一种基因免疫治疗肿瘤的静脉用制剂的制作方法
专利名称：一种基因免疫治疗肿瘤的静脉用制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因制剂，特别涉及一种基因免疫治疗肿瘤的静脉用制剂。
背景技术：
hTERTC27 (C-terminal fragment of the human telomerase reverse transcriptase, hTERTC27)，是一个27kD的人端粒酶逆转录酶C_末端多肽，能引起端粒的 功能异常，使染色体末端快速融合而不影响端粒酶的活性，导致hTERT+ HeLa细胞的凋亡和 老化，在HeLa细胞的裸鼠模型上产生了明显的抑瘤效果(Huang，J. J.，Lin, M. C.，Bai YX, Jing D, Wong BC, Han Sff, Lin J, Xu B, Huang CF, Kung HF. Ectopic expression of a COOH—terminal fragment of the human telomerase reverse transcriptase leads to telomere dysfunction and reduction of growth and tumorigenicity in HeLa cells. Cancer Research. 62:3226-3232, 2002. ；. Huang, J. J., Han Sff, Bai YX, Ng SSM, Jing DD, Wong BCY, Huang CF, Kung HF, and Lin MC. A human TERT C-terminal polypeptide sensitizes HeLa cells to H202_induced senescence without affecting telomerase enzymatic activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301:627-632，2003.)。在接种了人恶性胶质瘤细胞(U87-MG)的裸鼠 中，hTERTC27也明显地抑制肿瘤的生长(Ng SS, Gao Y, Chau DH, Li GH, Lai LH, Huang PT, Huang CF, Huang JJ, Chen YC, Kung HF, Lin MC. A novel glioblastoma cancer gene therapy using AAV—mediated long-term expression of human TERT C-terminal polypeptide. Cancer Gene Therapy. 14:561-72,2007.)。hTERTC27可以作为抗hTERT+肿瘤细胞的有效基因疗法，同时，hTERTC27能够诱 导黑色素瘤C57BL/6小鼠体内细胞和体液免疫，显著地抑制黑色素瘤的生长。由此可见 hTERTC27可以通过基因调节和免疫调节双重机制共同作用于hTERT+肿瘤细胞，起到一种广 谱的抗肿瘤效果。目前黄君健教授和孔祥复院士等发现hTERTC7能引起端粒功能失调不影 响端粒酶活性并抑制肿瘤细胞生长，成功申请并获得美国专利(US 7294708 )。在US 7294708中，采用的是单纯的携带hTERTC27的质粒对肿瘤细胞转染并观察 其对肿瘤细胞端粒功能的影响，并筛选出稳定转染hTERTC27及EGFP质粒的HeLa细胞株， 在裸鼠皮下接种成瘤，观察hTERTC27对肿瘤生长的抑制作用。这样极大的限制了 hTERTC27 作用的发挥；同时，稳定转染hTERTC27的HeLa细胞裸鼠皮下种植，与自然成瘤有一定的差B.
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因免疫治疗肿瘤的制剂。本发明所采取的技术方案是
一种基因免疫治疗肿瘤的静脉用制剂，由复制缺陷型腺病毒装载人端粒酶逆转录酶 C"末端多肽基因hTERTC27和可接受的药用辅料组成。
优选的，复制缺陷型腺病毒为Ad5。本发明的抗肿瘤基因制剂rAdv_hTERTC27，转染效率高，对肿瘤细胞的增值和凋亡 调节更为有效。同时，本发明的抗肿瘤基因制剂，能有效的将目的肽段转染进入树突状细胞 DCs,使DCs激活，分泌IFN- y、IL-2，增加并进一步刺激T淋巴细胞增殖，并促使T淋巴细 胞对相应肿瘤细胞产生特异性的杀伤效应CTL，对肿瘤进行免疫调节。
图1是hTERTC27的毒种鉴定电泳图2是rAdv-hTERTC27病毒感染靶细胞后的RT-PCR、Western blot电泳图； 图3是rAdv-hTERTC27对肝癌(H印a 1_6)、胶质瘤(U87)细胞增殖和凋亡的影响图； 图4是rAdv-hTERTC27对细胞端粒酶活性的影响图； 图5是rAdv-hTERTC27转染骨髓来源DCs效果图； 图6是rAdv-hTERTC27转染对DCs分泌细胞因子的影响； 图7是rAdv-hTERTC27-DCs促进T淋巴细胞增殖的作用； 图8是rAdv-hTERTC27-DCs促进T淋巴细胞杀伤肿瘤靶细胞的作用； 图9是注射rAdv-hTERTC27后对小鼠肝癌肿瘤体积和生存期的影响图。
具体实施例方式一种基因免疫治疗肿瘤的静脉用制剂，由复制缺陷型腺病毒装载人端粒酶逆转录 酶C-末端多肽基因hTERTC27和可接受的药用辅料组成。可接受的药用辅料是本领导技术 人员所熟知的，如生理盐水等。优选的，复制缺陷型腺病毒为Ad5。复制缺陷型腺病毒Ad5是由骨架质粒pBHGlox_El，3Cre和穿梭质粒 pDC316-hTERTC27-EGFP双质粒共转染293细胞，同源重组产生重组腺病毒。下面结合实施例，进一步说明本发明。rAdv-hTERTC27 (recombinant adenovirus-hTERTC27_EGFP)的制备及鉴定
1)将293细胞接种于六孔板中，每孔5 X 105个细胞，培养基为DMEM+10% Hyclone胎 牛血清，置37°C含5% C02的培养箱中培养过夜；
2)换液，用新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养至细胞生长至底面积的 80 90% ；取24 ii g骨架质粒和6 ii g穿梭质粒，混合均勻，其中骨架质粒选用pBHGlox_El， 3Cre,穿梭质粒选用 pDC316-hTERTC27-EGFP ；
3)将混合均勻的质粒用1800 u 1的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min ；取60 yl 的Lipofectamine2000脂质体用1800 u 1的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min ；
4)将稀释的混合质粒与稀释的脂质体混合，室温避光放置30imn ；将室温避光放置 的混合物均勻地与培养好的细胞混合，参照LipofectamindOOO脂质体说明书进行转染；
