聚乙二醇修饰产物不均一等问题，因此迫切需要研制体内降血糖时间更长，分离纯化快速简便且易于临床应用的新型单点修饰的Exendin-4衍生物复合物产品。
发明内容
本发明的目的是提出一种Exendin-4衍生物的复合物，该复合物由Exendin-4衍生物与经马来酰亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇组成，其中，所述Exendin-4衍生物ID No. 2, Seq ID No. 3, Seq ID No. 4, Seq ID No. 6, Seq ID No. 7 或 kq ID No. 8，其中 Xaa40，Xaa41, Xaa42, Xaa31, Xaa32 或 Xaa33 分别是 Cys，Ala, Gly, His, Ser 或 Thr 中的任何一个氨基酸；所述经活化的单甲氧基聚乙二醇是mPEG-MAL，分子量为5 40kD ；所述复合物是通过Exendin-4衍生物中的游离巯基和mPEG-MAL基团的双键形成的硫醚键连接而成。本发明Exendin-4衍生物的复合物中的Exendin-4衍生物可以是以下六种结构之任何一种Exendin-4 (1-39) _Xaa40 (Seq ID No. 2)，Exendin-4 (1-39) _Xaa40_Xaa41 (Seq ID No. 3), Exendin-4 (1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42 (Seq ID No. 4)； Exendin-4(1-30)-Xaa31(Seq IDNo. 6)，Exendin-4(1-30)_Xaa31_Xaa32(Seq-ID-No. 7)和 Exendin-4 (1-30) -Xaa31-Xaa32-Xaa33 (Seq ID No. 8)，其中 Xaa40 和 Xaa31 是 Cys，Xaa41， Xaa42, Xaa32 和 Xaa33 分别是 Cys，Ala, Gly, His, Set 或 Thr 中的任何一个氨基酸。更进一步地，该复合物中的Exendin-4衍生物可以是以下四种结构之任何一种 Exendin-4 (1-39)-Xaa40_Xaa41(Seq ID No. 3), Exendin-4 (1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42(Se q ID No. 4) ；Exendin-4 (1-30)-)(aa31-)(aa32(^5q-ID-No· 7)和 Exendin-4 (1-30)-Xaa31_Xa a32-Xaa33 (Seq ID No. 8)，其中 Xaa41 和 Xaa32 是 Cys，Xaa40, Xaa42, Xaa31 和 Xaa33 分别是Cys，Ala, Gly, His, Ser或Thr中的任何一个氨基酸。更进一步地，该复合物中的hendin-4衍生物可以是以下两种结构之任何一种E xendin-4 (1-39)-Xaa40-Xaa41_Xaa42(Seq ID No. 4) ；Exendin-4(1-30)-Xaa31_Xaa32_Xaa 33 (Seq ID No. 8)，其中 Xaa42 和 Xaa33 是 Cys，Xaa40, Xaa41, Xaa31 和 Xaa32 分别是 Cys， Ala, Gly, His, Ser或Thr中的任何一个氨基酸。本发明所涉及的“Exendin-4” 包括 Exendin-4 (1-39)。其序列(Seq ID No. 1)如下His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser0本发明所涉及的“Exendin-4”还包括Exendin-4的截短形式Exendin (1-30)，其序列(Seq ID No. 5)如下His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-A la_Val_Arg_Leu_Phe_Ile_Glu_Trp_Leu_Lys_Asn_Gly_Gly0上述Exendin-4衍生物，见本申请人的发明专利申请申请号为 “200910045187. 6”，发明名称为“一种Exendin-4衍生物及其固相化学合成”中提出的 Exendin-4 衍生物。本发明提供的Exendin-4衍生物的复合物，其中，经活化的单甲氧基聚乙二醇是 mPEG-MAL,其分子量为5 40kD ；该Exendin-4衍生物的复合物是通过Exendin-4衍生物中游离巯基(-SH)和单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺mPEG-MAL基团的末端双键进行加成反应形成的硫醚键连接而成(结构如下图所示)。该Exendin-4衍生物中游离巯基(-SH) 可以实现mPEG-MAL的定点修饰，从而得到均一的修饰产物。
