一种治疗免疫疾病的药物组合物、其制备及用途的制作方法
专利名称：一种治疗免疫疾病的药物组合物、其制备及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药制剂领域，具体的说是涉及一种治疗免疫疾病的药物组合物、其 制备及用途。
背景技术：
免疫抑制药物是具有免疫有抑制效应的药物，可以抑制机体异常的免疫反应。临 床上主要用于治疗自身免疫性疾病和防止脏器移植排斥。不同的具体药物分别作用于免疫 反应及调节的不同环节，自身免疫病患者的免疫系统认已为敌而发生反应，有损于组织和 脏器，有害健康，这种免疫反应是有害无益的，所以必需要抑制它，器官移植后，机体的免疫 系统识别出植入物是异物，会发生程度不同的排斥反应，有损于植入器官，有悖于移植疗法 的目的，必须用免疫抑制剂来抑制这种排斥反应，免疫治疗通过调节机体免疫功能，纠正免 疫反应异常，达到治病的目的。随着重症感染性疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反应等免 疫相关性疾病发病率的显著升高，免疫抑制剂药物应用较为广泛，同时，近几年器官移植技 术在临床医学上的迅速发展，由于现有的免疫抑制剂在临床应用中还存在不同程度的毒副 作用，因此，继续寻找高效、低毒的免疫抑制剂药物受到国内外药学研究领域的广泛重视。风湿性疾病(rheumatic diseases)泛指影响骨、关节及周围软组织、肌肉、滑囊、 肌腱、筋膜及免疫系统等的一组疾病，其发病原因可以是感染性的，免疫性的，代谢性的，退 行性的。风湿性关节被认为某些遗传背景的人，在内分泌及环境因素影响下，在外来抗原刺 激下产生免疫反应后而发生，属于自身免疫性疾病。目前治疗这方面疾病的药物主要有非 甾体抗炎药，慢作用抗风湿药(环孢素、环磷酰胺)，糖皮质激素，生物制剂，抗生素和中药。 但它们副作用较大，肝、肾的毒性较大，骨髓抑制，生殖系统损害，胃肠道反应，甚至诱发肿 瘤。但自身免疫疾病病程长，长期服用这些药物的毒副作用较大，在治疗过程引起很多不良 反应及并发症，其治疗不能消除病因，只能改善症状，实际上，没有从根本上纠正免疫异常， 仅仅是一种非特异性的治疗方法，不能有效地从根本上控制疾病的发生、发展，并因它广泛 的副作用难于坚持长期用药。豨莶草为常用中药，始载于《新修本草》，《中国药典》(2005年版)规定豨莶为菊 科植物腺梗豨莶Sigesbeckia pubescens Makino，东方豨莶S. orientalis L.和毛梗豨莶 S. glabrescens Makino的干燥地上部分。豨莶草，味苦性寒，入肝肾经。具有祛风湿，利筋 骨的功能，临床常用其治疗四肢麻痹、筋骨疼痛、风湿痹痛，半身不遂、风疹湿疮等症。从化学成分的研究来看豨莶草植物的成分主要为二萜类化合物，从文献资料可知 有关豨莶草药理作用的物质基础没有明确阐明，特别近年来的药理实验及我们对豨莶草的 化学和药理研究的结果，其毒性小，在临床未见报道其毒副作用，这正是我们进一步研究该 项目的切入点和立题的基础，其中发现奇壬醇(kirenol，其结构如下所示)，为有活性的二 萜类先导化合物，由于它的植物资源广泛且目标化合物含量较高，同时化学结构并不复杂 而且较稳定。这不仅从细胞水平、分子水平和整体动物揭示中药活性的物质基础和药理作 用有重要意义，而且对创制具有中国特色，拥有自主知识产权，开发新的免疫抑制剂治疗药物有着重要的基础理论研究和应用研究意义。
专利申请02116909. 8公开了一种提取纯化奇壬醇的方法使用石油醚或环己烷 回流提取，过滤后的滤渣再用醇、氯仿或丙酮等水溶液渗漉提取。溶液浓缩后得到的提取物 加水溶解，使用石油醚和二氯甲烷等萃取，萃取液浓缩后进行色谱法纯化，最后再重结晶得 到奇壬醇结晶。纯度为95%，其并没有公开详细的重结晶过程。但是根据其公开的资料，其 提取得到的化合物中甲基和羟甲基构型与上述结构完全相反。鉴于上述原因，特提出本发明。
发明内容
本发明第一发明目的在于提供一种奇壬醇的提取方法，所提供的提取方法收率 高，制备的奇壬醇纯度高。本发明第二发明目的在于提供含有所述提取方法提取出来的奇壬醇提取物药物 组合物，所述的药物组合物中奇壬醇提取物纯度高，其它杂质含量低。本发明第三发明目的在于提供所述药物组合物的用途。为了实现上述发明目的，本发明采取如下技术方案一种奇壬醇提取物的提取方法所述奇壬醇提取物经过1)醇提取、2)有机酸酯萃 取、3)柱色谱和4)重结晶过程得到，从生药计收率为0. 3 1%;所述奇壬醇提取物中奇壬 醇含量为90 100 %，优选为95 99. 8 %，更优选为98. 5 99. 5 %。这里所述的生药为本领域技术常用术语，即为本领域技术人员通常所知晓的生药。根据前面所述的提取方法1)醇提取将原料药材菊科植物豨莶草，加入醇溶液回流提取，提取液过滤并减 压浓缩至无醇味，得提取液；现有技术出采用的是石油醚进行提取，然而石油醚沸点极低，工业生产危险性极 强。本发明实验发现，使用醇溶液更加便于奇壬醇的提取。2)有机酸酯萃取将步骤1)得到的提取液，以水饱和过的有机酸酯进行萃取，合 并萃取液，减压浓缩，得浸膏状物；3)柱色谱将步骤2)得到的浸膏状物，加入热水溶解，将此水溶液进行大孔树脂 柱色谱，以水洗脱至流出液无色，再以醇溶液进行洗脱，收集含奇壬醇部分的洗脱液，合并 含奇壬醇部分的洗脱液，减压浓缩，得浸膏；
将所得浸膏，进行硅胶柱色谱，以有机酸酯和醇或卤代烃和醇洗脱，合并含奇壬醇 部分的洗脱液，将洗脱液减压浓缩，得浓缩物； 本发明实验发现，对提取物采取大孔树脂色谱和硅胶柱色谱联用的方法可以在和 现有技术比较不降低收率的前提下，最大程度的提高提取物中奇壬醇含量。而具体柱色谱 的操作可以参考现有技术相类似的柱色谱操作方法。4)重结晶将步骤3)硅胶柱色谱后得到的浓缩物溶于醇中，加入有机酸酯，密闭 放置，析出晶体，过滤得到奇壬醇晶体。将得到的奇壬醇晶体，加入醇或脂肪酮，加热溶解，重结晶，得到无色透明晶体，干 燥得到奇壬醇提取物。现有技术使用石油醚提取后，收率非常低，又采用丙酮等溶液进行渗漉提取，然而 渗漉过程往往需要若干天时间，生产效率非常低。本发明经过实验发现，特定用量的醇溶液 可以在很短时间内完成对奇壬醇的提取，大大提高了收率和生产效率。因此，本发明优选步骤1)所述回流提取为提取2 4次，每次回流1 5小时，每 次加入的提取溶剂体积量与生药的体积比为5 1 15 1 ；更优选为提取3次，每次2 3小时，每次加入的提取溶剂体积量与生药的体积比为8 1 12 1。所述的醇溶液可以优选为体积浓度为40 80 %的醇水溶液，更优选为50 70 % 的醇水溶液。此外，还可优选步骤2)所述萃取为2 4次，每次使用的萃取溶剂量与提取液的 比例为0.1 2.0 1.0，浓缩至所得浸膏状物比重为1.0 1.4;优选为萃取3次，每次使 用的萃取溶剂量与提取液的比例为0.3 1.0 1.0，浓缩至所得浸膏状物比重为1.1 1. 2。为了提高奇壬醇的纯度，本发明经过实验发现大孔树脂和硅胶色谱采取梯度洗脱 的方法能够再进一步提高收率和奇壬醇含量。因此，本发明可以优选步骤3)所述大孔树脂柱色谱中以醇溶液洗脱为按照浓度 为25 35 %、45 65 %，68 75 %的顺序进行梯度洗脱，更优选为按照浓度为30 %、50 %， 70%的顺序进行梯度洗脱。所述硅胶色谱中以有机酸酯和醇洗脱或卤代烃和醇洗脱均为洗脱液中两种溶剂 比例27 32 1、18 22 1和8 12 1进行梯度洗脱，优选为30 1,20 1和 10 1。上述梯度洗脱以薄层色谱法检测，当板层上无奇壬醇样品点出现时，即可换下一 梯度进行洗脱。色谱柱填料用量也对提取具有一定影响，如果填料较少，则杂质难以分离，如果填 料过多，洗脱液用量势必大大增加。本领域技术人员根据本发明前面所公开的内容，并结合 现有色谱柱技术，可以大致确定一个合理的范围。但本发明为了更进一步减少工作量和试剂用量，从而降低对试剂对人体的危害， 优选如下方法步骤3)大孔树脂柱色谱中所述热水温度为30 90°C，所述热水用量与浸膏的体 积比为1 6 1，所述大孔树脂填料为AB-8、D201、HP20或DlOl树脂，浸膏状物与大孔树 脂的重量比例为1 15 1 200 ；更优选为所述热水温度为50 60°C，所述热水用量与
6浸膏的体积比为2 4 1，所述大孔树脂填料为AB-8树脂，浸膏状物与大孔树脂的重量比 例为 1 25 1 100 ；所述硅胶柱色谱为先将经大孔树脂柱色谱得到的浸膏与硅胶拌勻，浸膏与硅胶重 量比为1 1 1 3，浸膏与柱色谱硅胶重量比为1 4 1 30;更优选为浸膏与硅胶 重量比为1 1.2 1 2. 5，浸膏与柱色谱硅胶重量比为1 6 1 20。根据前面所述的提取方法步骤4)中溶解浓缩物的醇和有机酸酯体积用量均为浓缩物质量的2 3倍，析出 晶体并过滤后所得母液继续放置析出晶体并过滤，重复上述操作3 5次，合并析出的晶 体；溶解奇壬醇晶体的醇或脂肪酮体积用量均为奇壬醇晶体质量的2 3倍。上述重结晶方法中，使用溶剂溶解了奇壬醇后自然析晶或采用本领域常用的重结 晶方法都可得到纯度较高奇壬醇结晶。但本发明为了更进一步提高奇壬醇纯度，可以更优 选采取如下操作将浓缩物用2 3倍的醇或有机酸酯溶解后，加热至55°C，然后将反应容器下半 部置于温度为-10°C的环境中，保持搅拌速度为70 80转/min，迅速降温至室温，然后停 止搅拌，将所述-10°C的环境调整为0°C，静置3小时，过滤，母液继续0°C下静置3小时，过 滤，母液重复3 5次，合并晶体；将得到的晶体加入2 3倍醇或脂肪酮，加热至40°C溶解，自然降温至10°C，保温 静置5小时，过滤即得奇壬醇晶体。上述优选的重结晶操作可以将提取物中奇壬醇高效液相纯度提高至99. 7 99. 8%左右。根据前面所述的提取方法步骤2) 步骤4)所述有机酸酯SR1COOR2，其中R1和R2分别为相同或不同的直 链烷烃，优选为1 4个碳的直链烷烃，更优选为乙酸乙酯；步骤1) 步骤4)所述醇为直链烷烃醇，优选为1 4个碳的直链烷烃醇，更优选 为甲醇或乙醇；所述醇溶液浓度为20 90%，优选为30 80% ；步骤3)所述卤代烃为直链烷基卤代烃，优选为直链烷基氯代烃，更优选为1 4 个碳的直链烷基氯代烃，最优选为氯仿；步骤4)所述脂肪酮为R3COR4,其中R3和R4分别为相同或不同的直链烷烃，优选为 1 4个碳的直链烷烃，更优选所述脂肪酮为丙酮。一种含有前面所述提取方法提取的奇壬醇的治疗免疫系统疾病的药物组合物， 所述药物组合物含有奇壬醇提取物和可药用辅料，奇壬醇提取物中奇壬醇含量为90 100%，优选为95 99. 8%，更优选为98. 5 99. 5% ；所述奇壬醇提取物按照前面所述提 取方法提取。根据前面所述的治疗免疫系统疾病的药物组合物，所述的药物组合物剂型为片 剂、胶囊、微丸、颗粒剂、缓释剂、口服液、冻干粉针或小水针注射剂。所述的剂型可以在本发明所公开的基础上结合制剂领域中上述剂型常用的制备 方法制备，本领域技术人员通常知晓上述剂型的制备方法，或者在现有公知方法的基础上 进行简单实验以调整至适合。
然而可以优选采用如下方法制备向奇壬醇中加入辅料(微晶纤维素；泊洛沙姆； 95%乙醇；羟丙基纤维素；微晶纤维素；25%淀粉浆；硬质酸镁)，制粒，制成颗粒剂、胶囊剂 或压成片剂。或者优选采用如下方法制备向奇壬醇中加入辅料(微晶纤维素；泊洛沙姆；95% 乙醇；羟丙基纤维素；25%淀粉浆；硬质酸镁)，制粒，制成缓释片剂或胶囊剂。所述微丸剂优选采用如下方法制备向奇壬醇中加入辅料(微晶纤维素；泊洛沙 姆；95%乙醇；羟丙基纤维素；淀粉浆)，制成微丸剂。所述小水针注射剂优选采用如下方法制备向奇壬醇中加入助溶剂，再加入注射 用水，加热溶解，稀释至IOOOml，过滤，滤液超滤，灌装，封口制成1000只，灭菌，检验，即得。所述冻干粉针优选采用如下方法制备向奇壬醇中加入助溶剂，再加入支架剂和 注射用水，加热过滤，滤液超滤，分装，冷冻干燥后压盖即得。上述冷冻干燥分为四个阶段⑴预冻3-4小时，温度在-30 -45°C; (2)减压干 燥14小时，温度在-30 -45°C ； (3)升温干燥4小时，温度在-15 _10°C ；⑷二次升温 干燥4小时，温度在30°C。本发明中，所述的助溶剂可以优选为泊洛沙姆和氨基酸或其盐酸盐，泊洛沙姆即 能溶于也能溶于有机溶剂，无论是固体制剂还是液体制剂都具有良好助溶作用，氨基酸或 其盐酸盐优选天门冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、络氨酸、缬氨酸、组氨 酸或L-半胱氨酸盐酸盐，更优选天门冬氨酸。本发明中选用泊洛沙姆和氨基酸或其盐酸盐 作为助溶剂，增加了奇壬醇在水中的溶解性。本发明中，所述的支架剂可以优选为甘露醇、甘露醇-葡萄糖、甘露醇-右旋糖酐、 葡萄糖或右旋糖酐，优选甘露醇-葡萄糖、甘露醇-右旋糖酐，更优选比例为5 1的甘露 醇-葡萄糖或4 1的甘露醇-右旋糖酐。本发明人发现在制备冻干剂时，选用甘露醇-葡 萄糖、甘露醇_右旋糖酐能更好地解决河豚毒素在制剂中的稳定性问题。所述的药物组合物中优选奇壬醇的剂量为每制剂单位含有5_200mg奇壬醇。前面所述药物组合物在制备治疗自身免疫性疾病和防止器官移植排斥药物的用 途。优选其中奇壬醇的剂量为每制剂单位含有5_200mg奇壬醇。本发明中，所述的制剂单位是指片剂的每片、胶囊剂的每粒胶囊、颗粒剂的每袋等 药学上常规制剂的剂型单位。相对于现有技术，本发明具有如下优点(1)本发明所提供的药物组合物，不仅水溶性良好，而且稳定性良好，安全可靠，质 量稳定，不需在特定温度下的冰箱中保存，室温下贮存期可达5年以上，大大节约了贮藏、 运输成本，方便医疗使用。(2)本发明提取方法所提供的原料药，奇壬醇纯度大于98%，其稳定性良好，所制 备的制剂稳定性优良，疗效好，治疗效果明显。(3)本发明所提供的提取方法制备奇壬醇，损耗少、收率高、纯度高、稳定性好；(4)本发明所提供的奇壬醇的提取方法中不需采用活性炭吸附，采用两次柱层析， AB-8大孔树脂富集奇壬醇，同时除杂质；脱色的作用。不仅能有效地除去杂质，还减少了提 取时间，使奇壬醇的损失减少到最低限度。
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(5)本发明所提供的奇壬醇的制备方法中的提取分离过程中保持较低温度处理， 避免了温度对奇壬醇造成的破坏。
具体实施例方式以下为本发明的具体实施方式
