一种黄酮木脂素用于制备防治乙型病毒性肝炎药物的用途的制作方法
专利名称：一种黄酮木脂素用于制备防治乙型病毒性肝炎药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及式(1)所示的黄酮木脂素或其 可药用盐及其药物组合物在制备治疗乙肝病毒感染疾病和抗乙肝病毒药物中的用途。该黄 酮木脂素经药效学测试发现具有强效抑制乙肝表面抗原HBsAg活性，可预期发展成为抗乙 肝病毒药物。
背景技术：
乙型病毒性肝炎(多简称乙肝)是由乙型肝炎病毒HBV引起的传染病，HBV是嗜 肝DNA病毒科H印adnaviridae的一员。HBV是奇特的病毒，在其它动物中较少有传染性，唯 有在人体或者灵长类动物黑猩猩体内才能得以复制。该病毒通过血液与体液传播，具有慢 性携带状态。乙型病毒性肝炎在我国广泛流行，人群感染率高，在某些地区感染率达到35% 以上。据有关资料，肝炎检测阳性的患者已经达到1. 89亿，而应就诊未就诊人数(携带者) 将近4亿，是当前危害人民健康最严重的传染病之一。乙肝临床表现多样化，易发展为慢性 肝炎和肝硬化，少数病人可转变为原发性肝癌。相当多的慢性乙肝(CHB)患者如不经治疗， 在感染HBV后20 30年期间会发生肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌(HCC)，而亚洲慢性乙肝 患者发展成HCC几率远高于西方患者。现在乙型肝炎的治疗主要有核苷类药物、保肝类药 物和免疫调节制剂等，但均不能完全控制病情的进展。目前核苷类药物中最常用也是最有 效的是拉米夫啶，但需要长期使用，而长期使用又可导致耐药性，且停药后易反跳，这严重 影响了药物的疗效。干扰素(α、β _干扰素)以及重组干扰素类等来源于人白细胞的生物工程类抗病 毒药物近期成为研究和治疗CHB热点药物，其具有抗病毒和免疫调节双重作用。其既可通 过抗病毒作用抑制病毒复制从而减轻肝脏细胞炎症反应，减少肝细胞损害，延缓病情发展 从而起到改善病人临床症状和肝脏生理功能；又可以增强免疫作用，通过加强体内自然杀 伤细胞和辅助性T细胞的作用，尤其是可以促进杀伤T细胞去杀伤被病毒感染细胞，因此间 接起到抗病毒作用。因此，干扰素日渐成为临床上用于治疗慢性乙肝病毒的首选药物，但其 副作用和不良反应报道较多，总有效率不高，价格昂贵，患者经济负担大，因而造成临床上 难以广泛使用。因此，开发新型抗乙肝病毒药是当今药物研发领域的当务之急，其对于治疗我国 大量的乙肝患者和病毒携带者、控制传染源等都有着极其重要的社会意义和经济意义。乙肝表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒的外壳蛋白，HBsAg阳性是判断HBV感染的金标 准。HBsAg阳性、但无肝炎症状出现者成为HBV病毒携带者。HBsAg滴度越大，其合并乙肝 核心抗原HBeAg、HBV DNA阳性和DNA多聚酶活性升高的几率就越大，因而传染性越强。同 理，抑制HBsAg的分泌和复制也是研发抗乙肝病毒药物中的一个重要靶标和检测标的。北 京地坛医院吴淑云等报告乙肝HBsAg清除和乙肝闭环共价DNA(cccDNA)存在一定相关性， 清除HBsAg是cccDNA水平显著降低的标志。2002年，在《新英格兰医学杂志》发表研究结 果之研究者认为对于CHB患者，如在肝硬化前获HBsAg清除，则其肝硬化和肝细胞癌发生率将降低60倍。美国肝病研究协会AASLD、亚太肝脏研究协会APASL和欧洲肝脏研究协会 EASL的指南中均将HBsAg血清清除作为治疗终点判定标准之一。据2008年欧洲肝脏研究学会年会报道聚乙二醇干扰素α -2a治疗CHB患者48 周后停药，随访1、2、3、4年，其HBsAg清除率分别为3%、6%、8%和11%，而单独用拉米夫 定者对HBsAg清除率于停药后1、2、3、4年仅为0%、0%、0%和3%。因而该干扰素被认为 是治疗HBeAg阴性CHB患者最佳治疗选择。可见发现能够高效清除HBsAg的药物具有重大 的社会和经济效益。发明人以前曾完成多项抗乙肝病毒天然产物及其结构改造衍生物的专利和文 章，发现了多种抑制乙肝病毒或乙肝病毒表面抗原HBsAg活性的化合物，从而说明从天 然产物及其合成衍生物中筛选出抑制乙肝表面抗原、防治乙肝病毒感染的创新性药物 是可行的[参见“一类对映桉烷醇类倍半萜抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、刘光 明、于荣敏、李海波等；ZL 200610053827. 4) ；“2 β -羟基冬青酸抑制乙肝病毒的医药 用途”(李校堃、赵昱、黄可新、李海波等；ZL 200610053749. 