CpG-ODN2395在制备治疗辐射损伤药物中的应用的制作方法
专利名称：CpG-ODN2395在制备治疗辐射损伤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及CPG-0DN2395在制备治疗辐射损伤药物中的应用。
背景技术：
目前我国辐射防护药物的研究主要集中于照射前给药，然而辐射事故的发生往往是不确定的，绝大多数辐射损伤的防护治疗是在事故发生后进行的，所以研制一种照后给药仍具有显著辐射保护作用的药物更具有实用意义。CpG-ODN (CpG-oligodeoxynuleotide)是人工合成的一种含有非甲基化胞嘧啶-鸟嘧啶序列的寡核苷酸链。CpG-0DN2395是CpG-ODN中的一种经典类型，具体序列为5' -TcgTcgTTTTcgGcgcgcgCcg-3 ‘(大写字母代表硫代修饰，小写字母磷酸化修饰)，其在免疫调节(Michael J. McCluskie, Risini D. ffeeratna, Arthur Μ. Krieg, et al.，CpG DNA is an effective oral adjuvant to protein antigens mice, Vaccine. 2001 (19) 950-957·)、肿瘤治疗(Luka Milas, Kathryn A. Mason, Hisanori Ariga, et al. , CpGOligodeoxynucIeotide Enhances Tumor Response to Radiation, Cancer Research. 2004 (64) 5074-5077)、抗感染(Manolis pasparakis. Regulation of tissue homeostasis by NF- κ B signaling !implications for inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 2009 (9) 778-788.)等方面的应用已得到了深入研究。目前尚未见有关CpG_0DN2395在治疗辐射损伤方面的作用的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供CpG_0DN2395的新用途。本发明提供了 CpG_0DN2395在制备治疗辐射损伤药物中的应用。本发明人在实验中惊奇发现在大剂量辐射后连续3天给予一定剂量的 CpG-0DN2395，通过观察不同剂量辐射后照射给药组和照射对照组小鼠30天存活率显著提高；对6. OGy, 6. 5Gy和8. OGy照射后各个照射给药组和照射对照组存活率进行辐射剂量 (D)-存活率线性拟合并计算出其半数致死剂量(LD5(i/3(i)照射给药组达到11.7Gy而照射对照组仅为7. 4Gy，辐射剂量降低因子(DRF)为1. 53 ；观察辐射后不同时期照射给药组和照射对照组的动物外周血白细胞和骨髓中有核细胞含量变化，发现照射给药组动物的造血系统功能损伤和恢复程度都较照射对照组动物好；外源性和内源性皮结节法检测照射给药组和照射对照组中动物造血系统造血干细胞的含量，其结果同样也表明照射给药组动物中造血干细胞损伤相对较轻。此外CpG-0DN2395具有制备简单，价格低廉，毒性较低等优点。因此，本发明涉及的CpG_0DN2359，可将其作为一种辐射损伤治疗药物。特别是对辐射事故发生后造成的急性骨髓型放射病进行治疗。
图1是不同剂量照射后照射给药组与照射对照组的小鼠30天存活率。图2是对不同剂量照射后照射给药组与照射对照组小鼠存活率进行辐射剂量 (D)-存活率线性拟合。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。实施例1 观察不同剂量辐射后照射给药组和照射对照组小鼠30天存活率。实施例所用的CpG_0DN2359是由生工生物工程(上海)有限公司合成并HPLC纯化，具体序列为 5' -TcgTcgTTTTcgGcgcgcgCcg-3 ‘ (SEQ ID NO :1)，其中第 1，4，7-10，13， 20位碱基硫代修饰。实施例中选用雄性BALB/c小鼠20_22g(由上海斯莱克生物科技有限公司提供， SPF级)。