，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是 限制本发明。实施例1原料药奇壬醇的提取将原料药材菊科植物豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)100kg，加入12倍量的 70%乙醇回流提取，提取3次，每次2-3小时，将提取液合并过滤，滤液减压回收醇，至无醇 味，得提取液；药渣弃去。获得的提取液，以水饱和过的乙酸乙脂进行萃取，萃取三次，每次 使用的萃取溶剂量与提取液的比例为0.3-1.0 1.0。合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏 状物，其比重为1. 1-1.2。将浸膏状物，加入50-60°C热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的 体积比为4 1，将此液进行AB-8大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的比例为 1 25，以水洗脱至流出液无色，再以30% ;50%;70%甲醇或乙醇液进行梯度洗脱，洗脱中 以TLC示样品点消失为进行下一梯度的标志。收集含奇壬醇部分的洗脱液，以HPLC或TLC 检测，合并含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏。硅胶柱色谱将获得的浸膏，与 60-100目的硅胶拌样，浸膏与硅胶的比例为1 2;浸膏与柱色谱硅胶的比例为1 10，以 乙酸乙脂和甲醇溶剂系统按照乙酸乙酯和甲醇比例为30 1,20 UlO 1顺序梯度洗 脱，以TLC检测，合并含奇壬醇部分的洗脱液。含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得粘 稠物，进行如下重结晶将粘稠物溶于2倍甲醇中，加入2. 4倍乙酸乙脂，密闭放置，有大量 无色透明晶体析出，滤出晶体，母液继续放置，晶体析出，上述操作3-5次，直至奇壬醇几乎 全部析出，合并析出的奇壬醇晶体。将析出的奇壬醇晶体，加入1.5倍丙酮，加热溶解，重结 晶，得到无色透明晶体，干燥得到450g ；纯度> 98%的奇壬醇。或者将粘稠物用如下重结晶方法将浓缩的粘稠物用3倍的甲醇溶解后，加热至 55 °C，然后将反应容器下半部置于温度为-10°C的环境中，保持搅拌速度为70 80转/ min，迅速降温至室温，然后停止搅拌，将所述-10°C的环境调整为0°C，静置3小时，过滤，母 液继续0°C下静置3小时，过滤，母液重复3 5次，合并晶体；将得到的晶体加入3倍甲醇，加热至40°C溶解，自然降温至10°C，保温静置5小 时，过滤即得430g奇壬醇晶体，纯度为99. 8%。实施例2原料药奇壬醇的提取将原料药材豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)100kg，加入11倍量的50%甲醇回 流提取，提取3次，每次2-3小时，将提取液合并过滤，滤液减压回收醇，至无醇味，得提取 液；药渣弃去。获得的提取液，以水饱和过的乙酸乙脂进行萃取，萃取三次，每次使用的萃取 溶剂量与提取液的比例为0.4 1.0。合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏状物，其比重为 1.1-1.2。将浸膏状物，加入60°C热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的体积比为4 1，将 此液进行AB-8大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的比例为1 100，以水洗脱 至流出液无色，再以30% ；50% ；70%乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱中以TLC示样品点消失 为进行下一梯度的标志。收集含奇壬醇部分的洗脱液，以HPLC或TLC检测，合并含奇壬醇 部分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏。硅胶柱色谱将获得的浸膏，与60-100目的硅胶拌样，浸膏与硅胶的比例为1 2;浸膏与柱色谱硅胶的比例为1 10，以乙酸乙脂和甲醇溶 剂系统按照乙酸乙酯和甲醇比例为30 1,20 UlO 1顺序梯度洗脱，以TLC检测，合并 含奇壬醇部分的洗脱液。含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得粘稠物，进行如下重结 晶将粘稠物溶于3倍乙醇中，加入3倍乙酸乙脂，密闭放置，有大量无色透明晶体析出，滤 出晶体，母液继续放置，晶体析出，上述操作3-5次，直至奇壬醇几乎全部析出，合并析出的 奇壬醇晶体。将析出的奇壬醇晶体，加入3倍甲醇，加热溶解，重结晶，得到无色透明晶体， 干燥得到458g ；纯度彡98. 5%的奇壬醇。或者将粘稠物用如下重结晶方法将浓缩的粘稠物用3倍的乙醇溶解后，加热至 55 °C，然后将反应容器下半部置于温度为-10°C的环境中，保持搅拌速度为70 80转/ min，迅速降温至室温，然后停止搅拌，将所述-10°C的环境调整为0°C，静置3小时，过滤，母 液继续0°C下静置3小时，过滤，母液重复3 5次，合并晶体；将得到的晶体加入3倍乙醇，加热至40°C溶解，自然降温至10°C，保温静置5小 时，过滤即得450g奇壬醇晶体，纯度为99. 9%。实施例3原料药奇壬醇的提取将原料药材菊科植物豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)100kg，加入10倍量的 60%乙醇回流提取，提取2次，每次2. 5小时，将提取液合并过滤，滤液减压回收醇，至无醇 味，得提取液；药渣弃去。获得的提取液，以乙酸乙脂进行萃取，萃取2次，每次使用的萃取 溶剂量与提取液的比例为0.3 1.0。合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏状物，其比重为 1.1-1. 2。将浸膏状物，加入50°C热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的体积比为2 1，将此 液进行AB-8大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的比例为1 50，以水洗脱至 流出液无色，再以30% ；50% ；70%甲醇溶液进行梯度洗脱，洗脱中以TLC示样品点消失为 进行下一梯度的标志。收集含奇壬醇部分的洗脱液，以HPLC或TLC检测，合并含奇壬醇部 分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏。硅胶柱色谱将获得的浸膏，与60-100目的硅胶拌样， 浸膏与硅胶的比例为1 2. 5;浸膏与柱色谱硅胶的比例为1 20，以乙酸乙脂和甲醇溶剂 系统按照乙酸乙酯和甲醇比例为30 1,20 UlO 1顺序梯度洗脱，以TLC检测，合并 含奇壬醇部分的洗脱液。含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得粘稠物，进行如下重结 晶将粘稠物溶于3倍乙醇中，加入2倍乙酸乙脂，密闭放置，有大量无色透明晶体析出，滤 出晶体，母液继续放置，晶体析出，上述操作3-5次，直至奇壬醇几乎全部析出，合并析出的 奇壬醇晶体。将析出的奇壬醇晶体，加入3倍乙醇，加热溶解，重结晶，得到无色透明晶体， 干燥得到490g ；纯度彡98. 7%的奇壬醇。或者将粘稠物用如下重结晶方法将浓缩的粘稠物用3倍的乙酸乙酯溶解后，加 热至55°C，然后将反应容器下半部置于温度为-10°C的环境中，保持搅拌速度为70 80转 /min，迅速降温至室温，然后停止搅拌，将所述-10°C的环境调整为0°C，静置3小时，过滤， 母液继续0°C下静置3小时，过滤，母液重复3 5次，合并晶体；将得到的晶体加入2倍丙酮，加热至40°C溶解，自然降温至10°C，保温静置5小 时，过滤即得437g奇壬醇晶体，纯度为99. 9%。实施例4原料药奇壬醇的提取将原料药材菊科植物豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)100kg，加入9倍量的 50%甲醇回流提取，提取2次，每次2小时，将提取液合并过滤，滤液减压回收醇，至无醇味，得提取液；药渣弃去。获得的提取液，以水饱和过的乙酸乙脂进行萃取，萃取3次，每次使用 的萃取溶剂量与提取液的比例为0.5-1.0 1.0。合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏状物， 其比重为1.2-1.4。将浸膏状物，加入55°C热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的体积比为
3 1，将此液进行AB-8大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的比例为1 40， 以水洗脱至流出液无色，再以30% ；50% ；70%乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱中以TLC示样品 点消失为进行下一梯度的标志。收集含奇壬醇部分的洗脱液，以HPLC或TLC检测，合并含 奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏。硅胶柱色谱将获得的浸膏，与60-100目的 硅胶拌样，浸膏与硅胶的比例为1 2;浸膏与柱色谱硅胶的比例为1 15，以氯仿和甲醇 溶剂系统按照氯仿和甲醇比例为30 1,20 UlO 1顺序梯度洗脱，以TLC检测，合并 含奇壬醇部分的洗脱液。含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得粘稠物，进行如下重结 晶将粘稠物溶于2倍甲醇中，加入2倍乙酸乙脂，密闭放置，有大量无色透明晶体析出，滤 出晶体，母液继续放置，晶体析出，上述操作3-5次，直至奇壬醇几乎全部析出，合并析出的 奇壬醇晶体。将析出的奇壬醇晶体，加入2倍丙酮，加热溶解，重结晶，得到无色透明晶体， 干燥得到532g ；纯度彡98. 9%的奇壬醇。或者将粘稠物用如下重结晶方法将浓缩的粘稠物用3倍的乙醇溶解后，加热至 55 °C，然后将反应容器下半部置于温度为-10°C的环境中，保持搅拌速度为70 80转/ min，迅速降温至室温，然后停止搅拌，将所述-10°C的环境调整为0°C，静置3小时，过滤，母 液继续0°C下静置3小时，过滤，母液重复3 5次，合并晶体；将得到的晶体加入3倍乙醇，加热至40°C溶解，自然降温至10°C，保温静置5小 时，过滤即得486g奇壬醇晶体，纯度为99. 5%。实施例5原料药奇壬醇的提取将原料药材菊科植物豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)100kg，加入8倍量的 80%乙醇回流提取，提取3次，每次3小时，将提取液合并过滤，滤液减压回收醇，至无醇味， 得提取液；药渣弃去。获得的提取液，以水饱和过的乙酸乙脂进行萃取，萃取3次，每次使用 的萃取溶剂量与提取液的比例为0.8 1.0。合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏状物，其 比重为1.0-1. 1。将浸膏状物，加入50-60°C热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的体积比为
4 1，将此液进行HP20大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的比例为1 75， 以水洗脱至流出液无色，再以30% ；50% ；70%甲醇溶液进行梯度洗脱，洗脱中以TLC示样 品点消失为进行下一梯度的标志。收集含奇壬醇部分的洗脱液，以HPLC或TLC检测，合并 含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏。硅胶柱色谱将获得的浸膏，与60-100目 的硅胶拌样，浸膏与硅胶的比例为1 1.2;浸膏与柱色谱硅胶的比例为1 6，以二氯甲烷 和甲醇溶剂系统按照二氯甲烷和甲醇比例为30 1,20 UlO 1顺序梯度洗脱，以TLC 检测，合并含奇壬醇部分的洗脱液。含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得粘稠物，进行 如下重结晶将粘稠物溶于3倍甲醇中，加入2倍乙酸乙脂，密闭放置，有大量无色透明晶体 析出，滤出晶体，母液继续放置，晶体析出，上述操作3-5次，直至奇壬醇几乎全部析出，合 并析出的奇壬醇晶体。将析出的奇壬醇晶体，加入2倍甲醇，加热溶解，重结晶，得到无色透 明晶体，干燥得到920g ；纯度彡98. 3%的奇壬醇。或者将粘稠物用如下重结晶方法将浓缩的粘稠物用2倍的乙酸乙酯溶解后，加 热至55°C，然后将反应容器下半部置于温度为-10°C的环境中，保持搅拌速度为70 80转/min,迅速降温至室温，然后停止搅拌，将所述-10°C的环境调整为0°C，静置3小时，过滤， 母液继续0°C下静置3小时，过滤，母液重复3 5次，合并晶体；将得到的晶体加入2倍甲醇，加热至40°C溶解，自然降温至10°C，保温静置5小 时，过滤即得800g奇壬醇晶体，纯度为99. 4%。实施例6原料药奇壬醇的提取将原料药材菊科植物豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)100kg，加入5倍量的 40%甲醇回流提取，提取3次，每次5小时，将提取液合并过滤，滤液减压回收醇，至无醇味， 得提取液；药渣弃去。获得的提取液，以水饱和过的甲酸丙脂进行萃取，萃取2次，每次使 用的萃取溶剂量与提取液的比例为2.0 1.0。合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏状物， 其比重为1. 1-1.2。将浸膏状物，加入30-40°C热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的体积 比为1.5 1，将此液进行DlOl大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的比例为 1 15 1 20，以水洗脱至流出液无色，再以25% ;65%;73%甲醇或乙醇液进行梯度洗 脱，洗脱中以TLC示样品点消失为进行下一梯度的标志。收集含奇壬醇部分的洗脱液，以 HPLC或TLC检测，合并含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏。硅胶柱色谱将获 得的浸膏，与60-100目的硅胶拌样，浸膏与硅胶的比例为1 1 ；浸膏与柱色谱硅胶的比例 为1 4，以乙酸乙脂和乙醇溶剂系统按照乙酸乙酯和乙醇比例为27 1、18 1、8 1顺 序梯度洗脱，以TLC检测，合并含奇壬醇部分的洗脱液。含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收 溶剂，得粘稠物，进行如下重结晶将粘稠物溶于3倍甲醇中，加入3倍乙酸乙脂，密闭放置， 有大量无色透明晶体析出，滤出晶体，母液继续放置，晶体析出，上述操作3-5次，直至奇壬 醇几乎全部析出，合并析出的奇壬醇晶体。将析出的奇壬醇晶体，加入3倍甲醇，加热溶解， 重结晶，得到无色透明晶体，干燥得到550g ；纯度彡98%的奇壬醇。实施例7原料药奇壬醇的提取将原料药材菊科植物豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)100kg，加入15倍量的 60 %乙醇回流提取，提取2次，每次1小时，将提取液合并过滤，滤液减压回收醇，至无醇 味，得提取液；药渣弃去。获得的提取液，以乙酸丙脂进行萃取，萃取4次，每次使用的萃 取溶剂量与提取液的比例为0.3-1.0 1.0。合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏状物， 其比重为1. 1-1.2。将浸膏状物，加入70-90°C热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的体积 比为6 1，将此液进行D201大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的比例为 1 150-1 180，以水洗脱至流出液无色，再以25 35%;45 65%;68 75%甲醇或乙 醇溶液进行梯度洗脱，洗脱中以TLC示样品点消失为进行下一梯度的标志。收集含奇壬醇 部分的洗脱液，以HPLC或TLC检测，合并含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏。硅 胶柱色谱将获得的浸膏，与柱层析硅胶拌样，浸膏与硅胶的比例为1 3;浸膏与柱色谱硅 胶的比例为1 30，以氯仿和乙醇溶剂系统按照氯仿和乙醇比例为32 1、22 1、12 1 顺序梯度洗脱，以TLC检测，合并含奇壬醇部分的洗脱液。含奇壬醇部分的洗脱液，减压回 收溶剂，得粘稠物，进行如下重结晶将粘稠物溶于2倍甲醇中，加入2倍甲酸乙脂，密闭放 置，有大量无色透明晶体析出，滤出晶体，母液继续放置，晶体析出，上述操作3-5次，直至 奇壬醇几乎全部析出，合并析出的奇壬醇晶体。将析出的奇壬醇晶体，加入3倍丙酮，加热 溶解，重结晶，得到无色透明晶体，干燥得到437g ；纯度> 98. 0%的奇壬醇。实施例8奇壬醇片剂的制备