8) ；“2 α，3 β - 二羟基-5， 11 (13)-二烯桉烷-12-酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、张礼和、孙汉董、李海波等； ZL200610053601.4)；“艾里莫芬烷内酯抑制乙肝病毒的用途及其药物组合物”(赵昱、李 海波、杨雷香、周长新等；ZL 03153691.3)；“一种艾里莫芬内酯酸天然产物及其应用”(赵 昱、周长新、施树云、王晓雨等；ZL 200610053575. 5)；“一种桉烷型倍半萜酸及其用途”(赵 昱、刘光明、李海波、巫秀美等；ZL 200610053579. 3)；“六棱菊属植物提取物抑制单纯疱 疹病毒及乙肝病毒的用途”(赵昱、周长新、于荣敏、白骅；CN 1989989Α) ；“1β-氧代_5， 11 (13)- 二烯桉烷-12-酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、李校堃、黄可新、李海波等； CN 1927197Α) ；“ 1 β -羟基冬青酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、李校堃、黄可新、 巫秀美等；CN 1935131Α)；“对映艾里莫芬烷酸及其抑制乙肝表面抗原的医药用途”(黄 可新、李校堃、王晓雨、赵昱等；CN 101239054) ；“ 1_氧-取代苯甲酰奎尼酸化合物及其 抑制乙肝病毒用途”(李校堃、胡利红、巫秀美、赵昱等；CN101293836)；发明人已发表之 抑制 HBsAg 等活性文章参见“In VitroAntiviral Activity of Three Enantiomeric Sesquiterpene Lactones fromSenecio Species Against Hepatitis B Virus，，， Haibo Li (李海波)，Changxin Zhou(周长新)，Xiumei Wu(巫秀美)，Yu Zhao*(赵昱)等， Antiviral Chemistry&Chemotherapy, 2005,16, 277-282 "‘Evaluation of Antiviral Activity of Compounds Isolated fromRanunculus sieboldii Miq. and Ranunculus sceleratus L，，，Haibo Li (李海波)，Changxin Zhou (周长新)，Xiumei Wu (巫秀美)，Yu Zhao* (赵昱)等，Planta Medica, 2005, 71 (12), 1128-1133 ；"Application ofhigh-speed counter-current chromatography for the isolation of antiviraleremophiIenolides from Ligularia atroviolacea", Shi, Shu-Yun ( H W S ) Hai-Bo ( ^ ^ ), Zhao, Yu ( M S )等，Biomedical Chromatography, 2008, 22 (9), 985-991 ；"Purification and identification of antiviralcomponents from Laggera pterodonta by high-speed counter-currentchromatography，，, Shuyun Shi (施树云),Yu Zhao (赵昱)等，Journalof Chromatography B, 2007,859,119-124]。毋庸置疑，继续从天然产物及其结构改造衍生物 中寻找能够清除HBsAg的先导化合物是非常有必要性和紧迫性的，也因此被国家科技部列 为新药研制重大专项之一。