5)转染后第二天，将长满的细胞传代于25cm2细胞培养瓶中，用含5%胎牛血清的 DMEM培养基继续培养，每天观察，待细胞长满瓶底时，再传入75 cm2细胞培养瓶中，当细胞 变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑，表明细胞出毒，待细胞大部分病变并从底部脱 落后收取出毒细胞；6)将出毒的细胞培养瓶先后置于-70°C冰箱和37°C水浴锅中反复冻融三次，使病毒 从病变细胞中充分释放，将冻融液3000rpm离心5min，收集含病毒的上清液，得第一代毒种 (P1)；
7)用P1转染293细胞，培养之后收毒，PCR扩增、电泳鉴定无误后，得到第二代毒种 (P2)；
8)用P2转染293细胞，培养之后收毒，将收获的病毒上清用DNase酶消化后，用 0. 45um的滤膜过滤，然后过离子柱纯化，之后再过分子筛进一步纯化病毒；
9)将纯化的病毒保存于腺病毒保存液中，经除盐处理后用0. 22 ym —次性滤器过滤 除菌，从而得到无菌的纯化病毒重组腺病毒人端粒酶多肽基因rAdv-hTERTC27。电泳鉴定图如图1所示。RT-PCR、Western blot检测重组腺病毒在H印al_6细胞株中的表达
1)将生长状态良好、70% 80%融合的Ifepal-6细胞消化计数，5X 105cells/孔传代 接种于 6 孔培养板中，按 M0I=20 转染 rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP，用含 10%FCS 的 RPMI 1640 完全培养基于37°C、5%C02培养箱中孵育48h，用于RT-PCR和Western blot检测；
2)取 1 P g 总 RNA 逆转录成为 cDNA，反应为 42 °C 70min, 70 °C 15min, 4 °C 保存；lOiil cDNA与0. 4iil蛋白酶k混合56 °C 30min,沸水浴lOmin，冰上骤 冷，以破裂病毒衣壳；用Premix Taq进行聚合酶链式反应PCR，hTERTC27的引物 为hTERTC27-F (5'-ATGACAGTGGTGAACTTCC-3' ) (SEQ ID NO1)，hTERTC27_R (5，-TCAGTCCAGGATGGTCTTG-3，)(SEQ ID NO 2) (PCR 产物 716bp) ;PCR 反应程序94 °C 5min，30 个循环(94°C 30sec，55°C 30sec，72°C lmin),72°C lOmin，PCR 产物上样到含有 SYBR Safe DNA染料(0. 1 u g/ml)的1. 0 %琼脂糖上，在TBE中以100V的电压跑30min，用 凝胶成像仪观察结果；
3)取15ii g总蛋白100°C变性5min，加入等体积2XSDS蛋白电泳上样缓冲液，混勻 上样，并加蛋白质分子量预染Marker —起电泳(200V，至溴酚蓝到达分离胶底部或进入电 泳槽)；电转膜，70V, lh，可见预染Marker亦转至PVDF膜上；TBST洗膜，5minX3次；封闭液 室温封闭，2h(封闭完不洗膜);加一抗(1:1000)孵育，4°C振荡过夜；TBST洗膜，5minX6次； 加HRP标记的二抗(1 1000)，室温孵育lh ；TBST洗膜，5minX6次；暗室曝光现配发光液， 将ECL试剂盒的A液和B液按1 1混合的，滴加至膜上，在暗室进行曝光。小鼠原位肝癌模型的建立
实验动物C57BL/6小鼠24只，雌雄各半，体重18_21g ；瘤株采用小鼠肝癌细胞 H印al-6，由上海细胞库提供。方法取对数期生长的Ifepal-6细胞制备密度为5X 107个/ml的细胞悬浮液，采 用微量注射器于每只小鼠肝包膜下注射细胞0. lml(5X106个)，分笼饲养于SPF环境下，所 有裸鼠自由饮食，观察体重变化继续喂养至产生肝癌，备用。rAdv-hTERTC27对肝癌(Ifepa 1-6)细胞增殖和凋亡的影响
1) 将对数生长期的H印1-6细胞，以每孔6000个细胞接种在96孔板中；分为3 组，rAdv-hTERTC27、rAdv_EGFP24 和 PBS 组，每组 4 个复孔；24 小时后 rAdv_hTERTC27 和 rAdv-EGFP 分别按照 M0I=30 感染 rAdv_hTERTC27 和 rAdv-EGFP, PBS 组加入与 rAdv-hTERTC27等体积的PBS ；重新置于37°C、5%C02培养箱中培养48小时；2)细胞的增值采用CCK-8 clolrimetric assays (Dojindo Molecular Technologies, Inc. , Gaithersbury，MD, USA)进行测定；取出96孔板，各孔中加入10 μ 1 CCK-8溶液，继 续培养4小时，室温振荡5分钟后，通过化学发光酶标仪测定在450nm处的吸光值(参比波长 650nm)；
3)观察不同处理组细胞凋亡的差异；同步骤1，24小时后用光学显微镜观察各组 细胞形态学变化；然后在各孔细胞中分别加入Hochest 33258与PI使其终浓度分别为 10 μ g/ml与100 μ g/ml，4°C避光保存10分钟后在荧光显微镜上进行观察，Hochest染色以 紫外光340nm波长激发，荧光显微镜下观察。凋亡细胞染色呈强蓝色荧光，而正常细胞只呈微弱荧光，死细胞则不被染色，由此 可检测出凋亡；在荧光显微镜下选用大于536nm的激发光观察PI染色结果，染色呈红色荧 光为死亡细胞，通过计数不同组凋亡和死亡细胞数量比较不同处理组间差别。其结果如图 3所示。rAdv_hTERTC27对细胞端粒酶活性的影响
端粒酶活性采用PCR ELISA试剂盒(Roche，Mannheim, Germany)进行测定。1) 取对数生长期的H印1-6细胞，当细胞生长至约90%融合时用0.25胰酶消 化，0. OlM pH7.3 PBS洗细胞3次，于15mL离心管中制成单细胞悬液；将细胞稀释至浓度为 2X105cellS/ml，以每孔500μ 1细胞悬液将细胞接种在24孔板中；轻轻摇动，使细胞均勻， 置于37°C、5%C02培养箱中培养48小时；
2)将各孔细胞分为3组，每组设4个复孔，rAdv-hTERTC27和rAdv_EGFP分别按照 M0I=30感染靶细胞，第三组加入与rAdv-hTERTC27同体积的PBS，重新置于37°C、5%C02培 养箱中培养24小时；
3)端粒酶活性检测每个EP管加200 μ 1细胞裂解液，冰上孵育30分钟，期间摇动 EP管使细胞充分裂解，16000Xg 4°C离心20分钟；取上清，转移至一新的EP管；另取一组 蛋白样品经过100°C水浴10分钟变性，作为阴性对照组，用BCA法测量各组蛋白浓度，按每 个样品2 μ g蛋白计算上样量并上样，具体操作步骤见Telomerase PCR ELISA Kit说明书。分别采用银染法和ELISA法对端粒酶活性进行标记，各组端粒酶活性结果如图4 所示。骨髓来源树突状细胞(DCs)及rAdv_hTERTC27感染DCs转染效率观察
