无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分的同时检测方法
专利名称：无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分的同时检测方法
技术领域：
本发明涉及一种无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分含量的同时检测方 法，更确切地讲是无糖型复方扶芳藤制剂中卫矛醇、黄芪甲苷和人参皂苷Rbl含量的同 时检测方法，属于复方中药制剂的分析检测领域。
背景技术：
复方扶芳藤制剂是由扶芳藤、黄芪、红参(或人参)三味中药经适宜的加工、 提取而制成的复方制剂，具益气补血、健脾养心的功效，有较好的补血、抗疲劳、提高 机体免疫等作用，特别适合于气血亏虚，精力不足，失眠多梦，神经衰弱等患者。扶芳 藤的主要成分是卫矛醇，而黄芪、红参(或人参)的主要成分有黄芪甲苷和人参皂苷等 成分。现代药理研究表明，复方扶芳藤制剂中的卫矛醇及皂苷类等成分，具有增强心血 管功能、增强造血功能、改善机体缺血状态等多种药理作用。目前复方扶芳藤制剂采用 的质量控制方法是按照《中国药典》(一部)收载的质量标准进行。现行质量标准中除 有TLC鉴别外，只有一个薄层色谱扫描的含量测定项目，用于测定制剂中黄芪甲苷的含 量；显然现有的质量控制方法未能达到全面控制产品质量的目的。在我们的前期研究工 作中，曾采用标准加入法测定了复方扶芳藤合剂中的人参皂苷Rgl和Rbl的含量；应用 RP-HPLC-UV方法，建立了复方扶芳藤合剂中主要皂苷成分的HPLC-UV指纹图谱分析 方法及HPLC-UV指纹图谱共有模式；并有用HPLC-ELSD法测定复方扶芳藤合剂中黄芪 甲苷含量的报道。扶芳藤是该制剂的君药。但从目前已经建立的复方扶芳藤制剂的质量 控制方法来看，这些方法较多的是测定制剂中黄芪、红参(或人参)的皂苷类成分，而对 制剂中扶芳藤的主要成分卫矛醇的测定则少见报道。卫矛醇为糖醇类结构，极性较大， 并且在紫外区没有吸收，因此一直无法用常规的高效液相色谱法进行分析。目前测定卫 矛醇的方法主要有薄层扫描法，柱前衍生化后用HPLC、GC测定的方法，这些方法均存 在实验操作步骤繁琐，实验条件不好控制等缺点。我们过去曾经报道过用正相色谱的氨 基柱结合ELSD检测器分析测定复方扶芳藤胶囊中黄芪甲苷和卫矛醇的含量，但该法用 的是正相柱，其缺点是当流动相含水量稍多时，固定相易流失，ELSD的基线噪音很大， 从而影响了方法的重复性及稳定性，并且色谱柱的寿命较短。到目前为止，尚未有只用 一个色谱系统就可同时测定复方扶芳藤制剂中3个药材的特征成分卫矛醇、黄芪甲苷和 人参皂苷含量的报道。
发明内容
本发明的解决方案是提供一种无糖型复方扶芳藤制剂中卫矛醇、黄芪甲苷和 人参皂苷Rbl含量的同时检测方法。该法采用超声辅助萃取法提取，并以新近开发的 HILIC (Hydrophilic Interaction LiquidChromatography)亲水色谱柱为固定相，以乙腈-水为
流动相，只用一个色谱条件便可同时测定该制剂中卫矛醇、黄芪甲苷、人参皂苷Rbl的
4含量。经科学实验证明，该法简便、快速、准确性和重复性较好，可同时测定该制剂中 3个药材的特征成分的含量，既可用于无糖型复方扶芳藤制剂成品的质量控制，也可用于 生产中各中间体的质量控制。本发明无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分的同时检测方法包括以下步 骤1.对照品溶液的制备①对照品溶液I的制备取黄芪甲苷和人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，置 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，即得含黄芪甲苷和人参皂苷Rb1的混合对照 品溶液。②对照品溶液II的制备取卫矛醇对照品适量，精密称定，置容量瓶中，先加 少量水溶解，再加稀甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇勻，即得卫矛醇对照品溶液。2.供试品溶液的制备①复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液I的制备取本品装量差异项下的胶囊 内容物(或片剂)研细，取细粉适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁 醇适量，密塞，超声提取，放冷，滤过，残渣用水饱和正丁醇少量多次洗涤，收集滤液 和洗涤液，用氨试液洗涤，取正丁醇层水浴蒸干，残留物加甲醇溶解并定容，摇勻，用 微孔滤膜(0.45 μ m)滤过，取续滤液，得供试品溶液I。②复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液II的制备取上述供试品溶液I制备项 下正丁醇提取后留下的残渣，置具塞锥形瓶中，精密加入稀甲醇水溶液适量，密塞，称 重，超声，放冷，补足重量，滤过，取续滤液稀释，定容；用孔径为0.45 μ m的微孔滤 膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液II。③无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液I的制备精密吸取合剂(口服液)适量， 加入适量水饱和的正丁醇，振摇均勻后，用超声仪辅助萃取，分取正丁醇层，用氨试液 洗涤，弃去氨水层，减压回收正丁醇，残渣用甲醇溶解并定容，用孔径为0.45 μ m的微 孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液I。