甘草及甘草提取物防治骨质疏松症的新用途的制作方法
专利名称：甘草及甘草提取物防治骨质疏松症的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药甘草及甘草提取物防治骨质疏松症的新用途。
骨质疏松症是老年医学的热门课题，随着世界人口的老化，患骨质疏松症的人群在逐年增多，据统计我国目前65岁以上的老年人已占1.2亿，而患有骨质疏松症的患者在这些人群中约占90％，因此，防治骨质疏松是抗衰老，延长寿命，保证人民的生活质量的一个十分迫切的研究课题。目前国内外对防治骨质疏松症尚未找到理想的新药，传统应用的雌激素、补钙和维生素D联合应用虽有一定的疗效，但仍存在较多的治疗学上的难题，为了解决这一难题，本课题组的成员一直在从天然药物中寻找抗骨质疏松的理想药物，希望能找到一种理想的抗骨质疏松的新药。
通过大量的动物实验研究和筛选，我们发现了中药豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)的干燥根及根茎以及其干燥根的提取物三萜类化合物甘草皂甙(甘草甜素glycyrrhizin或甘草酸glycyrrhizicacid)和甘草次酸(glycyrrhetinic acid)、黄酮类化合物甘草黄甙(liquiritin或称甘草黄碱酮)、异甘草黄甙(isoliquiritin)、甘草素(liquiriligenin)、异甘草素(iso-liquiriligenin)以及甘草多糖有较好的防治骨质疏松症的作用。深入的已经也证明了甘草及甘草的上述提取物具有明显的防治骨质疏松的作用，为人类解决骨质疏松提供了一个新的途径。
本发明的任务是用科学的工艺把甘草及其有效成份的提取物做成制剂，使该制剂用于人类防治骨质疏松症，该制剂既能阻止骨质的丢失，又能促进新骨的形成，为解决骨质疏松的难题提供新的用途。
解决这一任务的途径是这样实现的，选取豆科植物甘草(Glycyrrhizauralensis Fisch.)的干燥根及根茎，即中药称为甘草的药用部份，按传统的工艺加10倍水，分别水提三次，过滤，浓缩至含药量100％，作为甘草水提液用于研究，此外，按有关文献报道的方法，用甘草为原料，分别提纯出其有关的化学成分甘草皂甙(甘草酸)、甘草次酸、甘草黄甙、异甘草黄甙、甘草素、异甘草素以及甘草多糖，然后用本研究室建立的小白鼠骨质疏松模型和大白鼠骨质疏松模型进行给药研究，比较观察甘草水提液和这七个受试品抗骨质疏松的药效学功能。
结果如下甘草水提液和这七个受试品均有显著的预防实验动物骨质疏松的作用。其中甘草和甘草皂甙(甘草酸)预防动物骨质疏松的作用非常显著。甘草黄甙及甘草多糖作用次之，其他几个品种也有一定的疗效。
实施例甘草酸(Glycyrrhizin，GL)是中药甘草的有效成分，具有抗炎、抗过敏以及保肝护肝的作用[1，2]，近年来，已发现不仅原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者可发生骨质疏松症，其它原因的肝脏疾病也可引起[3，4]，因此，防治肝脏疾病所致的骨质疏松症日益受到重视[5，6]。本研究用小白鼠建立慢性肝纤维化的动物模型，探讨在慢性肝病中骨丢失的状况，并观察甘草酸护肝的同时，是否有减少骨丢失的作用。1 材料与方法1.1 动物 本院实验动物中心提供的普通级昆明种小白鼠40只，体重20-22g，♀♂各半，按体重对等原则随机分组。1.2 药物 四氯化碳(分析纯)购于广州化学试剂厂，批号为980402-25，实验时用纯正食用花生油配成40％四氯化碳花生油。
秋水仙碱 (colchicine，CL)德国进口分装，批号991010，购于上海医学试剂公司，用时配成0.01mg.ml-1水溶液。
甘草酸 蒙古甘草提取，10mg.ml-1，由广东医学院医药科技开发中心提供。1.3 仪器与试剂 WFX-1D原子吸收分光光度计(北京第二光学仪器厂生产)；梅特勒-托利多AE240电子天平(梅特勒-托利多仪器公司上海分公司)，LEICA QWIN图象分析仪(德国莱卡公司)，UV-3101PC扫描分光光度仪(日本岛津仪器设备公司株式会社)，天冬氨酸氨基转氨酶(AST/GOT)测试盒均购于南京建成生物工程研究所，丙氨酸氨基转移酶(ALT/GPT)测试盒购于宁波市慈城生化试剂厂，总蛋白(TP)液体试剂盒和白蛋白(Alb)试剂盒均购于北京中生生物工程高技术公司。1.4实验方法 取上述小鼠随机分为4组，每组10只，♀♂各半，分笼饲养，A组予N.S 10ml.kg-1皮下注射，首剂加倍，5d注射1次，连续5周，注射后予N.S 10ml.kg-1灌胃，qd，连续6周；B组，予40％四氯化碳花生油溶液按10ml.kg-1皮下注射，首剂加倍，5d注射1次，连续5周，注射后予N.S按10ml.kg-1灌胃，qd，连续6周；C组按B组同法给予CCl4后按0.01mg.kg-1予秋水仙溶液；D组，按B组同法注射CCl4后按100mg.kg-1予甘草酸溶液。在实验过程中每天观察各组小鼠进食、饮水、活动情况及皮毛变化，7d称体重1次，于第五周全部停用四氯化碳，继续给药1周，于末次给药后第二天分别摘眼球取血，分离血清作生化检查；取肝、肾、脾和胸腺称重，右股骨干燥后称重，酸溶解测定骨中微量元素和羟脯胺酸(Hyp)的含量；肝左叶用玻氏液固定，石蜡包埋，切片、HE及VG(Van Gieson)染色后作病查。1.5 观察指标及测定方法(1)对小白鼠一般情况及体重的观察。(2)按文献[7]测定骨羟脯氨酸的含量。