12
奇壬醇IOOg ；微晶纤维素70g ；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羟丙基纤维素15g ； 25%淀粉浆120ml ；硬酸镁5g，制粒，60°C干燥，12目筛整粒，压成片剂；1000片；每片含 IOOmg奇壬醇实施例9奇壬醇胶囊剂的制备奇壬醇IOOg ；微晶纤维素80g ；；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羟丙基纤维素25g ； 25%淀粉浆120ml ；12目筛制粒，60°C干燥，14目筛整粒，填入空胶囊；得1000粒胶囊；每粒 胶囊含IOOmg奇壬醇实施例10奇壬醇颗粒剂的制备奇壬醇IOOg ；淀粉120g ；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羟丙基纤维素15g ；25% 淀粉浆120ml;糖粉20g;硬酸镁5g，14目筛制粒，60°C干燥，14目筛整粒，分装成袋；1000 袋；每袋含IOOmg奇壬醇。实施例11奇壬醇缓释片剂的制备奇壬醇IOOg ；微晶纤维素70g ；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羟丙基纤维素150g ； 25%淀粉浆100ml;微粉硅胶20g;硬酸镁5g，滑石粉20g;14目制粒，60°C干燥，12目筛整 粒，压成片剂；1000片；每片含IOOmg奇壬醇。实施例12奇壬醇微丸剂的制备奇壬醇IOOg ；微晶纤维素180g ；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羟丙基纤维素20g ； 25%淀粉浆IOOml ；微粉硅胶20g ；滚动制丸，60°C干燥，制成微丸，填入空胶囊；1000粒；每 粒含IOOmg奇壬醇。实施例13奇壬醇缓释胶囊剂的制备奇壬醇IOOg ；微晶纤维素80g ；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羟丙基纤维素150g ； 25%淀粉浆IOOml ；微粉硅胶20g;硬酸镁5g，14目制粒，60°C干燥，12目筛整粒，压成片剂； 1000片；每片含IOOmg奇壬醇。实施例14奇壬醇冻干粉针剂的制备奇壬醇IOOg ；泊洛沙姆2g ；加入5. Og谷氨酸，加入10. Og甘露醇，加入注射用水， 加热溶解，稀释至2000ml，过滤、滤液超滤，分装、冷冻干燥，完毕后压盖。制成1000只，每只 含奇壬醇lOOmg。上述冷冻干燥分为四个阶段(1)预冻3.6小时，温度在_331 ； (2)减压干燥14 小时，温度在_36°C ； (3)升温干燥4小时，温度在-13°C ； (4) 二次升温干燥4小时，温度在 30 "C。实施例15奇壬醇注射剂的制备奇壬醇IOOg ；泊洛沙姆2g ；加入5. Og谷氨酸，加入注射用水，加热溶解，稀释至 2000ml，过滤、滤液超滤，灌装、灭菌。制成1000只，每只含奇壬醇lOOmg。试验例1本发明 对奇壬醇(kirenol)进行了药效学试验。(一)奇壬醇对小鼠的急性经口毒性实验和最大耐受量测定目的测定奇壬醇的LD50和TMD。试验材料①受试动物ICR小鼠，只，体重18g-22g，6_8周龄，雌雄各半，②受试药品奇壬醇，蒸馏水溶解。
(2)LD50 测定动物分组按体重将小鼠随机分成5组，每组6只，雌雄各半10①药物的剂量和配制设5个剂量组，分别为0.64、0.8、l、1.25、1.56g/kg，组间剂量比值为1 0. 8。给 药前以蒸馏水调配成所需浓度，②实验方法给药前小鼠禁食12小时，自由饮水。给药(0. 2ml/10g体重)后立即观察和记录 动物的中毒症状及死亡情况，对死亡动物作尸检，如有异常病变进行组织学检查。观察期为 7天，计算LD50值及95%可信限。7天后解剖动物肉眼观察重要脏器颜色、大小、质地等。最大耐受量试验(TMD)若LD50值不能测出，按照《新药审批办法》的有关规定进行最大耐受量试验。实验方法按照最大浓度最大容积原则，奇壬醇剂最大浓度为，给药体积为 0. 4ml/10克体重，每日2次，每次间隔10h，，给药后立即观察和记录动物的状况、中毒症状 及死亡情况，观察期为7天，观察内容如下 ( 二)奇壬醇大鼠急性经口毒性试验报告(1)试验目的按《中药新药研究指南(药学，药理学，毒理学)》的要求，检测奇壬醇对大鼠的经 口急性毒性。(2)受试动物及药物①药物奇壬醇②溶剂蒸馏水③动物大白鼠(3)材料与方法奇壬醇(豨莶草)生药临床拟用剂量为15g/天/人，人体重量按60kg计。Ig奇 壬醇相当于豨莶草生药lOOOg。①试验组设置测定半数致死量按《中药新药研究指南(药学，药理学，毒理学)》的要求，由北京大学医学部实验 动物科学部提供二级健康SD种大鼠体重170g-200g，雌雄各半。试验前检疫7天，大鼠分 为4组，每组各15只，雌雄各半。采用临床拟用途径，经口给药。剂量分别以5. 00，3. 25， 2. ll，1.37g/kg体重，组距0.65。最高剂量相当于人临床拟用剂量的100倍。空腹12小时 后，等容量一次灌胃，灌胃容量2ml/100g体重。未见大鼠异常和死亡。未得到半数致死量。②最大耐受量试验根据以上试验结果，取大鼠40只，雌雄各半一次灌胃，灌胃容量5. Og/kg体重。灌 胃容量2ml/100g体重。相当于人临床用药量的200倍。给药后每日观察一次，注意观察动 物中毒症状、死亡数和死亡时间。共观察14天。对试验内死亡和试验结束处死的动物进行 尸检。奇壬醇按上述剂量经口给药，观察14天，未见大鼠异常和死亡。试验结束处死动物 进行尸检，未发现异常。③观察方法奇壬醇按上述剂量经口给药，给药后每日观察一次，观察动物中毒症状、死亡数和 死亡时间，试验结束处死动物进行尸检。④结果奇壬醇按上述剂量经口给药，观察14天，解剖观察肝脏、心脏、脾脏、胃等内脏器 官，颜色质地未见异常。未见大鼠异常和死亡。试验结束处死动物进行尸检，未发现异常。⑤结论奇壬醇大鼠急性经口最大耐受量为5g/kg体重，相当于人临床拟用剂量的200倍。
(三)奇壬醇对不同致炎物质所致大鼠足趾肿胀的研究1.试验目的观察奇壬醇对蛋清、甲醛、角叉菜胶等不同致炎物质所致的大鼠足趾肿胀的影响。2.试验材料2.1药品及试剂奇壬醇取140mg奇壬醇溶于700mL蒸馏水中，从中取出200mL加入200mL蒸馏水； 再从剩下的500mL药液中取出IOOmL加入300mL蒸馏水，配出0. 2mg/ml，0. lmg/ml，0. 05mg/ ml药液各400mLo强的松天津力生制药股份有限公司，规格5mg/片。批号030618。取出20片溶 入400mL蒸馏水中。配成0. 25mg/mL药液。新鲜蛋清购于北京大学医学部实验动物中心，取出蛋清ImL加入9mL生理盐水， 制成10%浓度。甲醛北京化工厂生产。取出0. 3mL甲醛加入9. 7mL生理盐水，配置成3%浓度。角叉菜胶Sigma公司，取出0. Ig角叉菜胶加入生理盐水10mL，配置成浓度。2. 2试验仪器游标卡尺2. 3实验动物SD大鼠50只，雌雄各半，北京大学医学部实验动物中心提供。3.试验方法3.1动物分组与给药大鼠按体重随机分成5组，每组10只，分别为①模型对照组，②强的松组5mg/kg体重③奇壬醇低剂量组(QRCL) :lmg/kg体重④奇壬醇中剂量组(QRCM) :2mg/kg体重，⑤奇壬醇高剂量组(QRCH) :4mg/kg体重。奇壬醇各剂量组和强的松组每日灌胃给药一次，给药体积为2ml/100g体重，共给 药一周。模型对照组给予同体积蒸馏水灌胃。3. 2试验方法3.2. 1最后一次给药Ih后，各鼠右后足趾内注入0. ImL新鲜蛋清致炎，分别于致炎 后1、4、6小时测定注射足的肿胀程度。3. 2. 2最后一次给药Ih后，各鼠右后足趾内注入0. lmL3%甲醛致炎，分别于致炎 后2、24、48、72、96小时测定注射足的肿胀程度。3. 2. 3最后一次给药Ih后，各鼠右后足趾内注入0. ImLl %角叉菜胶致炎，分别于 致炎后1、4、6小时测定注射足的肿胀程度。3. 3统计方法SpSS软件进行统计分析，试验数据均以均数士标准差表示。t检 验进行组间比较。4.试验结果4. 1蛋清致炎结果与模型对照组相比，QRCH在0. 5h、2h、4h均能够抑制蛋清引起 的足趾肿胀(P < 0. 05，0. 05，0. 05)。QRCL和QRCM也能降低肿胀度，但无统计学意义(P >
160. 05)；强的松组能够抑制蛋清引起的足趾肿胀(P < 0. 05,0. 01,0. 01)。见表1表1奇壬醇对蛋清所致大鼠足趾肿胀的影响(η = 10)
组别 _致炎后不同时间肿胀度值(X士SD)_
__0. 5h2h4h
模型0. 577±0. 06440. 490±0. 06730. 434±0. 0644
强的松0. 478±0. 0721*0. 426±0. 0720林0. 361 ±0. 0651** 与模型对照组相比*P < 0. 05，**P < 0. 01。4. 2甲醛致炎结果与模型对照组相比，强的松组在第2h、4h、48h、72h、96h均能抑 制甲醛所致足趾肿胀(P < 0.01,0. 05,0.01,0. 05,0. 05). QRCL组在2h显示了一定的抑制 作用(P <0.05)后续时间里与模型组无显著性差异(P>0。05)。QRCM组能够抑制右足 的肿胀(与模型对照组相比P < 0. 05，0. 05，0. 05，0. 01，0. 05)。QRCH组的抑制作用更强 (与模型对照组相比，P < 0. 01,0. 001,0. 001,0. 001,0. 001)结果见表2。表2奇壬醇对甲醛所致大鼠足趾肿胀的影响(X士SD，N = 10)
肿胀度
致炎后不同时间肿胀度值 与模型组相比*P < 0. 05，**P < 0. 01，_P < 0. 001。4.3角叉菜胶与模型对照组相比，QRCL组在4h、6h对肿胀足有明显抑制(P <0.05，0.05)，QRCM组能够抑制角叉菜胶所致足肿胀(P < 0. 05,0. 01,0. 01) QRCH组在 测量的三个时间点均能明显抑制足肿胀(P < 0. 001,0. 001)结果见表3。
表3奇壬醇对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀的影响(X士SD)
QRCM 100.205土 0.0518*0.254士 0.0388** 0.171 士 0.0533**
QRCII 100.203土 0.0572** 0.247士 0.0391*** 0.161土 0. 0337*林与模型对照组相比*P < 0. 05，**P < 0. 01，_P < 0. 001。(四)奇壬醇对佐剂性关节炎大鼠免疫功能的影响1.试验目的观察奇壬醇对佐剂性关节炎大鼠免疫功能的影响2.试验材料(同试验1)3.动物分组与给药(同试验1)4.方法4. INK细胞杀伤活性检测将60只雄性大鼠按体重随机分成6组(1)正常组(NOR)；⑵模型组(AA) ； (3) 氢化可的松预防组(C0RP，2mg/kg iv) ； (4)氢化可的松治疗组(CORT，2mg/kgiv) ； (5)奇壬 醇预防组(KIRP，4mg/kg，ig) ； (6)奇壬醇治疗组(KIRT，4mg/kg，ig)。各预防组注射佐剂当 日开始给药，各治疗组第8天开始给药。连续21天，正常组和模型组给予同体积蒸馏水ig。 除正常组外，各组均以弗氏完全佐剂0. ImL注射于右后足趾。末次给药后，将大鼠全部处死 取脾细胞和腹腔巨噬细胞备用。1.NK细胞杀伤活性检测制备脾淋巴细胞，于96孔细胞培养板中，按以下方案加样效应细胞孔脾细胞100 μ 1/孔(5\106/1111) +细胞培养基10(^1/孔靶细胞孔YAC-I细胞 100 μ 1/孔(1 X 105/ml) + 培养基 100 μ 1/孔实验孔YAC-I细胞100 μ 1/孔+脾细胞100 μ 1/孔放入培养箱中培养4小时。取出离心15分钟。弃上清，加ΜΤΤ100 μ 1/孔，震荡混 勻。继续培养4小时。离心，弃上清，加盐酸-异丙醇ΙΟΟμΙ/孔，震荡混勻。在酶标仪上 选择检测波长570nm，参考波长630nm的条件下测定OD值。计算NK细胞杀伤活性，公式如 下NK细胞杀伤活性=1_(实验孔OD值-效应孔OD值)/靶细胞孔OD值X 100%2. AA大鼠脾细胞培养上清和血清中细胞因子测定2. 1 IL-2的诱生制备的脾细胞ImL加入24孔培养板中，加入终浓度为5ug/mL的 ConA,培养24h，离心取上清，冻存待测。
2. 2 IL-I的诱生大鼠腹腔注入5ml Hank' s液，打开腹膜，用尖吸管抽取腹腔液， 离心。调整细胞浓度为2X106。加入24孔培养板中。30分钟摇动一次。培养2小时，使 细胞充分贴壁，弃去未贴壁的细胞，用不完全培养液洗两次，加入完全培养液至Iml/孔。加 入LPS(终浓度为lOug/ml)于24孔培养板，培养24小时，离心收获上清，-20°C冻存待测。2. 3细胞因子的测定实验前将反应板置于室温平衡，每孔各加入待测样品 100 μ L ；将反应板置37oC 120min ；用洗涤液将反应板充分洗涤4_6次，滤纸上印干。每孔中 加入第一抗体工作液50 μ L，混勻后置37oC 60min,洗板，每孔加底物工作液100 μ L，37oC 暗处反应5-10min。加入1滴终止液混勻。492nm处测定OD值。3.统计采用spss 10. 0软件进行统计，结果用(χ士 s)表示。4 结果4. 1奇壬醇对NK细胞杀伤活性的影响AA大鼠与正常大鼠相比NK细胞杀伤活性降低(P < 0. 001)。可的松治疗组和预 防组对AA大鼠降低的NK活性没有影响(与AA组相比，P>0. 05)。奇壬醇治疗组和预防 组可以升高AA大鼠NK活性(与AA组相比P < 0. 01，P < 0. 001)。见表4。表4奇壬醇对AA大鼠NK细胞杀伤活性的影响
(五)奇壬醇对小鼠迟发型变态性反应的影响
1.试验目的
观察奇壬醇对二硝基氯苯所致小鼠迟发型变态性反应的影响。
2.试验材料
2. 1药品及试剂 奇壬醇同试验一。
乙酰水杨酸(阿斯匹林)水溶片同试验一。
2，4-二硝基氯苯北京化工厂生产，批号760422，取0. 125g2，4-二硝基氯苯溶于