④无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液II的制备取供试品溶液I制备项下正丁醇 萃取留下的下层液，蒸至稠膏状，加适量硅藻土拌样分散均勻，转移至具塞锥形瓶中， 精密加入水或稀甲醇的水溶液，称重，超声提取，放冷，补足重量，滤过，取续滤液用 稀甲醇稀释，摇勻；用孔径为0.45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液II。3.色谱条件以HILIC亲水色谱柱为固定相；乙腈-水为流动相，梯度洗脱； 柱温为25 30°C ；流速为lml/min ；检测器为蒸发光散射检测器。4.测定方法①黄芪甲苷、人参皂苷Rb1含量测定法分别精密吸取黄芪甲苷、人参皂苷Rb1 标准混合溶液及供试品溶液I适量，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面 积，以外标两点法对数方程计算，即得。②卫矛醇含量测定法分别精密吸取卫矛醇标准溶液及供试品溶液II适量，按 上述色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，以外标两点法对数方程计算，即得。经过研究，本发明优化的无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分的同时检测方法按以下步骤实施1.对照品溶液的制备①对照品溶液I的制备取黄芪甲苷和人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，置 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，制得含黄芪甲苷0.5 0.6mg/ml和人参皂 苷Rb1CU 0.2mg/ml的混合对照品溶液，即得。②对照品溶液II的制备取卫矛醇对照品适量，精密称定，置容量瓶中，先 加少量水溶解，再加含30%-40%甲醇的水溶液溶解并稀释至刻度，摇勻，制得浓度为 0.8 lmg/ml的卫矛醇对照品溶液，即得。2.供试品溶液的制备①复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液I的制备取本品装量差异项下的胶囊 内容物(或片剂)研细，取相当于原药材15-25克的细粉，精密称定，置具塞锥形瓶中， 精密加入水饱和正丁醇50ml，密塞，超声提取45min，放冷，滤过，残渣用水饱和正丁 醇少量多次洗涤，收集滤液和洗涤液，用氨试液洗涤后，取正丁醇层水浴蒸干，残留物 加甲醇溶解并定容至5ml，摇勻，用微孔滤膜(0.45 μ m)滤过，取续滤液，即得供试品溶 液I。②复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液II的制备取上述供试品溶液I制备项 下正丁醇提取后留下的残渣，置IOOml具塞锥形瓶中，精密加入含30%-40%甲醇的水溶 液50ml，密塞，称重，超声30min，放冷，补足重量，滤过，取续滤液Iml于5ml容量 瓶，加30%-40%甲醇至刻度，摇勻；用孔径为0.45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即 得供试品溶液II。③无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液I的制备精密吸取相当于原药材15-25克 的合剂(口服液)，加水饱和的正丁醇50ml，振摇均勻，超声辅助萃取20min，分取正丁 醇层，用氨试液洗涤，弃去氨水层，减压回收正丁醇，残渣用甲醇溶解并定容到5ml，用 孔径为0.45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液I。④无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液II的制备取供试品溶液I制备项下正丁 醇萃取后留下的下层液，蒸至稠膏状，加适量硅藻土拌样分散均勻，转移至IOOml具塞 锥形瓶中，精密加入含30%-40%甲醇的水溶液50ml，称重，超声30min，放冷，补足 重量，滤过，取续滤液Iml于5ml容量瓶，加30%-40%甲醇至刻度，摇勻；用孔径为
0.45μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液II。3.色谱条件及色谱适用性试验以 phenomenex Luna HILIC (250mmX 4.6mm
1.d.，5μιη)色谱柱为固定相，乙腈(A)-水(B)为流动相，其梯度洗脱的体积百分比条 件是0 5min 93% A，5 15min 93% 80% A, 15 25min 80% A ；柱温为 25 30°C；流速为lml/min;检测器为蒸发光散射检测器，色谱柱柱效以黄芪甲苷峰计算不小 于 15000。4.测定方法①黄芪甲苷、人参皂苷Rb1含量测定法分别精密吸取黄芪甲苷、人参皂苷Rb1 标准混合溶液5 μ 1、10 μ 1及供试品溶液I 10 μ 1，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪， 测定相应峰面积，以外标两点法对数方程计算，即得。②卫矛醇含量测定法分别精密吸取卫矛醇标准溶液2 μ 1、5 μ 1及供试品溶液ΙΙ5μ1，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，以外标两点法对数方程 计算，即得。本发明与现有技术相比，其主要优点及积极效果在于(1)本发明的检测方法，采用新的 HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)亲水色谱柱为固定相，只用一个色谱条件便可同时测定该制剂中主要特 征成分卫矛醇、黄芪甲苷、人参皂苷Rbl的含量。(2)本发明的检测方法，采用超声辅助萃取法制备合剂的供试品溶液，方法简 便、快速，易于操作，并有效地克服了通常液液萃取法操作繁琐及常见的乳化现象。(3)本发明的检测方法，适用于各种剂型的无糖型复方扶芳藤制剂的检测，如合 剂、胶囊或片剂。(4)本发明的检测方法具有简便、快速、稳定，重复性及重现性好、准确性高， 易于掌握和操作的特点。本发明的检测方法，是通过大量实验摸索得到的切实可行的方法，具有可重复 性和较好的稳定性，根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员将很清楚本发明的 其它实施方案，但只要使用本发明所述的检测方法，均在本发明保护范围之内。