实验前将小鼠随机分为7组，(包括正常组，6. OGy照射给药组，6. OGy照射对照组，6. 5Gy照射给药组，6. 5Gy照射对照组，8. OGy照射给药组和8. OGy照射对照组)每组8 只小鼠，重复3次。建立放射损伤模型，采用Co6tl释放的Y-射线对小鼠进行全身照射，辐射剂量率为0. 80Gy/min,分别给予6. OGy (亚致死剂量)，6. 5Gy (致死剂量)和8. OGy (超致死剂量)照射。照射给药组中每只小鼠在照射后30分钟和第2天，第3天连续通过腹腔注射给予由PBS (PH = 7. 2)制成的浓度为250ug/ml的CpG_0DN2395溶液0. 2m,照射对组在相同时间点给予PBS 0. 2ml/只。观察小鼠的30天存活率。实验结果如图1所示在6. 0，6. 5和SGy照射给药组组小鼠存活率分别为100%， 89%和81%，而给予PBS的照射对照组存活率分别为95%，58%和35%。实施例2 对6. OGy, 6. 5Gy和8. OGy照射后各个照射给药组和照射对照组存活率进行辐射剂量(D)-存活率线性拟合并计算出其半数致死剂量(LD5(i/3(i)和辐射剂量降低因子(DRF)。将实施例1中的存活率实验结果通过CurveExpert 1. 3软件进行线性拟合，，最终计算出实验各组中小鼠的LD5Q/3Q和DRFJf CpG-0DN2395对辐射损伤的治疗效果量化。通过拟合的线性方程(如图2所示)可以计算出照射给药组的LD5Q/3Q为11. 3Gy，照射对照组 LD50730 为 7. 4Gy ；DRF 为 1. 53 (见表 1)。拟合的线性方程是照射给药组为y = "8. 53D+148. 35，照射对照组为y =-26. 62D+244. 54 (D 代表辐射剂量)。表1.通过辐射剂量-存活率线性拟合方程计算出照射给药组和照射对照组的半数致死剂量(LD5(i/3(i)和辐射剂量降低因子(DRF)
组别截距(b)斜率(a)y=aZ -bLD50/30DRF照射给药组148.35-8.53y--8.53Z>fl48.3511.31.53照射对照组244.54-26.62y=-26.62ZH244.547.4 实施例3 观察辐射后不同时期照射给药组和照射对照组的小鼠外周血白细胞和骨髓中有核细胞含量变化。
本次实施例中所需小鼠的品性和药物CpG_0DN2395与实施例1相同，将小鼠随机分组(包括，正常组，照射给药组，照射对照组)，每组6只，重复3次。建立辐射损伤模型，采用Co6°释放的Y-射线对小鼠进行全身照射，辐射剂量率为0. 80Gy/min，照射剂量为6Gy ； 各组小鼠给药剂量，给药时间点与实施例1相同。在照射后第1天(辐射后初期)，第9天 (辐射后极期)，观天(辐射后恢复期)，尾静脉取血，将血液中红细胞破除，应用细胞计数及分析系统(CASY-Technology，德国)计数白细胞数(见表2)；同时取小鼠股骨，用注射器将股骨中细胞完全冲去，再通过注射器的4号针头制备成单细胞悬液，应用细胞计数及分析系统计数股骨中有核细胞数(见表3)。由表2，表3可以看出6. OGy照射后连续3次给予CpG-0DN2395，小鼠其外周血白细胞数和股骨中有核细胞数都较照射对照组高，尤其是在第9天和第28天。表2照射后在不同时期检测正常组，照射给药组与照射对照组小鼠的外周血白细
胞含量
权利要求
1. CpG-0DN2395在制备治疗辐射损伤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域。CpG-ODN是人工合成的一种含有非甲基化胞嘧啶-鸟嘧啶序列的寡核苷酸链。CpG-ODN2395是CpG-ODN中的一种经典类型，具体序列为5′-TcgTcgTTTTcgGcgcgcgCcg-3′，其在免疫调节、肿瘤治疗、抗感染等方面的应用已得到了深入研究。本发明的目的在于提供CpG-ODN2395的新用途。本发明提供了CpG-ODN2395在制备治疗辐射损伤药物中的应用。
文档编号A61K31/7115GK102309502SQ20101029692
公开日2012年1月11日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者刘聪, 张超, 李百龙, 蔡建明, 高福 申请人:中国人民解放军第二军医大学
