A环二氧六环黄酮木脂素用于制备抗乙肝病毒药物的用途的制作方法

专利名称：：A环二氧六环黄酮木脂素用于制备抗乙肝病毒药物的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，具体而言，本发明涉及式(1)所示的一个A环上有二氧六环偶合结构的黄酮木脂素类化合物或其可药用盐用于制备清除乙肝e抗原、抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸HBVDNA复制、治疗乙型病毒性肝炎药物之用途，该黄酮木脂素经药效学测试发现具有一定的抑制乙肝病毒核心抗原HBeAg活性，其清除HBeAg强度在100微克/毫升浓度下高于阳性对照拉米呋啶，且与10000单位/毫升的α_干扰素接近；同时在100微克/毫升时该化合物对HBVDNA显示出大于80%的抑制率。以上药效学结果表明该A环二氧六环偶合型黄酮木脂素或其可药用盐可预期用于制备清除乙肝e抗原药物、抑制HBVDNA复制、治疗乙型肝炎病毒感染疾病药物的用途。
背景技术：
：乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒HBV引起的传染病，HBV是嗜肝DNA病毒科hepadnaviridae的一员，其形状为直径42纳米的球形颗粒。HBV是奇特的病毒，在其它动物中较少有传染性，唯有在人体或者灵长类动物黑猩猩体内才能得以复制。该病毒通过乙肝病毒携带者和乙肝病人的血液、唾液、精液、阴道分泌物进行传播，具有慢性携带状态。本病在我国广泛流行，因其分为垂直传播、水平传播、家庭内传播、医源性传播和性传播等多种方式，对人群感染率高，在某些地区感染率达到35%以上。据有关资料，肝炎检测阳性的患者已经达到1.89亿，而应就诊未就诊人数(携带者)将近4亿，是当前危害人民健康最严重的传染病之一。乙肝临床表现多样化，易发展为慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化，少数病人可转变为原发性肝癌。乙肝e抗原HBeAg是乙肝病毒HBV内核的结构蛋白，在乙肝病毒繁殖时大量产生。乙肝病毒HBV具有所有已知DNA病毒中最小的基因组(仅3.2kb)，其基因主要编码五种蛋白(S、C、E、P、X)。C蛋白为病毒核心蛋白，而E蛋白是C蛋白的一部分，成为乙肝e抗原(HBeAg)，其是已经编码好但未组装到病毒颗粒中的蛋白，在病毒复制时会分泌到患者血液中去。临床上，通常将血清HBeAg作为HBV复制、传染性、病情严重程度以及对其进行治疗应答进行评价的重要标志物。该抗原与HBVDNA密切相关，是临床上表达病毒复制非常实用的血清标志物。血清标志物HBeAg阳性患者说明其体内有HBV复制，故而有较高的传染性，患者HBeAg表达越高说明该患者传染性越强。因此，抑制HBeAg的分泌和复制是研发抗乙肝病毒药物中的一个重要靶标和检测标的，HBeAg清除说明体内有着持续的HBV抑制，ALT正常，组织炎症坏死减轻，肝硬化发生的几率降低。因此，血清HBeAg被认为能够反映更为稳定的治疗效果，HBeAg血清清除标志着患者免疫系统开始发挥作用。2002年，在《新英格兰医学杂志》发表研究结果之研究者认为对于CHB患者，如在肝硬化前获HBeAg清除，则其肝硬化和肝细胞癌发生率将降低10倍。美国肝病研究协会AASLD、亚太肝脏研究协会APASL和欧洲肝脏研究协会EASL的指南中均将HBeAg血清清除作为治疗终点判定标准之一。所以，能够抑制、降低HBeAg表达或活性的药物也即属于治疗乙肝病毒感染有效药物。目前，对乙肝患者的用药主要分为保肝降酶、抗病毒、抗肝纤维化和调节免疫等数个大类。近些年来取得进展的还是在于抗病毒药物治疗方面的研究；抗病毒是根本方法，而保肝降酶只是辅助治疗，多治标而鲜见治本。然而，目前对于病毒性乙肝临床上的治疗方案只能达到抑制HBV复制和继发感染，最主要药物仍是核苷类药物如拉米呋啶(3-TC)、恩替卡韦、阿德福韦(ADV)、替比夫定等，还有处于临床试验期中的emtricitabine、tenofovir、clevuding等。在我国，拉米呋啶已经成为医保用药，应用于大批HBV患者。核苷类药物部分优点为生物利用度高，口服较安全。然而，它们虽然能有效地控制病情，但一则售价昂贵；二则长期使用均可出现耐药性，以及停药后出现HBVDNA、ALT及肝组织学的不同程度的反弹；三是长期使用核苷类药物出现的较为明显的众所周知的不良作用，例如肾脏损伤、婴儿致畸等。最为头痛的是病毒耐药的出现大大降低了治愈率，因为核苷类药物对病毒复制是可逆的，所以对大部分患者若欲达到最大疗效，疗程必须在一年以上，如此其耐药性随之出现，就达不到预期之效果；且核苷类药物还有难以清除cccDNA、治疗一年后HBsAg难以阴转等不足之处。