1)骨髓来源树突状细胞的分离取5-6周龄的C57BL/6小鼠，断颈椎处死，无菌剥离 股骨和胫骨，剪至红骨髓，用30 mL注射器吸取RPMI1640将骨髓冲至培养皿中，100目筛网 过滤后458Xg离心6min收集骨髓细胞，细胞沉淀加入预温的0. 83% Tris-NH4C1 3mL裂解 红细胞，裂解5min后加入40 mL RPMI 1640 :458 X g离心6 min，弃上清；
2)台盼蓝拒染法计数活细胞数(测定细胞活力大于95%)，细胞沉淀加入RPMI1640完 全培养基(含10%胎牛血清)，接种至6孔培养板，加入lOng/mL rmGM_CSF、5 ng/mL IL-4， 每孔加完全培养基至4 mL ；至第3天，换含相同浓度细胞因子的完全培养液；至第5天，半 量换液并补足细胞因子；至第6天，轻轻吹打收集所有的悬浮细胞，即为体外扩增的小鼠骨 髓来源的DCs ；每日用相差显微镜观察细胞的生长和形态变化。3)与 200 ng/mL LPS共培养养 2 4 h 后，按照M0I=200 分别加入rAdv_hTERTC27 或rAdv-EGFP孵育24 h，在荧光显微镜下观察转染效率。
表达绿色荧光即为有效转染入DCs的rAdv-hTERTC27或rAdv_EGFP。结果如图5 所示。rAdv-hTERTC27 刺激 DCs 分泌细胞因子 11-2、INF- γ 增加
1、收集rAdv-hTERTC27，rAdv-EGFP或PBS感染24小时的各组DC培养上清；
2、ELISA法检测DC培养上清中INF-γ和IL-2的含量 1) NF-y-ELISA (R&D Systems, USA)
①用IXCalibrator Diluent RD5P 剃度稀释配制 5000pg/mL、2500 pg/mL、1250 pg/ mL、625 pg/mL、312 pg/mL、156 pg/mL 禾口 78 pg/mL 的标准品，以 1 XCalibrator Diluent RD5P作为Opg/mL (零对照)；
②用IXCalibratorDiluent RD5P将待检测样品稀释50倍；
③在酶标板中加入AssayDiluent RD1-55，每孔100 L ；
④分别在相应的孔中加入100 L标准品、100 L零对照和100 L待测样品，各设2 个复孔，粘贴膜封盖，置于水平轨道震荡器上，室温、500rpm振荡孵育2h ；
⑤吸掉液体，用WashBuffer约500 L/孔洗涤4次，在滤纸上印干洗涤液；
⑥加入6CkineConjugate 200 L/孔，粘贴膜封盖，置水平轨道震荡器上，室温、 500rpm振荡孵育2h ；
⑦重复步骤⑥1次；
⑧加入Substrate Solution 200 L/孔，避光、室温孵育 20min ；
⑨加入Stop Solution 50 L/ 孔；
⑩在30min内用酶标仪测定450nm波长处的光密度(OD)值，以570nm为参考波长； 绘制标准曲线，计算样品的浓度。2) IL-2-ELISA (R&D Systems, USA) 具体操作步骤同上，结果如图6所示。转染rAdv_hTERTC27的DCs对T细胞增值及细胞毒性T细胞(CTL)效应的观察 (1) T淋巴细胞的培养
断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1 2分钟。在超净台中小心剪开小鼠的腹 部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏；在35mm培养皿中放入 4-5mL EZ-Sep Mouse IX淋巴细胞分离液(使用前摇勻淋巴细胞分离)；用镊子固定尼龙 网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分 离液中；把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μ1的 1640培养基。(2) DCs对淋巴细胞的增殖实验
在重组腺病毒感染24h后的rAdv-hTERTC27-DC、rAdv_EGFP-DC、未处理的DC和T淋 巴细胞共培养；按刺激细胞(S)效应细胞(T)=I :5、1 :10、1 :20、1 40的比例，在96孔 板加入中加入1X1 O 4/孔的3种DCs各100 μ 1和5X1 O4 μ 1/孔、1 X IO5 μ 1/孔、 2 X IO5 μ 1/孔、4X IO5 μ 1/孔淋巴细胞100 μ 1，同时设立对照，每组各设3个复孔；细胞培 养箱孵72h，加入CCK-8试剂20 μ 1/孔，继续孵育3 h后，用酶标仪在450nm波长测定吸光 度值(参比波长650nm)。结果如图7所示。(3) rAdv-hTERTC27-DC刺激的T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用收集体外培养的Hepal-6细胞，按每孔1 X IO4个细胞的密度接种细胞于96孔板中， 作为靶细胞。以分别与rAdv-hTERTC27-DC、rAdv-EGFP-DC、未处理的DC与T淋巴细胞共同 培养24h，收集T淋巴细胞作为效应细胞。效靶比(E:T)为5:1、20:1、40:1，另外设只有靶 细胞和只有效应细胞的对照孔，共培养48h后用CCK-8法检测各组在波长450 nm下吸光 度值(参比波长650nm)。按下式计算CTL的杀伤活性
杀伤率=[1_ (效靶孔值一效应孔值)/靶细胞孔值]X 100% 结果如图8所示。体内实验观察rAdv_hTERTC27对肿瘤生长的抑制作用
1)动物分为3组，每组8只小鼠组 1 :rAdv-hTERTC27(5X 107pfu)4i2: rAdv-EGFP (5 X 107pfu)；组 3 与 rAdv-hTERTC27 等体积的 PBS ；
2)用微量注射器肝包膜下注射Hepal-6小鼠肝癌细胞建立小鼠原位肝癌肿瘤模型， 肝包膜下接种后第7天根据分组尾静脉注入rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP或PBS ；
3)各组动物治疗后生存期观察及肿瘤大小测量观察小鼠生活状态及生存期；
4)小鼠于濒死前即取肝脏组织麻醉动物，剪开大鼠腹腔，切取肝脏组织，观察各组肿 瘤生长情况，并按垂直和水平方向测量肿瘤大小，肿瘤体积=a2XbX π /6(a为肿瘤的短径， b为肿瘤的长径)。结果如图9所示。结果