IOmL丙酮溶液中，配置成1.25%二硝基氯苯丙酮溶液。丙酮北京化工厂生产，批号20030320。2. 2实验动物ICR小鼠50只，雌雄各半，体重18_22g，北京大学医学部实验动物中心提供。3.试验方法3. 1动物分组小鼠按体重随机分成5组，每组10只，分别为①模型对照组②阿斯匹林组0. lg/kg体重
19
③奇壬醇低剂量组(QRCL) :lmg/kg体重④奇壬醇中剂量组(QRCM) :2mg/kg体重⑤奇壬醇高剂量组(QRCH) :4mg/kg体重。奇壬醇各剂量组和阿司匹林组每日灌胃给药一次，给药体积为0.2ml/10g体重， 共给药三天。模型对照组给予同体积蒸馏水灌胃。3. 2试验方法各组动物背部注射1. 25%二硝基氯苯丙酮溶液0. 02ml/只，24小时后喂药，喂药 9天后，右耳涂布1.25% 二硝基氯苯丙酮溶液0. 03ml，左耳涂布同体积丙酮，38小时后，用
冲耳器冲下两耳称重。右耳片重量减去左耳片重量(mg)为肿胀度，并计算抑肿率(同试验一)。3. 3统计方法SpsslO. 0软件进行统计分析，试验数据均以均数士标准差表示。t_检验进行组 间比较。4.试验结果与模型对照组相比，奇壬醇各剂量组均能能明显抑制二硝基氯苯所致迟发性变态 性反应的耳廓肿胀(与模型对照组比，均P < 0. 001)。阿司匹林组也明显抑制二硝基氯苯 所致迟发性变态性反应的耳廓肿胀，与模型对照组比，P < 0. 01 (结果见表5)。表5奇壬醇对二硝基氯苯所致小鼠迟发型变态反应的影响 QRCM91.5士 0.241 林*39.75% QRCH 9 1.4士 0.420*** 42.17%注均与模型对照组比**Ρ < 0. 01，_Ρ < 0. 001。(六)奇壬醇对大鼠佐剂性关节炎炎性因子的影响1.试验目的1. 1观察奇壬醇对大鼠佐剂性关节炎滑膜细胞C0X-2、Bcl_2、Fas-L的影响1. 2观察奇壬醇对佐剂性关节炎大鼠血清IL-I β、IL_2、IL_6、PGE等炎性因子的 影响2.实验方法制备大鼠AA模型将50只雄性大鼠随机分成5组(1)正常组(normal,NOR) ； (2)模型组(AA) ； (3) 奇壬醇组(kirenol，KIR，2mg/kg，ig) ； (4)氢化可的松组(Cortisol，CORT，2mg/kg，ip) ； (5) 阿司匹林加环磷酰胺组(aspirin，cyclophosphamide, ASA+CTX, 100mg/kg, 7mg/kg, ig)。除正常组外，各组均以弗氏完全佐剂0. ImL注射于右后足跖皮下。各治疗组第3天开始给药， 连续21天，正常组和模型组给予同体积蒸馏水灌胃。注射佐剂前及末次给药结束后分别测 量测左、右两侧足跖周长，测量三次取平均值。末次给药后将大鼠全部处死，取股动脉血， 3000rpm离心，取上层血清并分装于1. 5mLEP管中，置于-20°C冰箱冻存待用。取踝关节、肝、 脾、胃、胸腺、肾上腺以10 %甲醛固定，组织脱水，备用。制备大鼠踝关节病理切片取方法1中的踝关节组织，以lmol/L EDTA液脱钙3周后常规石蜡包埋、切片、做 HE染色，显微镜观察。右踝关节切片做免疫组化染色。测定大鼠血清PGEC0X-2免疫组化染色测定大鼠血清细胞因子IL-I β、IL-2、IL-6Bcl-2免疫组化染色Fas-L免疫组化染色统计方法实验数值采用SPSS 12. 0统计软件包进行，多组间比较采用One-Way ANONA分析。 统计结果以IT ±s形式表达。实验结果1.奇壬醇对大鼠佐剂性关节炎的影响1. 1奇壬醇对大鼠足肿胀指数的影响右侧AA与NOR相比，足肿胀指数升高(P < 0. 01)，KIR、CORT、ASA+CTX与AA相比 降低(P < 0. 01)。左侧=AA与NOR相比，足肿胀指数升高(P < 0. 01)，KIR、CORT、ASA+CTX 与AA相比降低(P < 0. 05)。见表6。表6奇壬醇对大鼠足肿胀指数的影响(η = 10，了 ±s) 注与正常组比较*ρ < 0. 05，**Ρ < 0. 01 ；与模型组比较ΔΡ < 0. 05，ΔΔΡ < 0.01 (下表同)1. 2奇壬醇对AA大鼠滑膜病理学改变的影响NOR 见图6滑膜边缘光滑，滑膜衬里层1 2层；衬里下层未见炎性细胞浸润、成 纤维细胞及胶原纤维；软骨细胞数目较多，陷窝密集。AA 右侧滑膜细胞增生、肥大，呈绒毛状突起，滑膜衬里层4 5层；衬里下层见
大量淋巴细胞、巨噬细胞浸润，脂肪空泡融合，可见大量成纤维细胞及胶原纤维，个别见纤维素样坏死。左侧滑膜细胞少量增生，滑膜衬里层2 3层；衬里下层见巨噬细胞、淋巴细 胞浸润；软骨细胞、陷窝细胞数目减少。KIR 右侧滑膜细胞少量增生、肥大，个别处呈绒毛状突起，滑膜衬里层2 3层； 衬里下层见少量巨噬细胞、淋巴细胞浸润，脂肪空泡融合，见少量成纤维细胞、胶原纤维。左 侧滑膜细胞增生不明显，滑膜衬里层1 2层；衬里下层见少量巨噬细胞、淋巴细胞浸润， 未见血管新生。CORT 右侧滑膜细胞少量增生、肥大，滑膜衬里层2 3层；衬里下层见少量巨噬 细胞、淋巴细胞浸润及少量成纤维细胞、胶原纤维，血管新生不明显；软骨细胞、陷窝细胞数 目减少。左侧滑膜细胞增生、肥大，滑膜衬里层2 3层；衬里下层见少量巨噬细胞、淋巴 细胞浸润，少量成纤维细胞、胶原纤维；软骨细胞、陷窝细胞数目改变不明显。Asp+CTX 右侧滑膜细胞少量增生、肥大，滑膜衬里层2 3层；衬里下层见少量 巨噬细胞、淋巴细胞浸润，血管新生不明显；软骨细胞、陷窝细胞数目减少不明显。左侧滑 膜细胞肥大，但增生不明显；衬里下层见少量巨噬细胞、淋巴细胞浸润；软骨细胞、陷窝细 胞数目减少不明显。2.奇壬醇的抗炎作用2. 1奇壬醇对AA大鼠血清PGE2的影响AA 大鼠血清 PGE2OD 值 AA 与 NOR 相比升高(P < 0. 01) ；KIR, CORT、ASA+CTX 与 AA 相比降低(P < 0. 01)，且各给药组之间无显著性差异(P > 0. 05)。见表7。表7奇壬醇对AA大鼠血清PGE2的影响(η = 10，1 士 s ) 2. 1. 2奇壬醇对AA大鼠右踝关节滑膜细胞C0X-2表达的影响AA大鼠右踝关节滑膜细胞C0X-2平均积分光密度值AA与NOR相比升高(P < 0.01)；与AA相比，KIR、CORT均降低(P < 0.05，P < 0. 01)，两组间比较无显著性差异 (P > 0. 05)，ASA+CTX与AA相比降低，但无显著性差异(ρ > 0. 05)。见表8。表8奇壬醇对AA大鼠滑膜细胞C0X-2表达的影响(η = 10，了 ±s ) 2. 1. 3奇壬醇对AA大鼠血清细胞因子IL-I β、IL_2、IL_6影响对AA大鼠血清IL-I β、IL-6的影响与NOR相比，AA IL-1 β、IL-60D值均升高 (P < 0. 01)；与 AA 相比，KIR、CORT、ASA+CTX IL-I β OD 值均降低(ρ < 0. 05，ρ < 0. 01，ρ < 0. 05)，IL-60D值均降低(ρ < 0. 05)，且三组间无显著性差异(ρ > 0. 05)对AA大鼠血清IL-2的影响ΑΑ与NOR相比，IL-20D值降低(P < 0. 01)；与AA相 比，KIR升高(ρ < 0. 01)，与NOR相比无显著性差异(P > 0. 05)，CORT,ASA+CTX与AA相比 无显著性差异(P > 0.05)，与NOR相比降低(ρ < 0.01)。见表9。表9奇壬醇对AA大鼠血清细胞因子的影响(η = 10，了 土S) 2. 2奇壬醇对AA大鼠踝关节滑膜细胞凋亡蛋白Bcl_2、Fas-L表达的影响见表10。与NOR相比，AA Bcl_2平均积分光密度值升高(ρ < 0. 05)，Fas-L降低(ρ < 0. 05)；与 AA 相比，KIR, ASA+CTX Bcl-2 平均积分光密度值降低(ρ < 0. 05，ρ < 0. 01)， Fas-L升高(ρ < 0. 05，ρ < 0. 01)，且两组间无显著性差异(ρ > 0. 05)，CORTBc 1-2平均积 分光密度值降低(P < 0. 05), Fas-L平均积分光密度值降低，但无显著性差异(ρ > 0. 05)。表10奇壬醇对AA大鼠滑膜细胞凋亡蛋白表达的影响(η= 10，了 ±s) (七)奇壬醇对大鼠体重及重要器官的影响1.奇壬醇对AA大鼠体重增长的影响见表11。AA与NOR大鼠相比，体重增长率降低(P < 0. 01) ；KIR与NOR相比，体重 增长率无显著变化(P > 0. 05) ；C0RT、ASA+CTX与NOR相比，体重增长率降低(P < 0. 05)。表11奇壬醇对大鼠体重增长的影响(I 士S) 2.奇壬醇对AA大鼠重要器官的影响2. 1奇壬醇对AA大鼠胸腺、脾、肾上腺的影响镜下见NOR大鼠胸腺皮质区内细胞密集，染色较深，髓质区染色较浅。AA与NOR相 比，未见明显改变。各给药组与NOR相比，未见淋巴细胞数目减少。镜下见NOR大鼠红髓区大量染成深红色的红细胞，白髓区见大量染成蓝紫色的淋 巴细胞。AA与NOR相比，未见明显改变。各给药组与NOR相比，未见淋巴细胞数目减少。镜下见NOR大鼠肾上腺胞膜完整，细胞密集，胞膜外可见脂肪空泡。AA与NOR相 比，未见明显改变。各给药组与NOR相比，未见腺体细胞数目减少。2. 2奇壬醇对AA大鼠胃、肝脏的影响镜下见NOR大鼠胃黏膜结构正常，AA与NOR相比未见异常。各给药组与NOR相比， 未见黏膜有出血点或水肿，未见黏膜变薄、腺体萎缩或数目减少，固有膜内未见大量淋巴细 胞、浆细胞浸润。镜下见NOR大鼠肝小叶结构正常，门管区结构正常，小胆管未见增生。AA与NOR相 比未见明显异常。各给药组与NOR相比未见明显异常。本发明上述试验例所述的奇壬醇为本发明实施例1所制备的奇壬醇，本发明其他 实施例制备的奇壬醇也进行了相同的实验，并得出了具有相同趋势的实验结果，本发明不
再一一复述。
权利要求
一种奇壬醇提取物的提取方法，其特征在于所述奇壬醇提取物经过1)醇提取、2)有机酸酯萃取、3)柱色谱和4)重结晶过程得到，从生药计收率为0.3～1％；所述奇壬醇提取物中奇壬醇含量为90～100％，优选为95～99.8％，更优选为98.5～99.5％。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于1)醇提取将原料药材菊科植物豨莶草，加入醇溶液回流提取，提取液过滤并减压浓 缩至无醇味，得提取液；2)有机酸酯萃取将步骤1)得到的提取液，以水饱和过的有机酸酯进行萃取，合并萃 取液，减压浓缩，得浸膏状物；3)柱色谱将步骤2)得到的浸膏状物，加入热水溶解，将此水溶液进行大孔树脂柱色 谱，以水洗脱至流出液无色，再以醇溶液进行洗脱，收集含奇壬醇部分的洗脱液，合并含奇 壬醇部分的洗脱液，减压浓缩，得浸膏；将所得浸膏，进行硅胶柱色谱，以有机酸酯和醇或商代烃和醇洗脱，合并含奇壬醇部分 的洗脱液，将洗脱液减压浓缩，得浓缩物；4)重结晶将步骤3)硅胶柱色谱后得到的浓缩物溶于醇中，加入有机酸酯，密闭放置， 析出晶体，过滤得到奇壬醇晶体。将得到的奇壬醇晶体，加入醇或脂肪酮，加热溶解，重结晶，得到无色透明晶体，干燥得 到奇壬醇提取物。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于步骤1)所述回流提取为提取2 4次，每次回流1 5小时，每次加入的提取溶剂体 积量与生药的体积比为5 1 15 1 ；优选为提取3次，每次2 3小时，每次加入的提 取溶剂体积量与生药的体积比为8 1 12 1。步骤2)所述萃取为2 4次，每次使用的萃取溶剂量与提取液的比例为0. 1 2.0 1.0，浓缩至所得浸膏状物比重为1.0 1.4;优选为萃取3次，每次使用的萃取溶剂 量与提取液的比例为0.3 1.0 1.0，浓缩至所得浸膏状物比重为1.1 1.2。
4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于步骤3)所述大孔树脂柱色谱中以醇溶液洗脱为按照浓度为25 35%、45 65%， 68 75%的顺序进行梯度洗脱，优选为按照浓度为30%、50%，70%的顺序进行梯度洗脱。所述硅胶色谱中以有机酸酯和醇洗脱或卤代烃和醇洗脱均为洗脱液中两种溶剂比例 27 32 1、18 22 1和8 12 1进行梯度洗脱，优选为30 1,20 1和10 1。
5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于步骤3)大孔树脂柱色谱中所述热水温度为30 90°C，所述热水用量与浸膏的体积比 为1 6 1，所述大孔树脂填料为AB-8、D201、HP20或DlOl树脂，浸膏状物与大孔树脂的 重量比例为1 15 1 200;优选为所述热水温度为50 60°C，所述热水用量与浸膏的 体积比为2 4 1，所述大孔树脂填料为AB-8树脂，浸膏状物与大孔树脂的重量比例为 1 25 1 100 ；所述硅胶柱色谱为先将经大孔树脂柱色谱得到的浸膏与硅胶拌勻，浸膏与硅胶重量比 为1 1 1 3，浸膏与柱色谱硅胶重量比为1 4 1 30 ；优选为浸膏与硅胶重量比 为1 1.2 1 2. 5，浸膏与柱色谱硅胶重量比为1 6 1 20。
6.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于步骤4)中溶解浓缩物的醇和有机酸酯体积用量均为浓缩物质量的2 3倍，析出晶体 并过滤后所得母液继续放置析出晶体并过滤，重复上述操作3 5次，合并析出的晶体；溶解奇壬醇晶体的醇或脂肪酮体积用量均为奇壬醇晶体质量的2 3倍。
7.根据权利要求2 6任意一项所述的提取方法，其特征在于步骤2) 步骤4)所述有机酸酯为R1COOR2，其中R1和R2分别为相同或不同的直链烷 烃，优选为1 4个碳的直链烷烃，更优选为乙酸乙酯；步骤1) 步骤4)所述醇为直链烷烃醇，优选为1 4个碳的直链烷烃醇，更优选为甲 醇或乙醇；所述醇溶液浓度为20 90%，优选为30 80% ；步骤3)所述商代烃为直链烷基商代烃，优选为直链烷基氯代烃，更优选为1 4个碳 的直链烷基氯代烃，最优选为氯仿；步骤4)所述脂肪酮为R3COR4，其中民和礼分别为相同或不同的直链烷烃，优选为1 4个碳的直链烷烃，更优选所述脂肪酮为丙酮。
8.一种含有权利要求1 7任意一项所述提取方法提取的奇壬醇的治疗免疫系统疾病 的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有奇壬醇提取物和可药用辅料，奇壬醇提取 物中奇壬醇含量为90 100%，优选为95 99. 8%，更优选为98. 5 99. 5% ；所述奇壬 醇提取物按照权利要求1 8任意一项所述提取方法提取。
9.根据权利要求8所述的治疗免疫系统疾病的药物组合物，其特征在于，所述的药物 组合物剂型为片剂、胶囊、微丸、颗粒剂、缓释剂、口服液、冻干粉针或小水针注射剂。
10.权利要求8或9所述药物组合物在制备治疗自身免疫性疾病和防止器官移植排斥 药物的用途。
全文摘要
本发明涉及一种用于治疗自身免疫性疾病和防止脏器移植排斥的免疫抑制剂的药物活性成份奇壬醇制备的技术方法以及制剂。该制剂包括作为药物活性成份的奇壬醇及其相关的制剂。本发明所用的奇壬醇采用本发明特定的方法制备，操作简便，生产成本低，环境污染低，所制备的奇壬醇纯度高达98％以上，收率高。采用本发明所提供的方法所制备的奇壬醇和制剂不仅稳定性良好，安全可靠，而且质量稳定，治疗效果显著，特别是用于治疗自身免疫性疾病和防止脏器移植排斥的药物。