在上述治疗CHB药物中，还有一类是保肝类药物，其临床大量使用之典型为存在 于菊科植物水飞蓟的种子中的水飞蓟素。水飞蓟已在临床上广泛应用，在市场上其商品 名为Legalon 利肝隆或Flavobion ，其代表性化合物当属黄酮木脂素水飞蓟宾。黄酮 木脂素化合物属于杂木质素类，是由一分子苯丙素和一分子黄酮结合而成的一类天然产 物。水飞蓟中水飞蓟宾含量最多，活性也最高。该药作用主要有以下几点(一)抗自由 基活性水飞蓟素对于由四氯化碳、半乳糖胺、醇类和其他肝毒素造成的肝损害具有保护 作用。1990年Lotteron等人报道了在小鼠肝微粒体内，水飞蓟素能减少由四氯化碳代 谢引起的体外脂质过氧化及由还原型辅酶单独引起的过氧化作用，这些都表明水飞蓟素 为链中断抗氧化剂或为自由基清除剂。(二)保护肝细胞膜通过抗脂质过氧化反应维 持细胞膜的流动性，保护肝细胞膜。还能阻断真菌毒素鬼笔毒环肽和α-鹅膏蕈碱等与 肝细胞上特异受体的结合，抑制其对肝细胞的攻击及跨膜转运，中断其肝肠循环，从而增 强肝细胞膜对于多种损害因素的抵抗力。(三)促进肝细胞的修复和再生水飞蓟宾进 入细胞后可以与雌二醇受体结合，并使之激活，活化的受体可以增强肝细胞核内RNA聚合 酶1的活性，使RNA转录增强，促进酶及蛋白质的合成，并间接促进DNA的合成，有利于肝 细胞的修复和再生。(四)抗肿瘤作用各种活性氧能氧化鸟嘌呤形成8-羟基鸟嘌呤， 造成DNA损伤，进而引起肿瘤，水飞蓟宾作为一个有效的抗自由基物质也显示了预防和治 疗肿瘤的作用。三十多年的临床实验证明该药具有确切的疗效和低毒性(参阅Flora， K.等，Am. J. Gastroenterol，1998，93，139-143 ;Saller R.等，Drugs，2001，61 (14)，
2035-2063 ；Gazak,'R·等，Curr. Med. Chem. 2007，14，315-338 ；Svagera:, Ζ·等，Phytother. Res. 2003，17，524-530 ； Gazak, R.等，Bioorg. Med. Chem. 2004，12，5677-5687 ；Varga, Z.等；Phytothe. Res. 2001，15，608-612. Singh，R. P.等，Curr. Cancer Drug Tar. 2004, 4，1-11)。因此，以水飞蓟宾为代表的黄酮木脂素类化合物引起了越来越多的关注，如发 明人于2006年制备并报道的多个系列水飞蓟宾类衍生物也具有显著的抗氧化活性(杨 雷香、赵昱等，"Design，Synthesis and Examinationof Neuron Protective Properties of Alkenylated and AmidatedDehydro-Silybin Derivatives，，，Journal of Medicinal Chemistry，2009，52(23)，7732-7752 ；汪峰，赵昱等，“Pr 印 aration of C-23 esterified silybinderivatives and evaluation of their lipid peroxidation inhibitory and DNAprotective properties", Bioorganic&Medicinal Chemistry,2009,17(17)， 6380-6389 ；杨雷香，赵昱等，"Synthesis and Antioxidant PropertiesEvaluation of Novel Silybin Analogues”， Journal of Enzyme Inhibitionand Medicinal Chemistry, 2006，21(4), 399-404 ；等等)。在发明人报道的这些文章中，经发明人设计并合成出的多个 系列之A环、B环、E环和23位取代的黄酮木脂素类化合物都显示出强效捕获DPPH自由基 和超氧阴离子自由基的活性、抗氧化活性、以及保护PC12细胞的活性。但是显而易见上述 研究仅集中于研究水飞蓟宾类黄酮木脂素的抗氧化作用和细胞保护作用。近期(2006年)，谢军报道了联合应用具有抗病毒和免疫调节双重作用的干扰素 和保肝护肝的水飞蓟宾磷脂复合物治疗慢性乙肝，发现对对患者体内ALT、AST值降低比单 独用干扰素效果明显，说明水飞蓟宾磷脂复合物能加强干扰素的治疗慢性乙肝。但是，类似 的治疗方案仍是将水飞蓟宾等黄酮木脂素作为辅助用药，主要是用于保护肝细胞膜而非直 接用其实施抗病毒作用。左国营等(左国营，刘树玲，徐贵丽，世界华人消化杂志，2006年14卷13期，1241-1246页)综述了近20年来药用植物成分体外抗HBV活性的研究进展，文 中论及多种天然产物，其中并没有报道任何黄酮木脂素类化合物具有抗HBV活性的相关记 录，尤其是水飞蓟宾类天然产物及其衍生物，国内几乎无人涉及，仅由发明人团队对其进行 了前人未加注意的结构改造和抗氧化活性研究。以水飞蓟宾为代表的黄酮木脂素化合物虽然具有以上所述之抗氧化疗效，然而其 见报于抗病毒治疗方面之文献相对较少。黄酮木脂素类化合物治疗DNA类病毒感染尤其是 其用于抗乙肝病毒方面(包括抑制乙肝表面抗原HBsAg)的新用途尚未得到有效开发，故此 从黄酮木脂素中寻找抗乙肝病毒领域的活性化合物、也即将黄酮木脂素结构改造使其具有 抗DNA类病毒活性是一个崭新的领域。从其中发现抑制HBsAg的先导化合物更是千人所未 尝试过的挑战。为了探索这个领域，我们设计并制备了与水飞蓟宾结构有所差异的一种新 的黄酮木脂素衍生物，也即在黄酮木脂素水飞蓟宾E环引入新的甲氧基取代基，由此便形 成了 E环上含有两个甲氧基的木质素二氢黄酮醇类化合物(新型黄酮木脂素化合物)，以期 发现能降低HBsAg的黄酮木脂素先导化合物，从而将其进一步开发成具有能清除HBsAgJg 疗CHB的创新性药物，据此完成本发明。
