骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用的制作方法
专利名称：骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用。
背景技术：
大肠癌等恶性肿瘤的侵袭和转移是一个多步骤的复杂过程，一般包括癌细胞的局 部增殖和扩展、分离和脱落、肿瘤组织新生血管形成、癌细胞进入循环、癌细胞降解脉管基 膜逸出循环及随后的定位生长等。然而，这一系列复杂步骤都离不开癌细胞自身的运动能 力。癌细胞的运动，包括细胞膜的伪足样伸展、膜流动性及细胞极性的变化等，是癌细胞侵 袭转移各步骤基本的共同的特征。癌细胞的运动的实现过程依赖皮层肌动蛋白的聚合和解 聚。Arp2/3复合物的激活介导此重要生化过程。Arp2/3的重要激活分子是以Cortactin和 N-WASP为代表的家族。两种蛋白的结构，尤其是和Arp2/3以及肌动蛋白单体结合的区域 (氨基酸序列)已经阐明。Cortactin的氨基端㈧以及随后的重复区域(R印eat)、N_WASP 的VCA区域，是激活Arp2/3必须的结构域。有研究表明，Cortactin和N-WASP与癌细胞的 侵袭转移有关，并在大肠癌组织中异常表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移 的药物中的应用。本发明的技术解决方案是一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用，其特征 是所述骨架蛋白源性多肽为如下氨基酸序列的V+R印eat融合多肽NKAALLDQIREGAQLKKVGRDALLDQIRQGIQLKSV
SHGYGGKFGVEQDRMDKSAVGHEYQSKLSKHCSQVDSVRG
FGGKFGVQMDRVDQSAVGFEYQGKTEKHASQKDYSSGFGG
KYGVQADRVDKSAVGFDYQGKTEKHESQRDYSKGFGGKYG
IDKDKVDKSAVGFEYQGKTEKHESQKDYVKGFGGKFGVQT
DRQDKCALGWDHQEKLQLHESQKDYKTGFGGKFGVQSERQ
DSAAVGFDYKEKLAKHESQQDYSKGFGGKYGVQKDRMDKN
ASTF。本发明的V+R印eat融合性多肽对于大肠癌的侵袭转移具有显著的抑制作用。下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施例方式一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用，所述骨架蛋白源性多肽为如下氨基酸系列的V+R印eat融合多肽
NKAALL
DQIREGAQLKKV GRDALLDQ IRQGIQLKSV
SHGYGGKFGV FGGKFGVQMD KYGVQADRVD IDKDKVDKSA DRQDKCALGW DSAAVGFDYK ASTF。 实验证据
1.多肽的设计和准备
EQDRMDKSAV RVDQSAVGFE KSAVGFDYQG VGFEYQGKTE DHQEKLQLHE EKLAKHESQQ
GHEYQSKLSK HCSQVDSVRG YQGKTEKHAS QKDYSSGFGG KTEKHESQRD YSKGFGGKYG KHESQKDYVK GFGGKFGVQT SQKDYKTGFG GKFGVQSERQ DYSKGFGGKY GVQKDRMDKN人N-WASP由505个氨基酸组成，N-ffASP的V区域由第405至422及第433到 450 共 36 个氨基酸组成。氨基酸序列为 NKAALLDQIREGAQLKKV 和 GRDALLDQ IRQGIQLKSV。 除外V区域，N-WASP的羧基端包括CA区域，由451到505共55个氨基酸组成。氨基 酸序列为 ADGQESTPPT PAPTSGIVGA LMEVMQKRSKAIHSSDEDED EDDEEDFEDD DEWED。人 Cortactin由550个氨基酸组成，Cortactin的氨基端A区域由1-80个氨基酸组成， 单独该段区域仅与ARP2/3复合物结合但无促进肌动蛋白聚合的作用。其氨基酸序 列如下MWKASAGHAV SIAQDDAGAD DWETDPDFVNDVSEKEQRWG AKTVQGSGHQ EHINIHKLRE NVFQEHQTLKEKELETGPKA。人Cortactin的重复结构域(R印eat区域)由244个氨基酸组 成。其氨基酸序列如下SHGYGGKFGV EQDRMDKSAVGHEYQSKLSK HCSQVDSVRG FGGKFGVQMD RVDQSAVGFEYQGKTEKHAS QKDYSSGFGG KYGVQADRVD KSAVGFDYQGKTEKHESQRD YSKGFGGKYG IDKDKVDKSA VGFEYQGKTEKHESQKDYVK GFGGKFGVQT DRQDKCALGW DHQEKLQLHESQKDYKTGFG GKFGVQSERQ DSAAVGFDYK EKLAKHESQQDYSKGFGGKY GVQKDRMDKN ASTF。