一类吡唑的衍生物、其制备方法和用途的制作方法
专利名称：一类吡唑的衍生物、其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，更确切地说，是涉及一类具有抗真菌活性的化合物、其制备方法、组合物及应用。
背景技术：
真菌感染根据其侵入部位不同可分为浅部和深部两类。浅部真菌感染是一种常见病、多发病，多见于皮肤和甲部；深部真菌较常见的为白色念珠菌和新型隐球菌，发病率虽低但危害较大，感染严重时可危及生命。特别是近几十年来，随着广谱抗菌素、皮质激素、抗肿瘤药物和免疫抑制剂的广泛使用，放射治疗和器官移植的广泛进行，导管和插管的普遍开展，以及免疫缺陷患者尤其是艾滋病患者的急速增加，破坏了正常菌丛的共生关系，使肌体对真菌的抵抗力降低，从而致使真菌感染特别是深部真菌感染大幅度上升，并已成为艾滋病和肿瘤等重大疾病死亡的主要原因之一。
现有的抗真菌药物中，氮唑类药物是具有较好前景的一类，在临床上得到了广泛地应用。氮唑类药物尤其对深部真菌感染的疗效较为理想，所以一直是抗真菌药物研究中的热点。它们能抑制真菌细胞色素P4503A依赖C14-α-脱甲基酶(ERG11)，而这个酶是把羊毛固醇转化成麦角固醇的关键酶。其作用机制是阻断底物羟化反应，使真菌体内羊毛甾醇14-甲基化的甾醇大量蓄积，麦角甾醇合成缺乏，导致膜通透性和膜上许多酶活性改变，从而抑制真菌的生长。
目前临床上治疗深部真菌感染的首选药物，主要有以酮康唑(Ketoconazole)、咪康唑(Miconazole)、噻康唑(Tioconazole)为代表的咪唑类化合物，和以氟康唑(Fluconazole)、伊曲康唑(Itraconazole)和伏立康唑(Voriconazole)为代表的三氮唑类抗真菌药物。但是随着长期广泛应用，逐渐出现对现有氮唑类药物的耐药菌株，且有明显增多的趋势。已有报道称白念珠菌B41628对现有多种药物耐药，耐药性问题使真菌病防治面临更为严峻的挑战。同时在多年临床大规模试验中发现现有药物，大多具有一定程度的毒副作用如肝功能损害、胃肠道损害、皮疹等，致使其临床应用受到限制。
针对现有药物存在的局限性，如抗菌谱窄、耐药性严重、生物利用度低、有较强的毒副作用等问题。除了优化改良现有药物的制剂外，使得新型抗真菌药物研究成为全球新药研发的热点领域之一。此外，药物间的相互作用使深部真菌感染治疗变得更加复杂，因此，临床迫切需要高效低毒、抗菌谱广、高选择性的新型深部抗真菌药物。
发明内容
本发明的一个目的在于，为了克服现有氮唑类化合物的不足，研制新型抗真菌药物，公开了一类吡唑的衍生物及其药用盐。
本发明的另一个目的在于，公开了通式I化合物及其药用盐的制备方法。
本发明的再一个目的在于，公开了通式I化合物及其药用盐为主要活性成分的药物组合物。
本发明还有一个目的在于，公开了通式I化合物及其药用盐作为抗真菌药物方面的用途。
现结合发明目的对本发明内容进行具体描述。
本发明所涉及的通式I结构的化合物或盐如下
其中 R为氢或
本发明中的具有式I结构的化合物，可选自如下化合物 I-1 5-((1，3-二甲基-1H-吡唑-5-基)甲基)-4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶； I-2 (5-((1，3-二甲基-1H-吡唑-5-基)甲基)-4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶-2-基)乙酸酯。
本发明的具有式I结构的化合物，其盐系指本发明化合物与无机酸、有机酸所成的盐。其中特别优选的盐是盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐，对甲苯磺酸盐、马来酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、牛磺酸盐、葡萄糖酸盐等药学上可接受的盐。
式I结构的化合物合成路线图简明表示如下
噻吩并吡啶的盐酸盐与5-溴甲基-1，3-二甲基-1H-吡唑在二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、乙醇、丙酮等溶剂中，在三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾等缚酸剂存在下，-10℃～85℃反应制得I-1。
噻吩并吡啶酮的盐酸盐与5-溴甲基-1，3-二甲基-1H-吡唑在二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈或甲苯等溶剂中，在三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾等缚酸剂存在下，-10℃～105℃反应制得关键中间体4。中间体4再与乙酸酐、乙酸、乙酰氯或乙酰溴等，在二氯甲烷、三氯甲烷或甲苯中，在三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾等缚酸剂存在下，-30℃～50℃反应制得化合物I-2。
