眼镜蛇短链神经毒素在制备免疫抑制药物中的应用的制作方法
专利名称：眼镜蛇短链神经毒素在制备免疫抑制药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于制药技术领域，具体涉及一种眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin)在 制备炎症、自身免疫性疾病和器官移植免疫排斥药物中的用途。
背景技术：
蛇毒是由蛇的毒腺分泌的多种组分构成的复杂混合物。蛇毒的干物质中90%以上 是蛋白质，是其毒性和其生物学活性的主要成分。祖国传统医学认为眼镜蛇及其毒性成分 可通经络，祛风湿，并具有强身健体之功效，早在二十世纪初，人们就开始应用蛇毒来缓解 恶性肿瘤疼痛、神经痛和关节痛，随后出现一系列关于蛇毒有类似吗啡样镇痛作用的报道。眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin)是从中华眼镜蛇蛇毒中提纯的神经毒素， 其序列是 mktllltllv vtivcldlgy tlechnqqss qtptttgcsg getncykkrwrdhrgyrter gcgcpsvkng ieinccttdr cnn，所提纯的眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin)含64-83个氨 基酸，其分子量为6946左右。尽管中华眼镜蛇蛇毒在临床上已用于治疗风湿性疼痛和缓解 恶性肿瘤疼痛和神经痛等，但关于眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin)抑制炎症、自身免疫 性疾病和器官移植免疫排斥等还没有报道，也没有文献报道中华眼镜蛇中提纯的短链神经 毒素(Cobrotoxin)可通过口服、鼻(口)粘膜喷雾、透皮给药和注射给药能抑制机体免疫 系统的报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种眼镜蛇短链神经毒素在制备免疫抑制药物中的应用，得 到一种与现有技术中免疫抑制剂环磷酰胺和雷公藤作用相当的免疫抑制药物。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是一种眼镜蛇短链神经毒素在制备免疫抑制药物中的应用。本发明的另一目的在于提供一种所述的组合物在制备抑制炎症、自身免疫性疾病 和器官移植免疫排斥药物中的应用。一种眼镜蛇短链神经毒素在制备抑制炎症、自身免疫性疾病和器官移植免疫排斥 药物中的应用。本发明人研究发现眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin)抑制巨噬细胞的吞噬活 性，抑制免疫刺激剂ConA和LPS引起的T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，抑制IL-2的分 泌，对迟发型超敏反应小鼠的耳廓肿胀有明显的抑制作用，对弗氏完全佐剂致类风湿关节 炎有明显的抑制作用，其作用强度等当于或优于经典免疫抑制剂环磷酰胺和雷公藤。这一 发现，将对炎症反应、自身免疫性疾病和器官移植的免疫排斥的研究和药物开发产生重大 的影响，并有临床实用价值，为眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin)开辟新的临床用途。相对于现有技术中的方案，本发明的优点是本发明得到了一种眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin)在制备免疫抑制药物中的 用途，我们的研究发现眼镜蛇短链神经毒素在(1-600 yg/kg)范围内对巨噬细胞吞噬活性，T和B淋巴细胞激活，IL-2分泌和迟发型超敏反应有明显的抑制作用，其作用相等或优 于经典免疫抑制剂环磷酰胺和雷公藤，具有用量小、安全、可口服、可注射、可透过口鼻粘膜 和皮肤给药等优点。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做 进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例药学试验1)眼镜蛇短链神经毒素巨噬细胞吞噬活性抑制试验实验材料昆明种小鼠，雌雄各半，体重18_22g，由苏州动物中心提供，动物合格证号 SYXK (苏)2007-0035。