干扰素(α、β_干扰素)以及重组干扰素类等来源于人白细胞的生物工程类抗病毒药物近期成为研究和治疗CHB热点药物，其具有抗病毒和免疫调节双重作用。其既可通过抗病毒作用抑制病毒复制从而减轻肝脏细胞炎症反应，减少肝细胞损害，延缓病情发展从而起到改善病人临床症状和肝脏生理功能；又可以增强免疫作用，通过加强体内自然杀伤细胞和辅助性T细胞的作用，尤其是可以促进杀伤T细胞去杀伤被病毒感染细胞，因此间接起到抗病毒作用。干扰素治疗CHB患者获得的HBeAg血清学转换比拉米呋啶更为持久，2003年《消化道》杂志上一项研究显示干扰素治疗组HBeAg的3年复发率显著低于拉米呋啶组；且长效干扰素可以每周使用一次，较为方便。因此，干扰素日渐成为临床上用于治疗慢性乙肝病毒的首选药物之一，但其副作用和不良反应报道较多，总有效率不高，价格昂贵，患者经济负担大，因而造成临床上难以广泛使用；且对失代偿肝硬化患者不适宜应用。近几年随着肝病的研究，发展了标准化的HBVDNA的分析，大大推进了对乙肝患者病情的了解。HBVDNA的定量分析能预测乙肝的严重性及其预后，因为HBVDNA持续阳性(即持续病毒血症)容易使乙肝病情进展和加重；高乙肝病毒(HBVDNA)含量容易促进肝硬化的形成；HBVDNA持续存在是肝细胞癌(HCC)发生的高危因素，特别是病毒含量较高、病程较长、年龄较大或合并其它肝病者；持续高浓度的HBVDNA存在，可导致失代偿性肝硬化及原发性肝重症的死亡率明显增加。同时必须认识到，HBVDNA水平与肝脏组织学的关系极其密切文献报道经抗病毒治疗，肝脏纤维化的改善和消除明显；近期国际肝病会议报导，强效和低耐药性的抗病毒治疗，随着HBVDNA的降低和转阴，而观察到肝硬化可出现不同程度的逆转。因此现在主张肝硬化也应进行抗病毒治疗。因此，HBVDNA指标在抗病毒治疗中的应用也起着举足轻重的作用HBVDNA的水平是决定慢性乙型肝炎是否需要抗病毒治疗的重要指标；根据HBVDNA的不同情况分别制定出HBeAg阳性或HBeAg阴性的不同治疗标准和要求；在抗病毒治疗中，根据HBVDNA的治疗反应，判断是否病毒学早期应答进而决定长期用药的策略以取得持续性的病毒学应答，达到持续病毒抑制的目的；根据HBVDNA的病毒学的应答情况，创造HBeAg血清学的转换基础和条件，以达到其良好的中间治疗目标；根据HBVDNA持续抑制情况争取病毒持续阴性，以争取达到抗病毒最终治疗目标；根据HBVDNA持续完全受到抑制，也显示出了cccDNA的不同程度好转和消失；在抗病毒治疗中，以HBVDNA的变化来评估和预防抗病毒药物所引起的病毒变异及耐药发生的风险；一旦发生病毒变异或耐药时，HBVDNA的变化是唯一的最先的信号和诊断依据，也是治疗耐药和改变治疗策略的指导和依据。综上所述，对HBVDNA的抑制程度在乙肝的进一步诊断和治疗上有着新的重大意义，对疗效的观察，对评估乙肝预后及耐药危险性均有较大的指导作用。由上述因素可知抑制乙肝病毒在体内增殖的另外一个根本环节在于抑制HBVDNA的复制。HBVDNA水平的降低或者低于检测水平是检验抗病毒药物的另外一把金钥匙。所以，亚太肝脏研究学会和欧洲肝脏研究学会均将HBVDNA检测不到作为乙型肝炎病毒患者治疗终点之一；我国新药开发指南中也将受测化合物对于HBVDNA的抑制强度视为必须完成的测试项目之一。拉米呋啶之所以能够成为首选核苷类药物便是因为其具有强效的抑制HBVDNA复制之活性。因此既能抑制HBVDNA复制又能抑制HBeAg的化合物将更有希望成为治疗乙肝患者的创新性药物。必须说明的是目前使用的抗病毒药物其实只是病毒复制的抑制剂，并不能直接杀灭病毒和破坏病毒体，否则就会损伤宿主细胞。这些抗病毒药物(多为核苷类药物)还存在上述毒副作用大、易引起病毒基因突变、停药后易反跳等缺点，因此开发新型抗病毒药物是当今药物研发领域的当务之急，其对于治疗我国大量的乙肝患者和病毒携带者、控制传染源等都有着极其重要的社会意义和经济意义。所以，从民族民间长期使用的天然药物中发现新的非核苷类乙肝病毒抑制剂及此类能够降低HBeAg或抑制HBVDNA复制的先导化合物有着很大的指导性意义，并有着辽阔的发展前景。