附图1无糖型复方扶芳藤合剂供试品I(A)和供试品II(B)的HPLC-ELSD图谱附图2复方扶芳藤胶囊供试品I(A)和供试品II⑶HPLC-ELSD图谱附图3复方扶芳藤片供试品I(A)和供试品II⑶HPLC-ELSD图谱附图4黄芪甲苷、人参皂苷Rbl混合对照品溶液HPLC-ELSD图谱附图5卫矛醇对照品溶液HPLC-ELSD图谱
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的实施例仅作为示例，旨在 说明本发明，并不构成对本发明的限制。实施例1无糖型复方扶芳藤合剂中卫矛醇、黄芪甲苷、人参皂苷Rbl的含量测定1仪器与试药1.1 仪器日本SHIMADZULC2010AHT高效液相色谱仪，包括在线真空脱气机、高压四 元梯度泵、标准自动进样器、智能化柱温箱；检测器为SofiA corporation Model 400型蒸 发光散射检测器，威马龙色谱工作站数据处理系统；Sart0riUSBP211D型电子分析天平； KQ5200B型超声波清洗器(功率250W，频率50kHz)(昆山市超声仪器有限公司)； LG16-W型离心机(北京医用离心机厂)。1.2 试药人参皂苷Rb1对照品(中国药品生物制品检定所，批号110704-200216)，黄芪 甲苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110781-200613)；卫矛醇对照品(北京化 学试剂公司出品，批号000711)，经HPLC-ELSD峰面积归一化法检测纯度为99.2 % ；乙 腈为色谱纯(Fisher Scientific)，正丁醇、氨水、甲醇为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，水为超纯水；无糖型复方扶芳藤合剂10批，由广西中医学院制药厂提供。2方法与结果2.1色谱条件 及系统适用性试验以 phenomenex Luna HILIC (250mm X 4.6mm i.d.，5 μ m)色谱柱为固定相，乙腈
(A)-水(B)为流动相，其梯度洗脱的体积百分比条件是0 5min 93% A, 5 15min 93% 80%A，15 25min 80% A ；柱温为 28°C ；流速为 lml/min ；检测器为 SoftA corporation Model 400 型蒸发光散射检测器(SC = 40 °C, DT = 80 °C, FS = 5V，FLT = 5)；色谱柱柱效以黄芪甲苷峰计算不小于15000。在此色谱条件下，处方中其它成分对 测定无干扰。无糖型复方扶芳藤合剂供试品I (A)和供试品II(B)的HPLC-ELSD图谱及 黄芪甲苷、人参皂苷Rbl混合对照品溶液、卫矛醇对照品溶液的HPLC-ELSD图谱分别见 附图1、附图4和附图5。2.2对照品及供试品溶液的制备2.2.1对照品溶液的制备人参皂苷Rb1*黄芪甲苷对照品溶液的制备取人参皂苷Rb1和黄芪甲苷对照品 适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇溶解，制成每Iml含人参皂苷Rb1CXUSmg和每Iml 含黄芪甲苷0.55mg的对照品混合溶液，即得。卫矛醇对照品溶液的制备取卫矛醇对照品适量，精密称定，加35%甲醇溶解 并制成每Iml含卫矛醇对照品1.05mg的溶液，即得。2.2.2供试品溶液的制备供试品溶液I的制备精密吸取相当于原药材15克的合剂(口服液)样品，加水 饱和的正丁醇50ml，振摇均勻，超声辅助萃取20min，分取正丁醇层，用氨试液洗涤， 弃去氨水层，减压回收正丁醇，残渣用甲醇溶解并定容到5ml，用孔径为0.45 μ m的微孔 滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液I。供试品溶液II的制备取供试品溶液I制备项下正丁醇萃取后留下的下层液，蒸 至稠膏状，加适量硅藻土拌样分散均勻，转移至IOOml具塞锥形瓶中，精密加入含35% 甲醇的水溶液50ml，称重，超声30min，放冷，补足重量，滤过，取续滤液Iml于5ml容 量瓶，加35%甲醇至刻度，摇勻；用孔径为0.45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得 供试品溶液II。2.3测定法①黄芪甲苷、人参皂苷Rb1含量测定法分别精密吸取黄芪甲苷、人参皂苷Rb1 标准混合溶液5 μ 1、10 μ 1及供试品溶液I 10 μ 1，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪， 测定相应峰面积，以外标两点法对数方程计算，即得。②卫矛醇含量测定法分别精密吸取卫矛醇标准溶液2 μ 1、5 μ 1及供试品溶液 ΙΙ5μ1，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，以外标两点法对数方程 计算，即得。2.4方法学考察2.4.1线性关系的考察分别吸取黄芪甲苷及人参皂苷RbJg合对照品溶液2、4、8、10、12、14μ1和卫 矛醇对照品溶液1、2、3、4、5、6μ1，按2.1项下色谱条件进样分析，测定峰面积，以峰面积的自然对数(Y)对进样量(μ g)的自然对数(X)进行线性回归，求得回归方程分别 是黄芪甲苷 Y = 1.4282X+13.251，r = 0.997 ；人参皂苷 Rb1Y = 1.5181X+12.651，r = 0.9971。实验结果显示，黄芪甲苷及人参皂苷Rb1分别在1.1 6.6 μ g，0.256 1.792 μ g 范围内，卫矛醇在2.10 7.35yg范围内，其峰面积的自然对数(Y)与进样量(μ g)的自 然对数(X)呈良好的线性关系。表1黄芪甲苷峰面积的自然对数(Y)与进样量(yg)的