(3)按文献[8]检测血清学指标，赖氏法测定ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)的活性，双缩尿法测定血清TB(总蛋白)及溴甲酚绿法测定血清Alb(白蛋白)含量。(4)取小鼠右侧股骨干燥后酸溶解，用原子吸收分光光度仪测定Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mg2+的含量。(5)按文献[9][10]观察肝组织大体及镜下病理改变，将肝脏病变分4级进行评价。(6)肝组织胶原纤维的相对量的判定VG胶原特殊染色，按文献用半定量方法判断胶原纤维增生程度[9]。1.6 统计学处理 实验数据采用X±S表示，组间差异性用t检验，差异的显著性分别用下述标志表示与A组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001，与B组比较ΔP＜0.05；ΔΔP＜0.01；ΔΔΔP＜0.001；＜0.01)半定量标准判断采用等级秩和检验。2 结果
2.1 小鼠慢性肝损伤后一般情况和体重变化 实验中仅B组2只小鼠死亡。各组小鼠的体重变化结果见表1，由表1可见，CCl4染毒一周后B、C、D三组动物的体重均比A组明显减轻(P＜0.05)，B组至第六周体重明显比A、C、D三组0.01mg.kg-1低(P＜0.05)，而C、D两组的体重并不比A组低(P＞0.05)，故认为两种药物对降低CCl4的毒性有一定的作用。
表1小鼠慢性肝损伤后各组小鼠的体重变化结果(X±S，n＝10)(g)Group Original First Second Third Forth Firth Sixthweight week week week weekweek weekA 19.4±1.4 24.2±1.829.5±4.9 31.7±5.1 32.±5.3 33.2±6.0 34.1±6.1B 20±1.6 22.3±1.9*26.9±4.7 27.9±3.4 30.±2.6 28.3±1.9 28.7±1.9*C 20±1.1 21.3±1.3*26.4±2.3 26.7±2.3 28.±2.8 30.3±4.1 33.7±3.5ΔD 20±1.0 19.8±2.0*26.4±2.5 27.4±3.0 30.±5.2 31.8±4.1 33.4±5.4Δ2.2 甘草酸对CCl4小鼠肝损伤后肝脏重量指数和血清生化指标的影响 B组小鼠肝脏重量指数(LW＝肝脏重量/体重*10)比A组增加了76.2％，差异具有显著性(P＜0.001)，；C组的LW比A组大，但明显比B组轻(P＜0.05)，D组LW与A组相比无差异(P＞0.05)，却比B组轻32.4％(P＜0.01)。血清指标结果显示B组小鼠的血清AST、ALT比A组明显上升(P＜0.01)，C、D两组肝酶亦升高，但比B组低(P＜0.01)，其中D组的ALT比C组低(P＜0.05)；B组的白蛋白比A组低(P＜0.01)，亦比C、D两组低(P＜0.01)，A/G值也比C、D组低(P＜0.05)，各项结果见表2；Tab 2甘草酸对CCl4小鼠肝损伤后肝脏重量指数和血清生化指标的影响(X±S，n＝10)Group LW(g/g) ALT(IU) AST(IU) TP(g/l)Alb(g/1) A/GA0.42±0.07 54.0±12.6 82.2±16.0 51.4±5.8 24.9±2.7 1.05±0.42B0.74±0.08***111±16.3***98.2±11.2**65.0±9.08**17.13±3.01**0.37±0.09**C0.52±0.13*Δ76.0±9.28*ΔΔ90.1±19.1Δ53.2±11.7 22.0±1.21ΔΔ0.80±0.29ΔD0.50±0.07ΔΔ65.0±5.01*ΔΔ#79.9±16.8Δ64.6±8.77**22.6±1.92ΔΔ0.56±0.13*Δ
#P＜0.05 vs group C2.3 甘草酸对CCl4小鼠肝脏病理改变的的影响 肉眼观察A组小鼠肝脏呈红褐色，表面光滑，质软；B组明显肿胀，色苍黄，质硬；C组部分肝脏稍肿大，呈黄褐色，表面尚光滑；D组大体与C组相似。HE染色可见A组镜下结构正常(见A)，B组肝脏的正常结构被破坏，肝小叶排列紊乱，肝细胞大片变性、坏死，呈桥接状，汇管区大量淋巴细胞浸润，中央静脉偏位或缺如(见B)，与A组比较有显著差异(P＜0.001)。C组镜下可见肝组织结构较完整，肝细胞变性、坏死情况较轻(见C)，与B组比较有显著差异(P＜0.01)，D小鼠病变明显比B组要轻，镜下结构与C组接近(P＞0.05)(见D)；VG染色可见A组肝脏无纤维组织增生(见A-1)，B组肝组织汇管区和肝实质内有较多的胶原纤维增生，向肝实质内延伸包绕，分割肝实质，纤维化率达到100％，(见B-1)，C组小鼠肝组织的胶原纤维增生程度较B组轻(见C-1)，与B组的差异具有显著意义(P＜0.01)，D组仅在汇管区周围可见少量纤维组织，未向肝实质内延伸，增生程度明显比B组轻(P＜0.01)(见D-1)。各组小鼠肝组织HE染色光镜下表现见表3，VG染色肝组织纤维化程度见表4。
表3甘草酸对CCl4小鼠肝组织HE染色光镜下肝脏病理改变的的影响(n＝10)Group Degeneration Necrosis- +++ +++ - + ++ +++A9 10 0 10 0 0 0B0 00 80 0 1 7C0 04 60 0 7 3D0 05 50 2 6 2group B vs group A，P＜0.001，group B vs group C and vs groupb D，P＜0.01，groupb D vs group C，P＞0.05.