文档编号A61P37/00GK101880217SQ20101016852
公开日2010年11月10日 申请日期2010年5月7日 优先权日2009年5月7日
发明者付宏征, 欧志强, 钱瑞琴 申请人:北京大学
技术领域：
本发明涉及医药制剂领域，具体的说是涉及一种治疗免疫疾病的药物组合物、其 制备及用途。
背景技术：
免疫抑制药物是具有免疫有抑制效应的药物，可以抑制机体异常的免疫反应。临 床上主要用于治疗自身免疫性疾病和防止脏器移植排斥。不同的具体药物分别作用于免疫 反应及调节的不同环节，自身免疫病患者的免疫系统认已为敌而发生反应，有损于组织和 脏器，有害健康，这种免疫反应是有害无益的，所以必需要抑制它，器官移植后，机体的免疫 系统识别出植入物是异物，会发生程度不同的排斥反应，有损于植入器官，有悖于移植疗法 的目的，必须用免疫抑制剂来抑制这种排斥反应，免疫治疗通过调节机体免疫功能，纠正免 疫反应异常，达到治病的目的。随着重症感染性疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反应等免 疫相关性疾病发病率的显著升高，免疫抑制剂药物应用较为广泛，同时，近几年器官移植技 术在临床医学上的迅速发展，由于现有的免疫抑制剂在临床应用中还存在不同程度的毒副 作用，因此，继续寻找高效、低毒的免疫抑制剂药物受到国内外药学研究领域的广泛重视。风湿性疾病(rheumatic diseases)泛指影响骨、关节及周围软组织、肌肉、滑囊、 肌腱、筋膜及免疫系统等的一组疾病，其发病原因可以是感染性的，免疫性的，代谢性的，退 行性的。风湿性关节被认为某些遗传背景的人，在内分泌及环境因素影响下，在外来抗原刺 激下产生免疫反应后而发生，属于自身免疫性疾病。目前治疗这方面疾病的药物主要有非 甾体抗炎药，慢作用抗风湿药(环孢素、环磷酰胺)，糖皮质激素，生物制剂，抗生素和中药。 但它们副作用较大，肝、肾的毒性较大，骨髓抑制，生殖系统损害，胃肠道反应，甚至诱发肿 瘤。但自身免疫疾病病程长，长期服用这些药物的毒副作用较大，在治疗过程引起很多不良 反应及并发症，其治疗不能消除病因，只能改善症状，实际上，没有从根本上纠正免疫异常， 仅仅是一种非特异性的治疗方法，不能有效地从根本上控制疾病的发生、发展，并因它广泛 的副作用难于坚持长期用药。豨莶草为常用中药，始载于《新修本草》，《中国药典》(2005年版)规定豨莶为菊 科植物腺梗豨莶Sigesbeckia pubescens Makino，东方豨莶S. orientalis L.和毛梗豨莶 S. glabrescens Makino的干燥地上部分。豨莶草，味苦性寒，入肝肾经。具有祛风湿，利筋 骨的功能，临床常用其治疗四肢麻痹、筋骨疼痛、风湿痹痛，半身不遂、风疹湿疮等症。从化学成分的研究来看豨莶草植物的成分主要为二萜类化合物，从文献资料可知 有关豨莶草药理作用的物质基础没有明确阐明，特别近年来的药理实验及我们对豨莶草的 化学和药理研究的结果，其毒性小，在临床未见报道其毒副作用，这正是我们进一步研究该 项目的切入点和立题的基础，其中发现奇壬醇(kirenol，其结构如下所示)，为有活性的二 萜类先导化合物，由于它的植物资源广泛且目标化合物含量较高，同时化学结构并不复杂 而且较稳定。这不仅从细胞水平、分子水平和整体动物揭示中药活性的物质基础和药理作 用有重要意义，而且对创制具有中国特色，拥有自主知识产权，开发新的免疫抑制剂治疗药物有着重要的基础理论研究和应用研究意义。
专利申请02116909. 8公开了一种提取纯化奇壬醇的方法使用石油醚或环己烷 回流提取，过滤后的滤渣再用醇、氯仿或丙酮等水溶液渗漉提取。溶液浓缩后得到的提取物 加水溶解，使用石油醚和二氯甲烷等萃取，萃取液浓缩后进行色谱法纯化，最后再重结晶得 到奇壬醇结晶。纯度为95%，其并没有公开详细的重结晶过程。但是根据其公开的资料，其 提取得到的化合物中甲基和羟甲基构型与上述结构完全相反。鉴于上述原因，特提出本发明。
发明内容
本发明第一发明目的在于提供一种奇壬醇的提取方法，所提供的提取方法收率 高，制备的奇壬醇纯度高。本发明第二发明目的在于提供含有所述提取方法提取出来的奇壬醇提取物药物 组合物，所述的药物组合物中奇壬醇提取物纯度高，其它杂质含量低。本发明第三发明目的在于提供所述药物组合物的用途。为了实现上述发明目的，本发明采取如下技术方案一种奇壬醇提取物的提取方法所述奇壬醇提取物经过1)醇提取、2)有机酸酯萃 取、3)柱色谱和4)重结晶过程得到，从生药计收率为0. 3 1%;所述奇壬醇提取物中奇壬 醇含量为90 100 %，优选为95 99. 8 %，更优选为98. 5 99. 5 %。这里所述的生药为本领域技术常用术语，即为本领域技术人员通常所知晓的生药。根据前面所述的提取方法1)醇提取将原料药材菊科植物豨莶草，加入醇溶液回流提取，提取液过滤并减 压浓缩至无醇味，得提取液；现有技术出采用的是石油醚进行提取，然而石油醚沸点极低，工业生产危险性极 强。本发明实验发现，使用醇溶液更加便于奇壬醇的提取。2)有机酸酯萃取将步骤1)得到的提取液，以水饱和过的有机酸酯进行萃取，合 并萃取液，减压浓缩，得浸膏状物；3)柱色谱将步骤2)得到的浸膏状物，加入热水溶解，将此水溶液进行大孔树脂 柱色谱，以水洗脱至流出液无色，再以醇溶液进行洗脱，收集含奇壬醇部分的洗脱液，合并 含奇壬醇部分的洗脱液，减压浓缩，得浸膏；
将所得浸膏，进行硅胶柱色谱，以有机酸酯和醇或卤代烃和醇洗脱，合并含奇壬醇 部分的洗脱液，将洗脱液减压浓缩，得浓缩物； 本发明实验发现，对提取物采取大孔树脂色谱和硅胶柱色谱联用的方法可以在和 现有技术比较不降低收率的前提下，最大程度的提高提取物中奇壬醇含量。而具体柱色谱 的操作可以参考现有技术相类似的柱色谱操作方法。4)重结晶将步骤3)硅胶柱色谱后得到的浓缩物溶于醇中，加入有机酸酯，密闭 放置，析出晶体，过滤得到奇壬醇晶体。将得到的奇壬醇晶体，加入醇或脂肪酮，加热溶解，重结晶，得到无色透明晶体，干 燥得到奇壬醇提取物。现有技术使用石油醚提取后，收率非常低，又采用丙酮等溶液进行渗漉提取，然而 渗漉过程往往需要若干天时间，生产效率非常低。本发明经过实验发现，特定用量的醇溶液 可以在很短时间内完成对奇壬醇的提取，大大提高了收率和生产效率。因此，本发明优选步骤1)所述回流提取为提取2 4次，每次回流1 5小时，每 次加入的提取溶剂体积量与生药的体积比为5 1 15 1 ；更优选为提取3次，每次2 3小时，每次加入的提取溶剂体积量与生药的体积比为8 1 12 1。所述的醇溶液可以优选为体积浓度为40 80 %的醇水溶液，更优选为50 70 % 的醇水溶液。此外，还可优选步骤2)所述萃取为2 4次，每次使用的萃取溶剂量与提取液的 比例为0.1 2.0 1.0，浓缩至所得浸膏状物比重为1.0 1.4;优选为萃取3次，每次使 用的萃取溶剂量与提取液的比例为0.3 1.0 1.0，浓缩至所得浸膏状物比重为1.1 1. 2。为了提高奇壬醇的纯度，本发明经过实验发现大孔树脂和硅胶色谱采取梯度洗脱 的方法能够再进一步提高收率和奇壬醇含量。因此，本发明可以优选步骤3)所述大孔树脂柱色谱中以醇溶液洗脱为按照浓度 为25 35 %、45 65 %，68 75 %的顺序进行梯度洗脱，更优选为按照浓度为30 %、50 %， 70%的顺序进行梯度洗脱。所述硅胶色谱中以有机酸酯和醇洗脱或卤代烃和醇洗脱均为洗脱液中两种溶剂 比例27 32 1、18 22 1和8 12 1进行梯度洗脱，优选为30 1,20 1和 10 1。上述梯度洗脱以薄层色谱法检测，当板层上无奇壬醇样品点出现时，即可换下一 梯度进行洗脱。色谱柱填料用量也对提取具有一定影响，如果填料较少，则杂质难以分离，如果填 料过多，洗脱液用量势必大大增加。本领域技术人员根据本发明前面所公开的内容，并结合 现有色谱柱技术，可以大致确定一个合理的范围。但本发明为了更进一步减少工作量和试剂用量，从而降低对试剂对人体的危害， 优选如下方法步骤3)大孔树脂柱色谱中所述热水温度为30 90°C，所述热水用量与浸膏的体 积比为1 6 1，所述大孔树脂填料为AB-8、D201、HP20或DlOl树脂，浸膏状物与大孔树 脂的重量比例为1 15 1 200 ；更优选为所述热水温度为50 60°C，所述热水用量与
6浸膏的体积比为2 4 1，所述大孔树脂填料为AB-8树脂，浸膏状物与大孔树脂的重量比 例为 1 25 1 100 ；所述硅胶柱色谱为先将经大孔树脂柱色谱得到的浸膏与硅胶拌勻，浸膏与硅胶重 量比为1 1 1 3，浸膏与柱色谱硅胶重量比为1 4 1 30;更优选为浸膏与硅胶 重量比为1 1.2 1 2. 5，浸膏与柱色谱硅胶重量比为1 6 1 20。根据前面所述的提取方法步骤4)中溶解浓缩物的醇和有机酸酯体积用量均为浓缩物质量的2 3倍，析出 晶体并过滤后所得母液继续放置析出晶体并过滤，重复上述操作3 5次，合并析出的晶 体；溶解奇壬醇晶体的醇或脂肪酮体积用量均为奇壬醇晶体质量的2 3倍。上述重结晶方法中，使用溶剂溶解了奇壬醇后自然析晶或采用本领域常用的重结 晶方法都可得到纯度较高奇壬醇结晶。但本发明为了更进一步提高奇壬醇纯度，可以更优 选采取如下操作将浓缩物用2 3倍的醇或有机酸酯溶解后，加热至55°C，然后将反应容器下半 部置于温度为-10°C的环境中，保持搅拌速度为70 80转/min，迅速降温至室温，然后停 止搅拌，将所述-10°C的环境调整为0°C，静置3小时，过滤，母液继续0°C下静置3小时，过 滤，母液重复3 5次，合并晶体；将得到的晶体加入2 3倍醇或脂肪酮，加热至40°C溶解，自然降温至10°C，保温 静置5小时，过滤即得奇壬醇晶体。上述优选的重结晶操作可以将提取物中奇壬醇高效液相纯度提高至99. 7 99. 8%左右。根据前面所述的提取方法步骤2) 步骤4)所述有机酸酯SR1COOR2，其中R1和R2分别为相同或不同的直 链烷烃，优选为1 4个碳的直链烷烃，更优选为乙酸乙酯；步骤1) 步骤4)所述醇为直链烷烃醇，优选为1 4个碳的直链烷烃醇，更优选 为甲醇或乙醇；所述醇溶液浓度为20 90%，优选为30 80% ；步骤3)所述卤代烃为直链烷基卤代烃，优选为直链烷基氯代烃，更优选为1 4 个碳的直链烷基氯代烃，最优选为氯仿；步骤4)所述脂肪酮为R3COR4,其中R3和R4分别为相同或不同的直链烷烃，优选为 1 4个碳的直链烷烃，更优选所述脂肪酮为丙酮。一种含有前面所述提取方法提取的奇壬醇的治疗免疫系统疾病的药物组合物， 所述药物组合物含有奇壬醇提取物和可药用辅料，奇壬醇提取物中奇壬醇含量为90 100%，优选为95 99. 8%，更优选为98. 5 99. 5% ；所述奇壬醇提取物按照前面所述提 取方法提取。根据前面所述的治疗免疫系统疾病的药物组合物，所述的药物组合物剂型为片 剂、胶囊、微丸、颗粒剂、缓释剂、口服液、冻干粉针或小水针注射剂。所述的剂型可以在本发明所公开的基础上结合制剂领域中上述剂型常用的制备 方法制备，本领域技术人员通常知晓上述剂型的制备方法，或者在现有公知方法的基础上 进行简单实验以调整至适合。
然而可以优选采用如下方法制备向奇壬醇中加入辅料(微晶纤维素；泊洛沙姆； 95%乙醇；羟丙基纤维素；微晶纤维素；25%淀粉浆；硬质酸镁)，制粒，制成颗粒剂、胶囊剂 或压成片剂。或者优选采用如下方法制备向奇壬醇中加入辅料(微晶纤维素；泊洛沙姆；95% 乙醇；羟丙基纤维素；25%淀粉浆；硬质酸镁)，制粒，制成缓释片剂或胶囊剂。所述微丸剂优选采用如下方法制备向奇壬醇中加入辅料(微晶纤维素；泊洛沙 姆；95%乙醇；羟丙基纤维素；淀粉浆)，制成微丸剂。所述小水针注射剂优选采用如下方法制备向奇壬醇中加入助溶剂，再加入注射 用水，加热溶解，稀释至IOOOml，过滤，滤液超滤，灌装，封口制成1000只，灭菌，检验，即得。所述冻干粉针优选采用如下方法制备向奇壬醇中加入助溶剂，再加入支架剂和 注射用水，加热过滤，滤液超滤，分装，冷冻干燥后压盖即得。上述冷冻干燥分为四个阶段⑴预冻3-4小时，温度在-30 -45°C; (2)减压干 燥14小时，温度在-30 -45°C ； (3)升温干燥4小时，温度在-15 _10°C ；⑷二次升温 干燥4小时，温度在30°C。本发明中，所述的助溶剂可以优选为泊洛沙姆和氨基酸或其盐酸盐，泊洛沙姆即 能溶于也能溶于有机溶剂，无论是固体制剂还是液体制剂都具有良好助溶作用，氨基酸或 其盐酸盐优选天门冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、络氨酸、缬氨酸、组氨 酸或L-半胱氨酸盐酸盐，更优选天门冬氨酸。本发明中选用泊洛沙姆和氨基酸或其盐酸盐 作为助溶剂，增加了奇壬醇在水中的溶解性。本发明中，所述的支架剂可以优选为甘露醇、甘露醇-葡萄糖、甘露醇-右旋糖酐、 葡萄糖或右旋糖酐，优选甘露醇-葡萄糖、甘露醇-右旋糖酐，更优选比例为5 1的甘露 醇-葡萄糖或4 1的甘露醇-右旋糖酐。本发明人发现在制备冻干剂时，选用甘露醇-葡 萄糖、甘露醇_右旋糖酐能更好地解决河豚毒素在制剂中的稳定性问题。所述的药物组合物中优选奇壬醇的剂量为每制剂单位含有5_200mg奇壬醇。前面所述药物组合物在制备治疗自身免疫性疾病和防止器官移植排斥药物的用 途。优选其中奇壬醇的剂量为每制剂单位含有5_200mg奇壬醇。本发明中，所述的制剂单位是指片剂的每片、胶囊剂的每粒胶囊、颗粒剂的每袋等 药学上常规制剂的剂型单位。相对于现有技术，本发明具有如下优点(1)本发明所提供的药物组合物，不仅水溶性良好，而且稳定性良好，安全可靠，质 量稳定，不需在特定温度下的冰箱中保存，室温下贮存期可达5年以上，大大节约了贮藏、 运输成本，方便医疗使用。(2)本发明提取方法所提供的原料药，奇壬醇纯度大于98%，其稳定性良好，所制 备的制剂稳定性优良，疗效好，治疗效果明显。(3)本发明所提供的提取方法制备奇壬醇，损耗少、收率高、纯度高、稳定性好；(4)本发明所提供的奇壬醇的提取方法中不需采用活性炭吸附，采用两次柱层析， AB-8大孔树脂富集奇壬醇，同时除杂质；脱色的作用。不仅能有效地除去杂质，还减少了提 取时间，使奇壬醇的损失减少到最低限度。
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(5)本发明所提供的奇壬醇的制备方法中的提取分离过程中保持较低温度处理， 避免了温度对奇壬醇造成的破坏。
具体实施例方式以下为本发明的具体实施方式