发明内容
本发明的目的是提供式(1)所示的黄酮木脂素或其可药用盐在制备治疗乙型病 毒性肝炎药物或用于制备降低乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的药物之新用途。其特征为 式(1)化合物的名称为(士)-2-[2，3_ 二氢-3-(3，5_ 二甲氧基-4-羟基苯 基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6] -2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃_4_酮。式(1)化合物可以由化学合成方法得到。本发明的另一个目的是提供了一种用于降低乙肝表面抗原、防治乙型病毒性肝炎 的药物组合物，其特征为由含有治疗有效量的作为活性成分的式(1)化合物或者它的可药 用盐和可药用辅料组成的混合物。其药物剂型可以是片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、 膜剂、滴丸剂、贴片剂、皮下植埋剂、外用搽剂、口服液或软膏剂，还可以采用现代制药界所 公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。本发明的黄酮木脂素化合物(1)与天然产物水飞蓟宾相比较，具有诸多结构和物 化性质上差异化的特征，包括其疏水性、吉布斯自由能、氢键受体、电性、分子间范德华力、 以及3D构象等特质均与水飞蓟宾有着明显不同；且化合物(1)分子量比水飞蓟宾增大了 30个质量单位。上述特征都决定了式(1)所示之化合物三维构象与HBsAg之3D空间结构 相结合之配体_受体结合复合物形态和结合方式都可能产生较大的差别，其结合位点和结 合模式、其结合自由能等均会产生较大的改变，因而可能在抑制HBsAg方面有着意想不到 的效果。
我们测试了该化合物对H印G2. 2. 15细胞的生长抑制作用，同时测试了其对 H印G2. 2. 15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原HBsAg的抑制活性。试验结果发现本发明中合 成得到的木质素二氢黄酮醇类化合物即(士)_2-[2，3- 二氢-3- (3，5- 二甲氧基-4-羟基苯 基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6] -2，3- 二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃_4_酮 对H印G2. 2. 15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原HBsAg具有强效的抑制活性，超过阳性对照 (也是临床治疗乙肝病毒患者一线用药)拉米夫啶和α-干扰素，从而预期其可以作为抗乙 肝病毒药物先导化合物继续开发。经本发明人详细的文献查阅，到目前为止，尚无有关该黄 酮木脂素化合物治疗乙肝病毒感染性疾病和制备抗乙肝病毒药物的报道。综上所述，我们从头合成的该黄酮木脂素既有结构上的独特性，又有抗病毒作用 方面研究的新颖性，并在抗乙肝病毒活性测试中发现了超乎寻常的抑制乙肝病毒表面抗原 的活性，有望成为降低HBsAg及治疗CHB之先导化合物。本发明的有益之处在于首次发现了制备出的黄酮木脂素化合物(士)-2_[2， 3- 二氢-3-(3，5- 二甲氧基-4-羟基苯基)-2_羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6]_2，3_ 二 氢-3，5，7-三羟基-4Η-1-苯并吡喃-4-酮在抑制HBsAg方面的药效活性，对于开发治疗乙 型病毒性肝炎药物或开发降低乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg药物提供了新的物质基础。具 有潜在的巨大社会效益和经济效益。本发明再一特点为该化合物可由简单原料经几步合 成改造而得，原料来源方便易得，制备步骤简便，成本低，产率较高，利于产业化。