权利要求
1.一种Exendin-4衍生物的复合物，其特征在于，该复合物由Exendin-4衍生物与经马来酰亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇组成，其中，所述Exendin-4衍生物ID No. 2, Seq IDNo. 3，Seq ID No. 4, Seq ID No. 6, Seq ID No. 7 或 Seq ID No. 8，其中 Xaa40，Xaa41，Xaa42， Xaa31,Xaa32或Xaa33分别是Cys，Ala, Gly，His, Ser或Thr中的任何一个氨基酸；所述经活化的单甲氧基聚乙二醇是mPEG-MAL，分子量为5 40kD ；所述复合物是通过Exendin-4 衍生物中的游离巯基和mPEG-MAL基团的双键形成的硫醚键连接而成。
2.如权利要求1所述的Exendin-4衍生物的复合物，其特征在于，所述Exendin-4衍生物为 Seq ID No. 3, Seq ID No. 4, Seq ID No. 7 或 kq ID No. 8 ；其中，Xaa41 和 Xaa32 是 Cys ；Xaa40, Xaa42, Xaa31 和 Xaa33 分别是 Cys, Ala, Gly, His, Ser 或 Thr 中的任何一个氨基酸。
3.如权利要求2所述的Exendin-4衍生物的复合物，其特征在于，所述Exendin-4衍生物为 Seq ID No. 4 或 Seq ID No. 8 ；其中，Xaa42 和 Xaa33 是 Cys ；Xaa40,Xaa41,Xaa31 和 Xaa32分别是Cys，Ala, Gly, His, Ser或Thr中的任何一个氨基酸。
4.如权利要求1所述Exendin-4衍生物的复合物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下第一步，将Exendin-4衍生物溶解于磷酸盐缓冲液中；第二步，再加入mPEG-MAL ；第三步，在4 40°C，pH3. O 9. O条件下进行mPEG修饰反应0. 5 M小时；第四步，置于_20°C终止上述mPEG修饰反应，制得所述Exendin-4衍生物的复合物的粗品溶液；第五步，取以上粗品溶液用Tris-HCl缓冲液稀释，ikpharose Q XL层析柱，梯度洗脱，收集穿透峰和洗脱峰的洗脱溶液；第六步，将以上洗脱液用截留分子量为1 IOkD的超滤管浓缩，冷冻干燥，得到产物即所述Exendin-4衍生物的复合物的纯品，所述产物的分子量介于8. 5 44. 3kD。
5.权利要求1所述的Exendin-4衍生物的复合物在制备治疗糖尿病的药物中的用途。
6.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有有效量的权利要求1所述的Exendin-4衍生物的复合物，以及药学可接受的成分。
全文摘要
本发明公开一种Exendin-4衍生物的复合物及其制备方法和应用，该Exendin-4衍生物的复合物是由Exendin-4衍生物与经马来酰亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇组成，该Exendin-4衍生物的复合物的生物稳定性高，体内半衰期长，生物利用度高。其制备方法操作简便，原料易得。
文档编号A61P3/10GK102234331SQ20101016845
公开日2011年11月9日 申请日期2010年5月6日 优先权日2010年5月6日
发明者劳勋, 吴自荣, 张洪丹, 杨燕, 蒋子威, 黄静 申请人:华东师范大学
技术领域：
本发明涉及一种修饰的Exendin-4衍生物，确切的说，涉及一种单甲氧基聚乙二醇-Exendin-4衍生物的复合物及其制备方法和应用，属于肽或蛋白质的修饰复合物及其制备的技术领域。
背景技术：
糖尿病是一组由于胰岛素分泌缺陷及其生物学作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。目前我国糖尿病的患病率和病死率正在呈快速上升趋势，成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的另一个严重危害人民健康的慢性非传染性疾病，其中90%以上为II型糖尿病。目前，人们主要应用磺酰脲类和双胍类等药物来治疗II型糖尿病，但是这些药物的副作用较大，限制了其的临床应用。Exendin-4是希拉毒蜥进食后由唾液腺产生的一种39肽的内分泌激素，与哺乳动物胰高血糖素样肽-1 (GLP-I)有53%的氨基酸序列重叠。Exendin-4与GLP-I有许多共同的糖代谢调节作用，包括葡萄糖依赖性促进胰岛素分泌和抑制胰高血糖素过多分泌作用、 延缓胃排空、减少食物摄取等，Exendin-4与GLP-I相比的最大优点是抗二肽酰基肽酶IV降解。但是Exendin-4在体内也存在半衰期较短的问题，目前Exendin-4治疗糖尿病的研究方向之一是通过对Exendin-4的结构进行改变，得到Exendin-4衍生物，用该衍生物治疗糖尿病，达到延长药物在体内的药效时间的目的。