，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是 限制本发明。实施例1原料药奇壬醇的提取将原料药材菊科植物豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)100kg，加入12倍量的 70%乙醇回流提取，提取3次，每次2-3小时，将提取液合并过滤，滤液减压回收醇，至无醇 味，得提取液；药渣弃去。获得的提取液，以水饱和过的乙酸乙脂进行萃取，萃取三次，每次 使用的萃取溶剂量与提取液的比例为0.3-1.0 1.0。合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏 状物，其比重为1. 1-1.2。将浸膏状物，加入50-60°C热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的 体积比为4 1，将此液进行AB-8大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的比例为 1 25，以水洗脱至流出液无色，再以30% ;50%;70%甲醇或乙醇液进行梯度洗脱，洗脱中 以TLC示样品点消失为进行下一梯度的标志。收集含奇壬醇部分的洗脱液，以HPLC或TLC 检测，合并含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏。硅胶柱色谱将获得的浸膏，与 60-100目的硅胶拌样，浸膏与硅胶的比例为1 2;浸膏与柱色谱硅胶的比例为1 10，以 乙酸乙脂和甲醇溶剂系统按照乙酸乙酯和甲醇比例为30 1,20 UlO 1顺序梯度洗 脱，以TLC检测，合并含奇壬醇部分的洗脱液。含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得粘 稠物，进行如下重结晶将粘稠物溶于2倍甲醇中，加入2. 4倍乙酸乙脂，密闭放置，有大量 无色透明晶体析出，滤出晶体，母液继续放置，晶体析出，上述操作3-5次，直至奇壬醇几乎 全部析出，合并析出的奇壬醇晶体。将析出的奇壬醇晶体，加入1.5倍丙酮，加热溶解，重结 晶，得到无色透明晶体，干燥得到450g ；纯度> 98%的奇壬醇。或者将粘稠物用如下重结晶方法将浓缩的粘稠物用3倍的甲醇溶解后，加热至 55 °C，然后将反应容器下半部置于温度为-10°C的环境中，保持搅拌速度为70 80转/ min，迅速降温至室温，然后停止搅拌，将所述-10°C的环境调整为0°C，静置3小时，过滤，母 液继续0°C下静置3小时，过滤，母液重复3 5次，合并晶体；将得到的晶体加入3倍甲醇，加热至40°C溶解，自然降温至10°C，保温静置5小 时，过滤即得430g奇壬醇晶体，纯度为99. 8%。实施例2原料药奇壬醇的提取将原料药材豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)100kg，加入11倍量的50%甲醇回 流提取，提取3次，每次2-3小时，将提取液合并过滤，滤液减压回收醇，至无醇味，得提取 液；药渣弃去。获得的提取液，以水饱和过的乙酸乙脂进行萃取，萃取三次，每次使用的萃取 溶剂量与提取液的比例为0.4 1.0。合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏状物，其比重为 1.1-1.2。将浸膏状物，加入60°C热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的体积比为4 1，将 此液进行AB-8大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的比例为1 100，以水洗脱 至流出液无色，再以30% ；50% ；70%乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱中以TLC示样品点消失 为进行下一梯度的标志。收集含奇壬醇部分的洗脱液，以HPLC或TLC检测，合并含奇壬醇 部分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏。硅胶柱色谱将获得的浸膏，与60-100目的硅胶拌样，浸膏与硅胶的比例为1 2;浸膏与柱色谱硅胶的比例为1 10，以乙酸乙脂和甲醇溶 剂系统按照乙酸乙酯和甲醇比例为30 1,20 UlO 1顺序梯度洗脱，以TLC检测，合并 含奇壬醇部分的洗脱液。含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得粘稠物，进行如下重结 晶将粘稠物溶于3倍乙醇中，加入3倍乙酸乙脂，密闭放置，有大量无色透明晶体析出，滤 出晶体，母液继续放置，晶体析出，上述操作3-5次，直至奇壬醇几乎全部析出，合并析出的 奇壬醇晶体。将析出的奇壬醇晶体，加入3倍甲醇，加热溶解，重结晶，得到无色透明晶体， 干燥得到458g ；纯度彡98. 5%的奇壬醇。或者将粘稠物用如下重结晶方法将浓缩的粘稠物用3倍的乙醇溶解后，加热至 55 °C，然后将反应容器下半部置于温度为-10°C的环境中，保持搅拌速度为70 80转/ min，迅速降温至室温，然后停止搅拌，将所述-10°C的环境调整为0°C，静置3小时，过滤，母 液继续0°C下静置3小时，过滤，母液重复3 5次，合并晶体；将得到的晶体加入3倍乙醇，加热至40°C溶解，自然降温至10°C，保温静置5小 时，过滤即得450g奇壬醇晶体，纯度为99. 9%。实施例3原料药奇壬醇的提取将原料药材菊科植物豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)100kg，加入10倍量的 60%乙醇回流提取，提取2次，每次2. 5小时，将提取液合并过滤，滤液减压回收醇，至无醇 味，得提取液；药渣弃去。获得的提取液，以乙酸乙脂进行萃取，萃取2次，每次使用的萃取 溶剂量与提取液的比例为0.3 1.0。合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏状物，其比重为 1.1-1. 2。将浸膏状物，加入50°C热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的体积比为2 1，将此 液进行AB-8大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的比例为1 50，以水洗脱至 流出液无色，再以30% ；50% ；70%甲醇溶液进行梯度洗脱，洗脱中以TLC示样品点消失为 进行下一梯度的标志。收集含奇壬醇部分的洗脱液，以HPLC或TLC检测，合并含奇壬醇部 分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏。硅胶柱色谱将获得的浸膏，与60-100目的硅胶拌样， 浸膏与硅胶的比例为1 2. 5;浸膏与柱色谱硅胶的比例为1 20，以乙酸乙脂和甲醇溶剂 系统按照乙酸乙酯和甲醇比例为30 1,20 UlO 1顺序梯度洗脱，以TLC检测，合并 含奇壬醇部分的洗脱液。含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得粘稠物，进行如下重结 晶将粘稠物溶于3倍乙醇中，加入2倍乙酸乙脂，密闭放置，有大量无色透明晶体析出，滤 出晶体，母液继续放置，晶体析出，上述操作3-5次，直至奇壬醇几乎全部析出，合并析出的 奇壬醇晶体。将析出的奇壬醇晶体，加入3倍乙醇，加热溶解，重结晶，得到无色透明晶体， 干燥得到490g ；纯度彡98. 7%的奇壬醇。或者将粘稠物用如下重结晶方法将浓缩的粘稠物用3倍的乙酸乙酯溶解后，加 热至55°C，然后将反应容器下半部置于温度为-10°C的环境中，保持搅拌速度为70 80转 /min，迅速降温至室温，然后停止搅拌，将所述-10°C的环境调整为0°C，静置3小时，过滤， 母液继续0°C下静置3小时，过滤，母液重复3 5次，合并晶体；将得到的晶体加入2倍丙酮，加热至40°C溶解，自然降温至10°C，保温静置5小 时，过滤即得437g奇壬醇晶体，纯度为99. 9%。实施例4原料药奇壬醇的提取将原料药材菊科植物豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)100kg，加入9倍量的 50%甲醇回流提取，提取2次，每次2小时，将提取液合并过滤，滤液减压回收醇，至无醇味，得提取液；药渣弃去。获得的提取液，以水饱和过的乙酸乙脂进行萃取，萃取3次，每次使用 的萃取溶剂量与提取液的比例为0.5-1.0 1.0。合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏状物， 其比重为1.2-1.4。将浸膏状物，加入55°C热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的体积比为
3 1，将此液进行AB-8大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的比例为1 40， 以水洗脱至流出液无色，再以30% ；50% ；70%乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱中以TLC示样品 点消失为进行下一梯度的标志。收集含奇壬醇部分的洗脱液，以HPLC或TLC检测，合并含 奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏。硅胶柱色谱将获得的浸膏，与60-100目的 硅胶拌样，浸膏与硅胶的比例为1 2;浸膏与柱色谱硅胶的比例为1 15，以氯仿和甲醇 溶剂系统按照氯仿和甲醇比例为30 1,20 UlO 1顺序梯度洗脱，以TLC检测，合并 含奇壬醇部分的洗脱液。含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得粘稠物，进行如下重结 晶将粘稠物溶于2倍甲醇中，加入2倍乙酸乙脂，密闭放置，有大量无色透明晶体析出，滤 出晶体，母液继续放置，晶体析出，上述操作3-5次，直至奇壬醇几乎全部析出，合并析出的 奇壬醇晶体。将析出的奇壬醇晶体，加入2倍丙酮，加热溶解，重结晶，得到无色透明晶体， 干燥得到532g ；纯度彡98. 9%的奇壬醇。或者将粘稠物用如下重结晶方法将浓缩的粘稠物用3倍的乙醇溶解后，加热至 55 °C，然后将反应容器下半部置于温度为-10°C的环境中，保持搅拌速度为70 80转/ min，迅速降温至室温，然后停止搅拌，将所述-10°C的环境调整为0°C，静置3小时，过滤，母 液继续0°C下静置3小时，过滤，母液重复3 5次，合并晶体；将得到的晶体加入3倍乙醇，加热至40°C溶解，自然降温至10°C，保温静置5小 时，过滤即得486g奇壬醇晶体，纯度为99. 5%。实施例5原料药奇壬醇的提取将原料药材菊科植物豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)100kg，加入8倍量的 80%乙醇回流提取，提取3次，每次3小时，将提取液合并过滤，滤液减压回收醇，至无醇味， 得提取液；药渣弃去。获得的提取液，以水饱和过的乙酸乙脂进行萃取，萃取3次，每次使用 的萃取溶剂量与提取液的比例为0.8 1.0。合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏状物，其 比重为1.0-1. 1。将浸膏状物，加入50-60°C热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的体积比为
4 1，将此液进行HP20大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的比例为1 75， 以水洗脱至流出液无色，再以30% ；50% ；70%甲醇溶液进行梯度洗脱，洗脱中以TLC示样 品点消失为进行下一梯度的标志。收集含奇壬醇部分的洗脱液，以HPLC或TLC检测，合并 含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏。硅胶柱色谱将获得的浸膏，与60-100目 的硅胶拌样，浸膏与硅胶的比例为1 1.2;浸膏与柱色谱硅胶的比例为1 6，以二氯甲烷 和甲醇溶剂系统按照二氯甲烷和甲醇比例为30 1,20 UlO 1顺序梯度洗脱，以TLC 检测，合并含奇壬醇部分的洗脱液。含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得粘稠物，进行 如下重结晶将粘稠物溶于3倍甲醇中，加入2倍乙酸乙脂，密闭放置，有大量无色透明晶体 析出，滤出晶体，母液继续放置，晶体析出，上述操作3-5次，直至奇壬醇几乎全部析出，合 并析出的奇壬醇晶体。将析出的奇壬醇晶体，加入2倍甲醇，加热溶解，重结晶，得到无色透 明晶体，干燥得到920g ；纯度彡98. 3%的奇壬醇。或者将粘稠物用如下重结晶方法将浓缩的粘稠物用2倍的乙酸乙酯溶解后，加 热至55°C，然后将反应容器下半部置于温度为-10°C的环境中，保持搅拌速度为70 80转/min,迅速降温至室温，然后停止搅拌，将所述-10°C的环境调整为0°C，静置3小时，过滤， 母液继续0°C下静置3小时，过滤，母液重复3 5次，合并晶体；将得到的晶体加入2倍甲醇，加热至40°C溶解，自然降温至10°C，保温静置5小 时，过滤即得800g奇壬醇晶体，纯度为99. 4%。实施例6原料药奇壬醇的提取将原料药材菊科植物豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)100kg，加入5倍量的 40%甲醇回流提取，提取3次，每次5小时，将提取液合并过滤，滤液减压回收醇，至无醇味， 得提取液；药渣弃去。获得的提取液，以水饱和过的甲酸丙脂进行萃取，萃取2次，每次使 用的萃取溶剂量与提取液的比例为2.0 1.0。合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏状物， 其比重为1. 1-1.2。将浸膏状物，加入30-40°C热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的体积 比为1.5 1，将此液进行DlOl大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的比例为 1 15 1 20，以水洗脱至流出液无色，再以25% ;65%;73%甲醇或乙醇液进行梯度洗 脱，洗脱中以TLC示样品点消失为进行下一梯度的标志。收集含奇壬醇部分的洗脱液，以 HPLC或TLC检测，合并含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏。硅胶柱色谱将获 得的浸膏，与60-100目的硅胶拌样，浸膏与硅胶的比例为1 1 ；浸膏与柱色谱硅胶的比例 为1 4，以乙酸乙脂和乙醇溶剂系统按照乙酸乙酯和乙醇比例为27 1、18 1、8 1顺 序梯度洗脱，以TLC检测，合并含奇壬醇部分的洗脱液。含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收 溶剂，得粘稠物，进行如下重结晶将粘稠物溶于3倍甲醇中，加入3倍乙酸乙脂，密闭放置， 有大量无色透明晶体析出，滤出晶体，母液继续放置，晶体析出，上述操作3-5次，直至奇壬 醇几乎全部析出，合并析出的奇壬醇晶体。将析出的奇壬醇晶体，加入3倍甲醇，加热溶解， 重结晶，得到无色透明晶体，干燥得到550g ；纯度彡98%的奇壬醇。实施例7原料药奇壬醇的提取将原料药材菊科植物豨莶草(腺梗、东方或毛梗豨莶草)100kg，加入15倍量的 60 %乙醇回流提取，提取2次，每次1小时，将提取液合并过滤，滤液减压回收醇，至无醇 味，得提取液；药渣弃去。获得的提取液，以乙酸丙脂进行萃取，萃取4次，每次使用的萃 取溶剂量与提取液的比例为0.3-1.0 1.0。合并萃取液，减压回收溶剂，得浸膏状物， 其比重为1. 1-1.2。将浸膏状物，加入70-90°C热水，搅拌溶解，加入的水量与浸膏的体积 比为6 1，将此液进行D201大孔树脂为填料的柱色谱，浸膏状物与大孔树脂的比例为 1 150-1 180，以水洗脱至流出液无色，再以25 35%;45 65%;68 75%甲醇或乙 醇溶液进行梯度洗脱，洗脱中以TLC示样品点消失为进行下一梯度的标志。收集含奇壬醇 部分的洗脱液，以HPLC或TLC检测，合并含奇壬醇部分的洗脱液，减压回收溶剂，得浸膏。硅 胶柱色谱将获得的浸膏，与柱层析硅胶拌样，浸膏与硅胶的比例为1 3;浸膏与柱色谱硅 胶的比例为1 30，以氯仿和乙醇溶剂系统按照氯仿和乙醇比例为32 1、22 1、12 1 顺序梯度洗脱，以TLC检测，合并含奇壬醇部分的洗脱液。含奇壬醇部分的洗脱液，减压回 收溶剂，得粘稠物，进行如下重结晶将粘稠物溶于2倍甲醇中，加入2倍甲酸乙脂，密闭放 置，有大量无色透明晶体析出，滤出晶体，母液继续放置，晶体析出，上述操作3-5次，直至 奇壬醇几乎全部析出，合并析出的奇壬醇晶体。将析出的奇壬醇晶体，加入3倍丙酮，加热 溶解，重结晶，得到无色透明晶体，干燥得到437g ；纯度> 98. 0%的奇壬醇。实施例8奇壬醇片剂的制备