表3甘草酸对CCl4小鼠肝组织VG染色肝组织纤维化病理改变的影响(n＝10)GroupCollagenous Fiber- + ++ +++A 10 0 00B0 0 17C0 0 73D0 0 82group B vs group A，P＜0.001，group B vs group C and vs groupb D，P＜0.01，groupb D vs group C，P＞0.05.2.4 甘草酸对CCl4小鼠骨质的影响 从表5可见，B组的右股骨干重比A组减轻(P＜0.05)，骨钙和骨羟脯氨酸的含量显著下降(P＜0.01)；单位骨钙(钙量/骨重)变化不大而单位骨羟脯氨酸下降(P＜0.01)。C、D两组的骨钙含量低于A组(P＜0.05)，但比B组高(P＜0.05)，而骨羟脯氨酸含量与A组无显著性差异(P＞0.05)；D组骨干重不比A组轻而比C组重(P＜0.05)，说明甘草酸对CCl4染毒小鼠骨丢失有较佳的防治作用；B组单位骨钙不比A组少，提示慢性肝损伤导致骨丢失可能以骨的有机质丢失为主。
表5甘草酸对CCl4小鼠骨重量、骨钙、骨骨羟脯氨酸的含量的影响(X±S，n＝10)GroupBW(mg) Ca2+(mg) Ca2+/骨重(mg/g) Hyp(mg) Hyp/骨重(mg/g)A 51.2±8.42 4.06±0.54 80.8±14.8 2.7±0.72 54.2±17.9B 37.2±7.04**2.70±0.51**73.1±10.5 0.80±0.43**22.5±13.2**C 47.1±2.80**3.36±0.20*71.3±3.22.25±0.48ΔΔ48.3±11.7ΔD 51.1±7.44ΔΔ#3.32±0.37*65.6±5.5*3.5±0.81ΔΔ69.1±16.5ΔΔ2.5 甘草酸对CCl4小鼠骨微量元素含量的影响 B组右股骨单位骨重Cu2+、Mg2+和Zn2+的含量均比A组高(P＜0.01)，C组也高(P＜0.05)，而D组的含量与A组无显著性差异(P＞0.05)，但比B组低，(P＜0.05)；B、C、D三组右股骨的单位骨Fe2+的含量均比A组减少，但无显著性(P＞0.05)，而B组值较高，考虑与B组的骨重明显减少有关。表6显示甘草酸可有效防止铜、锌、镁在体内的蓄积，但并不能增加CCl4染毒小鼠单位骨中的铁含量。
表6甘草酸对CCl4小鼠骨微量元素含量的影响 (X±S，n＝10)Group Cu2+(mg/g) Zn2+(mg/g) Mg2+(mg/g) Fe2+(mg/g)A 1.02±0.36 2.23±1.51 6.00±0.960.90±0.56B 1.99±0.59**4.46±2.15**9.07±2.57**0.80±0.66C 1.27±0.38*Δ4.35±3.60*6.34±1.73*0.73±0.49D 1.11±0.24Δ2.41±0.98Δ5.82±0.99Δ0.74±0.243 讨论本实验用40％四氯化碳花生油对小白鼠行皮下注射，5天一次，连用五周。结果显示B组小鼠血清转氨酶明显增高，白蛋白显著下降，肝脏病理切片显示典型的肝纤维化表现，故本实验用四氯化碳染毒小鼠造成肝损伤后肝纤维化的实验动物模型是成功的。
在肝慢性损伤所致的肝纤维化模型中，我们已经发现小鼠的骨质丢失明显，本实验中，B组小鼠的右股骨干重、Ca2+总量显著下降，骨中羟脯氨酸的含量也明显下降，提示肝损伤后骨重显著减少、骨的有机质和无机质都明显丢失，注意到小鼠在骨丢失的同时，血清白蛋白显著下降，考虑这种骨丢失可能与肝脏合成蛋白障碍，导致某些促进骨合成的因子减少有关。本研究同时观察到肝损伤小鼠的骨铜、骨镁、骨锌的含量有不同程度的增加。铜是骨基质中赖氨酰氧化酶的辅助因子，该酶有促进骨胶原分子内交联形成、稳定胶原结构的功能[11]，文献曾报导铜过量可引起肾损害导致骨钙大量丢失，并可形成骨质疏松[12]，亦有报道铜可通过抑制成骨细胞和破骨细胞的功能，降低骨的转换率[13]，过量的铜可引起成骨细胞和间叶细胞的严重损害而引起骨组织的萎缩[14]，据此推断肝损伤后小鼠骨丢失可能与骨铜的增加有关。镁和骨代谢的作用也十分密切，有报导口服镁剂可抑制成年人的骨转换[15]，也有文献报告镁缺乏可通过增加破骨细胞的活性而导致骨质疏松，其机制不清[16]，我们考虑这可能与镁阻止非结晶钙磷酸盐转变成羟基磷灰石有关。骨铜和骨镁的增高在慢性肝病中对骨代谢的影响是一个值得深入探讨的问题。
秋水仙碱是经典的抗肝纤维化的药物，研究表明，四氯化碳染毒的小白鼠同时灌服秋水仙后，体重增加了17％，小鼠血清的谷丙转氨酶的含量显著下降了32％，血清白蛋白含量增加了42％，A/G比值增高87％，病检也证明肝脏细胞变性、坏死和肝纤维化程度均有明显减轻，提示了秋水仙对肝纤维化有一定的预防作用，另一方面，C组的骨钙和骨羟脯胺酸有一定程度的增加，骨铜也下降(P＜0.05)，这可能与秋水仙碱保肝降酶有关。
甘草属豆科植物(Glycyrrhiza Ura Lensis Fisch)，可消热解毒，缓解药物的毒性和烈性。甘草酸(glycyrrhinic acid C42H6O16)是甘草的有效成分，已有文献报道甘草酸可强烈抑制游离基和过氧化脂质的生成以及抑制Ca2+内流引起肝细胞损害[17]。本实验发现甘草酸100mg.kg-1灌胃可使四氯化碳染毒小白鼠的血清谷丙转氨酶下降41％、血浆白蛋白升高了32％，A/G值也显著提高，我们还从肝病理学角度上肯定了其抗肝纤维化的作用；另一方面，四氯化碳造成慢性肝损伤可使小鼠股骨骨钙总量和骨羟脯氨酸含量同时减少，尤以骨羟脯氨酸明显(骨钙总量下降34％，骨羟脯氨酸含量下降70％，P＜0.01)。骨羟脯氨酸主要由成骨细胞合成与分泌，因此，四氯化碳可能是通过抑制成骨细胞使其合成和分泌骨胶原减少，从而减少钙质的沉积[18]而导致骨丢失。骨钙是构成骨矿物质的重要成分，骨羟脯氨酸是骨胶原特有的氨基酸，其减少是骨基质减少的主要标志。而甘草酸灌胃后可使四氯化碳小鼠的体重增加16％(P＜0.05′)，骨重增加37％(P＜0.01)，骨钙增加23％，骨羟脯氨酸增加3倍多，说明甘草酸可明显促进成骨细胞的生长和增强其分泌功能，从而防止骨丢失的丢失；另外，我们也发现甘草酸可以使小鼠股骨的单位骨铜和骨镁的含量分别下降了44％和36％(P＜0.05)，因此考虑甘草酸防治肝纤维化所致的骨丢失的作用机制可能通过①诱导肝药酶，增强肝脏解毒作用，加速毒物的排泄和代谢，②保护肝脏，维持蛋白代谢水平。③维持骨的正常的代谢，促进骨钙和骨羟脯氨酸以及骨微量元素的平衡，④促进成骨细胞的功能，增加骨的合成这四方面的作用而实现的。