短链神经毒素Cobrotoxin (粉末)中鑫东泰(莱阳)纳米基因生 物技术有限公司批号NC070501。实验方案取小鼠40只，雌雄各半，体重18 22g，随机分4组，每组10只，分别正常组，短链 神经毒素(CBTX) (4.5,9.0,18. 0 μ g/kg)剂量组，隔日1次，连续16天，末次给药3h后，每只 小鼠按体重尾静脉注射印度墨水(用生理盐水稀释5倍)0. lml/10g，分别在静脉注射后2、 lOmin，于小鼠眼眶静脉丛取血50μ 1，放入6ml 0. 1% Na2CO3溶液试管中，摇勻，用JA5003N 分光光度计，在波长680nm处比色，测OD值，计算吞噬指数K值。按公式计算其吞噬指数K。 K= (logA10-logA2)/T2-Tl(K = log0D2-log0D10/tl0_t2)。实验结束，将小鼠颈椎脱臼处 死，分别称体重、胸腺重和肝脾重，按下列公式计算胸腺指数、脾指数、炭粒廓清指数K和吞 噬指数a。胸腺指数=胸腺重/体重脾指数=脾脏重/体重碳粒廓清指数K = (lgODl-lgOD2) / (t2_tl)吞噬指数a = kl/3X体重/(肝重+脾重)眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin，1-100 μ g/kg)腹腔注射和灌胃给药能降低正 常小鼠免疫器官指数，包括脾脏系数和胸腺系数，降低小鼠单核巨噬细胞吞噬指数和吞噬 活性。(见下表1，2)表ICBTX对小鼠免疫器官指数的影响(i±SD) 注*P< 0. 05，< 0. 01，< 0. OOlvssaline表2CBTX对小鼠单核巨噬细胞吞噬指数K和吞噬活性a的影响(x±s) 注*P< 0. 05，< 0. 01，< 0. OOlvs saline2)眼镜蛇短链神经毒素T和B淋巴细胞激活试验试验材料同前。试验过程淋巴细胞增殖和血清中IL-2浓度检测实验小鼠适应性喂养1周后，随机分为5 组正常对照组，中药(雷公藤多苷片)阳性对照组，西药(环磷酰胺)阳性对照组，短链神 经毒素(CBTX)低剂量组(4. 5 u g/kg)、中剂量组(9. 0 u g/kg) 2个剂量组。正常组腹腔注 射生理盐水，中药阳性对照组每天灌胃雷公藤多苷片(30mg/kg)共给药20次，西药阳性对 照组每天腹腔注射环磷酰胺(50mg/kg)共给药10次，短链神经毒素2个剂量组隔天腹腔注 射，共给药10次。小鼠淋巴细胞增殖实验小鼠淋巴细胞悬液制备实验小鼠摘眼球取血，后颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡 5min，无菌取脾，用Hank' s液洗涤，在200目钢丝网上剪碎，用灭菌玻璃注射芯轻磨、过滤， 制成单细胞悬液，1000r/min离心5min，沉淀经1640基础液洗2遍，用含10%小牛血清的 RPMI-1640培养液配成细胞悬液。显微镜下细胞计数，配成2 X 106/mL脾淋巴细胞悬液。
小鼠脾淋巴细胞增殖的影响取已制备好的脾细胞悬液(2X 106/ml)，加入96孔培 养板，每孔100 μ 1，每只小鼠设空白不加药的3复孔；T淋巴细胞反应孔加100 μ 1 ConA(终 浓度为5yg/ml) ；B淋巴细胞反应孔加100ulLPS(终浓度10yg/ml)，均设3复孔。置 37°C>5% CO2培养箱中培养72h。培养结束前4h每孔加入10 μ L 5mg/mL MTT，培养结束离 心(2000rpm，IOmin)，用枪头小心吸弃上清液，每孔加入100 μ 1 SDS，酶标仪上振荡混勻，置 37°C,5% CO2培养箱中过夜，酶标仪测定490nm波长处吸光度值。小鼠迟发型超敏反应实验小鼠60只，随机分成6组，即生理盐水对照组，CBTX高 中低剂量组(18. O μ g/kg，9. O μ g/kg。4. 5 μ g/kg)腹腔注射组，CBTX 100 μ g/kg 口服对照 组，强的松阳性对照组，0.02g/kg。每组10只。小鼠腹部皮肤去毛约3cm2区域，然后用微 量进样器取2% DNCBO. lml，均勻滴加于脱毛区致敏。于致敏当天开始给药，隔天1次。共 给药7次，末次给药后3小时后，用2% DNCB涂于每鼠右耳前后两面。24h后，脱颈椎处死 老鼠，分别剪下双耳，用8mm打孔器在相同部位打下圆耳片，电子天平称重，以左、右耳片重 量差值作为肿胀度。实验结果如下眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin，1-100 μ g/kg)腹腔注射和灌胃给药能抑制小 鼠淋巴细胞增殖反应。