12
奇壬醇IOOg ；微晶纤维素70g ；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羟丙基纤维素15g ； 25%淀粉浆120ml ；硬酸镁5g，制粒，60°C干燥，12目筛整粒，压成片剂；1000片；每片含 IOOmg奇壬醇实施例9奇壬醇胶囊剂的制备奇壬醇IOOg ；微晶纤维素80g ；；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羟丙基纤维素25g ； 25%淀粉浆120ml ；12目筛制粒，60°C干燥，14目筛整粒，填入空胶囊；得1000粒胶囊；每粒 胶囊含IOOmg奇壬醇实施例10奇壬醇颗粒剂的制备奇壬醇IOOg ；淀粉120g ；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羟丙基纤维素15g ；25% 淀粉浆120ml;糖粉20g;硬酸镁5g，14目筛制粒，60°C干燥，14目筛整粒，分装成袋；1000 袋；每袋含IOOmg奇壬醇。实施例11奇壬醇缓释片剂的制备奇壬醇IOOg ；微晶纤维素70g ；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羟丙基纤维素150g ； 25%淀粉浆100ml;微粉硅胶20g;硬酸镁5g，滑石粉20g;14目制粒，60°C干燥，12目筛整 粒，压成片剂；1000片；每片含IOOmg奇壬醇。实施例12奇壬醇微丸剂的制备奇壬醇IOOg ；微晶纤维素180g ；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羟丙基纤维素20g ； 25%淀粉浆IOOml ；微粉硅胶20g ；滚动制丸，60°C干燥，制成微丸，填入空胶囊；1000粒；每 粒含IOOmg奇壬醇。实施例13奇壬醇缓释胶囊剂的制备奇壬醇IOOg ；微晶纤维素80g ；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羟丙基纤维素150g ； 25%淀粉浆IOOml ；微粉硅胶20g;硬酸镁5g，14目制粒，60°C干燥，12目筛整粒，压成片剂； 1000片；每片含IOOmg奇壬醇。实施例14奇壬醇冻干粉针剂的制备奇壬醇IOOg ；泊洛沙姆2g ；加入5. Og谷氨酸，加入10. Og甘露醇，加入注射用水， 加热溶解，稀释至2000ml，过滤、滤液超滤，分装、冷冻干燥，完毕后压盖。制成1000只，每只 含奇壬醇lOOmg。上述冷冻干燥分为四个阶段(1)预冻3.6小时，温度在_331 ； (2)减压干燥14 小时，温度在_36°C ； (3)升温干燥4小时，温度在-13°C ； (4) 二次升温干燥4小时，温度在 30 "C。实施例15奇壬醇注射剂的制备奇壬醇IOOg ；泊洛沙姆2g ；加入5. Og谷氨酸，加入注射用水，加热溶解，稀释至 2000ml，过滤、滤液超滤，灌装、灭菌。制成1000只，每只含奇壬醇lOOmg。试验例1本发明 对奇壬醇(kirenol)进行了药效学试验。(一)奇壬醇对小鼠的急性经口毒性实验和最大耐受量测定目的测定奇壬醇的LD50和TMD。试验材料①受试动物ICR小鼠，只，体重18g-22g，6_8周龄，雌雄各半，②受试药品奇壬醇，蒸馏水溶解。
(2)LD50 测定动物分组按体重将小鼠随机分成5组，每组6只，雌雄各半10①药物的剂量和配制设5个剂量组，分别为0.64、0.8、l、1.25、1.56g/kg，组间剂量比值为1 0. 8。给 药前以蒸馏水调配成所需浓度，②实验方法给药前小鼠禁食12小时，自由饮水。给药(0. 2ml/10g体重)后立即观察和记录 动物的中毒症状及死亡情况，对死亡动物作尸检，如有异常病变进行组织学检查。观察期为 7天，计算LD50值及95%可信限。7天后解剖动物肉眼观察重要脏器颜色、大小、质地等。最大耐受量试验(TMD)若LD50值不能测出，按照《新药审批办法》的有关规定进行最大耐受量试验。实验方法按照最大浓度最大容积原则，奇壬醇剂最大浓度为，给药体积为 0. 4ml/10克体重，每日2次，每次间隔10h，，给药后立即观察和记录动物的状况、中毒症状 及死亡情况，观察期为7天，观察内容如下 ( 二)奇壬醇大鼠急性经口毒性试验报告(1)试验目的按《中药新药研究指南(药学，药理学，毒理学)》的要求，检测奇壬醇对大鼠的经 口急性毒性。(2)受试动物及药物①药物奇壬醇②溶剂蒸馏水③动物大白鼠(3)材料与方法奇壬醇(豨莶草)生药临床拟用剂量为15g/天/人，人体重量按60kg计。Ig奇 壬醇相当于豨莶草生药lOOOg。①试验组设置测定半数致死量按《中药新药研究指南(药学，药理学，毒理学)》的要求，由北京大学医学部实验 动物科学部提供二级健康SD种大鼠体重170g-200g，雌雄各半。试验前检疫7天，大鼠分 为4组，每组各15只，雌雄各半。采用临床拟用途径，经口给药。剂量分别以5. 00，3. 25， 2. ll，1.37g/kg体重，组距0.65。最高剂量相当于人临床拟用剂量的100倍。空腹12小时 后，等容量一次灌胃，灌胃容量2ml/100g体重。未见大鼠异常和死亡。未得到半数致死量。②最大耐受量试验根据以上试验结果，取大鼠40只，雌雄各半一次灌胃，灌胃容量5. Og/kg体重。灌 胃容量2ml/100g体重。相当于人临床用药量的200倍。给药后每日观察一次，注意观察动 物中毒症状、死亡数和死亡时间。共观察14天。对试验内死亡和试验结束处死的动物进行 尸检。奇壬醇按上述剂量经口给药，观察14天，未见大鼠异常和死亡。试验结束处死动物 进行尸检，未发现异常。③观察方法奇壬醇按上述剂量经口给药，给药后每日观察一次，观察动物中毒症状、死亡数和 死亡时间，试验结束处死动物进行尸检。④结果奇壬醇按上述剂量经口给药，观察14天，解剖观察肝脏、心脏、脾脏、胃等内脏器 官，颜色质地未见异常。未见大鼠异常和死亡。试验结束处死动物进行尸检，未发现异常。⑤结论奇壬醇大鼠急性经口最大耐受量为5g/kg体重，相当于人临床拟用剂量的200倍。
(三)奇壬醇对不同致炎物质所致大鼠足趾肿胀的研究1.试验目的观察奇壬醇对蛋清、甲醛、角叉菜胶等不同致炎物质所致的大鼠足趾肿胀的影响。2.试验材料2.1药品及试剂奇壬醇取140mg奇壬醇溶于700mL蒸馏水中，从中取出200mL加入200mL蒸馏水； 再从剩下的500mL药液中取出IOOmL加入300mL蒸馏水，配出0. 2mg/ml，0. lmg/ml，0. 05mg/ ml药液各400mLo强的松天津力生制药股份有限公司，规格5mg/片。批号030618。取出20片溶 入400mL蒸馏水中。配成0. 25mg/mL药液。新鲜蛋清购于北京大学医学部实验动物中心，取出蛋清ImL加入9mL生理盐水， 制成10%浓度。甲醛北京化工厂生产。取出0. 3mL甲醛加入9. 7mL生理盐水，配置成3%浓度。角叉菜胶Sigma公司，取出0. Ig角叉菜胶加入生理盐水10mL，配置成浓度。2. 2试验仪器游标卡尺2. 3实验动物SD大鼠50只，雌雄各半，北京大学医学部实验动物中心提供。3.试验方法3.1动物分组与给药大鼠按体重随机分成5组，每组10只，分别为①模型对照组，②强的松组5mg/kg体重③奇壬醇低剂量组(QRCL) :lmg/kg体重④奇壬醇中剂量组(QRCM) :2mg/kg体重，⑤奇壬醇高剂量组(QRCH) :4mg/kg体重。奇壬醇各剂量组和强的松组每日灌胃给药一次，给药体积为2ml/100g体重，共给 药一周。模型对照组给予同体积蒸馏水灌胃。3. 2试验方法3.2. 1最后一次给药Ih后，各鼠右后足趾内注入0. ImL新鲜蛋清致炎，分别于致炎 后1、4、6小时测定注射足的肿胀程度。3. 2. 2最后一次给药Ih后，各鼠右后足趾内注入0. lmL3%甲醛致炎，分别于致炎 后2、24、48、72、96小时测定注射足的肿胀程度。3. 2. 3最后一次给药Ih后，各鼠右后足趾内注入0. ImLl %角叉菜胶致炎，分别于 致炎后1、4、6小时测定注射足的肿胀程度。3. 3统计方法SpSS软件进行统计分析，试验数据均以均数士标准差表示。t检 验进行组间比较。4.试验结果4. 1蛋清致炎结果与模型对照组相比，QRCH在0. 5h、2h、4h均能够抑制蛋清引起 的足趾肿胀(P < 0. 05，0. 05，0. 05)。QRCL和QRCM也能降低肿胀度，但无统计学意义(P >
160. 05)；强的松组能够抑制蛋清引起的足趾肿胀(P < 0. 05,0. 01,0. 01)。见表1表1奇壬醇对蛋清所致大鼠足趾肿胀的影响(η = 10)
组别 _致炎后不同时间肿胀度值(X士SD)_
__0. 5h2h4h
模型0. 577±0. 06440. 490±0. 06730. 434±0. 0644
强的松0. 478±0. 0721*0. 426±0. 0720林0. 361 ±0. 0651** 与模型对照组相比*P < 0. 05，**P < 0. 01。4. 2甲醛致炎结果与模型对照组相比，强的松组在第2h、4h、48h、72h、96h均能抑 制甲醛所致足趾肿胀(P < 0.01,0. 05,0.01,0. 05,0. 05). QRCL组在2h显示了一定的抑制 作用(P <0.05)后续时间里与模型组无显著性差异(P>0。05)。QRCM组能够抑制右足 的肿胀(与模型对照组相比P < 0. 05，0. 05，0. 05，0. 01，0. 05)。QRCH组的抑制作用更强 (与模型对照组相比，P < 0. 01,0. 001,0. 001,0. 001,0. 001)结果见表2。表2奇壬醇对甲醛所致大鼠足趾肿胀的影响(X士SD，N = 10)
肿胀度
致炎后不同时间肿胀度值 与模型组相比*P < 0. 05，**P < 0. 01，_P < 0. 001。4.3角叉菜胶与模型对照组相比，QRCL组在4h、6h对肿胀足有明显抑制(P <0.05，0.05)，QRCM组能够抑制角叉菜胶所致足肿胀(P < 0. 05,0. 01,0. 01) QRCH组在 测量的三个时间点均能明显抑制足肿胀(P < 0. 001,0. 001)结果见表3。
表3奇壬醇对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀的影响(X士SD)
QRCM 100.205土 0.0518*0.254士 0.0388** 0.171 士 0.0533**
QRCII 100.203土 0.0572** 0.247士 0.0391*** 0.161土 0. 0337*林与模型对照组相比*P < 0. 05，**P < 0. 01，_P < 0. 001。(四)奇壬醇对佐剂性关节炎大鼠免疫功能的影响1.试验目的观察奇壬醇对佐剂性关节炎大鼠免疫功能的影响2.试验材料(同试验1)3.动物分组与给药(同试验1)4.方法4. INK细胞杀伤活性检测将60只雄性大鼠按体重随机分成6组(1)正常组(NOR)；⑵模型组(AA) ； (3) 氢化可的松预防组(C0RP，2mg/kg iv) ； (4)氢化可的松治疗组(CORT，2mg/kgiv) ； (5)奇壬 醇预防组(KIRP，4mg/kg，ig) ； (6)奇壬醇治疗组(KIRT，4mg/kg，ig)。各预防组注射佐剂当 日开始给药，各治疗组第8天开始给药。连续21天，正常组和模型组给予同体积蒸馏水ig。 除正常组外，各组均以弗氏完全佐剂0. ImL注射于右后足趾。末次给药后，将大鼠全部处死 取脾细胞和腹腔巨噬细胞备用。1.NK细胞杀伤活性检测制备脾淋巴细胞，于96孔细胞培养板中，按以下方案加样效应细胞孔脾细胞100 μ 1/孔(5\106/1111) +细胞培养基10(^1/孔靶细胞孔YAC-I细胞 100 μ 1/孔(1 X 105/ml) + 培养基 100 μ 1/孔实验孔YAC-I细胞100 μ 1/孔+脾细胞100 μ 1/孔放入培养箱中培养4小时。取出离心15分钟。弃上清，加ΜΤΤ100 μ 1/孔，震荡混 勻。继续培养4小时。离心，弃上清，加盐酸-异丙醇ΙΟΟμΙ/孔，震荡混勻。在酶标仪上 选择检测波长570nm，参考波长630nm的条件下测定OD值。计算NK细胞杀伤活性，公式如 下NK细胞杀伤活性=1_(实验孔OD值-效应孔OD值)/靶细胞孔OD值X 100%2. AA大鼠脾细胞培养上清和血清中细胞因子测定2. 1 IL-2的诱生制备的脾细胞ImL加入24孔培养板中，加入终浓度为5ug/mL的 ConA,培养24h，离心取上清，冻存待测。
2. 2 IL-I的诱生大鼠腹腔注入5ml Hank' s液，打开腹膜，用尖吸管抽取腹腔液， 离心。调整细胞浓度为2X106。加入24孔培养板中。30分钟摇动一次。培养2小时，使 细胞充分贴壁，弃去未贴壁的细胞，用不完全培养液洗两次，加入完全培养液至Iml/孔。加 入LPS(终浓度为lOug/ml)于24孔培养板，培养24小时，离心收获上清，-20°C冻存待测。2. 3细胞因子的测定实验前将反应板置于室温平衡，每孔各加入待测样品 100 μ L ；将反应板置37oC 120min ；用洗涤液将反应板充分洗涤4_6次，滤纸上印干。每孔中 加入第一抗体工作液50 μ L，混勻后置37oC 60min,洗板，每孔加底物工作液100 μ L，37oC 暗处反应5-10min。加入1滴终止液混勻。492nm处测定OD值。3.统计采用spss 10. 0软件进行统计，结果用(χ士 s)表示。4 结果4. 1奇壬醇对NK细胞杀伤活性的影响AA大鼠与正常大鼠相比NK细胞杀伤活性降低(P < 0. 001)。可的松治疗组和预 防组对AA大鼠降低的NK活性没有影响(与AA组相比，P>0. 05)。奇壬醇治疗组和预防 组可以升高AA大鼠NK活性(与AA组相比P < 0. 01，P < 0. 001)。见表4。表4奇壬醇对AA大鼠NK细胞杀伤活性的影响
(五)奇壬醇对小鼠迟发型变态性反应的影响
1.试验目的
观察奇壬醇对二硝基氯苯所致小鼠迟发型变态性反应的影响。
2.试验材料
2. 1药品及试剂 奇壬醇同试验一。
乙酰水杨酸(阿斯匹林)水溶片同试验一。
2，4-二硝基氯苯北京化工厂生产，批号760422，取0. 125g2，4-二硝基氯苯溶于
IOmL丙酮溶液中，配置成1.25%二硝基氯苯丙酮溶液。丙酮北京化工厂生产，批号20030320。2. 2实验动物ICR小鼠50只，雌雄各半，体重18_22g，北京大学医学部实验动物中心提供。3.试验方法3. 1动物分组小鼠按体重随机分成5组，每组10只，分别为①模型对照组②阿斯匹林组0. lg/kg体重