参考文献1 Tiegs G，Experimental hepatitis and role of cytokines. ActaGastroenterol-Belg，1997Gastroenterol60(2)176-92《全国中草药汇编》编写组。《全国中草药汇编》上册。北京人民卫生出版社，1986237-2393 Vleggaar FP，van Buuren HR，Wolfhagen FH，et al. Prevention andtreatment of osteoporosis in primary biliary cirrhosis. Eur JGastroenterol Hepatol，1999，11(6)617-214 Gonzalez Sanz-Agero P，Munoz Nunez F，Erdozain Sosa JC，et al.Bone metabolism in non-cholestatic chronic hepatopathy. Med Clin(Barc)1998，CL(12)446-505 Olsson R，Mattsson LA，Obrant K，et al.Estrogen-progestogentherapy for low bone mineral density in primary biliary cirrhosis.Liver，1999，19(3)188-926 Shiomi S，Masaki K，Habu D，et al.Calcitriol for bone disease inpatients with cirrhosis of the liver.J Gastroenterol Hepatol，1999，14(6)547-527 张均田主编.现代药理实验方法.北京北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，199813998 王霞义主编.临床生化检验技术.南京南京大学出版社，1995180-182；185-188；279-2849 杨玉林，贺志安主编.肝脏疾病实验诊断.北京中国医药科技出版社，19963bb10 武忠弼主编.病理学.北京人民卫生出版社，1996289-9211 Yee CD，Kubena KS，Walker M，et al.The relationship ofnutritional copper to the deve lopment of postmenopausal osteoporosisin rats. Biol Trace Elem Res，1995，48(1)1-1112 Walshe JM. Coppernot too little，not too much，but just right.LondonJ R Coll Physicians Land，1995.29(4)280-813 Okano T. Effects of essentiai trace elements on bone turnoverin relation to the osteoporosis. Nippon Rinsho，1996，54(1)148-5414 Kozuka H. Interactive exhibition of heavy metal toxicity in bonemetabolism from the viewpoint of deductive toxicology. YakugakuZasshi 1995，115(3)157-6915 Dimai HP，Porta S，Wirnsberger G，et al.Daily oral magnesiumsupplementation suppresses bone turnover in young adult males.J ClinEndocrinol Metab 1998，83(8)2742-816 Rude RK，Kirchen ME，Gruber HE，et al.Magnesiumdeficiency-induced osteoporosis in the ratuncoupling of boneformation and bone resumption. Magnes Res 1999，12(4)257-6717 阴健主编.《中药现代研究与临床应用》.北京学苑出版社1993196-20318 刘忠厚主编.骨质疏松学.北京科学出版社，19983权利要求
1.甘草及甘草提取物在制备用于防治骨质疏松症的制剂中的应用。
2.甘草提取物甘草酸在制备用于防治骨质疏松症的制剂中的应用。
3.甘草提取物甘草黄甙、异甘草黄甙在制备用于防治骨质疏松症的制剂中的应用。
4.甘草提取物甘草多糖在制备用于防治骨质疏松症的制剂中的应用。
5.甘草提取物甘草素、异甘草素在制备用于防治骨质疏松症的制剂中的应用。
6.甘草提取物甘草次酸在制备用于防治骨质疏松症的制剂中的应用。
7.甘草提取物甘草酸和钙剂组成的复方制剂在制备用于防治骨质疏松症的制剂中的应用。
8甘草提取物甘草酸和葡萄糖酸钙组成的复方制剂在制备用于防治骨质疏松症的制剂中的应用。
9.如权利要求书1所述的甘草提取物，其特征是该成份含有甘草的干燥根的提取物三萜类化合物甘草皂甙(甘草甜素glycyrrhizin或甘草酸glycyrrhizic acid)和甘草次酸(glycyrrhetinic acid)、黄酮类化合物甘草黄甙(liquiritin或称甘草黄碱酮)、异甘草黄甙(isoliquiritin)、甘草素(liquiriligenin)、异甘草素(iso-liquiriligenin)以及甘草多糖。