基于上述分子结构，产生5种多肽。按所在分子的功能区域命名，分别是 V(N-WASP)， CA(N-WASP)， A(Cortactin)， Repeat(Cortactin)， V+R印eat 融合多月太 (N-WASP&Cortactin)。V+R印eat 融合多Jj太是 V(N-WASP)与 R印eat (Cortactin)形成的融 合多肽，其氨基酸序列表示为NKAALL DQIREGAQLKKV GRDALLDQ IRQGIQLKSVSHGYGGKFGV EQDRMDKSAV GHEYQSKLSK HCSQVDSVRGFGGKFGVQMD RVDQSAVGFE YQGKTEKHAS QKDYSSGFGGKYGVQADRVD KSAVGFDYQG KTEKHESQRD YSKGFGGKYGIDKDKVDKSA VGFEYQGKTE KHESQKDYVK GFGGKFGVQTDRQDKCALGff DHQEKLQLHE SQKDYKTGFG GKFGVQSERQDSAAVGFDYK EKLAKHESQQ DYSKGFGGKY GVQKDRMDKNASTF。2.重组表达质粒的构建以及抑制性多肽的制备将与上述5种多肽对应的5种DNA片段通过分子克隆的方法插入真核表达质粒 PEGFP-N2,构建重组质粒 pEGFP-N2-V、pEGFP_N2_CA、pEGFP_N2_A、pEGFP_N2_R印eat 以及 pEGFP-N2-V-Repeat,并作鉴定。 将上述5种DNA片段通过分子克隆方法插入到原核表达质粒PGEX-4T-2，通过工程 菌生产多肽，HPLC纯化，低温保存备用。3.表达拮抗分子的大肠细胞系的建立以及癌细胞多肽导入的方法的建立将上述5种重组表达质粒通过脂质体转导大肠癌细胞LoVo，检测GFP表达情况，并采用G418筛选，获得稳定表达的细胞株。同时，将纯化的5种小多肽以Cy5荧光材料做标 记，随后采用Proteojuice 转导试剂将多肽导入大肠癌细胞HCT-8。4.细胞实验检测五种肌动蛋白装配拮抗分子对大肠癌细胞运动的影响采用细胞划痕分析法检测质粒转染和多肽导入的癌细胞的迁移能力的变化，采用 Capture-ELISA检测癌细胞内吞能力的变化；采用Boyden小室检测癌细胞侵袭能力的变 化；同时作细胞染色，观察癌细胞伪足形成、边缘肌动蛋白等的分布改变。5.动物实验检测表达拮抗分子的大肠癌细胞转移能力的改变实验采用脾内注射法制备大肠癌转移模型。观察脾脏内接种的不同种类的大肠癌 细胞转移能力的变化。将表达外源DNA片段的大肠癌细胞株常规培养，并制成细胞悬液。 无菌条件下，乙醚麻醉，取裸鼠左腹部切口进腹，显露脾脏，于脾脏上极以50ul微量注射器 缓慢进针，注入癌细胞悬液。用75%酒精纱布局部压迫并轻檫以杀灭可能存在的游离癌细 胞。脾脏置于原位并关腹。接种8周左右处死动物，观察癌细胞局部生长和肝转移情况。主要结果和结论1.成功制备和纯化了针对N-WASP和Cortactin功能的抑制性多肽A，Repeat以 及V+R印eat，并通过生物合成获得了 V和CA多肽。2.将多肽做了荧光标记并顺利导入大肠癌细胞。3.通过分子克隆方法构建了相应的5种重组表达质粒，并转导大肠癌细胞，筛选 获得稳定表达的大肠癌细胞。4.抑制性多肽处理的大肠癌细胞形成伪足减少、细胞迁移、侵袭和内吞作用能力 降低，其中针对cortactin功能的A，Repeat作用比较显著。融合性多肽V+R印eat作用最 为明显。5.转染重组质粒表达抑制性多肽的大肠癌细胞其迁移、内吞及侵袭能力也表现为 降低，结果与上述多肽导入的大肠癌细胞结果类似。6.建立了大肠癌肝转移模型并观察了接种重组质粒表达大肠癌细胞的肝转移形 成情况。结果发现，与对照组空载体转导细胞相比，转导抑制性分子的癌细胞形成转移减 少，其中V+R印eat片段表达细胞最为明显。7.基于以上研究结果，我们认为通过针对皮层肌动蛋白装配调控分子N-WASP和 cortactin的抑制性多肽可以对抗大肠癌细胞的肝转移形成，相应的采用重组DNA的体内 外抑制性实验结果支持上述结论。其中自行开发和合成的V+Repeat多肽作用最为明显，具 有抑制癌细胞侵袭转移的能力。
权利要求
一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用，其特征是所述骨架蛋白源性多肽为如下氨基酸序列的V+Repeat融合多肽NKAALL DQIREGAQLKKV GRDALLDQ IRQGIQLKSVSHGYGGKFGV EQDRMDKSAV GHEYQSKLSK HCSQVDSVRGFGGKFGVQMD RVDQSAVGFE YQGKTEKHAS QKDYSSGFGGKYGVQADRVD KSAVGFDYQG KTEKHESQRD YSKGFGGKYGIDKDKVDKSA VGFEYQGKTE KHESQKDYVK GFGGKFGVQTDRQDKCALGW DHQEKLQLHE SQKDYKTGFG GKFGVQSERQDSAAVGFDYK EKLAKHESQQ DYSKGFGGKY GVQKDRMDKNASTF。
全文摘要