权利要求
1.一种无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分含量的同时检测方法，其特征在于 该法采用超声辅助萃取，仅用一个色谱条件就可同时测定制剂中卫矛醇、黄芪甲苷、人 参皂苷Rbl的含量。
2.如权利要求1所述的无糖型复方扶芳藤制剂，是由扶芳藤、黄芪、人参(或红参) 制备而成的，是不加蔗糖的合剂(口服液)、胶囊或片剂。
3.如权利要求1所述的检测方法，其测定的色谱条件包括以HILIC亲水色谱柱为固定相，乙腈-水为流动相，梯度洗脱；柱温为25 30°C; 流速为lml/min ；检测器为蒸发光散射检测器。
4.如权利要求1所述的检测方法，其测定的色谱条件为以 phenomenex Luna HILIC (250mmX4.6mm i.d.，5 μ m)色谱柱为固定相，乙腈(A)-水(B)为流动相，其梯度洗脱的体积百分比条件是0 5min 93% A, 5 15min 93% 80% A，15 25min 80% A ；柱温为25 30°C ；流速为lml/min ；检测器为蒸 发光散射检测器，色谱柱柱效以黄芪甲苷峰计算不小于15000。
5.如权利要求1所述的检测方法，其试样溶液的制备及测定方法包括(1)对照品溶液的制备①对照品溶液I的制备取黄芪甲苷和人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，置容 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，制得含黄芪甲苷0.5 0.6mg/ml和人参皂苷 Rb1CXl 0.2mg/ml的混合对照品溶液，即得。②对照品溶液II的制备取卫矛醇对照品适量，精密称定，置容量瓶中，先加少量 水溶解，再加含30%-40%甲醇的水溶液溶解并稀释至刻度，摇勻，制得浓度为0.8 lmg/ml的卫矛醇对照品溶液，即得。(2)供试品溶液的制备①复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液I的制备取本品装量差异项下的胶囊内容 物(或片剂)研细，取相当于原药材15-25克的细粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密 加入水饱和正丁醇50ml，密塞，超声提取45min，放冷，滤过，残渣用水饱和正丁醇少 量多次洗涤，收集滤液和洗涤液，用氨试液洗涤，取正丁醇层水浴蒸干，残留物加甲醇 溶解并定容至5ml，摇勻，用微孔滤膜(0.45 μ m)滤过，取续滤液，即得供试品溶液I。②复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液II的制备取上述供试品溶液I制备项下 正丁醇提取后留下的残渣，置IOOml具塞锥形瓶中，精密加入含30%-40%甲醇的水溶液 50ml，密塞，称重，超声30min，放冷，补足重量，滤过，取续滤液Iml于5ml容量瓶， 加30%-40%甲醇至刻度，摇勻；用孔径为0.45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供 试品溶液II。③无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液I的制备精密吸取相当于原药材15-25克的 合剂(口服液)，加水饱和的正丁醇50ml，振摇均勻，超声20min，分取正丁醇层，用 氨试液洗涤，弃去氨水层，减压回收正丁醇，残渣用甲醇溶解并定容到5ml，用孔径为 0.45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液I。④无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液II的制备取供试品溶液I制备项下正丁醇萃取 后留下的下层液，蒸至稠膏状，加适量硅藻土拌样分散均勻，转移至IOOml具塞锥形瓶 中，精密加入含30%-40%甲醇的水溶液50ml，称重，超声30min，放冷，补足重量，滤过，取续滤液Iml于5ml容量瓶，加30%-40%甲醇至刻度，摇勻；用孔径为0.45μιη的 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液II。 (3)测定方法①黄芪甲苷、人参皂苷Rb1含量测定法分别精密吸取黄芪甲苷、人参皂苷Rb1标准 混合溶液5μ1、 ομ 及供试品溶液Ι ομ ，按权利要求3、4所述的色谱条件注入高效液 相色谱仪，测定相应峰面积，以外标两点法对数方程计算，即得。②卫矛醇含量测定法分别精密吸取卫矛醇标准溶液2μ 1、5μ1及供试品溶液II 5μ1,按权利要求3、4所述的色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，以外标 两点法对数方程计算，即得。
全文摘要
本发明提供一种可用于同时检测无糖型复方扶芳藤制剂中3个主要活性成分含量的测定方法。该法采用超声辅助萃取法提取，以HILIC亲水色谱柱为固定相，乙腈-水为流动相，只用一个色谱条件便可同时测定该制剂中卫矛醇、黄芪甲苷、人参皂苷Rb1的含量。经科学实验证明，该法简便、快速、准确性和重复性好，可用于各种剂型的无糖型复方扶芳藤制剂产品(如合剂、胶囊、片剂)的质量控制。
文档编号A61K9/20GK102008541SQ20101029911
公开日2011年4月13日 申请日期2010年10月8日 优先权日2010年10月8日