将反应所得产物溶于乙醚、DMF、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯或DMSO中的一种，滴加无机酸或有机酸的溶液，制成药学上可接受的盐。
具体是将各种化合物溶于乙醚、DMF、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯或DMSO中的一种，于冰水浴下滴加盐酸乙醚溶液至pH＝2，制成盐酸盐；或将各种化合物溶于乙醚、DMF、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯或DMSO中的一种，加入等摩尔葡萄糖酸，加热搅拌得其葡萄糖酸盐；抑或将各种化合物溶于乙醚、DMF、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯或DMSO中的一种，于冰水浴下滴加浓硫酸至pH＝3，制成硫酸盐，等等。
此类化合物对于治疗人类真菌感染性疾病是有效的。尽管本发明的化合物可以不经任何配制直接给药，但所述的各种化合物优选以药物制剂的形式使用，给药途径可以是非肠道途径(如静脉、肌肉给药)及口服给药。
本发明化合物的药物组合物制备方法如下使用标准和常规的技术，使本发明化合物与制剂学上可接受的固体或液体载体结合，以及使之任意地与制剂学上可接受的辅助剂和赋形剂结合制备成微粒或微球。固体剂型包括片剂、分散颗粒、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质，其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、聚山梨酯80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、粉剂等等。
药物组合物以及单元剂型中含有的活性成份(本发明化合物)的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定地加以应用，所用的化合物的量或浓度在一个较宽的范围内调节。通常，活性化合物量的范围为组合物的0.05％～90％(重量)，另一优选的范围为0.05％-70％。
本发明的具有式I结构的化合物或其药学上可接受的盐，对真菌有明显的抑制作用。下面采用标准微量稀释法(NCCLSM-27A)测定其最低抑菌浓度，进一步说明本发明化合物对临床几种常见真菌的体外抑菌活性。以目标化合物抑制所选真菌90％生长的浓度(MIC90)作为判断终点。
试验菌株5种深部真菌白色念珠菌(Candida albicans，C.alb.)ATCC 76615、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans，C.neo.)ATCC 32609、热带念珠菌(Candida tropicalis，C.tro.)ATCC 12034、近平滑念珠菌(Candida paropsilosis，C.par.)ATCC 22019、薰烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus，A.fum.)。3种浅表真菌红色毛癣菌(Trichophyton rubrum，T.rub.)、申克氏孢子丝菌(Sporothrixschenckii，S.sch.)和裴氏着色真菌(Fonsecaea pedrosoi，F.ped.)。以上菌株均由本单位药理学实验室提供。
试验药品本发明化合物I-1、I-2，选用两性霉素B(AmB)(华药集团)和酮康唑(KCZ)(武汉合中生化制造有限公司)作为阳性对照药，二甲基亚砜(DMSO)，AR级(天津市凯信化学工业有限公司)。酶标仪，BIO-RAD680。
试验方法以RPMI-1640(Sigma)为培养液，将实验菌种配成浓度为1×104～1×105/ml的混悬液。将化合物以灭菌蒸馏水和DMSO溶解，制成药物储存液(6400μg/ml)，-20℃保存待用。使用时用RPMI-1640稀释至640μg/ml，同时设溶剂对照和空白对照。取无菌96孔平底微量培养板，1号孔加RPMI-1640 100μL作空白对照，2号孔加菌悬液180μL和药液20μL，3-12号孔各加菌悬液100μL，2-11号孔10级倍比稀释，最后从11号孔中吸出的100μL丢弃。各孔药物浓度分别为64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125μg·mL-1。12号孔不加药液，作药物阴性对照。念珠菌属于35℃恒温培养24h，观察3d的生长情况。新型隐球菌培养72h后测定结果，浅部真菌26℃恒温培养，观察1周的生长情况。用酶标仪进行分析，与药物阴性对照孔进行比较，以90％抑制所对应的最低药物浓度为其最小抑菌浓度值(MIC90)。
化合物体外抗真菌活性实验(MIC90，μg·mL-1)