具体实施例方式本发明人通过多步合成，并通过层析手段得到该有效抑制乙肝表面抗原(HBsAg) 的分泌活性的黄酮木脂素类活性化合物，又经质谱和核磁共振波谱等综合解析推导出其化 学结构。本发明人发现，式(1)化合物对H印G2. 2. 15细胞的生长无明显抑制作用，表明 式(1)化合物对H印G2. 2. 15细胞无明显细胞毒性；而其对H印G2. 2. 15细胞分泌的乙肝表 面抗原(HBsAg)的分泌具有显著的抑制作用，提示该化合物具有降低乙肝病毒表面抗原高 效、用药安全的特点。因此，根据本发明人的研究，发明人所设计并合成的式(1)所示之黄 酮木脂素化合物可以用于治疗乙肝病毒感染性疾病和用于制备治疗乙肝病毒感染性疾病 的药物。为了更好地理解本发明的实质，下面分别用式(1)化合物的制备及其对 H印G2. 2. 15细胞生长抑制作用以及对H印G2. 2. 15细胞分泌的HBsAg之抑制作用试验的结 果，说明其在制药领域中的新用途。实施例给出了式(1)化合物的部分合成、结构鉴定、和 活性数据，其中OM是指甲氧基、OMOM是指甲氧甲氧基。必须说明，本发明的实施例是用于 说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本 发明要求保护的范围。实施例1 式(1)化合物(士)-2-[2，3_ 二氢-3-(3，5_ 二甲氧基-4-羟基苯 基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6] -2，3- 二氢-3，5，7-三羟基-4Η-1-苯并吡喃_4_酮 的制备仪器与试剂紫外光谱用Shimadzu UV-240紫外分光光度计测定；核磁共振氢 谱1H-NMR由INOVA型超导核磁共振波谱仪(VARIAN IN0VA-400MHz)测定(四甲基硅醚 TMS为内标)；电喷雾质谱ESI-MS由Bruker Esquire 3000+质谱仪测定，柱层析用硅胶
7(100-200，200-300和300-400目)以及薄层层析用硅胶GF254(10_40目)均由青岛海 洋化工厂生产；所用试剂均为分析纯，其中石油醚沸程为60-90°C ；薄层制备层析(PTLC) 用Merck公司的铝箔硅胶板；柱色谱用葡聚糖凝胶S印hadex LH-20采用瑞典Amersham PharmaciaBiotech AB 公司产品；反相硅胶 RP-18 采用日本 Fuji Silysia Chemical 公司 的Chromatorex产品；MCI为日本三菱化工公司产品，薄板(TLC)检测用254nm和365nm的 紫外灯；显色剂用碘蒸气、10%硫酸-乙醇以及磷钼酸溶液。本发明用从头合成法制备了式 (1)所示之黄酮木脂素化合物，除此方法之外，还可以用以市售taxifolin直接进行最后耦 合反应，一步生成式(1)化合物。具体合成步骤如下1. 1化合物2即3，4，2'，4'，6'-五甲氧甲氧基查尔酮的合成的制备 8. 4克氢氧化钾溶于100毫升无水甲醇中，搅拌降至室温后加入溶解有3克2，4， 6_三甲氧甲氧基苯乙酮和2. 3克3，4_ 二甲氧甲氧基苯甲醛的20毫升甲醇溶液，于室温 搅拌10小时，减压蒸去溶剂，残留物中加入50毫升水，醋酸乙酯提取，合并有机相，饱和食 盐水洗涤，无水硫酸钠Na2SO4干燥，过滤，浓缩得棕色残留物，经柱层析得黄色油状物3. 8 克。收率77% ;Rf(石油醚/醋酸乙酯=3/1) :0. 10 ；核磁共振氢谱1H NMR(400MHz，氘代 氯仿，δ in ppm) δ :3· 36 (单峰，6Η, OCH3)，3· 47 (单峰，9Η, OCH3)，5· 14 (单峰，4Η, OCH2O)， 5. 22 (单峰，2Η, OCH2O)，5. 25 (单峰，4Η, OCH2O)，6. 58 (单峰，2Η，Η-3 ‘，5 ‘ )，6. 83 (双峰， J = 16. 0Hz, 1Η, H- α ), 7. 16 (双峰，J = 8. OHz, 1Η, Η-5)，7. 24 (双双峰，J = 2. 0,8. OHz, 1Η，Η-6)，7. 26 (双峰，J = 16. OHz，1Η，H- β )，7. 45 (双峰，J = 2. OHz，1Η，Η-2)；电喷雾质谱 ESI-MS :m/z 507[M+H] +。1.2化合物3即3，4，2' ,4' ,6'-五甲氧甲氧基环氧查尔酮的制备 取1. 1步骤中得到的化合物2即3，4，2' ,4' ,6'-五甲氧甲氧基查尔酮2. 