基于此目的，发明人以前曾完成多项抗乙肝病毒天然产物及其结构改造衍生物的专利和文章，发现了多种抑制乙肝病毒表面抗原HBsAg或乙肝病毒e抗原HBeAg活性、抑制HBVDNA复制的化合物，从而说明从天然产物及其合成衍生物中筛选出能够清除乙肝e抗原、防治乙肝病毒感染的创新性药物是可行的[参见“一类对映桉烷醇类倍半萜抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、刘光明、于荣敏、李海波等；ZL200610053827.4)；“2β-羟基冬青酸抑制乙肝病毒的医药用途”(李校堃、赵昱、黄可新、李海波等；ZL200610053749.8)；“2α，3β-二羟基-5，11(13)-二烯桉烷_12_酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、张礼和、孙汉董、李海波等；ZL200610053601.4)；“艾里莫芬烷内酯抑制乙肝病毒的用途及其药物组合物”(赵昱、李海波、杨雷香、周长新等；ZL03153691.3)；“一种艾里莫芬内酯酸天然产物及其应用”(赵昱、周长新、施树云、王晓雨等；ZL200610053575.5)；“一种桉烷型倍半萜酸及其用途”(赵昱、刘光明、李海波、巫秀美等；ZL200610053579.3)；“六棱菊属植物提取物抑制单纯疱疹病毒及乙肝病毒的用途”(赵昱、周长新、于荣敏、白骅；CN1989989Α)；“1β-氧代_5，11(13)-二烯桉烷-12-酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、李校堃、黄可新、李海波等；CN1927197A)；“1β-羟基冬青酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、李校堃、黄可新、巫秀美等；CN1935131Α)；“对映艾里莫芬烷酸及其抑制乙肝表面抗原的医药用途”(黄可新、李校堃、王晓雨、赵昱等；CN101239054)；“1_氧-取代苯甲酰奎尼酸化合物及其抑制乙肝病毒用途”(李校堃、胡利红、巫秀美、赵昱等；CN101293836)；发明人已发表之抑制HBeAg和HBVDNA等活性文章参见“InVitroAntiviralActivityofThreeEnantiomericSesquiterpeneLactonesfromSenecioSpeciesAgainstHepatitisBVirus，，，HaiboLi(李海波)，ChangxinZhou(周长新)，XiumeiWu(巫秀美)，YuZhao*(赵昱)等，AntiviralChemistry&Chemotherapy,2005,16,277-282"‘EvaluationofAntiviralActivityofCompoundsIsolatedfromRanunculussieboldiiMiq.andRanunculussceleratusL，，，HaiboLi(李海波)，ChangxinZhou(周长新)，XiumeiWu(巫秀美)，YuZhao*(赵昱)等，PlantaMedca,2005,71(12),1128-1133；"Applicationofhigh-speedcounter-currentchromatographyfortheisolationofantiviraleremophiIenolidesfromLigulariaatroviolacea",Shi,Shu-Yun(HWS)Hai-Bo(^^),Zhao,Yu(MS)BiomedicalChromatography,2008,22(9),985-991；"PurificationandidentificationofantiviralcomponentsfromLaggerapterodontabyhigh-speedcounter-currentchromatography，，,ShuyunShi(施树云),YuZhao(赵昱)等，JournalofChromatographyB,2007,859,119-124]。毋庸置疑，继续从天然产物及其结构改造衍生物中寻找能够清除HBeAg或抑制HBVDNA复制的先导化合物是非常有必要性和紧迫性的，也因此被国家科技部列为新药研制重大专项之一。在上述治疗CHB药物中，还有一类是保肝类药物，其临床大量使用之典型为存在于菊科植物水飞蓟的种子中的水飞蓟素。水飞蓟已在临床上广泛应用，在市场上其商品名为Legalon利肝隆或Flavobion，其代表性化合物当属黄酮木脂素水飞蓟宾。黄酮木脂质素化合物属于杂木质素类，是由一分子苯丙素和一分子黄酮结合而成的一类天然产物。水飞蓟中水飞蓟宾含量最多，活性也最高。该药作用主要有以下几点(一)抗自由基活性水飞蓟素对于由四氯化碳、半乳糖胺、醇类和其他肝毒素造成的肝损害具有保护作用。1990年Lotteron等人报道了在小鼠肝微粒体内，水飞蓟素能减少由四氯化碳代谢引起的体外脂质过氧化及由还原型辅酶单独引起的过氧化作用，这些都表明水飞蓟素为链中断抗氧化剂或为自由基清除剂。(二)保护肝细胞膜通过抗脂质过氧化反应维持细胞膜的流动性，保护肝细胞膜。