背景技术：
已经提出一种Exendin-4衍生物及其制备方法，见申请号和发明名称分别为“200910045187. 6”和“一种Exendin-4衍生物及其固相化学合成”的发明专利，该Exendin-4衍生物的体内降血糖活性较天然的Exendin-4 已有所提高。而本发明制备所得的Exendin-4衍生物的复合物在体内的有效降血糖活性要显著高于Exendin-4衍生物。蛋白/多肽类药物普遍存在体内半衰期短、稳定性差、易被各种蛋白酶降解等特性，使得这些药物需要在一天之内多次注射，给病人带来痛苦和不便。研究表明，从血浆中清除Exendin-4几乎全部通过肾脏滤过而不是主要通过蛋白酶降解，因此对Exendin-4或其衍生物进行聚乙二醇化或其它修饰以增加分子大小是一种降低肾脏清除率的方法。目前对Exendin-4的修饰大都是多点修饰，产物存在多态性，分离纯化产物较为困难，并且修饰产物的生物学活性有所降低。鉴于Exendin-4及其衍生物存在体内的降血糖活性的时间有待进一步延长，且普通聚乙二醇修饰产物不均一等问题，因此迫切需要研制体内降血糖时间更长，分离纯化快速简便且易于临床应用的新型单点修饰的Exendin-4衍生物复合物产品。
发明内容
本发明的目的是提出一种Exendin-4衍生物的复合物，该复合物由Exendin-4衍生物与经马来酰亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇组成，其中，所述Exendin-4衍生物ID No. 2, Seq ID No. 3, Seq ID No. 4, Seq ID No. 6, Seq ID No. 7 或 kq ID No. 8，其中 Xaa40，Xaa41, Xaa42, Xaa31, Xaa32 或 Xaa33 分别是 Cys，Ala, Gly, His, Ser 或 Thr 中的任何一个氨基酸；所述经活化的单甲氧基聚乙二醇是mPEG-MAL，分子量为5 40kD ；所述复合物是通过Exendin-4衍生物中的游离巯基和mPEG-MAL基团的双键形成的硫醚键连接而成。本发明Exendin-4衍生物的复合物中的Exendin-4衍生物可以是以下六种结构之任何一种Exendin-4 (1-39) _Xaa40 (Seq ID No. 2)，Exendin-4 (1-39) _Xaa40_Xaa41 (Seq ID No. 3), Exendin-4 (1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42 (Seq ID No. 4)； Exendin-4(1-30)-Xaa31(Seq IDNo. 6)，Exendin-4(1-30)_Xaa31_Xaa32(Seq-ID-No. 7)和 Exendin-4 (1-30) -Xaa31-Xaa32-Xaa33 (Seq ID No. 8)，其中 Xaa40 和 Xaa31 是 Cys，Xaa41， Xaa42, Xaa32 和 Xaa33 分别是 Cys，Ala, Gly, His, Set 或 Thr 中的任何一个氨基酸。更进一步地，该复合物中的Exendin-4衍生物可以是以下四种结构之任何一种 Exendin-4 (1-39)-Xaa40_Xaa41(Seq ID No. 3), Exendin-4 (1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42(Se q ID No. 4) ；Exendin-4 (1-30)-)(aa31-)(aa32(^5q-ID-No· 7)和 Exendin-4 (1-30)-Xaa31_Xa a32-Xaa33 (Seq ID No. 8)，其中 Xaa41 和 Xaa32 是 Cys，Xaa40, Xaa42, Xaa31 和 Xaa33 分别是Cys，Ala, Gly, His, Ser或Thr中的任何一个氨基酸。更进一步地，该复合物中的hendin-4衍生物可以是以下两种结构之任何一种E xendin-4 (1-39)-Xaa40-Xaa41_Xaa42(Seq ID No. 4) ；Exendin-4(1-30)-Xaa31_Xaa32_Xaa 33 (Seq ID No. 8)，其中 Xaa42 和 Xaa33 是 Cys，Xaa40, Xaa41, Xaa31 和 Xaa32 分别是 Cys， Ala, Gly, His, Ser或Thr中的任何一个氨基酸。本发明所涉及的“Exendin-4” 包括 Exendin-4 (1-39)。