5克 溶解于60毫升甲醇中，于搅拌状态下加入2N氢氧化钠3毫升以及30%过氧化氢4毫升， 于室温搅拌5小时，取样做紫外分析，UV (MeOH) λ max nm 由209，330变为209，282，当330nm 的吸收峰完全消失后说明反应完全，减压蒸去溶剂，在残留物中加入50毫升水，醋酸乙酯 提取(3X30毫升)。合并有机相后用饱和食盐水(40毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤， 浓缩得黄色油状物2. 4克，收率88%。产物直接用于下一步反应。1.3化合物4即(士)-tranS-3，5，7，3'，4'-五羟基二氢黄酮醇的制备 取1.2步骤中得到的化合物3即3，4，2'，4'，6'-五甲氧甲氧基环氧查尔酮 2. 4克溶解于60毫升甲醇和20毫升四氢呋喃的混合溶剂中，向其中滴加3毫升浓盐酸， 于50-55°C搅拌15分钟，减压蒸去溶剂，醋酸乙酯提取(3X30毫升)，合并有机相后依次 用水，饱和食盐水(各40毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩，残留物用氯仿-甲醇 (10 1)作洗脱剂，经柱层析得到浅黄色固体1克，收率73% ;Rf (氯仿甲醇=10 1) 0. 30 ；核磁共振氢谱 1H NMR(400MHz，氘代丙酮，δ inppm) 4. 61 (双双峰，J = 4. 4，11. 6Hz， 1Η，Η-3)，4· 71 (双峰，J = 4. 4Hz, 1Η，3-0Η)，5. 02(双峰，J = 11. 6Ηζ, 1Η，Η_2)，5· 95(双峰， J = 2. 4Ηζ，Η-6)，5· 98 (双峰，J = 2. 4Hz, 1Η, Η_8)，6. 85-7. 07 (多重峰，3Η, Ar-H)，11· 71 (单 峰，1Η，5-0Η)；电喷雾质谱 ESI-MS :m/z 303[M_H] +。1.4化合物(1)即(士)-2-[2，3_ 二氢-3-(3，5_ 二甲氧基-4-羟基苯基)-2_羟甲 基-1，4-苯并二氧六环-6] -2，3- 二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃_4_酮的制备 在干燥氮气保护的反应瓶中加入0.6克步骤1.3中得到的化合物4即 (±)-tranS-3，5，7，3'，4' _五羟基二氢黄酮醇和5-甲氧基松柏醇0. 75克，用无水丙酮 40毫升和无水苯120毫升溶解，于55-60°C搅拌20分钟，再加入1. 5克碳酸银，继续搅拌12 小时，过滤，母液浓缩，经柱层析得浅黄色粉末0. 30克，收率30 %。浅黄色粉末；C26H24O11 ； Rf值(氯仿醋酸乙酯草酸=25 1 0. 25) :0. 12 ；核磁共振氢谱1H-NMIU氘代丙 酮，400MHz) δ 3. 55(1Η，多重峰，H_23a)，3. 77 (1H,多重峰，H_23b)，3. 86 (6H,单峰，OCH3)， 4. 16 (1H,多重峰，H-10) ,4. 66 (1H,双峰，J = 11. 6Hz, Η_3)，4· 99 (1Η,双峰，J = 8. OHz, H-11) ,5. 11 (1H，双峰，J = 11. 6Hz，H-2)，5. 97 (1H，双峰，J = 2. 0Hz,H-6) ,6. 00 (1Η，双峰，J =2. ΟΗζ,Η-8) ,6. 85-7. 34 (5Η，多重峰，Ar_H)，11. 69 (1H，单峰，5-0H)；电喷雾质谱 ESI-MS m/z 511[M-H]+。实施例2 化合物(1)对H印G2. 2. 15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑 制作用2. 1细胞培养将H印G2. 2. 15细胞培养于含10%灭活胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升 链霉素，100微克/毫升G418的DMEM培养基中，置37°C，5% C02，100%相对湿度的培养箱
中培养。2. 2采用MTT法测定式(1)化合物对H印G2. 2. 15细胞生长的抑制作用