发明者冯军, 冯旭, 李耀华, 李芸, 覃洁萍, 邓家刚 申请人:广西中医学院
技术领域：
本发明涉及一种无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分含量的同时检测方 法，更确切地讲是无糖型复方扶芳藤制剂中卫矛醇、黄芪甲苷和人参皂苷Rbl含量的同 时检测方法，属于复方中药制剂的分析检测领域。
背景技术：
复方扶芳藤制剂是由扶芳藤、黄芪、红参(或人参)三味中药经适宜的加工、 提取而制成的复方制剂，具益气补血、健脾养心的功效，有较好的补血、抗疲劳、提高 机体免疫等作用，特别适合于气血亏虚，精力不足，失眠多梦，神经衰弱等患者。扶芳 藤的主要成分是卫矛醇，而黄芪、红参(或人参)的主要成分有黄芪甲苷和人参皂苷等 成分。现代药理研究表明，复方扶芳藤制剂中的卫矛醇及皂苷类等成分，具有增强心血 管功能、增强造血功能、改善机体缺血状态等多种药理作用。目前复方扶芳藤制剂采用 的质量控制方法是按照《中国药典》(一部)收载的质量标准进行。现行质量标准中除 有TLC鉴别外，只有一个薄层色谱扫描的含量测定项目，用于测定制剂中黄芪甲苷的含 量；显然现有的质量控制方法未能达到全面控制产品质量的目的。在我们的前期研究工 作中，曾采用标准加入法测定了复方扶芳藤合剂中的人参皂苷Rgl和Rbl的含量；应用 RP-HPLC-UV方法，建立了复方扶芳藤合剂中主要皂苷成分的HPLC-UV指纹图谱分析 方法及HPLC-UV指纹图谱共有模式；并有用HPLC-ELSD法测定复方扶芳藤合剂中黄芪 甲苷含量的报道。扶芳藤是该制剂的君药。但从目前已经建立的复方扶芳藤制剂的质量 控制方法来看，这些方法较多的是测定制剂中黄芪、红参(或人参)的皂苷类成分，而对 制剂中扶芳藤的主要成分卫矛醇的测定则少见报道。卫矛醇为糖醇类结构，极性较大， 并且在紫外区没有吸收，因此一直无法用常规的高效液相色谱法进行分析。目前测定卫 矛醇的方法主要有薄层扫描法，柱前衍生化后用HPLC、GC测定的方法，这些方法均存 在实验操作步骤繁琐，实验条件不好控制等缺点。我们过去曾经报道过用正相色谱的氨 基柱结合ELSD检测器分析测定复方扶芳藤胶囊中黄芪甲苷和卫矛醇的含量，但该法用 的是正相柱，其缺点是当流动相含水量稍多时，固定相易流失，ELSD的基线噪音很大， 从而影响了方法的重复性及稳定性，并且色谱柱的寿命较短。到目前为止，尚未有只用 一个色谱系统就可同时测定复方扶芳藤制剂中3个药材的特征成分卫矛醇、黄芪甲苷和 人参皂苷含量的报道。
发明内容
本发明的解决方案是提供一种无糖型复方扶芳藤制剂中卫矛醇、黄芪甲苷和 人参皂苷Rbl含量的同时检测方法。该法采用超声辅助萃取法提取，并以新近开发的 HILIC (Hydrophilic Interaction LiquidChromatography)亲水色谱柱为固定相，以乙腈-水为
流动相，只用一个色谱条件便可同时测定该制剂中卫矛醇、黄芪甲苷、人参皂苷Rbl的
4含量。经科学实验证明，该法简便、快速、准确性和重复性较好，可同时测定该制剂中 3个药材的特征成分的含量，既可用于无糖型复方扶芳藤制剂成品的质量控制，也可用于 生产中各中间体的质量控制。本发明无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分的同时检测方法包括以下步 骤1.对照品溶液的制备①对照品溶液I的制备取黄芪甲苷和人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，置 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，即得含黄芪甲苷和人参皂苷Rb1的混合对照 品溶液。②对照品溶液II的制备取卫矛醇对照品适量，精密称定，置容量瓶中，先加 少量水溶解，再加稀甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇勻，即得卫矛醇对照品溶液。2.供试品溶液的制备①复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液I的制备取本品装量差异项下的胶囊 内容物(或片剂)研细，取细粉适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁 醇适量，密塞，超声提取，放冷，滤过，残渣用水饱和正丁醇少量多次洗涤，收集滤液 和洗涤液，用氨试液洗涤，取正丁醇层水浴蒸干，残留物加甲醇溶解并定容，摇勻，用 微孔滤膜(0.45 μ m)滤过，取续滤液，得供试品溶液I。②复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液II的制备取上述供试品溶液I制备项 下正丁醇提取后留下的残渣，置具塞锥形瓶中，精密加入稀甲醇水溶液适量，密塞，称 重，超声，放冷，补足重量，滤过，取续滤液稀释，定容；用孔径为0.45 μ m的微孔滤 膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液II。③无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液I的制备精密吸取合剂(口服液)适量， 加入适量水饱和的正丁醇，振摇均勻后，用超声仪辅助萃取，分取正丁醇层，用氨试液 洗涤，弃去氨水层，减压回收正丁醇，残渣用甲醇溶解并定容，用孔径为0.45 μ m的微 孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液I。④无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液II的制备取供试品溶液I制备项下正丁醇 萃取留下的下层液，蒸至稠膏状，加适量硅藻土拌样分散均勻，转移至具塞锥形瓶中， 精密加入水或稀甲醇的水溶液，称重，超声提取，放冷，补足重量，滤过，取续滤液用 稀甲醇稀释，摇勻；用孔径为0.45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液II。