(见下表3)眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin，1-400 μ g/kg)腹腔注射和灌胃给药能降低小 鼠血清中IL-2浓度。(见下表4)眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin，1-400 μ g/kg)腹腔注射和灌胃给药能抑制 DNCB致小鼠迟发型超敏反应。(见下表5)表3CBTX对小鼠淋巴细胞增殖反应的影响(x±SD) 注*P< 0. 05，**P < 0. Olvs saline表4CBTX对小鼠血清中IL-2浓度的影响(x±SD) 注*P< 0. 05，< 0. 01，< 0. OOlvs saline表5CBTX对DNCB致小鼠迟发性超敏反应的影响(x±SD) 注*P<0.05，〃P<0. 01，*〃P<0. OOlvs saline ；与生理盐水对照组比较存
在明显的差异。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是 能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精 神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种眼镜蛇短链神经毒素在制备免疫抑制药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述免疫抑制药物选自抑制炎症方面的药 物、防治自身免疫性疾病的药物和进行器官移植免疫排斥的药物。
全文摘要
本发明公开了一种眼镜蛇短链神经毒素在制备免疫抑制药物中的应用，特别是在制备抑制炎症方面的药物、防治自身免疫性疾病的药物和进行器官移植免疫排斥的药物方面的应用。所述眼镜蛇短链神经毒素作用相等或优于经典免疫抑制剂环磷酰胺和雷公藤，具有用量小、安全、可口服、可注射、可透过口鼻粘膜和皮肤给药等优点。
文档编号A61P29/00GK101890154SQ20101017496
公开日2010年11月24日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者刘艳丽, 秦正红 申请人:苏州大学;苏州旷远生物分子技术有限公司
技术领域：
本发明属于制药技术领域，具体涉及一种眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin)在 制备炎症、自身免疫性疾病和器官移植免疫排斥药物中的用途。
背景技术：
蛇毒是由蛇的毒腺分泌的多种组分构成的复杂混合物。蛇毒的干物质中90%以上 是蛋白质，是其毒性和其生物学活性的主要成分。祖国传统医学认为眼镜蛇及其毒性成分 可通经络，祛风湿，并具有强身健体之功效，早在二十世纪初，人们就开始应用蛇毒来缓解 恶性肿瘤疼痛、神经痛和关节痛，随后出现一系列关于蛇毒有类似吗啡样镇痛作用的报道。眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin)是从中华眼镜蛇蛇毒中提纯的神经毒素， 其序列是 mktllltllv vtivcldlgy tlechnqqss qtptttgcsg getncykkrwrdhrgyrter gcgcpsvkng ieinccttdr cnn，所提纯的眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin)含64-83个氨 基酸，其分子量为6946左右。尽管中华眼镜蛇蛇毒在临床上已用于治疗风湿性疼痛和缓解 恶性肿瘤疼痛和神经痛等，但关于眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin)抑制炎症、自身免疫 性疾病和器官移植免疫排斥等还没有报道，也没有文献报道中华眼镜蛇中提纯的短链神经 毒素(Cobrotoxin)可通过口服、鼻(口)粘膜喷雾、透皮给药和注射给药能抑制机体免疫 系统的报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种眼镜蛇短链神经毒素在制备免疫抑制药物中的应用，得 到一种与现有技术中免疫抑制剂环磷酰胺和雷公藤作用相当的免疫抑制药物。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是一种眼镜蛇短链神经毒素在制备免疫抑制药物中的应用。