秋水仙碱在制备治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用的制作方法

专利名称：：秋水仙碱在制备治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及秋水仙碱在制药方面的应用，特别涉及秋水仙碱在药物治疗胆汁淤积性肝病中的应用。
背景技术：
：秋水仙碱来源秋水仙碱是秋水仙药材中的主要有效成分和毒性成分，一种卓酚酮类生物碱。除百合科秋水仙属外，同科其它属，包括嘉兰属(Gloriosa)、益辟坚属(Iphigenia)、安圭拉氏兰属(Auguillaria)和天南星属(Arisaema)等植物中也含秋水仙碱类生物碱。化学名N-(5，6，7，9-四氢-1，2，3，10-四甲氧基-9-氧-苯并[a]庚间三烯并庚间三烯-7-基)乙酰胺，CAS:64-86-8。结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>秋水仙碱的主要药理作用简要归纳如下1.抗痛风目前秋水仙碱主要用于急性痛风。秋水仙碱对急性痛风性关节炎有选择性的消炎作用，对一般的疼痛、炎症及慢性痛风均无效，其作用主要是消炎，抑制粒细胞浸润，原因是与粒细的微管蛋白结合妨碍粒细胞的活动，秋水仙碱能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分裂，称为秋水仙素有丝分裂(c-mitosis)。在这样的有丝分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而使染色体加倍。秋水仙碱不论是破坏还是抑制纺锤体的形成，作用都是一时的。秋水素可以抑制纺锤体的形成，导致细胞不分裂，“然后过一段时间秋水仙素代谢掉，不再起作用，细胞继续分裂，-然后才是“染色体数目加倍”(着丝点的分裂)。2.抗肿瘤作用秋水仙碱是细胞有丝分裂强烈抑制剂，对肿瘤细胞的生长具有抑制作用。秋水仙碱发挥微管蛋白聚合抑制因子的作用，能引起肿瘤内部新生的毛细血管损伤而导致出血性广泛坏死。秋水仙碱的A和C环可与微管蛋白亚单位微管蛋白结合，干扰微管蛋白的组装过程，从而使微管蛋比解聚。秋水仙碱由于作用选择性较低，毒性大，现已少用。3.神经系统秋水仙碱具有神经毒性，主要与微管相结合，抑制轴浆运输，导致神经元去营养退化死亡。秋水仙素可使尾壳核的神经元坏死。秋水仙碱有增强或延长催眠药物的作用，能降低体温，增加对中枢药物的敏感性，抑制呼吸中枢，增加对拟交感神经的反应。由于神经末端小体与秋水仙碱结合，干扰了神经递质的转运，从而改变了神经肌肉的功能，增强了胃肠的活动。4.抗纤维化/抗组织增生秋水仙碱对肝脏纤维化、肺纤维化等均显示出一定的预防和治疗效果。对猪血清免疫性肝纤维化大鼠和血吸虫感染小鼠，秋水仙碱具有显著抗肝纤维化的作用，明显降低肝内各型胶原蛋白含量。秋水仙碱对肺纤维化大鼠纤维连接蛋白的形成具有抑制作用。秋水仙碱具有明显的抑制炎症细胞和抗肾脏纤维化作用，能预防环孢霉素引起的肾间质纤维化和预防细菌感染引起的肾脏瘢痕形成，并能减缓肾小球硬化和间质纤维化。用腹主动脉缩窄的方法建立心肌肥厚大鼠模型，秋水仙碱能有效抑制心肌肥厚发生、发展，同时明显的下调心肌肥厚相关因子表达。秋水仙碱腹腔注射，可预防家兔手术粘连。秋水仙碱对体外培养的人大隐静脉片的内膜增生具有抑制作用，这种抑制作用只有在培养早期施加药物才能显著。5.免疫系统和抗炎作用秋水仙碱对免疫细胞的增殖、分化、趋化和炎症介质释放等都有抑制作用。显著抑制T细胞和B细胞功能，特别对白细胞功能及免疫细胞的运动和趋化作用的抑制尤为显著。秋水仙碱还能抑制免疫细胞和上皮细胞TNFa、IL-2、IL-6、TGF-β、粒-巨细胞集落刺激因子等的mRNA和蛋白质水平的表达和分泌，但对IL-Ιβ的产生有促进作用。秋水仙碱通过抑制白细胞等细胞溶酶体酶的释放、抑制活化的白细胞和巨噬细胞等产生5-脂氧化酶，使胞内cAMP浓度增加、促进前列腺素合成和释放。