图1是hTERTC27的毒种鉴定电泳图，由可见在750bp条带稍下方有明亮条带，与阳性 对照的位置和亮度相仿，且两个样本均产生该条带，从图中可以确定hTERTC27成功包装进 了腺病毒载体中。图2是rAdv_hTERTC27病毒感染靶细胞后的RT-PCR及Western Blot电泳图，由 图可见，在小鼠肝癌细胞中成功检测到了 hTERTC27的DNA片段和蛋白片段，由此可知重组 腺病毒成功将hTERT携带入靶细胞内。图3是rAdv_hTERTC27对肝癌(!fepa 1-6)细胞增殖和凋亡的影响图。为了检测 hTERTC27对肿瘤细胞生长的抑制作用，将rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP或PBS感染靶细胞 孵育48小时后，细胞分别用PI和Hochest进行染色。由图可见rAdv_hTERTC27感染细胞 后诱导肿瘤细胞凋亡或死亡明显强于rAdv-EGFP和PBS组(Fig. 3A)。通过CCK-8检测法 可看到rAdv-hTERTC27较rAdv-EGFP或PBS相比明显抑制了肿瘤细胞的增值(图3B)。图4是rAdv-hTERTC27对细胞端粒酶活性的影响图。为了证明hTERTC27是否是通 过影响端粒酶活性而起到促进凋亡作用的，将重组腺病毒感染靶细胞，48小时后收集细胞 提取蛋白，采用TRAP-ELISA检测端粒酶活性，如图所示，在rAdv_hTERTC27、rAdv-EGFP和 PBS三组中端粒酶活性都是阳性的，三者之间并没有明显差别。ELISA法和银染法均证实了 同样的结果。图5是rAdv_hTERTC27转染骨髓来源DCs效果图。其中A所示为从小鼠骨髓分离 得到的DCs，培养至第八天，DCs成熟可以进行下一步实验。B所示为病毒感染DCs 24小时 后，绿色荧光所示为转染入DCs的病毒颗粒。当M0I=200时，转染效率可达到80%。图6是rAdv-hTERTC27 Ad_6Ckine/IFN γ转染对DC分泌细胞因子的影响； rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP或PBS感染DCs24小时后，培养上清中的IFN- y、IL-2浓度用
8ELISA试剂盒来测定，如图7所示，rAdv-hTERTC27感染DCs组上清中IFN- γ (328. 6 士 11. 26 pg/ml), IL-2 (8. 18士0. 45 pg/ml)明显高于 rAdv-EGFP 与 PBS 组，IFN- γ 与 IL-2 浓度分 别为 IFN-Y (234. 50士 10. 56 pg/ml, Ρ<0· 05)，IL-2 (3.06士0· 42 pg/ml, Ρ<0· 05)， IFN-y (251. 63士 13. 0 pg/ml, Ρ<0· 05)，IL-2 (2. 65士0.38 pg/ml, Ρ<0· 05)。这部分实 验结果证明了 rAdv-hTERTC27可以促进DC细胞分泌细胞因子增加。这也是rAdv_hTERTC27 免疫治疗的重要机制之一。 图7是rAdv-hTERT27-DCs促进T淋巴细胞增殖；刺激指数(Si)用来计算DC 细胞刺激后T淋巴细胞增值程度，如图8所示rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP、PBS分别感 染DC细胞后刺激T淋巴细胞增值水平分别为0. 91 士0. 09,0. 43士0. 01,0. 45士0. 02 (S/ T=I: 5) ；0. 56士0. 02,0. 37 + 0. 01,0. 37 + 0. 02 (S/T=l 10)、0· 46士0. 01,0. 37士0. 01、 0.37 士 0.02 (S/T=l:20) ;0· 41 士 0. 01、0· 35 士 0. 00、0· 39 士 0. 012 (S/T=l:40),由结果可 见rAdv-hTERTC27感染DC细胞后，在S/T彡1:10时，DC细胞刺激T淋巴细胞增值的能力 明显强于rAdv-EGFP与PBS组(P<0. 05)，而rAdv-EGFP与PBS之间差异不具有统计学意义 (P>0. 05)。 图8是rAdv-hTERTC27-DCs促进T淋巴细胞杀伤肿瘤靶细胞的作用；如图所 示E/T比值分别为5:1、20:1、40:1，结果显示rAdV-hTERTC27_DCs活化的T淋巴细胞对 H印al-6 细胞的杀伤率在 E:T=5:1、E:T=20 1 和 E:T=40 1 时分别为(16. 16士2. 75)%、 (44. 44 士 3. 11) % 和(65. 21 士 2. 98) % ；rAd-EGFP-DCs 禾口 PBS-DCs 活化的 T 淋巴细胞 在 E:T=5:1、E:T=20 :1 禾口 E:T=40:1 时分别为(17. 79士2. 95) %、(33. 65士3. 16) %、 (40. 54士3. 18)% 和(16. 99士2. 97)%、(30. 57士2. 64)%、(48. 72士3. 45)%。当 E:T 彡 20 1时，rAdv-hTERTC27-DCs活化的T淋巴细胞对!fepal-6肿瘤细胞的杀伤率明显高于 rAd-EGFP-DC 和 PBD-DC 组(/7<0. 05 )，而 rAd-EGFP-DC 和 PBS-DC 组间差异不具有显著性 (P>0. 05)。图9是注射rAdv_hTERTC27后对小鼠肝癌的影响图，从图中可以看出，注射了 rAdv-hTERTC27的小鼠，其肝癌已得到很好的抑制。如图所示，由大体模型可以直观地看到 rAdv-hTERTC27治疗组较rAdv-EGFP和PBS治疗组肿瘤体积明显缩小(P<0. 05)，测量肿瘤 体积分别为(1012士21. 43)mm3, (2567士32. 21)mm3, (2789士29. 12)mm3。而 rAdv_hTERTC27 治疗组生存期较rAdv-EGFP和PBS治疗组明显延长(P<0. 05)，分别为68天，34. 5天和31 天。由此可见rAdv-hTERTC27能够有效地抑制小鼠肝癌的生长，延长了荷瘤小鼠的生存期。 在实验过程中同时发现，对小鼠而言，rAdv-hTERTC27的注射量为5X107pfu/鼠时，其效果 最好。本发明的抗肿瘤基因制剂rAdv_hTERTC27，转染效率高，对肿瘤细胞的增值和凋亡 调节更为有效。同时，本发明的抗肿瘤基因制剂，能有效的将目的肽段转染进入树突状细胞 DCs,使DCs激活，分泌IFN- y、IL-2，增加并进一步刺激T淋巴细胞增殖，并促使T淋巴细 胞对相应肿瘤细胞产生特异性的杀伤效应CTL，对肿瘤进行免疫调节。通过以上途径，本发 明的抗肿瘤基因制剂可应用于多种肿瘤的治疗。
权利要求
一种基因免疫治疗肿瘤的静脉用制剂，由复制缺陷型腺病毒装载人端粒酶逆转录酶C 末端多肽基因hTERTC27和可接受的药用辅料组成。
2.根据权利要求1所述的一种基因免疫治疗肿瘤的静脉用制剂，其特征在于复制缺 陷型腺病毒为Ad5。
全文摘要
本发明公开了一种基因免疫治疗肿瘤的静脉用制剂，由复制缺陷型腺病毒装载人端粒酶逆转录酶C-末端多肽基因hTERTC27和可接受的药用辅料组成。本发明的抗肿瘤基因制剂rAdv-hTERTC27，转染效率高，对肿瘤细胞的增值和凋亡调节更为有效。同时，本发明的抗肿瘤基因制剂，能有效的将目的肽段转染进入树突状细胞DCs，使DCs激活，分泌IFN-γ、IL-2，增加并进一步刺激T淋巴细胞增殖，并促使T淋巴细胞对相应肿瘤细胞产生特异性的杀伤效应CTL，对肿瘤进行免疫调节。
文档编号A61K48/00GK101940796SQ201010295079
公开日2011年1月12日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者何蕾, 孔祥复, 彭英, 黄君健, 龚汉贤 申请人:中山大学孙逸仙纪念医院