19
③奇壬醇低剂量组(QRCL) :lmg/kg体重④奇壬醇中剂量组(QRCM) :2mg/kg体重⑤奇壬醇高剂量组(QRCH) :4mg/kg体重。奇壬醇各剂量组和阿司匹林组每日灌胃给药一次，给药体积为0.2ml/10g体重， 共给药三天。模型对照组给予同体积蒸馏水灌胃。3. 2试验方法各组动物背部注射1. 25%二硝基氯苯丙酮溶液0. 02ml/只，24小时后喂药，喂药 9天后，右耳涂布1.25% 二硝基氯苯丙酮溶液0. 03ml，左耳涂布同体积丙酮，38小时后，用
冲耳器冲下两耳称重。右耳片重量减去左耳片重量(mg)为肿胀度，并计算抑肿率(同试验一)。3. 3统计方法SpsslO. 0软件进行统计分析，试验数据均以均数士标准差表示。t_检验进行组 间比较。4.试验结果与模型对照组相比，奇壬醇各剂量组均能能明显抑制二硝基氯苯所致迟发性变态 性反应的耳廓肿胀(与模型对照组比，均P < 0. 001)。阿司匹林组也明显抑制二硝基氯苯 所致迟发性变态性反应的耳廓肿胀，与模型对照组比，P < 0. 01 (结果见表5)。表5奇壬醇对二硝基氯苯所致小鼠迟发型变态反应的影响 QRCM91.5士 0.241 林*39.75% QRCH 9 1.4士 0.420*** 42.17%注均与模型对照组比**Ρ < 0. 01，_Ρ < 0. 001。(六)奇壬醇对大鼠佐剂性关节炎炎性因子的影响1.试验目的1. 1观察奇壬醇对大鼠佐剂性关节炎滑膜细胞C0X-2、Bcl_2、Fas-L的影响1. 2观察奇壬醇对佐剂性关节炎大鼠血清IL-I β、IL_2、IL_6、PGE等炎性因子的 影响2.实验方法制备大鼠AA模型将50只雄性大鼠随机分成5组(1)正常组(normal,NOR) ； (2)模型组(AA) ； (3) 奇壬醇组(kirenol，KIR，2mg/kg，ig) ； (4)氢化可的松组(Cortisol，CORT，2mg/kg，ip) ； (5) 阿司匹林加环磷酰胺组(aspirin，cyclophosphamide, ASA+CTX, 100mg/kg, 7mg/kg, ig)。除正常组外，各组均以弗氏完全佐剂0. ImL注射于右后足跖皮下。各治疗组第3天开始给药， 连续21天，正常组和模型组给予同体积蒸馏水灌胃。注射佐剂前及末次给药结束后分别测 量测左、右两侧足跖周长，测量三次取平均值。末次给药后将大鼠全部处死，取股动脉血， 3000rpm离心，取上层血清并分装于1. 5mLEP管中，置于-20°C冰箱冻存待用。取踝关节、肝、 脾、胃、胸腺、肾上腺以10 %甲醛固定，组织脱水，备用。制备大鼠踝关节病理切片取方法1中的踝关节组织，以lmol/L EDTA液脱钙3周后常规石蜡包埋、切片、做 HE染色，显微镜观察。右踝关节切片做免疫组化染色。测定大鼠血清PGEC0X-2免疫组化染色测定大鼠血清细胞因子IL-I β、IL-2、IL-6Bcl-2免疫组化染色Fas-L免疫组化染色统计方法实验数值采用SPSS 12. 0统计软件包进行，多组间比较采用One-Way ANONA分析。 统计结果以IT ±s形式表达。实验结果1.奇壬醇对大鼠佐剂性关节炎的影响1. 1奇壬醇对大鼠足肿胀指数的影响右侧AA与NOR相比，足肿胀指数升高(P < 0. 01)，KIR、CORT、ASA+CTX与AA相比 降低(P < 0. 01)。左侧=AA与NOR相比，足肿胀指数升高(P < 0. 01)，KIR、CORT、ASA+CTX 与AA相比降低(P < 0. 05)。见表6。表6奇壬醇对大鼠足肿胀指数的影响(η = 10，了 ±s) 注与正常组比较*ρ < 0. 05，**Ρ < 0. 01 ；与模型组比较ΔΡ < 0. 05，ΔΔΡ < 0.01 (下表同)1. 2奇壬醇对AA大鼠滑膜病理学改变的影响NOR 见图6滑膜边缘光滑，滑膜衬里层1 2层；衬里下层未见炎性细胞浸润、成 纤维细胞及胶原纤维；软骨细胞数目较多，陷窝密集。AA 右侧滑膜细胞增生、肥大，呈绒毛状突起，滑膜衬里层4 5层；衬里下层见
大量淋巴细胞、巨噬细胞浸润，脂肪空泡融合，可见大量成纤维细胞及胶原纤维，个别见纤维素样坏死。左侧滑膜细胞少量增生，滑膜衬里层2 3层；衬里下层见巨噬细胞、淋巴细 胞浸润；软骨细胞、陷窝细胞数目减少。KIR 右侧滑膜细胞少量增生、肥大，个别处呈绒毛状突起，滑膜衬里层2 3层； 衬里下层见少量巨噬细胞、淋巴细胞浸润，脂肪空泡融合，见少量成纤维细胞、胶原纤维。左 侧滑膜细胞增生不明显，滑膜衬里层1 2层；衬里下层见少量巨噬细胞、淋巴细胞浸润， 未见血管新生。CORT 右侧滑膜细胞少量增生、肥大，滑膜衬里层2 3层；衬里下层见少量巨噬 细胞、淋巴细胞浸润及少量成纤维细胞、胶原纤维，血管新生不明显；软骨细胞、陷窝细胞数 目减少。左侧滑膜细胞增生、肥大，滑膜衬里层2 3层；衬里下层见少量巨噬细胞、淋巴 细胞浸润，少量成纤维细胞、胶原纤维；软骨细胞、陷窝细胞数目改变不明显。Asp+CTX 右侧滑膜细胞少量增生、肥大，滑膜衬里层2 3层；衬里下层见少量 巨噬细胞、淋巴细胞浸润，血管新生不明显；软骨细胞、陷窝细胞数目减少不明显。左侧滑 膜细胞肥大，但增生不明显；衬里下层见少量巨噬细胞、淋巴细胞浸润；软骨细胞、陷窝细 胞数目减少不明显。2.奇壬醇的抗炎作用2. 1奇壬醇对AA大鼠血清PGE2的影响AA 大鼠血清 PGE2OD 值 AA 与 NOR 相比升高(P < 0. 01) ；KIR, CORT、ASA+CTX 与 AA 相比降低(P < 0. 01)，且各给药组之间无显著性差异(P > 0. 05)。见表7。表7奇壬醇对AA大鼠血清PGE2的影响(η = 10，1 士 s ) 2. 1. 2奇壬醇对AA大鼠右踝关节滑膜细胞C0X-2表达的影响AA大鼠右踝关节滑膜细胞C0X-2平均积分光密度值AA与NOR相比升高(P < 0.01)；与AA相比，KIR、CORT均降低(P < 0.05，P < 0. 01)，两组间比较无显著性差异 (P > 0. 05)，ASA+CTX与AA相比降低，但无显著性差异(ρ > 0. 05)。见表8。表8奇壬醇对AA大鼠滑膜细胞C0X-2表达的影响(η = 10，了 ±s ) 2. 1. 3奇壬醇对AA大鼠血清细胞因子IL-I β、IL_2、IL_6影响对AA大鼠血清IL-I β、IL-6的影响与NOR相比，AA IL-1 β、IL-60D值均升高 (P < 0. 01)；与 AA 相比，KIR、CORT、ASA+CTX IL-I β OD 值均降低(ρ < 0. 05，ρ < 0. 01，ρ < 0. 05)，IL-60D值均降低(ρ < 0. 05)，且三组间无显著性差异(ρ > 0. 05)对AA大鼠血清IL-2的影响ΑΑ与NOR相比，IL-20D值降低(P < 0. 01)；与AA相 比，KIR升高(ρ < 0. 01)，与NOR相比无显著性差异(P > 0. 05)，CORT,ASA+CTX与AA相比 无显著性差异(P > 0.05)，与NOR相比降低(ρ < 0.01)。见表9。表9奇壬醇对AA大鼠血清细胞因子的影响(η = 10，了 土S) 2. 2奇壬醇对AA大鼠踝关节滑膜细胞凋亡蛋白Bcl_2、Fas-L表达的影响见表10。与NOR相比，AA Bcl_2平均积分光密度值升高(ρ < 0. 05)，Fas-L降低(ρ < 0. 05)；与 AA 相比，KIR, ASA+CTX Bcl-2 平均积分光密度值降低(ρ < 0. 05，ρ < 0. 01)， Fas-L升高(ρ < 0. 05，ρ < 0. 01)，且两组间无显著性差异(ρ > 0. 05)，CORTBc 1-2平均积 分光密度值降低(P < 0. 05), Fas-L平均积分光密度值降低，但无显著性差异(ρ > 0. 05)。表10奇壬醇对AA大鼠滑膜细胞凋亡蛋白表达的影响(η= 10，了 ±s) (七)奇壬醇对大鼠体重及重要器官的影响1.奇壬醇对AA大鼠体重增长的影响见表11。AA与NOR大鼠相比，体重增长率降低(P < 0. 01) ；KIR与NOR相比，体重 增长率无显著变化(P > 0. 05) ；C0RT、ASA+CTX与NOR相比，体重增长率降低(P < 0. 05)。表11奇壬醇对大鼠体重增长的影响(I 士S) 2.奇壬醇对AA大鼠重要器官的影响2. 1奇壬醇对AA大鼠胸腺、脾、肾上腺的影响镜下见NOR大鼠胸腺皮质区内细胞密集，染色较深，髓质区染色较浅。AA与NOR相 比，未见明显改变。各给药组与NOR相比，未见淋巴细胞数目减少。镜下见NOR大鼠红髓区大量染成深红色的红细胞，白髓区见大量染成蓝紫色的淋 巴细胞。AA与NOR相比，未见明显改变。各给药组与NOR相比，未见淋巴细胞数目减少。镜下见NOR大鼠肾上腺胞膜完整，细胞密集，胞膜外可见脂肪空泡。AA与NOR相 比，未见明显改变。各给药组与NOR相比，未见腺体细胞数目减少。2. 2奇壬醇对AA大鼠胃、肝脏的影响镜下见NOR大鼠胃黏膜结构正常，AA与NOR相比未见异常。各给药组与NOR相比， 未见黏膜有出血点或水肿，未见黏膜变薄、腺体萎缩或数目减少，固有膜内未见大量淋巴细 胞、浆细胞浸润。镜下见NOR大鼠肝小叶结构正常，门管区结构正常，小胆管未见增生。AA与NOR相 比未见明显异常。各给药组与NOR相比未见明显异常。本发明上述试验例所述的奇壬醇为本发明实施例1所制备的奇壬醇，本发明其他 实施例制备的奇壬醇也进行了相同的实验，并得出了具有相同趋势的实验结果，本发明不
再一一复述。
权利要求
一种奇壬醇提取物的提取方法，其特征在于所述奇壬醇提取物经过1)醇提取、2)有机酸酯萃取、3)柱色谱和4)重结晶过程得到，从生药计收率为0.3～1％；所述奇壬醇提取物中奇壬醇含量为90～100％，优选为95～99.8％，更优选为98.5～99.5％。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于1)醇提取将原料药材菊科植物豨莶草，加入醇溶液回流提取，提取液过滤并减压浓 缩至无醇味，得提取液；2)有机酸酯萃取将步骤1)得到的提取液，以水饱和过的有机酸酯进行萃取，合并萃 取液，减压浓缩，得浸膏状物；3)柱色谱将步骤2)得到的浸膏状物，加入热水溶解，将此水溶液进行大孔树脂柱色 谱，以水洗脱至流出液无色，再以醇溶液进行洗脱，收集含奇壬醇部分的洗脱液，合并含奇 壬醇部分的洗脱液，减压浓缩，得浸膏；将所得浸膏，进行硅胶柱色谱，以有机酸酯和醇或商代烃和醇洗脱，合并含奇壬醇部分 的洗脱液，将洗脱液减压浓缩，得浓缩物；4)重结晶将步骤3)硅胶柱色谱后得到的浓缩物溶于醇中，加入有机酸酯，密闭放置， 析出晶体，过滤得到奇壬醇晶体。将得到的奇壬醇晶体，加入醇或脂肪酮，加热溶解，重结晶，得到无色透明晶体，干燥得 到奇壬醇提取物。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于步骤1)所述回流提取为提取2 4次，每次回流1 5小时，每次加入的提取溶剂体 积量与生药的体积比为5 1 15 1 ；优选为提取3次，每次2 3小时，每次加入的提 取溶剂体积量与生药的体积比为8 1 12 1。步骤2)所述萃取为2 4次，每次使用的萃取溶剂量与提取液的比例为0. 1 2.0 1.0，浓缩至所得浸膏状物比重为1.0 1.4;优选为萃取3次，每次使用的萃取溶剂 量与提取液的比例为0.3 1.0 1.0，浓缩至所得浸膏状物比重为1.1 1.2。
4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于步骤3)所述大孔树脂柱色谱中以醇溶液洗脱为按照浓度为25 35%、45 65%， 68 75%的顺序进行梯度洗脱，优选为按照浓度为30%、50%，70%的顺序进行梯度洗脱。所述硅胶色谱中以有机酸酯和醇洗脱或卤代烃和醇洗脱均为洗脱液中两种溶剂比例 27 32 1、18 22 1和8 12 1进行梯度洗脱，优选为30 1,20 1和10 1。
5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于步骤3)大孔树脂柱色谱中所述热水温度为30 90°C，所述热水用量与浸膏的体积比 为1 6 1，所述大孔树脂填料为AB-8、D201、HP20或DlOl树脂，浸膏状物与大孔树脂的 重量比例为1 15 1 200;优选为所述热水温度为50 60°C，所述热水用量与浸膏的 体积比为2 4 1，所述大孔树脂填料为AB-8树脂，浸膏状物与大孔树脂的重量比例为 1 25 1 100 ；所述硅胶柱色谱为先将经大孔树脂柱色谱得到的浸膏与硅胶拌勻，浸膏与硅胶重量比 为1 1 1 3，浸膏与柱色谱硅胶重量比为1 4 1 30 ；优选为浸膏与硅胶重量比 为1 1.2 1 2. 5，浸膏与柱色谱硅胶重量比为1 6 1 20。
6.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于步骤4)中溶解浓缩物的醇和有机酸酯体积用量均为浓缩物质量的2 3倍，析出晶体 并过滤后所得母液继续放置析出晶体并过滤，重复上述操作3 5次，合并析出的晶体；溶解奇壬醇晶体的醇或脂肪酮体积用量均为奇壬醇晶体质量的2 3倍。
7.根据权利要求2 6任意一项所述的提取方法，其特征在于步骤2) 步骤4)所述有机酸酯为R1COOR2，其中R1和R2分别为相同或不同的直链烷 烃，优选为1 4个碳的直链烷烃，更优选为乙酸乙酯；步骤1) 步骤4)所述醇为直链烷烃醇，优选为1 4个碳的直链烷烃醇，更优选为甲 醇或乙醇；所述醇溶液浓度为20 90%，优选为30 80% ；步骤3)所述商代烃为直链烷基商代烃，优选为直链烷基氯代烃，更优选为1 4个碳 的直链烷基氯代烃，最优选为氯仿；步骤4)所述脂肪酮为R3COR4，其中民和礼分别为相同或不同的直链烷烃，优选为1 4个碳的直链烷烃，更优选所述脂肪酮为丙酮。
8.一种含有权利要求1 7任意一项所述提取方法提取的奇壬醇的治疗免疫系统疾病 的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有奇壬醇提取物和可药用辅料，奇壬醇提取 物中奇壬醇含量为90 100%，优选为95 99. 8%，更优选为98. 5 99. 5% ；所述奇壬 醇提取物按照权利要求1 8任意一项所述提取方法提取。
9.根据权利要求8所述的治疗免疫系统疾病的药物组合物，其特征在于，所述的药物 组合物剂型为片剂、胶囊、微丸、颗粒剂、缓释剂、口服液、冻干粉针或小水针注射剂。
10.权利要求8或9所述药物组合物在制备治疗自身免疫性疾病和防止器官移植排斥 药物的用途。
全文摘要
本发明涉及一种用于治疗自身免疫性疾病和防止脏器移植排斥的免疫抑制剂的药物活性成份奇壬醇制备的技术方法以及制剂。该制剂包括作为药物活性成份的奇壬醇及其相关的制剂。本发明所用的奇壬醇采用本发明特定的方法制备，操作简便，生产成本低，环境污染低，所制备的奇壬醇纯度高达98％以上，收率高。采用本发明所提供的方法所制备的奇壬醇和制剂不仅稳定性良好，安全可靠，而且质量稳定，治疗效果显著，特别是用于治疗自身免疫性疾病和防止脏器移植排斥的药物。
文档编号A61P37/00GK101880217SQ20101016852
公开日2010年11月10日 申请日期2010年5月7日 优先权日2009年5月7日
发明者付宏征, 欧志强, 钱瑞琴 申请人:北京大学
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