还能阻断真菌毒素鬼笔毒环肽和α-鹅膏蕈碱等与肝细胞上特异受体的结合，抑制其对肝细胞的攻击及跨膜转运，中断其肝肠循环，从而增强肝细胞膜对于多种损害因素的抵抗力。(三)促进肝细胞的修复和再生水飞蓟宾进入细胞后可以与雌二醇受体结合，并使之激活，活化的受体可以增强肝细胞核内RNA聚合酶1的活性，使RNA转录增强，促进酶及蛋白质的合成，并间接促进DNA的合成，有利于肝细胞的修复和再生。(四)抗肿瘤作用各种活性氧能氧化鸟嘌呤形成8-羟基鸟嘌呤，造成DNA损伤，进而引起肿瘤，水飞蓟宾作为一个有效的抗自由基物质也显示了预防和治疗肿瘤的作用。三十多年的临床实验证明该药具有确切的疗效和低毒性(参阅Flora，K.等，Am.J.Gastroenterol,1998,93,139-143；Sailer,R.等，Drugs,2001,61(14)，2035-2063；Gazak,R-等，Curr.Med.Chem.2007，14，315-338；Svagera,Z.等，Phytother.Res.2003，17，524-530；Gazalc,R.等，Bioorg.Med.Chem.2004，12，5677-5687；Varga,Z.等；Phytothe.Res.2001，15，608-612.Singh，R.P.等，Curr.CancerDrugTar.2004,4,1-11)。因此，以水飞蓟宾为代表的黄酮木脂素类化合物引起了越来越多的关注，如发明人于2006-2009年间制备并报道的多个系列水飞蓟宾类衍生物也具有显著的抗氧化活性(杨雷香、赵星等，"Design，synthesisandexaminationofneuronprotectivepropertiesofalkenylatedandamidateddehydro-silybinderivatives",JournalofMedicinalChemistry，2009，52(23)，7732-7752；汪峰，赵昱等，“PreparationofC-23esterifiedsilybinderivativesandevaluaionoftheir1ipidperoxidationinhibitoryandDNAprotectiveproperties",Bioorganic&MedicinalChemistry,2009,17(17)，6380-6389；杨雷香，赵昱等，"SynthesisandAntioxidantPropertiesEvaluationofNovelSilybinAnalogues”，JournalofEnzymeInhibitionandMedicinalChemistry,2006，21(4),399-404；等等)。在发明人报道的上述文章中，经发明人设计并合成出的多个系列之A环、B环、E环、23位取代的黄酮木脂素类化合物都显示出强效捕获DPPH自由基和超氧阴离子自由基的活性、抗氧化活性、以及保护PC12细胞的活性。但是显而易见上述研究仅集中于研究水飞蓟宾类黄酮木脂素的抗氧化作用和细胞保护作用。近期(2006年)，谢军报道了联合应用具有抗病毒和免疫调节双重作用的干扰素和保肝护肝的水飞蓟宾磷脂复合物治疗慢性乙肝的结果，发现联合用药对患者体内ALT、AST值降低比单独用干扰素效果明显，说明水飞蓟宾磷脂复合物能加强干扰素的治疗慢性乙肝之作用。但是，类似的治疗方案仍是将水飞蓟宾等黄酮木脂素作为辅助用药，且主要是用于保护肝细胞膜而非直接用其实施抗病毒作用。左国营等(左国营，刘树玲，徐贵丽，世界华人消化杂志，2006年14卷13期，1241-1246页)综述了近20年来药用植物成分体外抗HBV活性的研究进展，文中论及多种天然产物，其中并没有报道任何黄酮木脂素类化合物具有抗HBV活性的相关记录，尤其是水飞蓟宾类天然产物及其衍生物，国内几乎无人涉及，仅由发明人团队对其进行了前人未加注意的结构改造和抗氧化活性研究。以水飞蓟宾为代表的黄酮木脂素化合物虽然具有以上所述之抗氧化疗效，然而其见报于抗病毒治疗方面之文献相对较少，黄酮木脂素类化合物治疗DNA类病毒感染尤其是其用于抗乙肝病毒方面(包括抑制乙肝e抗原HBeAg或抑制HBVDNA复制)的新用途尚未得到有效开发，故此从黄酮木脂素中寻找抗乙肝病毒领域的活性化合物，亦即将黄酮木脂素结构改造使其具有抗DNA类病毒活性是一个崭新的领域。从其中发现抑制HBeAg或抑制HBVDNA复制的先导化合物更是前人所未尝试过的挑战。为了探索这个领域，我们设计并制备了另外一类黄酮木脂素衍生物，也即在A环7，8位与木质素以二氧六环偶合，形成A环上含有二氧六环的环系空间结构。如此设计可以生成一个空间结构完全不同于水飞蓟宾的新型黄酮木脂素化合物。以期发现能降低HBeAg或抑制HBVDNA复制的黄酮木脂素先导化合物，从而将其进一步开发成具有能清除HBeAg、抑制HBVDNA复制、治疗CHB的创新性药物，据此完成本发明。