技术领域：
本发明涉及一种基因制剂，特别涉及一种基因免疫治疗肿瘤的静脉用制剂。
背景技术：
hTERTC27 (C-terminal fragment of the human telomerase reverse transcriptase, hTERTC27)，是一个27kD的人端粒酶逆转录酶C_末端多肽，能引起端粒的 功能异常，使染色体末端快速融合而不影响端粒酶的活性，导致hTERT+ HeLa细胞的凋亡和 老化，在HeLa细胞的裸鼠模型上产生了明显的抑瘤效果(Huang，J. J.，Lin, M. C.，Bai YX, Jing D, Wong BC, Han Sff, Lin J, Xu B, Huang CF, Kung HF. Ectopic expression of a COOH—terminal fragment of the human telomerase reverse transcriptase leads to telomere dysfunction and reduction of growth and tumorigenicity in HeLa cells. Cancer Research. 62:3226-3232, 2002. ；. Huang, J. J., Han Sff, Bai YX, Ng SSM, Jing DD, Wong BCY, Huang CF, Kung HF, and Lin MC. A human TERT C-terminal polypeptide sensitizes HeLa cells to H202_induced senescence without affecting telomerase enzymatic activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301:627-632，2003.)。在接种了人恶性胶质瘤细胞(U87-MG)的裸鼠 中，hTERTC27也明显地抑制肿瘤的生长(Ng SS, Gao Y, Chau DH, Li GH, Lai LH, Huang PT, Huang CF, Huang JJ, Chen YC, Kung HF, Lin MC. A novel glioblastoma cancer gene therapy using AAV—mediated long-term expression of human TERT C-terminal polypeptide. Cancer Gene Therapy. 14:561-72,2007.)。hTERTC27可以作为抗hTERT+肿瘤细胞的有效基因疗法，同时，hTERTC27能够诱 导黑色素瘤C57BL/6小鼠体内细胞和体液免疫，显著地抑制黑色素瘤的生长。由此可见 hTERTC27可以通过基因调节和免疫调节双重机制共同作用于hTERT+肿瘤细胞，起到一种广 谱的抗肿瘤效果。目前黄君健教授和孔祥复院士等发现hTERTC7能引起端粒功能失调不影 响端粒酶活性并抑制肿瘤细胞生长，成功申请并获得美国专利(US 7294708 )。在US 7294708中，采用的是单纯的携带hTERTC27的质粒对肿瘤细胞转染并观察 其对肿瘤细胞端粒功能的影响，并筛选出稳定转染hTERTC27及EGFP质粒的HeLa细胞株， 在裸鼠皮下接种成瘤，观察hTERTC27对肿瘤生长的抑制作用。这样极大的限制了 hTERTC27 作用的发挥；同时，稳定转染hTERTC27的HeLa细胞裸鼠皮下种植，与自然成瘤有一定的差B.
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因免疫治疗肿瘤的制剂。本发明所采取的技术方案是
一种基因免疫治疗肿瘤的静脉用制剂，由复制缺陷型腺病毒装载人端粒酶逆转录酶 C"末端多肽基因hTERTC27和可接受的药用辅料组成。
优选的，复制缺陷型腺病毒为Ad5。本发明的抗肿瘤基因制剂rAdv_hTERTC27，转染效率高，对肿瘤细胞的增值和凋亡 调节更为有效。同时，本发明的抗肿瘤基因制剂，能有效的将目的肽段转染进入树突状细胞 DCs,使DCs激活，分泌IFN- y、IL-2，增加并进一步刺激T淋巴细胞增殖，并促使T淋巴细 胞对相应肿瘤细胞产生特异性的杀伤效应CTL，对肿瘤进行免疫调节。
图1是hTERTC27的毒种鉴定电泳图2是rAdv-hTERTC27病毒感染靶细胞后的RT-PCR、Western blot电泳图； 图3是rAdv-hTERTC27对肝癌(H印a 1_6)、胶质瘤(U87)细胞增殖和凋亡的影响图； 图4是rAdv-hTERTC27对细胞端粒酶活性的影响图； 图5是rAdv-hTERTC27转染骨髓来源DCs效果图； 图6是rAdv-hTERTC27转染对DCs分泌细胞因子的影响； 图7是rAdv-hTERTC27-DCs促进T淋巴细胞增殖的作用； 图8是rAdv-hTERTC27-DCs促进T淋巴细胞杀伤肿瘤靶细胞的作用； 图9是注射rAdv-hTERTC27后对小鼠肝癌肿瘤体积和生存期的影响图。
具体实施例方式一种基因免疫治疗肿瘤的静脉用制剂，由复制缺陷型腺病毒装载人端粒酶逆转录 酶C-末端多肽基因hTERTC27和可接受的药用辅料组成。可接受的药用辅料是本领导技术 人员所熟知的，如生理盐水等。优选的，复制缺陷型腺病毒为Ad5。复制缺陷型腺病毒Ad5是由骨架质粒pBHGlox_El，3Cre和穿梭质粒 pDC316-hTERTC27-EGFP双质粒共转染293细胞，同源重组产生重组腺病毒。下面结合实施例，进一步说明本发明。rAdv-hTERTC27 (recombinant adenovirus-hTERTC27_EGFP)的制备及鉴定
1)将293细胞接种于六孔板中，每孔5 X 105个细胞，培养基为DMEM+10% Hyclone胎 牛血清，置37°C含5% C02的培养箱中培养过夜；
2)换液，用新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养至细胞生长至底面积的 80 90% ；取24 ii g骨架质粒和6 ii g穿梭质粒，混合均勻，其中骨架质粒选用pBHGlox_El， 3Cre,穿梭质粒选用 pDC316-hTERTC27-EGFP ；
3)将混合均勻的质粒用1800 u 1的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min ；取60 yl 的Lipofectamine2000脂质体用1800 u 1的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min ；
4)将稀释的混合质粒与稀释的脂质体混合，室温避光放置30imn ；将室温避光放置 的混合物均勻地与培养好的细胞混合，参照LipofectamindOOO脂质体说明书进行转染；