通过体外抑菌测试实验结果可见，化合物I-1和I-2对8种致病真菌均有一定程度的抑制活性，有的甚至超过临床治疗真菌的首选但毒性较大的药物两性霉素B。部分化合物对临床上最为常见的和已大范围产生耐药的念珠菌感染具有较强的体外活性。这类新化合物具有广谱、高活性的优点，具有进一步深入研究价值。
具体实施例方式 下面结合实施例对本发明做进一步地说明，实施例仅为解释性的，决不意味着它以任何方式限制本发明的范围。所述的化合物经高效液相色谱(HPLC)，薄层色谱(TLC)进行检测。随后可以采用诸如红外光谱(IR)，核磁共振谱(1H NMR，13C NMR)，质谱(MS)等更进一步确证其结构。
实施例1 5-((1，3-二甲基-1H-吡唑-5-基)甲基)-4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶(化合物I-1)
在装有搅拌、冷凝器、温度计的反应瓶中加入18.9g(0.1mol)5-溴甲基-1，3-二甲基-1H-吡唑，再加入50mL无水乙醇，搅拌下加入无水碳酸钾27.6g(0.2mol)。然后加入17.6g(0.1mol)4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶的盐酸盐，25℃保温反应约5h(板层显示反应完全)。Rf＝0.44[展开剂v(石油醚)∶v(乙酸乙酯)＝1∶1]。停止反应，过滤，滤液减压蒸尽乙醇，柱分离，得淡黄色油状产物(HPLC99.1％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ2.147(s，3H)，3.079～3.120(d，1H)，3.247～3.277(d，1H)，3.411(s，1H)，3.698(s，1H)，3.851(s，3H)，4.205～4.307(t，2H)，4.502～4.527(d，2H)，6.413(s，1H)，6.915～6.928(d，1H)，7.443～7.456(d，1H)。MS(m-1)/z246.0。
实施例2 中间体4的制备
在装有搅拌、冷凝器、温度计的反应瓶中加入14.5g(0.1mol)5-溴甲基-1，3-二甲基-1H-吡唑，再加入35mL二氯甲烷，搅拌下加入三乙胺20.2g(0.2mol)。然后加入19.2g(0.1mol)5，6，7，7a-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶-2(4H)-酮的盐酸盐，回流反应约3h(板层显示反应完全)。Rf＝0.35[展开剂v(石油醚)∶v(乙酸乙酯)＝1∶2]。停止反应，用3×40mL水洗涤反应液，分取二氯甲烷层，用无水硫酸钠充分干燥，过滤，减压蒸尽二氯甲烷，柱分离，得黄色油状产物(HPLC97.5％)。
实施例3 (5-((1，3-二甲基-1H-吡唑-5-基)甲基)-4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶-2-基)乙酸酯(化合物I-2)
在装有搅拌、冷凝器、温度计的反应瓶中加入2.6g中间体4，用10mL三氯甲烷将其分散，搅拌下加入氢氧化钠1.4g。将反应体系冷却至-20℃，将1.1g乙酸酐分批加入反应体系。加完，于室温下继续搅拌反应1.5h(板层显示反应完全)。用3×15mL水洗涤反应液，分取三氯甲烷层，用无水硫酸钠充分干燥，过滤，减压蒸尽三氯甲烷，柱分离，即得浅黄色油状产物(HPLC99.0％)。Rf＝0.67[单点，展开剂v(石油醚)∶v(乙酸乙酯)＝1∶1]。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ2.146(s，3H)，2.280(s，3H)，2.963～3.003(d，1H)，3.178～3.192(d，1H)，3.400～3.434(t，1H)，3.683(s，1H)，3.861(s，3H)，4.149(s，2H)，4.503～4.521(s，2H)，6.437(s，1H)，6.596(s，1H)。MS(m-1)/z304.0。
实施例4 化合物I-1成盐酸盐取I-1油状产物2.0g，溶于10mL无水乙醚。冰水浴冷却至0℃，滴加20.5％盐酸乙醚溶液至pH为2，继续于冰水浴下搅拌约1h。过滤，得白色固体。
实施例5 化合物I-2成葡萄糖酸盐取I-2油状产物2.5g，溶于15mL无水乙醇。加热至回流后加入等摩尔葡萄糖酸，继续于回流下搅拌反应约3h。反应完毕，于室温下静置24h。过滤，得白色固体。
实施例6 化合物I-2成硫酸盐取I-2油状产物2.3g，溶于15mL无水甲醇。冰水浴冷却至5℃，滴加浓硫酸溶液至pH为3，继续于冰水浴下搅拌约2h。过滤，得白色固体。
为了更充分地说明本发明的吡唑类衍生物的药物组合物，下面提供下列制剂实施例，所述实施例仅用于说明，而不是用于限制本发明的范围。所述制剂可以使用本发明化合物中的任何活性化合物及其盐，优选使用实施例1、3、4、5、6中所描述的化合物。