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及CPG-0DN2395在制备治疗辐射损伤药物中的应用。
背景技术：
目前我国辐射防护药物的研究主要集中于照射前给药，然而辐射事故的发生往往是不确定的，绝大多数辐射损伤的防护治疗是在事故发生后进行的，所以研制一种照后给药仍具有显著辐射保护作用的药物更具有实用意义。CpG-ODN (CpG-oligodeoxynuleotide)是人工合成的一种含有非甲基化胞嘧啶-鸟嘧啶序列的寡核苷酸链。CpG-0DN2395是CpG-ODN中的一种经典类型，具体序列为5' -TcgTcgTTTTcgGcgcgcgCcg-3 ‘(大写字母代表硫代修饰，小写字母磷酸化修饰)，其在免疫调节(Michael J. McCluskie, Risini D. ffeeratna, Arthur Μ. Krieg, et al.，CpG DNA is an effective oral adjuvant to protein antigens mice, Vaccine. 2001 (19) 950-957·)、肿瘤治疗(Luka Milas, Kathryn A. Mason, Hisanori Ariga, et al. , CpGOligodeoxynucIeotide Enhances Tumor Response to Radiation, Cancer Research. 2004 (64) 5074-5077)、抗感染(Manolis pasparakis. Regulation of tissue homeostasis by NF- κ B signaling !implications for inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 2009 (9) 778-788.)等方面的应用已得到了深入研究。目前尚未见有关CpG_0DN2395在治疗辐射损伤方面的作用的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供CpG_0DN2395的新用途。本发明提供了 CpG_0DN2395在制备治疗辐射损伤药物中的应用。本发明人在实验中惊奇发现在大剂量辐射后连续3天给予一定剂量的 CpG-0DN2395，通过观察不同剂量辐射后照射给药组和照射对照组小鼠30天存活率显著提高；对6. OGy, 6. 5Gy和8. OGy照射后各个照射给药组和照射对照组存活率进行辐射剂量 (D)-存活率线性拟合并计算出其半数致死剂量(LD5(i/3(i)照射给药组达到11.7Gy而照射对照组仅为7. 4Gy，辐射剂量降低因子(DRF)为1. 53 ；观察辐射后不同时期照射给药组和照射对照组的动物外周血白细胞和骨髓中有核细胞含量变化，发现照射给药组动物的造血系统功能损伤和恢复程度都较照射对照组动物好；外源性和内源性皮结节法检测照射给药组和照射对照组中动物造血系统造血干细胞的含量，其结果同样也表明照射给药组动物中造血干细胞损伤相对较轻。此外CpG-0DN2395具有制备简单，价格低廉，毒性较低等优点。因此，本发明涉及的CpG_0DN2359，可将其作为一种辐射损伤治疗药物。特别是对辐射事故发生后造成的急性骨髓型放射病进行治疗。
图1是不同剂量照射后照射给药组与照射对照组的小鼠30天存活率。图2是对不同剂量照射后照射给药组与照射对照组小鼠存活率进行辐射剂量 (D)-存活率线性拟合。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。实施例1 观察不同剂量辐射后照射给药组和照射对照组小鼠30天存活率。实施例所用的CpG_0DN2359是由生工生物工程(上海)有限公司合成并HPLC纯化，具体序列为 5' -TcgTcgTTTTcgGcgcgcgCcg-3 ‘ (SEQ ID NO :1)，其中第 1，4，7-10，13， 20位碱基硫代修饰。实施例中选用雄性BALB/c小鼠20_22g(由上海斯莱克生物科技有限公司提供， SPF级)。实验前将小鼠随机分为7组，(包括正常组，6. OGy照射给药组，6. OGy照射对照组，6. 5Gy照射给药组，6. 