5)转染后第二天，将长满的细胞传代于25cm2细胞培养瓶中，用含5%胎牛血清的 DMEM培养基继续培养，每天观察，待细胞长满瓶底时，再传入75 cm2细胞培养瓶中，当细胞 变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑，表明细胞出毒，待细胞大部分病变并从底部脱 落后收取出毒细胞；6)将出毒的细胞培养瓶先后置于-70°C冰箱和37°C水浴锅中反复冻融三次，使病毒 从病变细胞中充分释放，将冻融液3000rpm离心5min，收集含病毒的上清液，得第一代毒种 (P1)；
7)用P1转染293细胞，培养之后收毒，PCR扩增、电泳鉴定无误后，得到第二代毒种 (P2)；
8)用P2转染293细胞，培养之后收毒，将收获的病毒上清用DNase酶消化后，用 0. 45um的滤膜过滤，然后过离子柱纯化，之后再过分子筛进一步纯化病毒；
9)将纯化的病毒保存于腺病毒保存液中，经除盐处理后用0. 22 ym —次性滤器过滤 除菌，从而得到无菌的纯化病毒重组腺病毒人端粒酶多肽基因rAdv-hTERTC27。电泳鉴定图如图1所示。RT-PCR、Western blot检测重组腺病毒在H印al_6细胞株中的表达
1)将生长状态良好、70% 80%融合的Ifepal-6细胞消化计数，5X 105cells/孔传代 接种于 6 孔培养板中，按 M0I=20 转染 rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP，用含 10%FCS 的 RPMI 1640 完全培养基于37°C、5%C02培养箱中孵育48h，用于RT-PCR和Western blot检测；
2)取 1 P g 总 RNA 逆转录成为 cDNA，反应为 42 °C 70min, 70 °C 15min, 4 °C 保存；lOiil cDNA与0. 4iil蛋白酶k混合56 °C 30min,沸水浴lOmin，冰上骤 冷，以破裂病毒衣壳；用Premix Taq进行聚合酶链式反应PCR，hTERTC27的引物 为hTERTC27-F (5'-ATGACAGTGGTGAACTTCC-3' ) (SEQ ID NO1)，hTERTC27_R (5，-TCAGTCCAGGATGGTCTTG-3，)(SEQ ID NO 2) (PCR 产物 716bp) ;PCR 反应程序94 °C 5min，30 个循环(94°C 30sec，55°C 30sec，72°C lmin),72°C lOmin，PCR 产物上样到含有 SYBR Safe DNA染料(0. 1 u g/ml)的1. 0 %琼脂糖上，在TBE中以100V的电压跑30min，用 凝胶成像仪观察结果；
3)取15ii g总蛋白100°C变性5min，加入等体积2XSDS蛋白电泳上样缓冲液，混勻 上样，并加蛋白质分子量预染Marker —起电泳(200V，至溴酚蓝到达分离胶底部或进入电 泳槽)；电转膜，70V, lh，可见预染Marker亦转至PVDF膜上；TBST洗膜，5minX3次；封闭液 室温封闭，2h(封闭完不洗膜);加一抗(1:1000)孵育，4°C振荡过夜；TBST洗膜，5minX6次； 加HRP标记的二抗(1 1000)，室温孵育lh ；TBST洗膜，5minX6次；暗室曝光现配发光液， 将ECL试剂盒的A液和B液按1 1混合的，滴加至膜上，在暗室进行曝光。小鼠原位肝癌模型的建立
实验动物C57BL/6小鼠24只，雌雄各半，体重18_21g ；瘤株采用小鼠肝癌细胞 H印al-6，由上海细胞库提供。方法取对数期生长的Ifepal-6细胞制备密度为5X 107个/ml的细胞悬浮液，采 用微量注射器于每只小鼠肝包膜下注射细胞0. lml(5X106个)，分笼饲养于SPF环境下，所 有裸鼠自由饮食，观察体重变化继续喂养至产生肝癌，备用。rAdv-hTERTC27对肝癌(Ifepa 1-6)细胞增殖和凋亡的影响
1) 将对数生长期的H印1-6细胞，以每孔6000个细胞接种在96孔板中；分为3 组，rAdv-hTERTC27、rAdv_EGFP24 和 PBS 组，每组 4 个复孔；24 小时后 rAdv_hTERTC27 和 rAdv-EGFP 分别按照 M0I=30 感染 rAdv_hTERTC27 和 rAdv-EGFP, PBS 组加入与 rAdv-hTERTC27等体积的PBS ；重新置于37°C、5%C02培养箱中培养48小时；2)细胞的增值采用CCK-8 clolrimetric assays (Dojindo Molecular Technologies, Inc. , Gaithersbury，MD, USA)进行测定；取出96孔板，各孔中加入10 μ 1 CCK-8溶液，继 续培养4小时，室温振荡5分钟后，通过化学发光酶标仪测定在450nm处的吸光值(参比波长 650nm)；
3)观察不同处理组细胞凋亡的差异；同步骤1，24小时后用光学显微镜观察各组 细胞形态学变化；然后在各孔细胞中分别加入Hochest 33258与PI使其终浓度分别为 10 μ g/ml与100 μ g/ml，4°C避光保存10分钟后在荧光显微镜上进行观察，Hochest染色以 紫外光340nm波长激发，荧光显微镜下观察。凋亡细胞染色呈强蓝色荧光，而正常细胞只呈微弱荧光，死细胞则不被染色，由此 可检测出凋亡；在荧光显微镜下选用大于536nm的激发光观察PI染色结果，染色呈红色荧 光为死亡细胞，通过计数不同组凋亡和死亡细胞数量比较不同处理组间差别。其结果如图 3所示。rAdv_hTERTC27对细胞端粒酶活性的影响
端粒酶活性采用PCR ELISA试剂盒(Roche，Mannheim, Germany)进行测定。1) 取对数生长期的H印1-6细胞，当细胞生长至约90%融合时用0.25胰酶消 化，0. OlM pH7.3 PBS洗细胞3次，于15mL离心管中制成单细胞悬液；将细胞稀释至浓度为 2X105cellS/ml，以每孔500μ 1细胞悬液将细胞接种在24孔板中；轻轻摇动，使细胞均勻， 置于37°C、5%C02培养箱中培养48小时；
2)将各孔细胞分为3组，每组设4个复孔，rAdv-hTERTC27和rAdv_EGFP分别按照 M0I=30感染靶细胞，第三组加入与rAdv-hTERTC27同体积的PBS，重新置于37°C、5%C02培 养箱中培养24小时；
3)端粒酶活性检测每个EP管加200 μ 1细胞裂解液，冰上孵育30分钟，期间摇动 EP管使细胞充分裂解，16000Xg 4°C离心20分钟；取上清，转移至一新的EP管；另取一组 蛋白样品经过100°C水浴10分钟变性，作为阴性对照组，用BCA法测量各组蛋白浓度，按每 个样品2 μ g蛋白计算上样量并上样，具体操作步骤见Telomerase PCR ELISA Kit说明书。分别采用银染法和ELISA法对端粒酶活性进行标记，各组端粒酶活性结果如图4 所示。骨髓来源树突状细胞(DCs)及rAdv_hTERTC27感染DCs转染效率观察