实施例7 用下述成分制备硬明胶胶囊 用量/囊 化合物I-1 75mg 预胶化淀粉100mg 泊洛沙姆4mg 羧甲基淀粉钠10mg 硬脂酸镁20mg 10％聚维酮乙醇溶液 适量 制备工艺将原辅料预先干燥，过100目筛备用。按处方量将上述成分混匀，过60目筛三次，加适量10％聚维酮乙醇(95％)溶液制软材，过18目筛制粒，40℃干燥，过16目筛整粒，填充入硬明胶胶囊中。
实施例8 用下述成分制备片剂 用量/片 化合物I-2 75mg 淀粉45mg 微晶纤维素 40mg 羧甲基淀粉钠盐 4.5mg 硬脂酸镁1mg 滑石粉 1mg 泊洛沙姆3mg 制备工艺将原辅料预先干燥，过100目筛备用。先将处方量的辅料充分混匀。将原料药以递增稀释法加到辅料中，每次加时充分混匀2-3次，保证药与辅料充分混匀，过20目筛，在55℃通风烘箱中干燥2h，干颗粒过16目筛整理，测定中间体含量，混合均匀，在压片机上压片。
实施例9 注射液的制备 化合物I-1的盐酸盐 45mg 丙二醇 100mg 聚山梨酯80 适量 蒸馏水 300mL 制备方法取活性成分加入到已溶解山梨醇和丙二醇的注射用水中，加入药用碱调节pH值至4～8使其溶解。加入活性炭，搅拌吸附30min，除炭、精滤、灌封、灭菌。
实施例10 注射用冻干粉的制备 化合物I-2的葡萄糖酸盐 50mg 药用碱 0.1-7.0％ 甘露醇 55-80％ 制备方法取活性成分加入注射用水，用药用碱调节pH值至4～8使其溶解。再加入甘露醇，按注射剂的要求进行高压灭菌，加入活性炭，采用微孔滤膜过滤，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得疏松块状物，封口，即得。
权利要求
1.具有式I结构的化合物或盐
其中
R为氢或
2.如权利要求1中所述的通式I化合物或盐，可选自如下化合物
I-15-((1，3-二甲基-1H-吡唑-5-基)甲基)-4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶；
I-2(5-((1，3-二甲基-1H-吡唑-5-基)甲基)-4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶-2-基)乙酸酯。
3.如权利要求1所述的化合物或盐，是指本发明化合物与无机酸、有机酸所成的盐。
4.如权利要求3中所述的化合物或盐，其中特别优选的盐是盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐，对甲苯磺酸盐、马来酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、牛磺酸、葡萄糖酸盐。
5.权利要求1中式I化合物或盐的制备方法，其特征在于4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶的盐酸盐与5-溴甲基-1，3-二甲基-1H-吡唑在二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、乙醇、丙酮中，在三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾存在下，-10℃～85℃反应制得I-1。
5，6，7，7a-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶-2(4H)-酮的盐酸盐与5-溴甲基-1，3-二甲基-1H-吡唑在二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈或甲苯中，在三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾存在下，-10℃～105℃反应制得关键中间体4。中间体4再与乙酸酐、乙酸、乙酰氯或乙酰溴，在二氯甲烷、三氯甲烷或甲苯中，在三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾存在下，-30℃～50℃反应制得化合物I-2。
6.一种具有抗真菌活性的药物组合物，它包含治疗有效量的式I化合物或盐及一种或多种药用赋形剂。
7.如权利要求1～4中式I化合物或盐在制备抗真菌药物方面的应用。
全文摘要
本发明属于抗真菌作用药物技术领域，提供具有通式I结构的一类吡唑衍生物及其药学上可接受的盐。其中R的定义同说明书中所述。本发明还涉及上述化合物的制备方法，并同时公开了以该化合物或其药学上可接受的盐作为活性有效成分的药物组合物，以及它们在作为抗真菌药物方面的应用。
文档编号A61P31/10GK101817834SQ201010171249
公开日2010年9月1日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者刘颖, 刘登科, 刘冰妮, 刘默, 周云松, 陈继方, 穆帅, 黄长江, 王平保 申请人:天津药物研究院