本发明公开了一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用。本发明的V+Repeat融合性多肽对于大肠癌的侵袭转移的具有显著的抑制作用。
文档编号A61P1/00GK101850107SQ201010172510
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者朱建伟, 马利林 申请人:南通大学附属医院
技术领域：
本发明涉及一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用。
背景技术：
大肠癌等恶性肿瘤的侵袭和转移是一个多步骤的复杂过程，一般包括癌细胞的局 部增殖和扩展、分离和脱落、肿瘤组织新生血管形成、癌细胞进入循环、癌细胞降解脉管基 膜逸出循环及随后的定位生长等。然而，这一系列复杂步骤都离不开癌细胞自身的运动能 力。癌细胞的运动，包括细胞膜的伪足样伸展、膜流动性及细胞极性的变化等，是癌细胞侵 袭转移各步骤基本的共同的特征。癌细胞的运动的实现过程依赖皮层肌动蛋白的聚合和解 聚。Arp2/3复合物的激活介导此重要生化过程。Arp2/3的重要激活分子是以Cortactin和 N-WASP为代表的家族。两种蛋白的结构，尤其是和Arp2/3以及肌动蛋白单体结合的区域 (氨基酸序列)已经阐明。Cortactin的氨基端㈧以及随后的重复区域(R印eat)、N_WASP 的VCA区域，是激活Arp2/3必须的结构域。有研究表明，Cortactin和N-WASP与癌细胞的 侵袭转移有关，并在大肠癌组织中异常表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移 的药物中的应用。本发明的技术解决方案是一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用，其特征 是所述骨架蛋白源性多肽为如下氨基酸序列的V+R印eat融合多肽NKAALLDQIREGAQLKKVGRDALLDQIRQGIQLKSV
SHGYGGKFGVEQDRMDKSAVGHEYQSKLSKHCSQVDSVRG
FGGKFGVQMDRVDQSAVGFEYQGKTEKHASQKDYSSGFGG
KYGVQADRVDKSAVGFDYQGKTEKHESQRDYSKGFGGKYG
IDKDKVDKSAVGFEYQGKTEKHESQKDYVKGFGGKFGVQT
DRQDKCALGWDHQEKLQLHESQKDYKTGFGGKFGVQSERQ
DSAAVGFDYKEKLAKHESQQDYSKGFGGKYGVQKDRMDKN
ASTF。本发明的V+R印eat融合性多肽对于大肠癌的侵袭转移具有显著的抑制作用。下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施例方式一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用，所述骨架蛋白源性多肽为如下氨基酸系列的V+R印eat融合多肽
NKAALL
DQIREGAQLKKV GRDALLDQ IRQGIQLKSV
SHGYGGKFGV FGGKFGVQMD KYGVQADRVD IDKDKVDKSA DRQDKCALGW DSAAVGFDYK ASTF。 实验证据
1.多肽的设计和准备
EQDRMDKSAV RVDQSAVGFE KSAVGFDYQG VGFEYQGKTE DHQEKLQLHE EKLAKHESQQ
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权利要求
一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用，其特征是所述骨架蛋白源性多肽为如下氨基酸序列的V+Repeat融合多肽NKAALL DQIREGAQLKKV GRDALLDQ IRQGIQLKSVSHGYGGKFGV EQDRMDKSAV GHEYQSKLSK HCSQVDSVRGFGGKFGVQMD RVDQSAVGFE YQGKTEKHAS QKDYSSGFGGKYGVQADRVD KSAVGFDYQG KTEKHESQRD YSKGFGGKYGIDKDKVDKSA VGFEYQGKTE KHESQKDYVK GFGGKFGVQTDRQDKCALGW DHQEKLQLHE SQKDYKTGFG GKFGVQSERQDSAAVGFDYK EKLAKHESQQ DYSKGFGGKY GVQKDRMDKNASTF。
全文摘要
本发明公开了一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用。本发明的V+Repeat融合性多肽对于大肠癌的侵袭转移的具有显著的抑制作用。
文档编号A61P1/00GK101850107SQ201010172510
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者朱建伟, 马利林 申请人:南通大学附属医院
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