秋水仙碱对于C0X-2的基因表达和蛋白质合成也有抑制作用。秋水仙碱尚能抑制嗜碱性粒细胞和巨噬细胞分泌组胺，剂量倚赖性地抑制LPS刺激的大鼠巨噬细胞分泌TNFa，且秋水仙碱作用于TNFa合成的早期，从而对动物肝毒性具有预防作用。目前秋水仙碱作为一种常用的抗痛风药和抗肿瘤药。抗痛风用法用量治疗急性痛风口服首剂lmg，以后23小时0.5mg，直至疼痛缓解。极量每日3mg。预防痛风急性发作每日或隔日0.5lmg。抗肿瘤用法用量静滴每次24ml(12mg)，加5%葡萄糖50ml，缓慢滴注，每日1次，1疗程4080ml。静注每次2ml。用25%葡萄糖或等渗盐水40ml，稀释后缓注。胆汁淤积是由于胆汁生成障碍和(或)流动障碍所造成的一种临床综合征。分为肝外胆汁淤积和肝内胆汁淤积。肝外胆汁淤积是指肝外胆管系统机械性梗阻所致的胆汁淤积；肝内胆汁淤积是指任何病因引起肝细胞和/或毛细胆管胆汁分泌功能障碍，或肝内小胆管弥漫性梗阻所致的一系列的病理和临床表现。胆盐在肝内淤积，均可导致肝脏损伤和慢性胆汁淤积性肝病。随着病情的进展，通常伴随有血清碱性磷酸酶升高、黄疸和高胆固醇血症，并逐步发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝功能衰竭。目前胆汁淤积性肝病无特效药，熊去氧胆酸作为常用的保肝药也只能减轻胆汁淤积的症状。文献未见有关秋水仙碱在治疗胆汁淤积肝病的报道，发明人首次发现秋水仙碱可以治疗胆汁淤积肝病。
发明内容发明目的发明人提供一种秋水仙碱在制备治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用，特别提供秋水仙碱在治疗妊娠肝内胆汁淤积综合症、内原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)重症黄疸和免疫性黄疸等胆汁淤积性肝病中的应用。技术方案妊娠肝内胆汁淤积综合症、内原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)重症黄疸或免疫性黄疸胆汁淤积性肝病是胆汁淤积性肝病常见的病症之一。α-萘异硫氰酸酯(ANIT)致胆汁淤积模型是研究PBC、PSC和重症黄疸常用的动物模型，17α-炔雌醇(EE)致大鼠胆汁淤积模型是常用的研究妊娠肝内胆汁淤积综合症动物模型，胆管结扎致肝外胆汁淤积模型是常用的研究梗阻性黄疸的动物模型。采用α-萘异硫氰酸酯(ANIT)致胆汁淤积模型，17α-炔雌醇(EE)致大鼠胆汁淤积模型，胆管结扎致大鼠肝外胆汁淤积模型，以50和100μg/kg的秋水仙碱针对上述三种模型进行试验，试验结果表明秋水仙碱对有效的降低肝脏出现明显的损伤以及减少胆汁淤积，优于临床常用药熊去氧胆酸，从而说明秋水仙碱可以治疗胆汁淤积性肝病，增加了秋水仙碱的新用途。治疗胆汁淤积性肝病的潜在靶点有一、减少肝细胞摄取胆盐及有机阴离子目前尚无特异性的减少肝细胞摄取胆盐的药物。研究显示法尼醇X受体(FXR)激动剂，如GW4064，6-E⑶CA等可能是降低肝细胞摄取胆盐的有效药物。这类药物能下调NTCP和OATPs的表达，减少肝细胞对胆汁酸及其他有机阴离子进入胆汁淤积的肝脏，避免肝内胆汁酸、胆红素及其他胆汁成分的超载，但有导致血清胆汁酸和其他有机阴离子升高的副作用。相反，胆汁酸多价螯合剂和回肠转运抑制剂则无这类副作用，而秋水仙碱可以上调肝脏胆汁酸受体FXR的表达，下调NTCP和OATPs的表达，减少肝细胞对胆汁酸及其他有机阴离子进入胆汁淤积的肝脏，减少肝损伤。二、促进肝细胞中胆汁酸盐的转运胆汁酸盐和其他物质吸收进入肝细胞后，依靠他的疏水性，通过扩散的方式在细胞质或细胞内脂质膜内到达小管顶端，依靠肝细胞基侧膜上的胆汁酸转运体，如MRP2、MDR3、MRP3、0ATP2C和BSEP等将胆汁酸盐排泄入毛细胆管。研究显示，一些遗传代谢性胆汁淤积症多是由于此类转运体的缺陷或突变所引起，而慢性胆汁淤积时该类转运体的表达和功能均下调，致各种潜在毒性的内源性和外源性物质的排泄受到影响。