本发明的另一目的在于提供一种所述的组合物在制备抑制炎症、自身免疫性疾病 和器官移植免疫排斥药物中的应用。一种眼镜蛇短链神经毒素在制备抑制炎症、自身免疫性疾病和器官移植免疫排斥 药物中的应用。本发明人研究发现眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin)抑制巨噬细胞的吞噬活 性，抑制免疫刺激剂ConA和LPS引起的T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，抑制IL-2的分 泌，对迟发型超敏反应小鼠的耳廓肿胀有明显的抑制作用，对弗氏完全佐剂致类风湿关节 炎有明显的抑制作用，其作用强度等当于或优于经典免疫抑制剂环磷酰胺和雷公藤。这一 发现，将对炎症反应、自身免疫性疾病和器官移植的免疫排斥的研究和药物开发产生重大 的影响，并有临床实用价值，为眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin)开辟新的临床用途。相对于现有技术中的方案，本发明的优点是本发明得到了一种眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin)在制备免疫抑制药物中的 用途，我们的研究发现眼镜蛇短链神经毒素在(1-600 yg/kg)范围内对巨噬细胞吞噬活性，T和B淋巴细胞激活，IL-2分泌和迟发型超敏反应有明显的抑制作用，其作用相等或优 于经典免疫抑制剂环磷酰胺和雷公藤，具有用量小、安全、可口服、可注射、可透过口鼻粘膜 和皮肤给药等优点。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做 进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例药学试验1)眼镜蛇短链神经毒素巨噬细胞吞噬活性抑制试验实验材料昆明种小鼠，雌雄各半，体重18_22g，由苏州动物中心提供，动物合格证号 SYXK (苏)2007-0035。短链神经毒素Cobrotoxin (粉末)中鑫东泰(莱阳)纳米基因生 物技术有限公司批号NC070501。实验方案取小鼠40只，雌雄各半，体重18 22g，随机分4组，每组10只，分别正常组，短链 神经毒素(CBTX) (4.5,9.0,18. 0 μ g/kg)剂量组，隔日1次，连续16天，末次给药3h后，每只 小鼠按体重尾静脉注射印度墨水(用生理盐水稀释5倍)0. lml/10g，分别在静脉注射后2、 lOmin，于小鼠眼眶静脉丛取血50μ 1，放入6ml 0. 1% Na2CO3溶液试管中，摇勻，用JA5003N 分光光度计，在波长680nm处比色，测OD值，计算吞噬指数K值。按公式计算其吞噬指数K。 K= (logA10-logA2)/T2-Tl(K = log0D2-log0D10/tl0_t2)。实验结束，将小鼠颈椎脱臼处 死，分别称体重、胸腺重和肝脾重，按下列公式计算胸腺指数、脾指数、炭粒廓清指数K和吞 噬指数a。胸腺指数=胸腺重/体重脾指数=脾脏重/体重碳粒廓清指数K = (lgODl-lgOD2) / (t2_tl)吞噬指数a = kl/3X体重/(肝重+脾重)眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin，1-100 μ g/kg)腹腔注射和灌胃给药能降低正 常小鼠免疫器官指数，包括脾脏系数和胸腺系数，降低小鼠单核巨噬细胞吞噬指数和吞噬 活性。(见下表1，2)表ICBTX对小鼠免疫器官指数的影响(i±SD) 注*P< 0. 05，< 0. 01，< 0. OOlvssaline表2CBTX对小鼠单核巨噬细胞吞噬指数K和吞噬活性a的影响(x±s) 注*P< 0. 05，< 0. 01，< 0. OOlvs saline2)眼镜蛇短链神经毒素T和B淋巴细胞激活试验试验材料同前。试验过程淋巴细胞增殖和血清中IL-2浓度检测实验小鼠适应性喂养1周后，随机分为5 组正常对照组，中药(雷公藤多苷片)阳性对照组，西药(环磷酰胺)阳性对照组，短链神 经毒素(CBTX)低剂量组(4. 5 u g/kg)、中剂量组(9. 0 u g/kg) 2个剂量组。正常组腹腔注 射生理盐水，中药阳性对照组每天灌胃雷公藤多苷片(30mg/kg)共给药20次，西药阳性对 照组每天腹腔注射环磷酰胺(50mg/kg)共给药10次，短链神经毒素2个剂量组隔天腹腔注 射，共给药10次。小鼠淋巴细胞增殖实验小鼠淋巴细胞悬液制备实验小鼠摘眼球取血，后颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡 5min，无菌取脾，用Hank' s液洗涤，在200目钢丝网上剪碎，用灭菌玻璃注射芯轻磨、过滤， 制成单细胞悬液，1000r/min离心5min，沉淀经1640基础液洗2遍，用含10%小牛血清的 RPMI-1640培养液配成细胞悬液。显微镜下细胞计数，配成2 X 106/mL脾淋巴细胞悬液。