技术领域：
本发明属于医药技术领域，更确切地说，是涉及一类具有抗真菌活性的化合物、其制备方法、组合物及应用。
背景技术：
真菌感染根据其侵入部位不同可分为浅部和深部两类。浅部真菌感染是一种常见病、多发病，多见于皮肤和甲部；深部真菌较常见的为白色念珠菌和新型隐球菌，发病率虽低但危害较大，感染严重时可危及生命。特别是近几十年来，随着广谱抗菌素、皮质激素、抗肿瘤药物和免疫抑制剂的广泛使用，放射治疗和器官移植的广泛进行，导管和插管的普遍开展，以及免疫缺陷患者尤其是艾滋病患者的急速增加，破坏了正常菌丛的共生关系，使肌体对真菌的抵抗力降低，从而致使真菌感染特别是深部真菌感染大幅度上升，并已成为艾滋病和肿瘤等重大疾病死亡的主要原因之一。
现有的抗真菌药物中，氮唑类药物是具有较好前景的一类，在临床上得到了广泛地应用。氮唑类药物尤其对深部真菌感染的疗效较为理想，所以一直是抗真菌药物研究中的热点。它们能抑制真菌细胞色素P4503A依赖C14-α-脱甲基酶(ERG11)，而这个酶是把羊毛固醇转化成麦角固醇的关键酶。其作用机制是阻断底物羟化反应，使真菌体内羊毛甾醇14-甲基化的甾醇大量蓄积，麦角甾醇合成缺乏，导致膜通透性和膜上许多酶活性改变，从而抑制真菌的生长。
目前临床上治疗深部真菌感染的首选药物，主要有以酮康唑(Ketoconazole)、咪康唑(Miconazole)、噻康唑(Tioconazole)为代表的咪唑类化合物，和以氟康唑(Fluconazole)、伊曲康唑(Itraconazole)和伏立康唑(Voriconazole)为代表的三氮唑类抗真菌药物。但是随着长期广泛应用，逐渐出现对现有氮唑类药物的耐药菌株，且有明显增多的趋势。已有报道称白念珠菌B41628对现有多种药物耐药，耐药性问题使真菌病防治面临更为严峻的挑战。同时在多年临床大规模试验中发现现有药物，大多具有一定程度的毒副作用如肝功能损害、胃肠道损害、皮疹等，致使其临床应用受到限制。
针对现有药物存在的局限性，如抗菌谱窄、耐药性严重、生物利用度低、有较强的毒副作用等问题。除了优化改良现有药物的制剂外，使得新型抗真菌药物研究成为全球新药研发的热点领域之一。此外，药物间的相互作用使深部真菌感染治疗变得更加复杂，因此，临床迫切需要高效低毒、抗菌谱广、高选择性的新型深部抗真菌药物。
发明内容
本发明的一个目的在于，为了克服现有氮唑类化合物的不足，研制新型抗真菌药物，公开了一类吡唑的衍生物及其药用盐。
本发明的另一个目的在于，公开了通式I化合物及其药用盐的制备方法。
本发明的再一个目的在于，公开了通式I化合物及其药用盐为主要活性成分的药物组合物。
本发明还有一个目的在于，公开了通式I化合物及其药用盐作为抗真菌药物方面的用途。
现结合发明目的对本发明内容进行具体描述。
本发明所涉及的通式I结构的化合物或盐如下
其中 R为氢或
本发明中的具有式I结构的化合物，可选自如下化合物 I-1 5-((1，3-二甲基-1H-吡唑-5-基)甲基)-4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶； I-2 (5-((1，3-二甲基-1H-吡唑-5-基)甲基)-4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶-2-基)乙酸酯。
本发明的具有式I结构的化合物，其盐系指本发明化合物与无机酸、有机酸所成的盐。其中特别优选的盐是盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐，对甲苯磺酸盐、马来酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、牛磺酸盐、葡萄糖酸盐等药学上可接受的盐。
式I结构的化合物合成路线图简明表示如下
噻吩并吡啶的盐酸盐与5-溴甲基-1，3-二甲基-1H-吡唑在二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、乙醇、丙酮等溶剂中，在三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾等缚酸剂存在下，-10℃～85℃反应制得I-1。
噻吩并吡啶酮的盐酸盐与5-溴甲基-1，3-二甲基-1H-吡唑在二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈或甲苯等溶剂中，在三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾等缚酸剂存在下，-10℃～105℃反应制得关键中间体4。中间体4再与乙酸酐、乙酸、乙酰氯或乙酰溴等，在二氯甲烷、三氯甲烷或甲苯中，在三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾等缚酸剂存在下，-30℃～50℃反应制得化合物I-2。