因此促进肝细胞基侧膜上胆汁酸盐转运体的的表达和转运能力，则可降低肝细胞内胆盐及有机阴离子的蓄积和对肝细胞的毒性。秋水仙碱能有效增加胆管中胆汁酸、胆红素和磷脂转运体BSEP、MRP2和MDR3的表达，促进体内淤积的胆汁酸、胆红素和磷脂的排泄，减轻胆汁淤积。三、促进胆管细胞的排泌胆管细胞排泌功能的重要意义在于稀释胆汁和清洗胆管。如囊性纤维化时，由于编码Ca2+依赖的氯离子通道的CFTR基因突变，致氯离子依赖的HC03_分泌受损。而在PBC中，则存在胆管细胞碳酸氢盐的分泌和Cl2HCO3-交换受损。刺激胆管细胞加强对胆盐的排泌则可降低胆汁酸对胆管细胞的毒性。秋水仙碱能有效增加胆管细胞对胆汁酸、胆红素和磷脂的排泄，从而增加胆汁酸依赖性胆流(BSDF)和非胆汁酸依赖性胆流(BSIF)，促进胆管细胞排泌。四、保护胆管上皮细胞保护胆管上皮细胞免受胆汁酸的毒性损害，是治疗以胆管损伤为主的慢性胆汁淤积疾病(如PBC、PSC)的重要措施。这类疾病中胆管上皮细胞是免疫介导损伤的靶点，高浓度的疏水性胆汁酸具有细胞毒性，可进一步加重胆管上皮细胞的损伤。一些少见的胆汁淤积性疾病，如遗传性MDR3缺乏所致的进行性家族性肝内胆汁淤积III型，由于胆汁中缺乏磷脂，不能形成胆汁-磷脂的微胶粒来降低胆汁的毒性作用。因此改善胆汁酸与磷脂的失衡则可减轻胆汁酸的毒性。秋水仙碱能有效上调肝脏MDR3表达，促进肝细胞对磷脂排泄，升高胆汁中磷脂的浓度，从而保护胆管上皮细胞，降低血清ALP和GGT水平，减少肝损伤。有益效果1、秋水仙碱能有效降低胆汁淤积性肝病引起的肝损伤及胆汁淤积，即可以有效地治疗胆汁淤积性肝病。2、秋水仙碱能有效减轻胆汁淤积导致的肝细胞坏死、炎症细胞浸润和毛细胆管增生。3、秋水仙碱能有效增加胆管中胆汁酸、胆红素和磷脂转运体BSEP、MRP2和MDR3的表达，促进体内淤积的胆汁酸、胆红素和磷脂的排泄，保护胆管上皮细胞，减少肝损伤。4、秋水仙碱可以上调肝脏胆汁酸受体FXR的表达，下调NTCP和OATPs的表达，减少肝细胞对胆汁酸及其他有机阴离子进入胆汁淤积的肝脏，减少肝损伤。具体实施例方式实施例1、对α-萘异硫氰酸酯(ANIT)致大鼠胆汁淤积作用α-萘异硫氰酸酯(ANIT)致胆汁淤积模型是研究肝内胆汁淤积经典的模型。ANIT致大鼠胆汁淤积是采用ANIT50-100mg/kg灌胃给药12h后出现胆汁淤积，24h后出现肝损伤和黄疸。实验方案30只220-250g雄性Wistar大鼠随机分为5组，每组6只正常对照组、模型组(ANIT50mg/kg灌胃)、褪黑素50mg/kg灌胃治疗组、秋水仙碱50和100μg/kg腹腔注射治疗组。给药组预防给药5天，第5天后禁食过夜，给予ANIT造模，然后于造模后48h分别眼眶采血0.5ml测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-氨基转肽酶(GGT)、总胆红素(TBIL)和总胆汁酸(TBA)。取肝脏用中性福尔马林固定，石蜡包埋做组织切片，分别做H-E染色和免疫组化检测FXR、BSEP、MRP2和MDR3的表达。实验结果显示，模型组ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、TBA各项生化指标均显著升高，肝脏出现肝细胞坏死和炎症细胞浸润，FXR、BSEP,MRP2和MDR3的表达减低，表明肝脏出现明显的损伤以及胆汁淤积，而秋水仙碱2个治疗组均能减轻肝细胞坏死和炎症细胞浸润，增加BSEP、MRP2和MDR3的表达不同程度的明显降低各项损伤血生化指标。血生化结果见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>**ρ<0.01，与正常组比较;#Ρ<0.05，·ρ<0·01，与模型组比较。实施例2、对17Ci-炔雌醇(EE)致大鼠胆汁淤积作用釆用17ex-炔雌醇(EE)致大鼠胆汁淤积作用造模。EE造模是研究妊娠期胆汁淤积常用的动物模型，釆用EE5mg/kg皮下注射连续5天即会造成胆汁淤积。