小鼠脾淋巴细胞增殖的影响取已制备好的脾细胞悬液(2X 106/ml)，加入96孔培 养板，每孔100 μ 1，每只小鼠设空白不加药的3复孔；T淋巴细胞反应孔加100 μ 1 ConA(终 浓度为5yg/ml) ；B淋巴细胞反应孔加100ulLPS(终浓度10yg/ml)，均设3复孔。置 37°C>5% CO2培养箱中培养72h。培养结束前4h每孔加入10 μ L 5mg/mL MTT，培养结束离 心(2000rpm，IOmin)，用枪头小心吸弃上清液，每孔加入100 μ 1 SDS，酶标仪上振荡混勻，置 37°C,5% CO2培养箱中过夜，酶标仪测定490nm波长处吸光度值。小鼠迟发型超敏反应实验小鼠60只，随机分成6组，即生理盐水对照组，CBTX高 中低剂量组(18. O μ g/kg，9. O μ g/kg。4. 5 μ g/kg)腹腔注射组，CBTX 100 μ g/kg 口服对照 组，强的松阳性对照组，0.02g/kg。每组10只。小鼠腹部皮肤去毛约3cm2区域，然后用微 量进样器取2% DNCBO. lml，均勻滴加于脱毛区致敏。于致敏当天开始给药，隔天1次。共 给药7次，末次给药后3小时后，用2% DNCB涂于每鼠右耳前后两面。24h后，脱颈椎处死 老鼠，分别剪下双耳，用8mm打孔器在相同部位打下圆耳片，电子天平称重，以左、右耳片重 量差值作为肿胀度。实验结果如下眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin，1-100 μ g/kg)腹腔注射和灌胃给药能抑制小 鼠淋巴细胞增殖反应。(见下表3)眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin，1-400 μ g/kg)腹腔注射和灌胃给药能降低小 鼠血清中IL-2浓度。(见下表4)眼镜蛇短链神经毒素(Cobrotoxin，1-400 μ g/kg)腹腔注射和灌胃给药能抑制 DNCB致小鼠迟发型超敏反应。(见下表5)表3CBTX对小鼠淋巴细胞增殖反应的影响(x±SD) 注*P< 0. 05，**P < 0. Olvs saline表4CBTX对小鼠血清中IL-2浓度的影响(x±SD) 注*P< 0. 05，< 0. 01，< 0. OOlvs saline表5CBTX对DNCB致小鼠迟发性超敏反应的影响(x±SD) 注*P<0.05，〃P<0. 01，*〃P<0. OOlvs saline ；与生理盐水对照组比较存
在明显的差异。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是 能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精 神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种眼镜蛇短链神经毒素在制备免疫抑制药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述免疫抑制药物选自抑制炎症方面的药 物、防治自身免疫性疾病的药物和进行器官移植免疫排斥的药物。
全文摘要
本发明公开了一种眼镜蛇短链神经毒素在制备免疫抑制药物中的应用，特别是在制备抑制炎症方面的药物、防治自身免疫性疾病的药物和进行器官移植免疫排斥的药物方面的应用。所述眼镜蛇短链神经毒素作用相等或优于经典免疫抑制剂环磷酰胺和雷公藤，具有用量小、安全、可口服、可注射、可透过口鼻粘膜和皮肤给药等优点。
文档编号A61P29/00GK101890154SQ20101017496
公开日2010年11月24日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者刘艳丽, 秦正红 申请人:苏州大学;苏州旷远生物分子技术有限公司
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