全文摘要
本发明公开了甘草及甘草提取物防治骨质疏松的新用途，通过动物实验研究和筛选，我们发现了中药豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)的干燥根及根茎以及其干燥根的提取物三萜类化合物甘草皂甙(甘草甜素glycyrrhizin或甘草酸glycyrrhizic acid)和甘草次酸(glycyrrhetinic acid)、黄酮类化合物甘草黄甙(liquiritin或称甘草黄碱酮)、异甘草黄甙(isoliquiritin)、甘草素(liquiriligenin)、异甘草素(iso－liquiriligenin)以及甘草多糖有较好的防治骨质疏松症的作用。本发明对甘草及上述提取物用于防治人类骨质疏松症的新用途提出了新的思路。
文档编号A61P19/10GK1446549SQ0210818
公开日2003年10月8日 申请日期2002年3月25日 优先权日2002年3月25日
发明者吴铁, 邹丽宜, 崔燎, 陈方, 刘晓青, 刘钰瑜 申请人:广东医学院医药科技开发中心
技术领域：
本发明涉及中药甘草及甘草提取物防治骨质疏松症的新用途。
骨质疏松症是老年医学的热门课题，随着世界人口的老化，患骨质疏松症的人群在逐年增多，据统计我国目前65岁以上的老年人已占1.2亿，而患有骨质疏松症的患者在这些人群中约占90％，因此，防治骨质疏松是抗衰老，延长寿命，保证人民的生活质量的一个十分迫切的研究课题。目前国内外对防治骨质疏松症尚未找到理想的新药，传统应用的雌激素、补钙和维生素D联合应用虽有一定的疗效，但仍存在较多的治疗学上的难题，为了解决这一难题，本课题组的成员一直在从天然药物中寻找抗骨质疏松的理想药物，希望能找到一种理想的抗骨质疏松的新药。
通过大量的动物实验研究和筛选，我们发现了中药豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)的干燥根及根茎以及其干燥根的提取物三萜类化合物甘草皂甙(甘草甜素glycyrrhizin或甘草酸glycyrrhizicacid)和甘草次酸(glycyrrhetinic acid)、黄酮类化合物甘草黄甙(liquiritin或称甘草黄碱酮)、异甘草黄甙(isoliquiritin)、甘草素(liquiriligenin)、异甘草素(iso-liquiriligenin)以及甘草多糖有较好的防治骨质疏松症的作用。深入的已经也证明了甘草及甘草的上述提取物具有明显的防治骨质疏松的作用，为人类解决骨质疏松提供了一个新的途径。
本发明的任务是用科学的工艺把甘草及其有效成份的提取物做成制剂，使该制剂用于人类防治骨质疏松症，该制剂既能阻止骨质的丢失，又能促进新骨的形成，为解决骨质疏松的难题提供新的用途。
解决这一任务的途径是这样实现的，选取豆科植物甘草(Glycyrrhizauralensis Fisch.)的干燥根及根茎，即中药称为甘草的药用部份，按传统的工艺加10倍水，分别水提三次，过滤，浓缩至含药量100％，作为甘草水提液用于研究，此外，按有关文献报道的方法，用甘草为原料，分别提纯出其有关的化学成分甘草皂甙(甘草酸)、甘草次酸、甘草黄甙、异甘草黄甙、甘草素、异甘草素以及甘草多糖，然后用本研究室建立的小白鼠骨质疏松模型和大白鼠骨质疏松模型进行给药研究，比较观察甘草水提液和这七个受试品抗骨质疏松的药效学功能。
结果如下甘草水提液和这七个受试品均有显著的预防实验动物骨质疏松的作用。其中甘草和甘草皂甙(甘草酸)预防动物骨质疏松的作用非常显著。甘草黄甙及甘草多糖作用次之，其他几个品种也有一定的疗效。
实施例甘草酸(Glycyrrhizin，GL)是中药甘草的有效成分，具有抗炎、抗过敏以及保肝护肝的作用[1，2]，近年来，已发现不仅原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者可发生骨质疏松症，其它原因的肝脏疾病也可引起[3，4]，因此，防治肝脏疾病所致的骨质疏松症日益受到重视[5，6]。本研究用小白鼠建立慢性肝纤维化的动物模型，探讨在慢性肝病中骨丢失的状况，并观察甘草酸护肝的同时，是否有减少骨丢失的作用。1 材料与方法1.1 动物 本院实验动物中心提供的普通级昆明种小白鼠40只，体重20-22g，♀♂各半，按体重对等原则随机分组。1.2 药物 四氯化碳(分析纯)购于广州化学试剂厂，批号为980402-25，实验时用纯正食用花生油配成40％四氯化碳花生油。
秋水仙碱 (colchicine，CL)德国进口分装，批号991010，购于上海医学试剂公司，用时配成0.01mg.ml-1水溶液。
甘草酸 蒙古甘草提取，10mg.ml-1，由广东医学院医药科技开发中心提供。1.3 仪器与试剂 WFX-1D原子吸收分光光度计(北京第二光学仪器厂生产)；梅特勒-托利多AE240电子天平(梅特勒-托利多仪器公司上海分公司)，LEICA QWIN图象分析仪(德国莱卡公司)，UV-3101PC扫描分光光度仪(日本岛津仪器设备公司株式会社)，天冬氨酸氨基转氨酶(AST/GOT)测试盒均购于南京建成生物工程研究所，丙氨酸氨基转移酶(ALT/GPT)测试盒购于宁波市慈城生化试剂厂，总蛋白(TP)液体试剂盒和白蛋白(Alb)试剂盒均购于北京中生生物工程高技术公司。1.4实验方法 取上述小鼠随机分为4组，每组10只，♀♂各半，分笼饲养，A组予N.S 10ml.kg-1皮下注射，首剂加倍，5d注射1次，连续5周，注射后予N.S 10ml.kg-1灌胃，qd，连续6周；B组，予40％四氯化碳花生油溶液按10ml.kg-1皮下注射，首剂加倍，5d注射1次，连续5周，注射后予N.S按10ml.kg-1灌胃，qd，连续6周；C组按B组同法给予CCl4后按0.01mg.kg-1予秋水仙溶液；D组，按B组同法注射CCl4后按100mg.kg-1予甘草酸溶液。