1)骨髓来源树突状细胞的分离取5-6周龄的C57BL/6小鼠，断颈椎处死，无菌剥离 股骨和胫骨，剪至红骨髓，用30 mL注射器吸取RPMI1640将骨髓冲至培养皿中，100目筛网 过滤后458Xg离心6min收集骨髓细胞，细胞沉淀加入预温的0. 83% Tris-NH4C1 3mL裂解 红细胞，裂解5min后加入40 mL RPMI 1640 :458 X g离心6 min，弃上清；
2)台盼蓝拒染法计数活细胞数(测定细胞活力大于95%)，细胞沉淀加入RPMI1640完 全培养基(含10%胎牛血清)，接种至6孔培养板，加入lOng/mL rmGM_CSF、5 ng/mL IL-4， 每孔加完全培养基至4 mL ；至第3天，换含相同浓度细胞因子的完全培养液；至第5天，半 量换液并补足细胞因子；至第6天，轻轻吹打收集所有的悬浮细胞，即为体外扩增的小鼠骨 髓来源的DCs ；每日用相差显微镜观察细胞的生长和形态变化。3)与 200 ng/mL LPS共培养养 2 4 h 后，按照M0I=200 分别加入rAdv_hTERTC27 或rAdv-EGFP孵育24 h，在荧光显微镜下观察转染效率。
表达绿色荧光即为有效转染入DCs的rAdv-hTERTC27或rAdv_EGFP。结果如图5 所示。rAdv-hTERTC27 刺激 DCs 分泌细胞因子 11-2、INF- γ 增加
1、收集rAdv-hTERTC27，rAdv-EGFP或PBS感染24小时的各组DC培养上清；
2、ELISA法检测DC培养上清中INF-γ和IL-2的含量 1) NF-y-ELISA (R&D Systems, USA)
①用IXCalibrator Diluent RD5P 剃度稀释配制 5000pg/mL、2500 pg/mL、1250 pg/ mL、625 pg/mL、312 pg/mL、156 pg/mL 禾口 78 pg/mL 的标准品，以 1 XCalibrator Diluent RD5P作为Opg/mL (零对照)；
②用IXCalibratorDiluent RD5P将待检测样品稀释50倍；
③在酶标板中加入AssayDiluent RD1-55，每孔100 L ；
④分别在相应的孔中加入100 L标准品、100 L零对照和100 L待测样品，各设2 个复孔，粘贴膜封盖，置于水平轨道震荡器上，室温、500rpm振荡孵育2h ；
⑤吸掉液体，用WashBuffer约500 L/孔洗涤4次，在滤纸上印干洗涤液；
⑥加入6CkineConjugate 200 L/孔，粘贴膜封盖，置水平轨道震荡器上，室温、 500rpm振荡孵育2h ；
⑦重复步骤⑥1次；
⑧加入Substrate Solution 200 L/孔，避光、室温孵育 20min ；
⑨加入Stop Solution 50 L/ 孔；
⑩在30min内用酶标仪测定450nm波长处的光密度(OD)值，以570nm为参考波长； 绘制标准曲线，计算样品的浓度。2) IL-2-ELISA (R&D Systems, USA) 具体操作步骤同上，结果如图6所示。转染rAdv_hTERTC27的DCs对T细胞增值及细胞毒性T细胞(CTL)效应的观察 (1) T淋巴细胞的培养
断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1 2分钟。在超净台中小心剪开小鼠的腹 部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏；在35mm培养皿中放入 4-5mL EZ-Sep Mouse IX淋巴细胞分离液(使用前摇勻淋巴细胞分离)；用镊子固定尼龙 网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分 离液中；把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μ1的 1640培养基。(2) DCs对淋巴细胞的增殖实验
在重组腺病毒感染24h后的rAdv-hTERTC27-DC、rAdv_EGFP-DC、未处理的DC和T淋 巴细胞共培养；按刺激细胞(S)效应细胞(T)=I :5、1 :10、1 :20、1 40的比例，在96孔 板加入中加入1X1 O 4/孔的3种DCs各100 μ 1和5X1 O4 μ 1/孔、1 X IO5 μ 1/孔、 2 X IO5 μ 1/孔、4X IO5 μ 1/孔淋巴细胞100 μ 1，同时设立对照，每组各设3个复孔；细胞培 养箱孵72h，加入CCK-8试剂20 μ 1/孔，继续孵育3 h后，用酶标仪在450nm波长测定吸光 度值(参比波长650nm)。结果如图7所示。(3) rAdv-hTERTC27-DC刺激的T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用收集体外培养的Hepal-6细胞，按每孔1 X IO4个细胞的密度接种细胞于96孔板中， 作为靶细胞。以分别与rAdv-hTERTC27-DC、rAdv-EGFP-DC、未处理的DC与T淋巴细胞共同 培养24h，收集T淋巴细胞作为效应细胞。效靶比(E:T)为5:1、20:1、40:1，另外设只有靶 细胞和只有效应细胞的对照孔，共培养48h后用CCK-8法检测各组在波长450 nm下吸光 度值(参比波长650nm)。按下式计算CTL的杀伤活性
杀伤率=[1_ (效靶孔值一效应孔值)/靶细胞孔值]X 100% 结果如图8所示。体内实验观察rAdv_hTERTC27对肿瘤生长的抑制作用
1)动物分为3组，每组8只小鼠组 1 :rAdv-hTERTC27(5X 107pfu)4i2: rAdv-EGFP (5 X 107pfu)；组 3 与 rAdv-hTERTC27 等体积的 PBS ；
2)用微量注射器肝包膜下注射Hepal-6小鼠肝癌细胞建立小鼠原位肝癌肿瘤模型， 肝包膜下接种后第7天根据分组尾静脉注入rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP或PBS ；
3)各组动物治疗后生存期观察及肿瘤大小测量观察小鼠生活状态及生存期；
4)小鼠于濒死前即取肝脏组织麻醉动物，剪开大鼠腹腔，切取肝脏组织，观察各组肿 瘤生长情况，并按垂直和水平方向测量肿瘤大小，肿瘤体积=a2XbX π /6(a为肿瘤的短径， b为肿瘤的长径)。结果如图9所示。结果