发明内容本发明的目的是提供式(1)所示的A环二氧六环偶合型黄酮木脂素或其可药用盐用于制备降低乙肝e抗原、抑制HBVDNA复制、治疗乙型病毒性肝炎药物中之新用途。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式(1)化合物的名称为(士)-tranS-6-羟基-2-羟甲基-3_(4-羟基苯基)-9_苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3-h]苯并吡喃-7-酮。本发明还提供了一种制备式(1)所示的A环二氧六环的黄酮木脂素类化合物的方法，其特征是5，7_二羟基黄酮白杨素在冷的碱液中与过硫酸钾发生Elbs氧化，酸水解得到5，7，8_三羟基黄酮即去甲汉黄芩素，再与对羟基肉桂醇在碳酸银或氧化银作用下发生氧化偶联而得；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中，碱是指有机碱或无机碱，酸是指有机酸或无机酸；银盐可以是碳酸银、氧化银或硝酸银等，本发明中报告了使用碳酸银的实施例；无水溶剂可以是无水苯、无水丙酮、无水四氢呋喃等无水非质子溶剂或它们的混合物，本发明中实施例1报告了无水苯与无水丙酮的混合溶剂。本发明的另一个目的是提供了一种用于制备降低乙肝e抗原或抑制HBVDNA复制、治疗乙型病毒性肝炎的药物组合物，其特征为含有治疗有效量的作为活性成分的式(1)化合物或者它的可药用盐和可药用辅料组成的混合物。其药物剂型可以是片剂、胶囊剂、注射齐、气雾齐、栓齐、膜齐、滴丸齐、贴片齐、皮下植埋剂、外用搽剂、口服液或软膏剂，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。发明人设计的A环二氧六环偶合型黄酮木脂素化合物(1)与天然黄酮木脂素类化合物水飞蓟宾相比较，具有诸多结构和物化性质上差异化的特征，包括其疏水性、芳香性、吉布斯自由能、氢键受体、电性、分子间范德华力、以及3D构象、伸展方向、分子重心、电性分布中心等特质均与水飞蓟宾有着明显不同；且化合物(1)分子量比水飞蓟宾减小了64个质量单位。上述特征都决定了式(1)所示化合物之三维构象与HBeAg或HBVDNA之3D空间结构相结合之配体-受体结合复合物形态和结合方式都可能产生较大的差别，其结合位点和结合模式、其结合自由能等均会产生较大的改变，因而可能在抑制HBeAg或抑制HBVDNA复制方面有着意想不到的效果。我们测试了该化合物对H印G2.2.15细胞的生长抑制作用，同时测试了其对H印G2.2.15细胞分泌的乙型肝炎e抗原HBeAg及对HBVDNA复制的抑制活性。试验结果发现本发明中合成得到的A环二氧六环偶合型黄酮木脂素类化合物即(士)-trans-6-羟基-2-羟甲基-3-(4-羟基苯基)-9_苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3_h]苯并吡喃-7-酮对H印G2.2.15细胞分泌的乙型肝炎e抗原HBeAg具有一定的抑制活性，其清除HBeAg强度在100微克/毫升下高于阳性对照拉米呋啶，且与10000单位/毫升的α-干扰素接近；令人振奋的是在100微克/毫升时该化合物对HBVDNA显示出大于80%的抑制率，如此高的抑制率于阳性一线用药拉米呋啶几乎相同；且如果转换为半数抑制浓度ED5tl的话，式(1)化合物将比3-TC更具优越性。以上均说明式(1)化合物有着意想不到的显著的抗HBV效果，从而可以预期其可以作为降低乙肝e抗原或抑制HBVDNA复制、治疗乙型病毒性肝炎之先导化合物继续开发。经本发明人详细的文献查阅，到目前为止，尚无有关该化合物治疗乙肝病毒感染性疾病和制备抗乙肝病毒药物的报道。黄酮木脂素式(1)化合物对于HBeAg和HBVDNA强效抑制均属于意想不到的发现，有着极为显著的原创性。综上所述，我们从头合成的该A环二氧六环偶合型黄酮木脂素既有结构上的独特性，又有抗病毒作用方面研究的新颖性，并在抗乙肝病毒活性测试中发现了超乎寻常的抑制乙肝e抗原的活性，有望成为降低HBeAg或抑制HBVDNA复制及治疗CHB之先导化合物。本发明有益之处在于首次发现式(1)所示之A环二氧六环偶合型黄酮木脂素具有降低乙肝e抗原、强效抑制HBVDNA复制的功效，并在防治乙肝病毒方面的成药潜力。为开发成治疗乙肝病毒创新药物，开发降低乙型肝炎e抗原HBeAg或抑制HBVDNA复制之创新药物提供了新的物质基础，具有潜在巨大的社会效益和经济效益。本发明再一特点为本发明之合成起始物来源方便，合成方便。