在实验过程中每天观察各组小鼠进食、饮水、活动情况及皮毛变化，7d称体重1次，于第五周全部停用四氯化碳，继续给药1周，于末次给药后第二天分别摘眼球取血，分离血清作生化检查；取肝、肾、脾和胸腺称重，右股骨干燥后称重，酸溶解测定骨中微量元素和羟脯胺酸(Hyp)的含量；肝左叶用玻氏液固定，石蜡包埋，切片、HE及VG(Van Gieson)染色后作病查。1.5 观察指标及测定方法(1)对小白鼠一般情况及体重的观察。(2)按文献[7]测定骨羟脯氨酸的含量。(3)按文献[8]检测血清学指标，赖氏法测定ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)的活性，双缩尿法测定血清TB(总蛋白)及溴甲酚绿法测定血清Alb(白蛋白)含量。(4)取小鼠右侧股骨干燥后酸溶解，用原子吸收分光光度仪测定Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mg2+的含量。(5)按文献[9][10]观察肝组织大体及镜下病理改变，将肝脏病变分4级进行评价。(6)肝组织胶原纤维的相对量的判定VG胶原特殊染色，按文献用半定量方法判断胶原纤维增生程度[9]。1.6 统计学处理 实验数据采用X±S表示，组间差异性用t检验，差异的显著性分别用下述标志表示与A组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001，与B组比较ΔP＜0.05；ΔΔP＜0.01；ΔΔΔP＜0.001；＜0.01)半定量标准判断采用等级秩和检验。2 结果
2.1 小鼠慢性肝损伤后一般情况和体重变化 实验中仅B组2只小鼠死亡。各组小鼠的体重变化结果见表1，由表1可见，CCl4染毒一周后B、C、D三组动物的体重均比A组明显减轻(P＜0.05)，B组至第六周体重明显比A、C、D三组0.01mg.kg-1低(P＜0.05)，而C、D两组的体重并不比A组低(P＞0.05)，故认为两种药物对降低CCl4的毒性有一定的作用。
表1小鼠慢性肝损伤后各组小鼠的体重变化结果(X±S，n＝10)(g)Group Original First Second Third Forth Firth Sixthweight week week week weekweek weekA 19.4±1.4 24.2±1.829.5±4.9 31.7±5.1 32.±5.3 33.2±6.0 34.1±6.1B 20±1.6 22.3±1.9*26.9±4.7 27.9±3.4 30.±2.6 28.3±1.9 28.7±1.9*C 20±1.1 21.3±1.3*26.4±2.3 26.7±2.3 28.±2.8 30.3±4.1 33.7±3.5ΔD 20±1.0 19.8±2.0*26.4±2.5 27.4±3.0 30.±5.2 31.8±4.1 33.4±5.4Δ2.2 甘草酸对CCl4小鼠肝损伤后肝脏重量指数和血清生化指标的影响 B组小鼠肝脏重量指数(LW＝肝脏重量/体重*10)比A组增加了76.2％，差异具有显著性(P＜0.001)，；C组的LW比A组大，但明显比B组轻(P＜0.05)，D组LW与A组相比无差异(P＞0.05)，却比B组轻32.4％(P＜0.01)。血清指标结果显示B组小鼠的血清AST、ALT比A组明显上升(P＜0.01)，C、D两组肝酶亦升高，但比B组低(P＜0.01)，其中D组的ALT比C组低(P＜0.05)；B组的白蛋白比A组低(P＜0.01)，亦比C、D两组低(P＜0.01)，A/G值也比C、D组低(P＜0.05)，各项结果见表2；Tab 2甘草酸对CCl4小鼠肝损伤后肝脏重量指数和血清生化指标的影响(X±S，n＝10)Group LW(g/g) ALT(IU) AST(IU) TP(g/l)Alb(g/1) A/GA0.42±0.07 54.0±12.6 82.2±16.0 51.4±5.8 24.9±2.7 1.05±0.42B0.74±0.08***111±16.3***98.2±11.2**65.0±9.08**17.13±3.01**0.37±0.09**C0.52±0.13*Δ76.0±9.28*ΔΔ90.1±19.1Δ53.2±11.7 22.0±1.21ΔΔ0.80±0.29ΔD0.50±0.07ΔΔ65.0±5.01*ΔΔ#79.9±16.8Δ64.6±8.77**22.6±1.92ΔΔ0.56±0.13*Δ
#P＜0.05 vs group C2.3 甘草酸对CCl4小鼠肝脏病理改变的的影响 肉眼观察A组小鼠肝脏呈红褐色，表面光滑，质软；B组明显肿胀，色苍黄，质硬；C组部分肝脏稍肿大，呈黄褐色，表面尚光滑；D组大体与C组相似。HE染色可见A组镜下结构正常(见A)，B组肝脏的正常结构被破坏，肝小叶排列紊乱，肝细胞大片变性、坏死，呈桥接状，汇管区大量淋巴细胞浸润，中央静脉偏位或缺如(见B)，与A组比较有显著差异(P＜0.001)。C组镜下可见肝组织结构较完整，肝细胞变性、坏死情况较轻(见C)，与B组比较有显著差异(P＜0.01)，D小鼠病变明显比B组要轻，镜下结构与C组接近(P＞0.05)(见D)；VG染色可见A组肝脏无纤维组织增生(见A-1)，B组肝组织汇管区和肝实质内有较多的胶原纤维增生，向肝实质内延伸包绕，分割肝实质，纤维化率达到100％，(见B-1)，C组小鼠肝组织的胶原纤维增生程度较B组轻(见C-1)，与B组的差异具有显著意义(P＜0.01)，D组仅在汇管区周围可见少量纤维组织，未向肝实质内延伸，增生程度明显比B组轻(P＜0.01)(见D-1)。各组小鼠肝组织HE染色光镜下表现见表3，VG染色肝组织纤维化程度见表4。
表3甘草酸对CCl4小鼠肝组织HE染色光镜下肝脏病理改变的的影响(n＝10)Group Degeneration Necrosis- +++ +++ - + ++ +++A9 10 0 10 0 0 0B0 00 80 0 1 7C0 04 60 0 7 3D0 05 50 2 6 2group B vs group A，P＜0.001，group B vs group C and vs groupb D，P＜0.01，groupb D vs group C，P＞0.05.