图1是hTERTC27的毒种鉴定电泳图，由可见在750bp条带稍下方有明亮条带，与阳性 对照的位置和亮度相仿，且两个样本均产生该条带，从图中可以确定hTERTC27成功包装进 了腺病毒载体中。图2是rAdv_hTERTC27病毒感染靶细胞后的RT-PCR及Western Blot电泳图，由 图可见，在小鼠肝癌细胞中成功检测到了 hTERTC27的DNA片段和蛋白片段，由此可知重组 腺病毒成功将hTERT携带入靶细胞内。图3是rAdv_hTERTC27对肝癌(!fepa 1-6)细胞增殖和凋亡的影响图。为了检测 hTERTC27对肿瘤细胞生长的抑制作用，将rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP或PBS感染靶细胞 孵育48小时后，细胞分别用PI和Hochest进行染色。由图可见rAdv_hTERTC27感染细胞 后诱导肿瘤细胞凋亡或死亡明显强于rAdv-EGFP和PBS组(Fig. 3A)。通过CCK-8检测法 可看到rAdv-hTERTC27较rAdv-EGFP或PBS相比明显抑制了肿瘤细胞的增值(图3B)。图4是rAdv-hTERTC27对细胞端粒酶活性的影响图。为了证明hTERTC27是否是通 过影响端粒酶活性而起到促进凋亡作用的，将重组腺病毒感染靶细胞，48小时后收集细胞 提取蛋白，采用TRAP-ELISA检测端粒酶活性，如图所示，在rAdv_hTERTC27、rAdv-EGFP和 PBS三组中端粒酶活性都是阳性的，三者之间并没有明显差别。ELISA法和银染法均证实了 同样的结果。图5是rAdv_hTERTC27转染骨髓来源DCs效果图。其中A所示为从小鼠骨髓分离 得到的DCs，培养至第八天，DCs成熟可以进行下一步实验。B所示为病毒感染DCs 24小时 后，绿色荧光所示为转染入DCs的病毒颗粒。当M0I=200时，转染效率可达到80%。图6是rAdv-hTERTC27 Ad_6Ckine/IFN γ转染对DC分泌细胞因子的影响； rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP或PBS感染DCs24小时后，培养上清中的IFN- y、IL-2浓度用
8ELISA试剂盒来测定，如图7所示，rAdv-hTERTC27感染DCs组上清中IFN- γ (328. 6 士 11. 26 pg/ml), IL-2 (8. 18士0. 45 pg/ml)明显高于 rAdv-EGFP 与 PBS 组，IFN- γ 与 IL-2 浓度分 别为 IFN-Y (234. 50士 10. 56 pg/ml, Ρ<0· 05)，IL-2 (3.06士0· 42 pg/ml, Ρ<0· 05)， IFN-y (251. 63士 13. 0 pg/ml, Ρ<0· 05)，IL-2 (2. 65士0.38 pg/ml, Ρ<0· 05)。这部分实 验结果证明了 rAdv-hTERTC27可以促进DC细胞分泌细胞因子增加。这也是rAdv_hTERTC27 免疫治疗的重要机制之一。 图7是rAdv-hTERT27-DCs促进T淋巴细胞增殖；刺激指数(Si)用来计算DC 细胞刺激后T淋巴细胞增值程度，如图8所示rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP、PBS分别感 染DC细胞后刺激T淋巴细胞增值水平分别为0. 91 士0. 09,0. 43士0. 01,0. 45士0. 02 (S/ T=I: 5) ；0. 56士0. 02,0. 37 + 0. 01,0. 37 + 0. 02 (S/T=l 10)、0· 46士0. 01,0. 37士0. 01、 0.37 士 0.02 (S/T=l:20) ;0· 41 士 0. 01、0· 35 士 0. 00、0· 39 士 0. 012 (S/T=l:40),由结果可 见rAdv-hTERTC27感染DC细胞后，在S/T彡1:10时，DC细胞刺激T淋巴细胞增值的能力 明显强于rAdv-EGFP与PBS组(P<0. 05)，而rAdv-EGFP与PBS之间差异不具有统计学意义 (P>0. 05)。 图8是rAdv-hTERTC27-DCs促进T淋巴细胞杀伤肿瘤靶细胞的作用；如图所 示E/T比值分别为5:1、20:1、40:1，结果显示rAdV-hTERTC27_DCs活化的T淋巴细胞对 H印al-6 细胞的杀伤率在 E:T=5:1、E:T=20 1 和 E:T=40 1 时分别为(16. 16士2. 75)%、 (44. 44 士 3. 11) % 和(65. 21 士 2. 98) % ；rAd-EGFP-DCs 禾口 PBS-DCs 活化的 T 淋巴细胞 在 E:T=5:1、E:T=20 :1 禾口 E:T=40:1 时分别为(17. 79士2. 95) %、(33. 65士3. 16) %、 (40. 54士3. 18)% 和(16. 99士2. 97)%、(30. 57士2. 64)%、(48. 72士3. 45)%。当 E:T 彡 20 1时，rAdv-hTERTC27-DCs活化的T淋巴细胞对!fepal-6肿瘤细胞的杀伤率明显高于 rAd-EGFP-DC 和 PBD-DC 组(/7<0. 05 )，而 rAd-EGFP-DC 和 PBS-DC 组间差异不具有显著性 (P>0. 05)。图9是注射rAdv_hTERTC27后对小鼠肝癌的影响图，从图中可以看出，注射了 rAdv-hTERTC27的小鼠，其肝癌已得到很好的抑制。如图所示，由大体模型可以直观地看到 rAdv-hTERTC27治疗组较rAdv-EGFP和PBS治疗组肿瘤体积明显缩小(P<0. 05)，测量肿瘤 体积分别为(1012士21. 43)mm3, (2567士32. 21)mm3, (2789士29. 12)mm3。而 rAdv_hTERTC27 治疗组生存期较rAdv-EGFP和PBS治疗组明显延长(P<0. 05)，分别为68天，34. 5天和31 天。由此可见rAdv-hTERTC27能够有效地抑制小鼠肝癌的生长，延长了荷瘤小鼠的生存期。 在实验过程中同时发现，对小鼠而言，rAdv-hTERTC27的注射量为5X107pfu/鼠时，其效果 最好。本发明的抗肿瘤基因制剂rAdv_hTERTC27，转染效率高，对肿瘤细胞的增值和凋亡 调节更为有效。同时，本发明的抗肿瘤基因制剂，能有效的将目的肽段转染进入树突状细胞 DCs,使DCs激活，分泌IFN- y、IL-2，增加并进一步刺激T淋巴细胞增殖，并促使T淋巴细 胞对相应肿瘤细胞产生特异性的杀伤效应CTL，对肿瘤进行免疫调节。通过以上途径，本发 明的抗肿瘤基因制剂可应用于多种肿瘤的治疗。
权利要求
一种基因免疫治疗肿瘤的静脉用制剂，由复制缺陷型腺病毒装载人端粒酶逆转录酶C 末端多肽基因hTERTC27和可接受的药用辅料组成。
2.根据权利要求1所述的一种基因免疫治疗肿瘤的静脉用制剂，其特征在于复制缺 陷型腺病毒为Ad5。
全文摘要
本发明公开了一种基因免疫治疗肿瘤的静脉用制剂，由复制缺陷型腺病毒装载人端粒酶逆转录酶C-末端多肽基因hTERTC27和可接受的药用辅料组成。本发明的抗肿瘤基因制剂rAdv-hTERTC27，转染效率高，对肿瘤细胞的增值和凋亡调节更为有效。同时，本发明的抗肿瘤基因制剂，能有效的将目的肽段转染进入树突状细胞DCs，使DCs激活，分泌IFN-γ、IL-2，增加并进一步刺激T淋巴细胞增殖，并促使T淋巴细胞对相应肿瘤细胞产生特异性的杀伤效应CTL，对肿瘤进行免疫调节。
文档编号A61K48/00GK101940796SQ201010295079
公开日2011年1月12日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者何蕾, 孔祥复, 彭英, 黄君健, 龚汉贤 申请人:中山大学孙逸仙纪念医院
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