3.色谱条件以HILIC亲水色谱柱为固定相；乙腈-水为流动相，梯度洗脱； 柱温为25 30°C ；流速为lml/min ；检测器为蒸发光散射检测器。4.测定方法①黄芪甲苷、人参皂苷Rb1含量测定法分别精密吸取黄芪甲苷、人参皂苷Rb1 标准混合溶液及供试品溶液I适量，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面 积，以外标两点法对数方程计算，即得。②卫矛醇含量测定法分别精密吸取卫矛醇标准溶液及供试品溶液II适量，按 上述色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，以外标两点法对数方程计算，即得。经过研究，本发明优化的无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分的同时检测方法按以下步骤实施1.对照品溶液的制备①对照品溶液I的制备取黄芪甲苷和人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，置 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，制得含黄芪甲苷0.5 0.6mg/ml和人参皂 苷Rb1CU 0.2mg/ml的混合对照品溶液，即得。②对照品溶液II的制备取卫矛醇对照品适量，精密称定，置容量瓶中，先 加少量水溶解，再加含30%-40%甲醇的水溶液溶解并稀释至刻度，摇勻，制得浓度为 0.8 lmg/ml的卫矛醇对照品溶液，即得。2.供试品溶液的制备①复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液I的制备取本品装量差异项下的胶囊 内容物(或片剂)研细，取相当于原药材15-25克的细粉，精密称定，置具塞锥形瓶中， 精密加入水饱和正丁醇50ml，密塞，超声提取45min，放冷，滤过，残渣用水饱和正丁 醇少量多次洗涤，收集滤液和洗涤液，用氨试液洗涤后，取正丁醇层水浴蒸干，残留物 加甲醇溶解并定容至5ml，摇勻，用微孔滤膜(0.45 μ m)滤过，取续滤液，即得供试品溶 液I。②复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液II的制备取上述供试品溶液I制备项 下正丁醇提取后留下的残渣，置IOOml具塞锥形瓶中，精密加入含30%-40%甲醇的水溶 液50ml，密塞，称重，超声30min，放冷，补足重量，滤过，取续滤液Iml于5ml容量 瓶，加30%-40%甲醇至刻度，摇勻；用孔径为0.45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即 得供试品溶液II。③无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液I的制备精密吸取相当于原药材15-25克 的合剂(口服液)，加水饱和的正丁醇50ml，振摇均勻，超声辅助萃取20min，分取正丁 醇层，用氨试液洗涤，弃去氨水层，减压回收正丁醇，残渣用甲醇溶解并定容到5ml，用 孔径为0.45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液I。④无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液II的制备取供试品溶液I制备项下正丁 醇萃取后留下的下层液，蒸至稠膏状，加适量硅藻土拌样分散均勻，转移至IOOml具塞 锥形瓶中，精密加入含30%-40%甲醇的水溶液50ml，称重，超声30min，放冷，补足 重量，滤过，取续滤液Iml于5ml容量瓶，加30%-40%甲醇至刻度，摇勻；用孔径为
0.45μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液II。3.色谱条件及色谱适用性试验以 phenomenex Luna HILIC (250mmX 4.6mm
1.d.，5μιη)色谱柱为固定相，乙腈(A)-水(B)为流动相，其梯度洗脱的体积百分比条 件是0 5min 93% A，5 15min 93% 80% A, 15 25min 80% A ；柱温为 25 30°C；流速为lml/min;检测器为蒸发光散射检测器，色谱柱柱效以黄芪甲苷峰计算不小 于 15000。4.测定方法①黄芪甲苷、人参皂苷Rb1含量测定法分别精密吸取黄芪甲苷、人参皂苷Rb1 标准混合溶液5 μ 1、10 μ 1及供试品溶液I 10 μ 1，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪， 测定相应峰面积，以外标两点法对数方程计算，即得。②卫矛醇含量测定法分别精密吸取卫矛醇标准溶液2 μ 1、5 μ 1及供试品溶液ΙΙ5μ1，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，以外标两点法对数方程 计算，即得。本发明与现有技术相比，其主要优点及积极效果在于(1)本发明的检测方法，采用新的 HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)亲水色谱柱为固定相，只用一个色谱条件便可同时测定该制剂中主要特 征成分卫矛醇、黄芪甲苷、人参皂苷Rbl的含量。(2)本发明的检测方法，采用超声辅助萃取法制备合剂的供试品溶液，方法简 便、快速，易于操作，并有效地克服了通常液液萃取法操作繁琐及常见的乳化现象。(3)本发明的检测方法，适用于各种剂型的无糖型复方扶芳藤制剂的检测，如合 剂、胶囊或片剂。(4)本发明的检测方法具有简便、快速、稳定，重复性及重现性好、准确性高， 易于掌握和操作的特点。本发明的检测方法，是通过大量实验摸索得到的切实可行的方法，具有可重复 性和较好的稳定性，根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员将很清楚本发明的 其它实施方案，但只要使用本发明所述的检测方法，均在本发明保护范围之内。