表3甘草酸对CCl4小鼠肝组织VG染色肝组织纤维化病理改变的影响(n＝10)GroupCollagenous Fiber- + ++ +++A 10 0 00B0 0 17C0 0 73D0 0 82group B vs group A，P＜0.001，group B vs group C and vs groupb D，P＜0.01，groupb D vs group C，P＞0.05.2.4 甘草酸对CCl4小鼠骨质的影响 从表5可见，B组的右股骨干重比A组减轻(P＜0.05)，骨钙和骨羟脯氨酸的含量显著下降(P＜0.01)；单位骨钙(钙量/骨重)变化不大而单位骨羟脯氨酸下降(P＜0.01)。C、D两组的骨钙含量低于A组(P＜0.05)，但比B组高(P＜0.05)，而骨羟脯氨酸含量与A组无显著性差异(P＞0.05)；D组骨干重不比A组轻而比C组重(P＜0.05)，说明甘草酸对CCl4染毒小鼠骨丢失有较佳的防治作用；B组单位骨钙不比A组少，提示慢性肝损伤导致骨丢失可能以骨的有机质丢失为主。
表5甘草酸对CCl4小鼠骨重量、骨钙、骨骨羟脯氨酸的含量的影响(X±S，n＝10)GroupBW(mg) Ca2+(mg) Ca2+/骨重(mg/g) Hyp(mg) Hyp/骨重(mg/g)A 51.2±8.42 4.06±0.54 80.8±14.8 2.7±0.72 54.2±17.9B 37.2±7.04**2.70±0.51**73.1±10.5 0.80±0.43**22.5±13.2**C 47.1±2.80**3.36±0.20*71.3±3.22.25±0.48ΔΔ48.3±11.7ΔD 51.1±7.44ΔΔ#3.32±0.37*65.6±5.5*3.5±0.81ΔΔ69.1±16.5ΔΔ2.5 甘草酸对CCl4小鼠骨微量元素含量的影响 B组右股骨单位骨重Cu2+、Mg2+和Zn2+的含量均比A组高(P＜0.01)，C组也高(P＜0.05)，而D组的含量与A组无显著性差异(P＞0.05)，但比B组低，(P＜0.05)；B、C、D三组右股骨的单位骨Fe2+的含量均比A组减少，但无显著性(P＞0.05)，而B组值较高，考虑与B组的骨重明显减少有关。表6显示甘草酸可有效防止铜、锌、镁在体内的蓄积，但并不能增加CCl4染毒小鼠单位骨中的铁含量。
表6甘草酸对CCl4小鼠骨微量元素含量的影响 (X±S，n＝10)Group Cu2+(mg/g) Zn2+(mg/g) Mg2+(mg/g) Fe2+(mg/g)A 1.02±0.36 2.23±1.51 6.00±0.960.90±0.56B 1.99±0.59**4.46±2.15**9.07±2.57**0.80±0.66C 1.27±0.38*Δ4.35±3.60*6.34±1.73*0.73±0.49D 1.11±0.24Δ2.41±0.98Δ5.82±0.99Δ0.74±0.243 讨论本实验用40％四氯化碳花生油对小白鼠行皮下注射，5天一次，连用五周。结果显示B组小鼠血清转氨酶明显增高，白蛋白显著下降，肝脏病理切片显示典型的肝纤维化表现，故本实验用四氯化碳染毒小鼠造成肝损伤后肝纤维化的实验动物模型是成功的。
在肝慢性损伤所致的肝纤维化模型中，我们已经发现小鼠的骨质丢失明显，本实验中，B组小鼠的右股骨干重、Ca2+总量显著下降，骨中羟脯氨酸的含量也明显下降，提示肝损伤后骨重显著减少、骨的有机质和无机质都明显丢失，注意到小鼠在骨丢失的同时，血清白蛋白显著下降，考虑这种骨丢失可能与肝脏合成蛋白障碍，导致某些促进骨合成的因子减少有关。本研究同时观察到肝损伤小鼠的骨铜、骨镁、骨锌的含量有不同程度的增加。铜是骨基质中赖氨酰氧化酶的辅助因子，该酶有促进骨胶原分子内交联形成、稳定胶原结构的功能[11]，文献曾报导铜过量可引起肾损害导致骨钙大量丢失，并可形成骨质疏松[12]，亦有报道铜可通过抑制成骨细胞和破骨细胞的功能，降低骨的转换率[13]，过量的铜可引起成骨细胞和间叶细胞的严重损害而引起骨组织的萎缩[14]，据此推断肝损伤后小鼠骨丢失可能与骨铜的增加有关。镁和骨代谢的作用也十分密切，有报导口服镁剂可抑制成年人的骨转换[15]，也有文献报告镁缺乏可通过增加破骨细胞的活性而导致骨质疏松，其机制不清[16]，我们考虑这可能与镁阻止非结晶钙磷酸盐转变成羟基磷灰石有关。骨铜和骨镁的增高在慢性肝病中对骨代谢的影响是一个值得深入探讨的问题。
秋水仙碱是经典的抗肝纤维化的药物，研究表明，四氯化碳染毒的小白鼠同时灌服秋水仙后，体重增加了17％，小鼠血清的谷丙转氨酶的含量显著下降了32％，血清白蛋白含量增加了42％，A/G比值增高87％，病检也证明肝脏细胞变性、坏死和肝纤维化程度均有明显减轻，提示了秋水仙对肝纤维化有一定的预防作用，另一方面，C组的骨钙和骨羟脯胺酸有一定程度的增加，骨铜也下降(P＜0.05)，这可能与秋水仙碱保肝降酶有关。
甘草属豆科植物(Glycyrrhiza Ura Lensis Fisch)，可消热解毒，缓解药物的毒性和烈性。甘草酸(glycyrrhinic acid C42H6O16)是甘草的有效成分，已有文献报道甘草酸可强烈抑制游离基和过氧化脂质的生成以及抑制Ca2+内流引起肝细胞损害[17]。本实验发现甘草酸100mg.kg-1灌胃可使四氯化碳染毒小白鼠的血清谷丙转氨酶下降41％、血浆白蛋白升高了32％，A/G值也显著提高，我们还从肝病理学角度上肯定了其抗肝纤维化的作用；另一方面，四氯化碳造成慢性肝损伤可使小鼠股骨骨钙总量和骨羟脯氨酸含量同时减少，尤以骨羟脯氨酸明显(骨钙总量下降34％，骨羟脯氨酸含量下降70％，P＜0.01)。骨羟脯氨酸主要由成骨细胞合成与分泌，因此，四氯化碳可能是通过抑制成骨细胞使其合成和分泌骨胶原减少，从而减少钙质的沉积[18]而导致骨丢失。骨钙是构成骨矿物质的重要成分，骨羟脯氨酸是骨胶原特有的氨基酸，其减少是骨基质减少的主要标志。而甘草酸灌胃后可使四氯化碳小鼠的体重增加16％(P＜0.05′)，骨重增加37％(P＜0.01)，骨钙增加23％，骨羟脯氨酸增加3倍多，说明甘草酸可明显促进成骨细胞的生长和增强其分泌功能，从而防止骨丢失的丢失；另外，我们也发现甘草酸可以使小鼠股骨的单位骨铜和骨镁的含量分别下降了44％和36％(P＜0.05)，因此考虑甘草酸防治肝纤维化所致的骨丢失的作用机制可能通过①诱导肝药酶，增强肝脏解毒作用，加速毒物的排泄和代谢，②保护肝脏，维持蛋白代谢水平。③维持骨的正常的代谢，促进骨钙和骨羟脯氨酸以及骨微量元素的平衡，④促进成骨细胞的功能，增加骨的合成这四方面的作用而实现的。