其制备方法简单易行，原料来源方便易得，成本低，污染小，利于节能减排条件下的大规模生产，产业化前景十分明确。具体实施例方式本发明人通过多步简单合成，并通过层析手段得到该既能有效抑制乙肝e抗原(HBeAg)的分泌又能有效抑制HBVDNA复制活性的一个黄酮木脂素类活性化合物，又经质谱和核磁共振波谱等综合解析推导出其化学结构。本发明人发现，式(1)化合物对H印G2.2.15细胞的生长无明显抑制作用，而对H印G2.2.15细胞分泌的乙肝e抗原(HBeAg)的分泌具有一定的抑制作用，对HBVDNA的复制具有强效的抑制作用，提示该化合物具有用药安全、有效降低乙肝病毒e抗原、强效抑制HBVDNA复制的特点。因此，根据本发明人的研究，发明人所设计并合成的式(1)所示之A环二氧六环偶合型黄酮木脂素化合物可以用于制备治疗乙肝病毒感染性疾病的药物和用于治疗乙肝病毒感染性疾病。为了更好地理解本发明的实质，下面分别用式(1)化合物的制备及其对H印G2.2.15细胞生长抑制作用以及对H印G2.2.15细胞分泌的HBeAg及HBVDNA复制之抑制作用试验的结果，说明其在制药领域中的新用途。实施例给出了式(1)化合物的部分合成、结构鉴定、和活性数据。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例1式(1)化合物(士)-tranS-6-羟基-2-羟甲基_3-(4-羟基苯基)-9-苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3-h]苯并吡喃-7-酮的制备仪器与试剂紫外光谱用ShimadzuUV-240紫外分光光度计测定；核磁共振氢谱1H-NMR由INOVA型超导核磁共振波谱仪(VARIANIN0VA-400MHz)测定(四甲基硅醚TMS为内标)；电喷雾质谱ESI-MS由BrukerEsquire3000+质谱仪测定，柱层析用硅胶(100-200，200-300和300-400目)以及薄层层析用硅胶GF254(10-40目)均由青岛海洋化工厂生产；所用试剂均为分析纯，其中石油醚沸程为60-90°C；薄层制备层析(PTLC)用Merck公司的铝箔硅胶板；柱色谱用葡聚糖凝胶S印hadex1^-20采用瑞典41^『81^111PharmaciaBiotechAB公司产品；反相硅胶RP-18采用日本FujiSilysiaChemical公司的Chromatorex产品；MCI为日本三菱化工公司产品，薄板(TLC)检测用254nm和365nm的紫外灯；显色剂用碘蒸气、10%硫酸-乙醇以及磷钼酸溶液。1.1在干燥氮气保护的反应瓶中投入2.28克5，7-二羟基黄酮，使之溶于3.15克氢氧化钾水溶液中，加入0.32克四丁基溴化铵，冰浴冷却下滴加溶有3克过硫酸钾的90毫升水溶液，滴加完毕后，搅拌2小时，撤去冰浴，室温放置过夜。用IN盐酸调pH值为5，搅拌，过滤析出的土黄色固体，滤液加入22.5毫升浓盐酸，2.25克亚硫酸钠，加热煮沸10分钟，静置冷却，过滤，滤饼水洗至中性，干燥，得棕黄色粗品1.07克，经无水乙醇重结晶，得到5，7，8_三羟基黄酮黄色晶体0.55克。测其紫外光谱谱图UV(MeOH)Amax:281,364nm；UV(Na0Ac/H3B03)Amax:287nm，提示邻二酚羟基结构的存在。1.2在干燥氮气保护的反应瓶中投入0.22克5，7，8-三羟基黄酮，0.245克4-羟基-肉桂醇和0.56克氧化银，注入8毫升无水丙酮和24毫升无水苯，50-60°C之间保温15小时，过滤，母液浓缩，硅胶(200-300目，20克)重复柱层析分离(氯仿/甲醇=9121)，得浅黄色针状晶体0.17克，收率50%。式⑴化合物(士)-tranS-6-羟基-2-羟甲基-3-(4_羟基苯基)-9_苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3-h]苯并吡喃-7-酮Rf(氯仿甲醇醋酸乙酯丙酮醋酸=2205110.1):0.24；核磁共振氢谱1HNMR(400MHz，氘代丙酮)δ:3·43(双双峰，J=12.0,4.0Hz,1Η，Η-9〃a)，3.68(双双峰，J=12.0，1.6Hz,1H，H_9〃b)，4·25(多重峰，1Η,Η-8“)，5·17(双峰，J=8.OHz,1Η,Η-7“)，6·40(单峰，1Η,Η_6)，6·82(双峰，J=8·0Ηζ，2Η，Η-2"，6〃)，7.04(单峰，1Η，Η-3)，7.29(双峰，J=8.0Hz，2Η，Η-3〃，5")，7·62(多重峰，3Η，Η-3'，4'，5')，8.12(多重峰，2Η，Η-2‘，6')，9.58(单峰，1Η，4'-0Η)，12.24(单峰，1Η，5-0Η)；电喷雾质谱ESI-MSm/z:417[Μ-Η]+。