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取对数生长期的H印G2. 2. 15细胞，用培养基将细胞稀释成1 X IO5个/毫升，接种 于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37°C，5% CO2,100%相对湿度的培养箱中培养24小 时后加入用培养基稀释的化合物(1)，浓度分别为1000微克/毫升，200微克/毫升，40微 克/毫升和8微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37°C，5% CO2,100% 相对湿度的培养箱中培养，培养72小时后，每孔加入MTT试剂10微升，继续培养4小时，弃 去培养基，每孔加入DMS0200微升，用振荡器振荡20分钟，在570nm波长下用酶标仪测定OD 值。以只加培养基的培养孔为对照孔。抑制率(％)=(对照孔OD值-实验组OD值)/对 照孔OD值X 100%。实验重复三次。测定化合物对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用。取对数生长期的 H印G2. 2. 15细胞，用培养基将细胞稀释成IX IO5/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100 毫升，在37°C，5% C02，100%相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的样 品，浓度分别为20微克/毫升，4微克/毫升和0. 8微克/毫升，每孔200微升，每个浓度 设三个复孔，置于37°C，5% C02，100%相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品 的培养基，将同一样品同一浓度的换出的培养基等体积混勻，作为待测样品。用ELISA试剂 盒测定培养基中HBsAg浓度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照1 (注拉米夫啶 测试浓度为100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升)；以α-干扰素为阳性对照 2 (注α -干扰素测试浓度为10000单位/毫升，5000单位/毫升和1000单位/毫升)。2. 3实验结果实验结果如表1所示，式(1)化合物有显著的抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的 作用。其对H印G2. 2. 15细胞的生长无明显抑制作用，但对H印G2. 2. 15细胞分泌的乙型肝 炎表面抗原HBsAg在第八天时高、中、低剂量下抑制活性都高于拉米呋啶。表1.样品对H印G2. 2. 15分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抑制率 该实施例结果说明式(1)所示之黄酮木脂素化合物(士)-2-[2，3_ 二氢_3-(3， 5- 二甲氧基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6] -2，3- 二氢-3，5，7-三羟 基-4Η-1-苯并吡喃-4-酮对H印G2. 2. 15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有显著 的抑制作用，其在极低浓度(4微克/毫升)时对HBsAg抑制活性即远超过拉米夫定，而在较低浓度(20微克/毫升)时对HBsAg抑制活性将近是阳性对照药物拉米夫定的五倍，比 α -干扰素最高测试浓度10000单位/毫升浓度下相应的HBsAg抑制活性高三倍；在此较 低浓度(20微克/毫升)下有50%的HBsAg活性被式(1)化合物抑制，可见该黄酮木脂素 有很强的抑制病毒分泌表面抗原活性。HBsAg清除是临床上最接近治愈的状态，对于乙肝患 者，其HBsAg清除成为非常有价值的CHB治疗终点。因而式(1)所示之黄酮木脂素化合物 可预期发展为降低乙型肝炎表面抗原、控制病毒性乙型肝炎症状的药物。
在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际 操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应 用包括所有一般变化、配合，或改进。
权利要求
式(1)所示的黄酮木脂素或其可药用盐用于制备治疗乙型病毒性肝炎药物之用途，其特征为式(1)化合物的名称为(±) 2 [2，3 二氢 3 (3，5 二甲氧基 4 羟基苯基) 2 羟甲基 1，4 苯并二氧六环 6] 2，3 二氢 3，5，7 三羟基 4H 1 苯并吡喃 4 酮。FSA00000134306600011.tif
2.式(1)所示的黄酮木脂素或其可药用盐用于制备降低乙型肝炎病^ 药物之用途，其特征为■表面抗原HBsAg 式(1)化合物的名称为(士)-2-[2，3-二氢-3-(3，5-二甲氧基-4-羟基苯基)-2_羟 甲基-1,4-苯并二氧六环-6] -2，3- 二氢-3，5，7-三羟基-4H—1-苯并吡喃_4_酮。