将反应所得产物溶于乙醚、DMF、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯或DMSO中的一种，滴加无机酸或有机酸的溶液，制成药学上可接受的盐。
具体是将各种化合物溶于乙醚、DMF、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯或DMSO中的一种，于冰水浴下滴加盐酸乙醚溶液至pH＝2，制成盐酸盐；或将各种化合物溶于乙醚、DMF、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯或DMSO中的一种，加入等摩尔葡萄糖酸，加热搅拌得其葡萄糖酸盐；抑或将各种化合物溶于乙醚、DMF、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯或DMSO中的一种，于冰水浴下滴加浓硫酸至pH＝3，制成硫酸盐，等等。
此类化合物对于治疗人类真菌感染性疾病是有效的。尽管本发明的化合物可以不经任何配制直接给药，但所述的各种化合物优选以药物制剂的形式使用，给药途径可以是非肠道途径(如静脉、肌肉给药)及口服给药。
本发明化合物的药物组合物制备方法如下使用标准和常规的技术，使本发明化合物与制剂学上可接受的固体或液体载体结合，以及使之任意地与制剂学上可接受的辅助剂和赋形剂结合制备成微粒或微球。固体剂型包括片剂、分散颗粒、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质，其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、聚山梨酯80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、粉剂等等。
药物组合物以及单元剂型中含有的活性成份(本发明化合物)的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定地加以应用，所用的化合物的量或浓度在一个较宽的范围内调节。通常，活性化合物量的范围为组合物的0.05％～90％(重量)，另一优选的范围为0.05％-70％。
本发明的具有式I结构的化合物或其药学上可接受的盐，对真菌有明显的抑制作用。下面采用标准微量稀释法(NCCLSM-27A)测定其最低抑菌浓度，进一步说明本发明化合物对临床几种常见真菌的体外抑菌活性。以目标化合物抑制所选真菌90％生长的浓度(MIC90)作为判断终点。
试验菌株5种深部真菌白色念珠菌(Candida albicans，C.alb.)ATCC 76615、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans，C.neo.)ATCC 32609、热带念珠菌(Candida tropicalis，C.tro.)ATCC 12034、近平滑念珠菌(Candida paropsilosis，C.par.)ATCC 22019、薰烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus，A.fum.)。3种浅表真菌红色毛癣菌(Trichophyton rubrum，T.rub.)、申克氏孢子丝菌(Sporothrixschenckii，S.sch.)和裴氏着色真菌(Fonsecaea pedrosoi，F.ped.)。以上菌株均由本单位药理学实验室提供。
试验药品本发明化合物I-1、I-2，选用两性霉素B(AmB)(华药集团)和酮康唑(KCZ)(武汉合中生化制造有限公司)作为阳性对照药，二甲基亚砜(DMSO)，AR级(天津市凯信化学工业有限公司)。酶标仪，BIO-RAD680。
试验方法以RPMI-1640(Sigma)为培养液，将实验菌种配成浓度为1×104～1×105/ml的混悬液。将化合物以灭菌蒸馏水和DMSO溶解，制成药物储存液(6400μg/ml)，-20℃保存待用。使用时用RPMI-1640稀释至640μg/ml，同时设溶剂对照和空白对照。取无菌96孔平底微量培养板，1号孔加RPMI-1640 100μL作空白对照，2号孔加菌悬液180μL和药液20μL，3-12号孔各加菌悬液100μL，2-11号孔10级倍比稀释，最后从11号孔中吸出的100μL丢弃。各孔药物浓度分别为64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125μg·mL-1。12号孔不加药液，作药物阴性对照。念珠菌属于35℃恒温培养24h，观察3d的生长情况。新型隐球菌培养72h后测定结果，浅部真菌26℃恒温培养，观察1周的生长情况。用酶标仪进行分析，与药物阴性对照孔进行比较，以90％抑制所对应的最低药物浓度为其最小抑菌浓度值(MIC90)。
化合物体外抗真菌活性实验(MIC90，μg·mL-1)