实施例2式(1)化合物对H印G2.2.15细胞分泌的乙型肝炎e抗原(HBeAg)的抑制作用2.1细胞培养将H印G2.2.15细胞培养于含10%灭活胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升链霉素，100微克/毫升G418的DMEM培养基中，置37°C，5%C02，100%相对湿度的培养箱中培养。2.2采用MTT法测定化合物(1)对H印G2.2.15细胞生长的抑制作用取对数生长期的H印G2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成1XIO5个/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37°C，5%CO2,100%相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的化合物(1)，浓度分别为1000微克/毫升，200微克/毫升，40微克/毫升和8微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37°C，5%CO2,100%相对湿度的培养箱中培养，培养72小时后，每孔加入MTT试剂10微升，继续培养4小时，弃去培养基，每孔加入DMS0200微升，用振荡器振荡20分钟，在570nm波长下用酶标仪测定OD值。以只加培养基的培养孔为对照孔。抑制率(％)=(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值X100%。实验重复三次。测定化合物对乙型肝炎e抗原(HBeAg)的抑制作用取对数生长期的H印G2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成1XIO5个/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100毫升，在37°C,5%C02，100%相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的样品，浓度分别为100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37°C，5%C02，100%相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品的培养基，将同一样品同一浓度的换出的培养基等体积混勻，作为待测样品。用ELISA试剂盒测定培养基中HBeAg浓度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照1(注测试浓度为100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升)；以α-干扰素为阳性对照2(注测试浓度为10000单位/毫升，5000单位/毫升和1000单位/毫升)。2.3实验结果实验结果如表1所示，式(1)化合物有一定的抑制乙型肝炎e抗原(HBeAg)的作用。其对H印G2.2.15细胞的生长无明显抑制作用，但对H印G2.2.15细胞分泌的HBeAg在第八天时抑制活性达到13.7%，而阳性对照1拉米呋啶对HBeAg抑制活性为零；阳性对照2即α_干扰素在第8天最高测试浓度(10000单位/毫升)时对HBeAg有16.9%的抑制活性，可见化合物⑴在100微克/毫升时对HBeAg抑制活性与最高测试浓度(10000单位/毫升)的α-干扰素非常接近。表1.样品对H印G2.2.15分泌的乙型肝炎e抗原(HBeAg)抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>10000单位/亳升16.9%α-干扰素5000单位/毫升7.8%__1000单位/毫升__8,2%_该实施例结果说明式(1)所示之黄酮木脂素化合物(士)-trans-6-羟基-2-羟甲基-3-(4-羟基苯基)-9-苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3-h]苯并吡喃_7_酮对H印G2.2.15细胞分泌的乙型肝炎e抗原(HBeAg)具有一定的抑制作用，其在100微克/毫升时对HBeAg抑制活性高于阳性对照拉米呋啶并接近一线用药α_干扰素在最高测试浓度(10000单位/毫升)时的抑制活性，可见该黄酮木脂素有一定的抑制乙肝病毒分泌乙肝e抗原活性，因而可预期进一步发展为降低乙型肝炎e抗原、控制病毒性乙型肝炎症状的药物。