参考文献1 Tiegs G，Experimental hepatitis and role of cytokines. ActaGastroenterol-Belg，1997Gastroenterol60(2)176-92《全国中草药汇编》编写组。《全国中草药汇编》上册。北京人民卫生出版社，1986237-2393 Vleggaar FP，van Buuren HR，Wolfhagen FH，et al. Prevention andtreatment of osteoporosis in primary biliary cirrhosis. Eur JGastroenterol Hepatol，1999，11(6)617-214 Gonzalez Sanz-Agero P，Munoz Nunez F，Erdozain Sosa JC，et al.Bone metabolism in non-cholestatic chronic hepatopathy. Med Clin(Barc)1998，CL(12)446-505 Olsson R，Mattsson LA，Obrant K，et al.Estrogen-progestogentherapy for low bone mineral density in primary biliary cirrhosis.Liver，1999，19(3)188-926 Shiomi S，Masaki K，Habu D，et al.Calcitriol for bone disease inpatients with cirrhosis of the liver.J Gastroenterol Hepatol，1999，14(6)547-527 张均田主编.现代药理实验方法.北京北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，199813998 王霞义主编.临床生化检验技术.南京南京大学出版社，1995180-182；185-188；279-2849 杨玉林，贺志安主编.肝脏疾病实验诊断.北京中国医药科技出版社，19963bb10 武忠弼主编.病理学.北京人民卫生出版社，1996289-9211 Yee CD，Kubena KS，Walker M，et al.The relationship ofnutritional copper to the deve lopment of postmenopausal osteoporosisin rats. Biol Trace Elem Res，1995，48(1)1-1112 Walshe JM. Coppernot too little，not too much，but just right.LondonJ R Coll Physicians Land，1995.29(4)280-813 Okano T. Effects of essentiai trace elements on bone turnoverin relation to the osteoporosis. Nippon Rinsho，1996，54(1)148-5414 Kozuka H. Interactive exhibition of heavy metal toxicity in bonemetabolism from the viewpoint of deductive toxicology. YakugakuZasshi 1995，115(3)157-6915 Dimai HP，Porta S，Wirnsberger G，et al.Daily oral magnesiumsupplementation suppresses bone turnover in young adult males.J ClinEndocrinol Metab 1998，83(8)2742-816 Rude RK，Kirchen ME，Gruber HE，et al.Magnesiumdeficiency-induced osteoporosis in the ratuncoupling of boneformation and bone resumption. Magnes Res 1999，12(4)257-6717 阴健主编.《中药现代研究与临床应用》.北京学苑出版社1993196-20318 刘忠厚主编.骨质疏松学.北京科学出版社，19983权利要求
1.甘草及甘草提取物在制备用于防治骨质疏松症的制剂中的应用。
2.甘草提取物甘草酸在制备用于防治骨质疏松症的制剂中的应用。
3.甘草提取物甘草黄甙、异甘草黄甙在制备用于防治骨质疏松症的制剂中的应用。
4.甘草提取物甘草多糖在制备用于防治骨质疏松症的制剂中的应用。
5.甘草提取物甘草素、异甘草素在制备用于防治骨质疏松症的制剂中的应用。
6.甘草提取物甘草次酸在制备用于防治骨质疏松症的制剂中的应用。
7.甘草提取物甘草酸和钙剂组成的复方制剂在制备用于防治骨质疏松症的制剂中的应用。
8甘草提取物甘草酸和葡萄糖酸钙组成的复方制剂在制备用于防治骨质疏松症的制剂中的应用。
9.如权利要求书1所述的甘草提取物，其特征是该成份含有甘草的干燥根的提取物三萜类化合物甘草皂甙(甘草甜素glycyrrhizin或甘草酸glycyrrhizic acid)和甘草次酸(glycyrrhetinic acid)、黄酮类化合物甘草黄甙(liquiritin或称甘草黄碱酮)、异甘草黄甙(isoliquiritin)、甘草素(liquiriligenin)、异甘草素(iso-liquiriligenin)以及甘草多糖。
全文摘要
本发明公开了甘草及甘草提取物防治骨质疏松的新用途，通过动物实验研究和筛选，我们发现了中药豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)的干燥根及根茎以及其干燥根的提取物三萜类化合物甘草皂甙(甘草甜素glycyrrhizin或甘草酸glycyrrhizic acid)和甘草次酸(glycyrrhetinic acid)、黄酮类化合物甘草黄甙(liquiritin或称甘草黄碱酮)、异甘草黄甙(isoliquiritin)、甘草素(liquiriligenin)、异甘草素(iso－liquiriligenin)以及甘草多糖有较好的防治骨质疏松症的作用。本发明对甘草及上述提取物用于防治人类骨质疏松症的新用途提出了新的思路。
文档编号A61P19/10GK1446549SQ0210818
公开日2003年10月8日 申请日期2002年3月25日 优先权日2002年3月25日
发明者吴铁, 邹丽宜, 崔燎, 陈方, 刘晓青, 刘钰瑜 申请人:广东医学院医药科技开发中心
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