其序列(Seq ID No. 1)如下His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser0本发明所涉及的“Exendin-4”还包括Exendin-4的截短形式Exendin (1-30)，其序列(Seq ID No. 5)如下His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-A la_Val_Arg_Leu_Phe_Ile_Glu_Trp_Leu_Lys_Asn_Gly_Gly0上述Exendin-4衍生物，见本申请人的发明专利申请申请号为 “200910045187. 6”，发明名称为“一种Exendin-4衍生物及其固相化学合成”中提出的 Exendin-4 衍生物。本发明提供的Exendin-4衍生物的复合物，其中，经活化的单甲氧基聚乙二醇是 mPEG-MAL,其分子量为5 40kD ；该Exendin-4衍生物的复合物是通过Exendin-4衍生物中游离巯基(-SH)和单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺mPEG-MAL基团的末端双键进行加成反应形成的硫醚键连接而成(结构如下图所示)。该Exendin-4衍生物中游离巯基(-SH) 可以实现mPEG-MAL的定点修饰，从而得到均一的修饰产物。
权利要求
1.一种Exendin-4衍生物的复合物，其特征在于，该复合物由Exendin-4衍生物与经马来酰亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇组成，其中，所述Exendin-4衍生物ID No. 2, Seq IDNo. 3，Seq ID No. 4, Seq ID No. 6, Seq ID No. 7 或 Seq ID No. 8，其中 Xaa40，Xaa41，Xaa42， Xaa31,Xaa32或Xaa33分别是Cys，Ala, Gly，His, Ser或Thr中的任何一个氨基酸；所述经活化的单甲氧基聚乙二醇是mPEG-MAL，分子量为5 40kD ；所述复合物是通过Exendin-4 衍生物中的游离巯基和mPEG-MAL基团的双键形成的硫醚键连接而成。
2.如权利要求1所述的Exendin-4衍生物的复合物，其特征在于，所述Exendin-4衍生物为 Seq ID No. 3, Seq ID No. 4, Seq ID No. 7 或 kq ID No. 8 ；其中，Xaa41 和 Xaa32 是 Cys ；Xaa40, Xaa42, Xaa31 和 Xaa33 分别是 Cys, Ala, Gly, His, Ser 或 Thr 中的任何一个氨基酸。
3.如权利要求2所述的Exendin-4衍生物的复合物，其特征在于，所述Exendin-4衍生物为 Seq ID No. 4 或 Seq ID No. 8 ；其中，Xaa42 和 Xaa33 是 Cys ；Xaa40,Xaa41,Xaa31 和 Xaa32分别是Cys，Ala, Gly, His, Ser或Thr中的任何一个氨基酸。
4.如权利要求1所述Exendin-4衍生物的复合物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下第一步，将Exendin-4衍生物溶解于磷酸盐缓冲液中；第二步，再加入mPEG-MAL ；第三步，在4 40°C，pH3. O 9. O条件下进行mPEG修饰反应0. 5 M小时；第四步，置于_20°C终止上述mPEG修饰反应，制得所述Exendin-4衍生物的复合物的粗品溶液；第五步，取以上粗品溶液用Tris-HCl缓冲液稀释，ikpharose Q XL层析柱，梯度洗脱，收集穿透峰和洗脱峰的洗脱溶液；第六步，将以上洗脱液用截留分子量为1 IOkD的超滤管浓缩，冷冻干燥，得到产物即所述Exendin-4衍生物的复合物的纯品，所述产物的分子量介于8. 5 44. 3kD。
5.权利要求1所述的Exendin-4衍生物的复合物在制备治疗糖尿病的药物中的用途。
6.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有有效量的权利要求1所述的Exendin-4衍生物的复合物，以及药学可接受的成分。
全文摘要
本发明公开一种Exendin-4衍生物的复合物及其制备方法和应用，该Exendin-4衍生物的复合物是由Exendin-4衍生物与经马来酰亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇组成，该Exendin-4衍生物的复合物的生物稳定性高，体内半衰期长，生物利用度高。其制备方法操作简便，原料易得。
文档编号A61P3/10GK102234331SQ20101016845
公开日2011年11月9日 申请日期2010年5月6日 优先权日2010年5月6日
发明者劳勋, 吴自荣, 张洪丹, 杨燕, 蒋子威, 黄静 申请人:华东师范大学
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