实施例3式(1)化合物对H印G2.2.15细胞分泌的乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)复制的抑制作用3.1细胞培养方法同实施例2。3.2采用MTT法测定式(1)所示之黄酮木脂素化合物对H印G2.2.15细胞生长的抑制作用方法同实施例2。3.3测定式(1)所示之黄酮木脂素化合物对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)复制的抑制作用取对数生长期的H印G2.2.15细胞，用培养基将细胞稀释成1XIO5个/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37°C，5%CO2,100%相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的式(1)所示之黄酮木脂素化合物，浓度分别为100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37°C，5%C02，100%相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品的培养基，将同一样品同一浓度的换出的培养基等体积混勻，作为待测样品。第8天时用HBVDNA定量PCR试剂盒测定培养基中HBVDNA浓度。以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照1(注测试浓度为100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升)，以α-干扰素为阳性对照2(注测试浓度为10000单位/毫升，5000单位/毫升和1000单位/毫升)。3.4实验结果实验结果举例说明如表2所示，从头合成的黄酮木脂素式(1)化合物具有强效的抑制HBVDNA复制的作用。表2样品第8天时对H印G2.2.15细胞的HBVDNA复制的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>该实施例结果说明式(1)所示之黄酮木脂素化合物对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)的复制具有极为强效的抑制作用，其在高剂量(100微克/毫升)和中浓度(20微克/毫升)时对乙肝病毒HBVDNA的复制抑制活性均接近一线用药拉米呋啶。而阳性对照α-干扰素在第8天最高测试浓度(10000单位/毫升)时对HBVDNA仅有38.2%的抑制活性，化合物(1)在最低测试浓度4微克/毫升时对HBVDNA抑制活性已超过最高测试浓度时的α-干扰素。因此该的A环二氧六环偶合型黄酮木脂素类化合物属于显著强效的非核苷类抑制乙肝病毒天然产物，值得进一步关注和深入研究，并可预期进一步优化发展为抑制乙肝病毒HBVDNA复制的药物。在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。权利要求具有式(1)所示结构的A环二氧六环偶合型黄酮木脂素类化合物或其可药用盐用于制备治疗乙型病毒性肝炎药物之用途；式(1)化合物的名称为(±)-trans-6-羟基-2-羟甲基-3-(4-羟基苯基)-9-苯基-2，3-二氢-[1，4]二氧六环[2，3-h]苯并吡喃-7-酮。FSA00000134503300011.tif2.具有式(1)所示结构的A环二氧六环偶合型黄酮木脂素或其可药用盐用于制备清除乙肝e抗原HBeAg药物之用途。3.具有式(1)所示结构的A环二氧六环偶合型黄酮木脂素或其可药用盐用于制备抑制乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸HBVDNA复制的药物的用途。全文摘要本发明涉及A环二氧六环黄酮木脂素用于制备抗乙肝病毒药物的用途，具体而言，本发明涉及一种A环二氧六环偶合型黄酮木脂素或其可药用盐用于制备清除乙肝e抗原HBeAg、抑制HBVDNA复制、治疗乙型肝炎病毒感染疾病药物的用途，该黄酮木脂素具有一定的抑制HBeAg活性，其清除HBeAg强度高于阳性对照拉米呋啶，且与10000单位/毫升的α-干扰素接近；同时在100微克/毫升时该化合物对HBVDNA复制的抑制率大于80％。以上药效学结果表明该黄酮木脂素或其可药用盐可预期用于制备清除乙肝e抗原药物、抑制HBVDNA复制、治疗乙型肝炎病毒感染疾病药物的用途。文档编号A61P31/20GK101829085SQ20101018141公开日2010年9月15日申请日期2010年5月25日优先权日2010年5月25日发明者丁红霞,巫秀美,张礼和,彭芳,徐路,赵昱,郝小江,龚景旭申请人:大理学院