5Gy照射对照组，8. OGy照射给药组和8. OGy照射对照组)每组8 只小鼠，重复3次。建立放射损伤模型，采用Co6tl释放的Y-射线对小鼠进行全身照射，辐射剂量率为0. 80Gy/min,分别给予6. OGy (亚致死剂量)，6. 5Gy (致死剂量)和8. OGy (超致死剂量)照射。照射给药组中每只小鼠在照射后30分钟和第2天，第3天连续通过腹腔注射给予由PBS (PH = 7. 2)制成的浓度为250ug/ml的CpG_0DN2395溶液0. 2m,照射对组在相同时间点给予PBS 0. 2ml/只。观察小鼠的30天存活率。实验结果如图1所示在6. 0，6. 5和SGy照射给药组组小鼠存活率分别为100%， 89%和81%，而给予PBS的照射对照组存活率分别为95%，58%和35%。实施例2 对6. OGy, 6. 5Gy和8. OGy照射后各个照射给药组和照射对照组存活率进行辐射剂量(D)-存活率线性拟合并计算出其半数致死剂量(LD5(i/3(i)和辐射剂量降低因子(DRF)。将实施例1中的存活率实验结果通过CurveExpert 1. 3软件进行线性拟合，，最终计算出实验各组中小鼠的LD5Q/3Q和DRFJf CpG-0DN2395对辐射损伤的治疗效果量化。通过拟合的线性方程(如图2所示)可以计算出照射给药组的LD5Q/3Q为11. 3Gy，照射对照组 LD50730 为 7. 4Gy ；DRF 为 1. 53 (见表 1)。拟合的线性方程是照射给药组为y = "8. 53D+148. 35，照射对照组为y =-26. 62D+244. 54 (D 代表辐射剂量)。表1.通过辐射剂量-存活率线性拟合方程计算出照射给药组和照射对照组的半数致死剂量(LD5(i/3(i)和辐射剂量降低因子(DRF)
组别截距(b)斜率(a)y=aZ -bLD50/30DRF照射给药组148.35-8.53y--8.53Z>fl48.3511.31.53照射对照组244.54-26.62y=-26.62ZH244.547.4 实施例3 观察辐射后不同时期照射给药组和照射对照组的小鼠外周血白细胞和骨髓中有核细胞含量变化。
本次实施例中所需小鼠的品性和药物CpG_0DN2395与实施例1相同，将小鼠随机分组(包括，正常组，照射给药组，照射对照组)，每组6只，重复3次。建立辐射损伤模型，采用Co6°释放的Y-射线对小鼠进行全身照射，辐射剂量率为0. 80Gy/min，照射剂量为6Gy ； 各组小鼠给药剂量，给药时间点与实施例1相同。在照射后第1天(辐射后初期)，第9天 (辐射后极期)，观天(辐射后恢复期)，尾静脉取血，将血液中红细胞破除，应用细胞计数及分析系统(CASY-Technology，德国)计数白细胞数(见表2)；同时取小鼠股骨，用注射器将股骨中细胞完全冲去，再通过注射器的4号针头制备成单细胞悬液，应用细胞计数及分析系统计数股骨中有核细胞数(见表3)。由表2，表3可以看出6. OGy照射后连续3次给予CpG-0DN2395，小鼠其外周血白细胞数和股骨中有核细胞数都较照射对照组高，尤其是在第9天和第28天。表2照射后在不同时期检测正常组，照射给药组与照射对照组小鼠的外周血白细
胞含量
权利要求
1. CpG-0DN2395在制备治疗辐射损伤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域。CpG-ODN是人工合成的一种含有非甲基化胞嘧啶-鸟嘧啶序列的寡核苷酸链。CpG-ODN2395是CpG-ODN中的一种经典类型，具体序列为5′-TcgTcgTTTTcgGcgcgcgCcg-3′，其在免疫调节、肿瘤治疗、抗感染等方面的应用已得到了深入研究。本发明的目的在于提供CpG-ODN2395的新用途。本发明提供了CpG-ODN2395在制备治疗辐射损伤药物中的应用。
文档编号A61K31/7115GK102309502SQ20101029692
公开日2012年1月11日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者刘聪, 张超, 李百龙, 蔡建明, 高福 申请人:中国人民解放军第二军医大学
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