附图1无糖型复方扶芳藤合剂供试品I(A)和供试品II(B)的HPLC-ELSD图谱附图2复方扶芳藤胶囊供试品I(A)和供试品II⑶HPLC-ELSD图谱附图3复方扶芳藤片供试品I(A)和供试品II⑶HPLC-ELSD图谱附图4黄芪甲苷、人参皂苷Rbl混合对照品溶液HPLC-ELSD图谱附图5卫矛醇对照品溶液HPLC-ELSD图谱
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的实施例仅作为示例，旨在 说明本发明，并不构成对本发明的限制。实施例1无糖型复方扶芳藤合剂中卫矛醇、黄芪甲苷、人参皂苷Rbl的含量测定1仪器与试药1.1 仪器日本SHIMADZULC2010AHT高效液相色谱仪，包括在线真空脱气机、高压四 元梯度泵、标准自动进样器、智能化柱温箱；检测器为SofiA corporation Model 400型蒸 发光散射检测器，威马龙色谱工作站数据处理系统；Sart0riUSBP211D型电子分析天平； KQ5200B型超声波清洗器(功率250W，频率50kHz)(昆山市超声仪器有限公司)； LG16-W型离心机(北京医用离心机厂)。1.2 试药人参皂苷Rb1对照品(中国药品生物制品检定所，批号110704-200216)，黄芪 甲苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110781-200613)；卫矛醇对照品(北京化 学试剂公司出品，批号000711)，经HPLC-ELSD峰面积归一化法检测纯度为99.2 % ；乙 腈为色谱纯(Fisher Scientific)，正丁醇、氨水、甲醇为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，水为超纯水；无糖型复方扶芳藤合剂10批，由广西中医学院制药厂提供。2方法与结果2.1色谱条件 及系统适用性试验以 phenomenex Luna HILIC (250mm X 4.6mm i.d.，5 μ m)色谱柱为固定相，乙腈
(A)-水(B)为流动相，其梯度洗脱的体积百分比条件是0 5min 93% A, 5 15min 93% 80%A，15 25min 80% A ；柱温为 28°C ；流速为 lml/min ；检测器为 SoftA corporation Model 400 型蒸发光散射检测器(SC = 40 °C, DT = 80 °C, FS = 5V，FLT = 5)；色谱柱柱效以黄芪甲苷峰计算不小于15000。在此色谱条件下，处方中其它成分对 测定无干扰。无糖型复方扶芳藤合剂供试品I (A)和供试品II(B)的HPLC-ELSD图谱及 黄芪甲苷、人参皂苷Rbl混合对照品溶液、卫矛醇对照品溶液的HPLC-ELSD图谱分别见 附图1、附图4和附图5。2.2对照品及供试品溶液的制备2.2.1对照品溶液的制备人参皂苷Rb1*黄芪甲苷对照品溶液的制备取人参皂苷Rb1和黄芪甲苷对照品 适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇溶解，制成每Iml含人参皂苷Rb1CXUSmg和每Iml 含黄芪甲苷0.55mg的对照品混合溶液，即得。卫矛醇对照品溶液的制备取卫矛醇对照品适量，精密称定，加35%甲醇溶解 并制成每Iml含卫矛醇对照品1.05mg的溶液，即得。2.2.2供试品溶液的制备供试品溶液I的制备精密吸取相当于原药材15克的合剂(口服液)样品，加水 饱和的正丁醇50ml，振摇均勻，超声辅助萃取20min，分取正丁醇层，用氨试液洗涤， 弃去氨水层，减压回收正丁醇，残渣用甲醇溶解并定容到5ml，用孔径为0.45 μ m的微孔 滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液I。供试品溶液II的制备取供试品溶液I制备项下正丁醇萃取后留下的下层液，蒸 至稠膏状，加适量硅藻土拌样分散均勻，转移至IOOml具塞锥形瓶中，精密加入含35% 甲醇的水溶液50ml，称重，超声30min，放冷，补足重量，滤过，取续滤液Iml于5ml容 量瓶，加35%甲醇至刻度，摇勻；用孔径为0.45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得 供试品溶液II。2.3测定法①黄芪甲苷、人参皂苷Rb1含量测定法分别精密吸取黄芪甲苷、人参皂苷Rb1 标准混合溶液5 μ 1、10 μ 1及供试品溶液I 10 μ 1，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪， 测定相应峰面积，以外标两点法对数方程计算，即得。②卫矛醇含量测定法分别精密吸取卫矛醇标准溶液2 μ 1、5 μ 1及供试品溶液 ΙΙ5μ1，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，以外标两点法对数方程 计算，即得。2.4方法学考察2.4.1线性关系的考察分别吸取黄芪甲苷及人参皂苷RbJg合对照品溶液2、4、8、10、12、14μ1和卫 矛醇对照品溶液1、2、3、4、5、6μ1，按2.1项下色谱条件进样分析，测定峰面积，以峰面积的自然对数(Y)对进样量(μ g)的自然对数(X)进行线性回归，求得回归方程分别 是黄芪甲苷 Y = 1.4282X+13.251，r = 0.997 ；人参皂苷 Rb1Y = 1.5181X+12.651，r = 0.9971。实验结果显示，黄芪甲苷及人参皂苷Rb1分别在1.1 6.6 μ g，0.256 1.792 μ g 范围内，卫矛醇在2.10 7.35yg范围内，其峰面积的自然对数(Y)与进样量(μ g)的自 然对数(X)呈良好的线性关系。表1黄芪甲苷峰面积的自然对数(Y)与进样量(yg)的