实验方案30只雄性大鼠根据体重随机分为以下5组，每组6只正常对照组、模型组(EE5mg/kg，sc)、熊去氧胆酸50mg/kg灌胃治疗组、秋水仙碱50和100μg/kg腹腔注射治疗组。其中EE造模给药5天，造模前Ih给予秋水仙碱，末次给药后禁食过夜，眼眶釆血Iml测ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和TBA。取肝脏用中性福尔马林固定，石蜡包埋做组织切片，分别做H-E染色和免疫组化检测FXR、BSEP.MRP2和MDR3的表达。实验结果显示，模型组动物血清ALP、GGT、TBIL和TBA水平显著升高，肝脏出现少量肝细胞坏死，FXR、BSEP、MRP2和MDR3的表达降低，提示发生明显的胆汁淤积和胆管损伤，而秋水仙碱2个治疗组均能不同程度的明显降低各项损伤指标，减轻肝细胞坏死增加BSEP、MRP2和MDR3的表达不同程度的明显降低各项损伤血生化指标。血生化结果见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*ρ<0.05，**ρ<0.01，与正常组比较;#ρ<0.05，##ρ<0.01，与模型组比较。实施例3、对胆管结扎致肝外胆汁淤积作用采用胆管结扎致肝外胆汁淤积作用造模。大鼠胆总管结扎后第二天就出现胆汁淤积性黄疸，大鼠胆管结扎模型是常用的研究肝外淤积性黄疸的动物模型。实验方案SD大鼠32只，雌雄各半，腹腔注射剂量为400mg/kg水合氯醛麻醉沿腹白线切开，分离总胆管，双重结扎并从中间剪断，其中对照组6只采用假手术方法，只分离胆管不结扎，用手术线缝合。两天后存活24只。分为对照组、模型组、熊去氧胆酸50mg/kg灌胃治疗组、秋水仙碱50和100μg/kg腹腔注射治疗组。连续给药5天，第5天禁食过夜，股动脉取血测血生化。取肝脏用中性福尔马林固定做病理组织切片，分别做H-E染色和免疫组化检测BSEP、MRP2和MDR3的表达。实验结果显示，模型组动物血清ALT、AST、ALP、GGT和TBA水平显著升高，肝脏出现肝细胞坏死，炎症细胞浸润和毛细胆管增生，FXR、BSEP、MRP2和MDR3的表达降低，提示发生明显的胆汁淤积和肝脏损伤，而秋水仙碱2个治疗组均能不同程度的明显降低各项损伤指标。减轻肝细胞坏死，炎症细胞浸润和毛细胆管增生，增加FXR、BSEP、MRP2和MDR3的表达，明显降低各项损伤血生化指标。血生化结果见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>**p<0.01，与正常组比较;#P<0.05，##p<0.01，与模型组比较。权利要求秋水仙碱在制备治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用。2.秋水仙碱在制备治疗妊娠肝内胆汁淤积综合症、内原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎重症黄疸或免疫性黄疸胆汁淤积性肝病药物中的应用。全文摘要本发明涉及秋水仙碱在制药方面的应用，特别涉及秋水仙碱在药物治疗胆汁淤积性肝病中的应用；秋水仙碱在制备治疗胆汁淤积性肝病药物中的应用；秋水仙碱在制备治疗妊娠肝内胆汁淤积综合症、内原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎重症黄疸或免疫性黄疸胆汁淤积性肝病药物中的应用；秋水仙碱能有效降低胆汁淤积性肝病引起的肝损伤及胆汁淤积，即可以有效地治疗胆汁淤积性肝病；秋水仙碱能有效减轻胆汁淤积导致的肝细胞坏死、炎症细胞浸润和毛细胆管增生；秋水仙碱能有效增加胆管中胆汁酸、胆红素和磷脂转运体BSEP、MRP2和MDR3的表达，促进体内淤积的胆汁酸、胆红素和磷脂的排泄，减少肝损伤。文档编号A61K31/165GK101822659SQ20101016855公开日2010年9月8日申请日期2010年5月11日优先权日2010年5月11日发明者周植星,尚靖,张陆勇,江振洲,王涛申请人:中国药科大学