通过体外抑菌测试实验结果可见，化合物I-1和I-2对8种致病真菌均有一定程度的抑制活性，有的甚至超过临床治疗真菌的首选但毒性较大的药物两性霉素B。部分化合物对临床上最为常见的和已大范围产生耐药的念珠菌感染具有较强的体外活性。这类新化合物具有广谱、高活性的优点，具有进一步深入研究价值。
具体实施例方式 下面结合实施例对本发明做进一步地说明，实施例仅为解释性的，决不意味着它以任何方式限制本发明的范围。所述的化合物经高效液相色谱(HPLC)，薄层色谱(TLC)进行检测。随后可以采用诸如红外光谱(IR)，核磁共振谱(1H NMR，13C NMR)，质谱(MS)等更进一步确证其结构。
实施例1 5-((1，3-二甲基-1H-吡唑-5-基)甲基)-4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶(化合物I-1)
在装有搅拌、冷凝器、温度计的反应瓶中加入18.9g(0.1mol)5-溴甲基-1，3-二甲基-1H-吡唑，再加入50mL无水乙醇，搅拌下加入无水碳酸钾27.6g(0.2mol)。然后加入17.6g(0.1mol)4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶的盐酸盐，25℃保温反应约5h(板层显示反应完全)。Rf＝0.44[展开剂v(石油醚)∶v(乙酸乙酯)＝1∶1]。停止反应，过滤，滤液减压蒸尽乙醇，柱分离，得淡黄色油状产物(HPLC99.1％)。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ2.147(s，3H)，3.079～3.120(d，1H)，3.247～3.277(d，1H)，3.411(s，1H)，3.698(s，1H)，3.851(s，3H)，4.205～4.307(t，2H)，4.502～4.527(d，2H)，6.413(s，1H)，6.915～6.928(d，1H)，7.443～7.456(d，1H)。MS(m-1)/z246.0。
实施例2 中间体4的制备
在装有搅拌、冷凝器、温度计的反应瓶中加入14.5g(0.1mol)5-溴甲基-1，3-二甲基-1H-吡唑，再加入35mL二氯甲烷，搅拌下加入三乙胺20.2g(0.2mol)。然后加入19.2g(0.1mol)5，6，7，7a-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶-2(4H)-酮的盐酸盐，回流反应约3h(板层显示反应完全)。Rf＝0.35[展开剂v(石油醚)∶v(乙酸乙酯)＝1∶2]。停止反应，用3×40mL水洗涤反应液，分取二氯甲烷层，用无水硫酸钠充分干燥，过滤，减压蒸尽二氯甲烷，柱分离，得黄色油状产物(HPLC97.5％)。
实施例3 (5-((1，3-二甲基-1H-吡唑-5-基)甲基)-4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶-2-基)乙酸酯(化合物I-2)
在装有搅拌、冷凝器、温度计的反应瓶中加入2.6g中间体4，用10mL三氯甲烷将其分散，搅拌下加入氢氧化钠1.4g。将反应体系冷却至-20℃，将1.1g乙酸酐分批加入反应体系。加完，于室温下继续搅拌反应1.5h(板层显示反应完全)。用3×15mL水洗涤反应液，分取三氯甲烷层，用无水硫酸钠充分干燥，过滤，减压蒸尽三氯甲烷，柱分离，即得浅黄色油状产物(HPLC99.0％)。Rf＝0.67[单点，展开剂v(石油醚)∶v(乙酸乙酯)＝1∶1]。1H NMR(DMSO-d6，400MHz)δ2.146(s，3H)，2.280(s，3H)，2.963～3.003(d，1H)，3.178～3.192(d，1H)，3.400～3.434(t，1H)，3.683(s，1H)，3.861(s，3H)，4.149(s，2H)，4.503～4.521(s，2H)，6.437(s，1H)，6.596(s，1H)。MS(m-1)/z304.0。
实施例4 化合物I-1成盐酸盐取I-1油状产物2.0g，溶于10mL无水乙醚。冰水浴冷却至0℃，滴加20.5％盐酸乙醚溶液至pH为2，继续于冰水浴下搅拌约1h。过滤，得白色固体。
实施例5 化合物I-2成葡萄糖酸盐取I-2油状产物2.5g，溶于15mL无水乙醇。加热至回流后加入等摩尔葡萄糖酸，继续于回流下搅拌反应约3h。反应完毕，于室温下静置24h。过滤，得白色固体。
实施例6 化合物I-2成硫酸盐取I-2油状产物2.3g，溶于15mL无水甲醇。冰水浴冷却至5℃，滴加浓硫酸溶液至pH为3，继续于冰水浴下搅拌约2h。过滤，得白色固体。
为了更充分地说明本发明的吡唑类衍生物的药物组合物，下面提供下列制剂实施例，所述实施例仅用于说明，而不是用于限制本发明的范围。所述制剂可以使用本发明化合物中的任何活性化合物及其盐，优选使用实施例1、3、4、5、6中所描述的化合物。