权利要求
1.一种无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分含量的同时检测方法，其特征在于 该法采用超声辅助萃取，仅用一个色谱条件就可同时测定制剂中卫矛醇、黄芪甲苷、人 参皂苷Rbl的含量。
2.如权利要求1所述的无糖型复方扶芳藤制剂，是由扶芳藤、黄芪、人参(或红参) 制备而成的，是不加蔗糖的合剂(口服液)、胶囊或片剂。
3.如权利要求1所述的检测方法，其测定的色谱条件包括以HILIC亲水色谱柱为固定相，乙腈-水为流动相，梯度洗脱；柱温为25 30°C; 流速为lml/min ；检测器为蒸发光散射检测器。
4.如权利要求1所述的检测方法，其测定的色谱条件为以 phenomenex Luna HILIC (250mmX4.6mm i.d.，5 μ m)色谱柱为固定相，乙腈(A)-水(B)为流动相，其梯度洗脱的体积百分比条件是0 5min 93% A, 5 15min 93% 80% A，15 25min 80% A ；柱温为25 30°C ；流速为lml/min ；检测器为蒸 发光散射检测器，色谱柱柱效以黄芪甲苷峰计算不小于15000。
5.如权利要求1所述的检测方法，其试样溶液的制备及测定方法包括(1)对照品溶液的制备①对照品溶液I的制备取黄芪甲苷和人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，置容 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，制得含黄芪甲苷0.5 0.6mg/ml和人参皂苷 Rb1CXl 0.2mg/ml的混合对照品溶液，即得。②对照品溶液II的制备取卫矛醇对照品适量，精密称定，置容量瓶中，先加少量 水溶解，再加含30%-40%甲醇的水溶液溶解并稀释至刻度，摇勻，制得浓度为0.8 lmg/ml的卫矛醇对照品溶液，即得。(2)供试品溶液的制备①复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液I的制备取本品装量差异项下的胶囊内容 物(或片剂)研细，取相当于原药材15-25克的细粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密 加入水饱和正丁醇50ml，密塞，超声提取45min，放冷，滤过，残渣用水饱和正丁醇少 量多次洗涤，收集滤液和洗涤液，用氨试液洗涤，取正丁醇层水浴蒸干，残留物加甲醇 溶解并定容至5ml，摇勻，用微孔滤膜(0.45 μ m)滤过，取续滤液，即得供试品溶液I。②复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液II的制备取上述供试品溶液I制备项下 正丁醇提取后留下的残渣，置IOOml具塞锥形瓶中，精密加入含30%-40%甲醇的水溶液 50ml，密塞，称重，超声30min，放冷，补足重量，滤过，取续滤液Iml于5ml容量瓶， 加30%-40%甲醇至刻度，摇勻；用孔径为0.45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供 试品溶液II。③无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液I的制备精密吸取相当于原药材15-25克的 合剂(口服液)，加水饱和的正丁醇50ml，振摇均勻，超声20min，分取正丁醇层，用 氨试液洗涤，弃去氨水层，减压回收正丁醇，残渣用甲醇溶解并定容到5ml，用孔径为 0.45 μ m的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液I。④无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液II的制备取供试品溶液I制备项下正丁醇萃取 后留下的下层液，蒸至稠膏状，加适量硅藻土拌样分散均勻，转移至IOOml具塞锥形瓶 中，精密加入含30%-40%甲醇的水溶液50ml，称重，超声30min，放冷，补足重量，滤过，取续滤液Iml于5ml容量瓶，加30%-40%甲醇至刻度，摇勻；用孔径为0.45μιη的 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液II。 (3)测定方法①黄芪甲苷、人参皂苷Rb1含量测定法分别精密吸取黄芪甲苷、人参皂苷Rb1标准 混合溶液5μ1、 ομ 及供试品溶液Ι ομ ，按权利要求3、4所述的色谱条件注入高效液 相色谱仪，测定相应峰面积，以外标两点法对数方程计算，即得。②卫矛醇含量测定法分别精密吸取卫矛醇标准溶液2μ 1、5μ1及供试品溶液II 5μ1,按权利要求3、4所述的色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，以外标 两点法对数方程计算，即得。
全文摘要
本发明提供一种可用于同时检测无糖型复方扶芳藤制剂中3个主要活性成分含量的测定方法。该法采用超声辅助萃取法提取，以HILIC亲水色谱柱为固定相，乙腈-水为流动相，只用一个色谱条件便可同时测定该制剂中卫矛醇、黄芪甲苷、人参皂苷Rb1的含量。经科学实验证明，该法简便、快速、准确性和重复性好，可用于各种剂型的无糖型复方扶芳藤制剂产品(如合剂、胶囊、片剂)的质量控制。
文档编号A61K9/20GK102008541SQ20101029911
公开日2011年4月13日 申请日期2010年10月8日 优先权日2010年10月8日
发明者冯军, 冯旭, 李耀华, 李芸, 覃洁萍, 邓家刚 申请人:广西中医学院
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