实施例7 用下述成分制备硬明胶胶囊 用量/囊 化合物I-1 75mg 预胶化淀粉100mg 泊洛沙姆4mg 羧甲基淀粉钠10mg 硬脂酸镁20mg 10％聚维酮乙醇溶液 适量 制备工艺将原辅料预先干燥，过100目筛备用。按处方量将上述成分混匀，过60目筛三次，加适量10％聚维酮乙醇(95％)溶液制软材，过18目筛制粒，40℃干燥，过16目筛整粒，填充入硬明胶胶囊中。
实施例8 用下述成分制备片剂 用量/片 化合物I-2 75mg 淀粉45mg 微晶纤维素 40mg 羧甲基淀粉钠盐 4.5mg 硬脂酸镁1mg 滑石粉 1mg 泊洛沙姆3mg 制备工艺将原辅料预先干燥，过100目筛备用。先将处方量的辅料充分混匀。将原料药以递增稀释法加到辅料中，每次加时充分混匀2-3次，保证药与辅料充分混匀，过20目筛，在55℃通风烘箱中干燥2h，干颗粒过16目筛整理，测定中间体含量，混合均匀，在压片机上压片。
实施例9 注射液的制备 化合物I-1的盐酸盐 45mg 丙二醇 100mg 聚山梨酯80 适量 蒸馏水 300mL 制备方法取活性成分加入到已溶解山梨醇和丙二醇的注射用水中，加入药用碱调节pH值至4～8使其溶解。加入活性炭，搅拌吸附30min，除炭、精滤、灌封、灭菌。
实施例10 注射用冻干粉的制备 化合物I-2的葡萄糖酸盐 50mg 药用碱 0.1-7.0％ 甘露醇 55-80％ 制备方法取活性成分加入注射用水，用药用碱调节pH值至4～8使其溶解。再加入甘露醇，按注射剂的要求进行高压灭菌，加入活性炭，采用微孔滤膜过滤，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得疏松块状物，封口，即得。
权利要求
1.具有式I结构的化合物或盐
其中
R为氢或
2.如权利要求1中所述的通式I化合物或盐，可选自如下化合物
I-15-((1，3-二甲基-1H-吡唑-5-基)甲基)-4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶；
I-2(5-((1，3-二甲基-1H-吡唑-5-基)甲基)-4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶-2-基)乙酸酯。
3.如权利要求1所述的化合物或盐，是指本发明化合物与无机酸、有机酸所成的盐。
4.如权利要求3中所述的化合物或盐，其中特别优选的盐是盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐，对甲苯磺酸盐、马来酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、牛磺酸、葡萄糖酸盐。
5.权利要求1中式I化合物或盐的制备方法，其特征在于4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶的盐酸盐与5-溴甲基-1，3-二甲基-1H-吡唑在二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、乙醇、丙酮中，在三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾存在下，-10℃～85℃反应制得I-1。
5，6，7，7a-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶-2(4H)-酮的盐酸盐与5-溴甲基-1，3-二甲基-1H-吡唑在二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈或甲苯中，在三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾存在下，-10℃～105℃反应制得关键中间体4。中间体4再与乙酸酐、乙酸、乙酰氯或乙酰溴，在二氯甲烷、三氯甲烷或甲苯中，在三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾存在下，-30℃～50℃反应制得化合物I-2。
6.一种具有抗真菌活性的药物组合物，它包含治疗有效量的式I化合物或盐及一种或多种药用赋形剂。
7.如权利要求1～4中式I化合物或盐在制备抗真菌药物方面的应用。
全文摘要
本发明属于抗真菌作用药物技术领域，提供具有通式I结构的一类吡唑衍生物及其药学上可接受的盐。其中R的定义同说明书中所述。本发明还涉及上述化合物的制备方法，并同时公开了以该化合物或其药学上可接受的盐作为活性有效成分的药物组合物，以及它们在作为抗真菌药物方面的应用。
文档编号A61P31/10GK101817834SQ201010171249
公开日2010年9月1日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者刘颖, 刘登科, 刘冰妮, 刘默, 周云松, 陈继方, 穆帅, 黄长江, 王平保 申请人:天津药物研究院
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