全文摘要
本发明涉及一种黄酮木脂素用于制备防治乙型病毒性肝炎药物的用途，具体而言，本发明涉及(±)-2-[2，3-二氢-3-(3，5-二甲氧基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮或其可药用盐用于制备治疗乙型病毒性肝炎药物或用于制备降低乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg药物之用途。由于该黄酮木脂素具有高效抑制乙肝病毒表面抗原HBsAg活性，从而可预期用于制备治疗乙型肝炎病毒感染疾病的药物用途。
文档编号A61P31/20GK101912384SQ20101018174
公开日2010年12月15日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者刘蜻蜻, 巫秀美, 廖晓辉, 曾苏, 李海波, 王成军, 赵军, 赵昱 申请人:大理学院
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及式(1)所示的黄酮木脂素或其 可药用盐及其药物组合物在制备治疗乙肝病毒感染疾病和抗乙肝病毒药物中的用途。该黄 酮木脂素经药效学测试发现具有强效抑制乙肝表面抗原HBsAg活性，可预期发展成为抗乙 肝病毒药物。
背景技术：
乙型病毒性肝炎(多简称乙肝)是由乙型肝炎病毒HBV引起的传染病，HBV是嗜 肝DNA病毒科H印adnaviridae的一员。HBV是奇特的病毒，在其它动物中较少有传染性，唯 有在人体或者灵长类动物黑猩猩体内才能得以复制。该病毒通过血液与体液传播，具有慢 性携带状态。乙型病毒性肝炎在我国广泛流行，人群感染率高，在某些地区感染率达到35% 以上。据有关资料，肝炎检测阳性的患者已经达到1. 89亿，而应就诊未就诊人数(携带者) 将近4亿，是当前危害人民健康最严重的传染病之一。乙肝临床表现多样化，易发展为慢性 肝炎和肝硬化，少数病人可转变为原发性肝癌。相当多的慢性乙肝(CHB)患者如不经治疗， 在感染HBV后20 30年期间会发生肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌(HCC)，而亚洲慢性乙肝 患者发展成HCC几率远高于西方患者。现在乙型肝炎的治疗主要有核苷类药物、保肝类药 物和免疫调节制剂等，但均不能完全控制病情的进展。目前核苷类药物中最常用也是最有 效的是拉米夫啶，但需要长期使用，而长期使用又可导致耐药性，且停药后易反跳，这严重 影响了药物的疗效。干扰素(α、β _干扰素)以及重组干扰素类等来源于人白细胞的生物工程类抗病 毒药物近期成为研究和治疗CHB热点药物，其具有抗病毒和免疫调节双重作用。其既可通 过抗病毒作用抑制病毒复制从而减轻肝脏细胞炎症反应，减少肝细胞损害，延缓病情发展 从而起到改善病人临床症状和肝脏生理功能；又可以增强免疫作用，通过加强体内自然杀 伤细胞和辅助性T细胞的作用，尤其是可以促进杀伤T细胞去杀伤被病毒感染细胞，因此间 接起到抗病毒作用。因此，干扰素日渐成为临床上用于治疗慢性乙肝病毒的首选药物，但其 副作用和不良反应报道较多，总有效率不高，价格昂贵，患者经济负担大，因而造成临床上 难以广泛使用。因此，开发新型抗乙肝病毒药是当今药物研发领域的当务之急，其对于治疗我国 大量的乙肝患者和病毒携带者、控制传染源等都有着极其重要的社会意义和经济意义。乙肝表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒的外壳蛋白，HBsAg阳性是判断HBV感染的金标 准。HBsAg阳性、但无肝炎症状出现者成为HBV病毒携带者。HBsAg滴度越大，其合并乙肝 核心抗原HBeAg、HBV DNA阳性和DNA多聚酶活性升高的几率就越大，因而传染性越强。同 理，抑制HBsAg的分泌和复制也是研发抗乙肝病毒药物中的一个重要靶标和检测标的。北 京地坛医院吴淑云等报告乙肝HBsAg清除和乙肝闭环共价DNA(cccDNA)存在一定相关性， 清除HBsAg是cccDNA水平显著降低的标志。2002年，在《新英格兰医学杂志》发表研究结 果之研究者认为对于CHB患者，如在肝硬化前获HBsAg清除，则其肝硬化和肝细胞癌发生率将降低60倍。美国肝病研究协会AASLD、亚太肝脏研究协会APASL和欧洲肝脏研究协会 EASL的指南中均将HBsAg血清清除作为治疗终点判定标准之一。据2008年欧洲肝脏研究学会年会报道聚乙二醇干扰素α -2a治疗CHB患者48 周后停药，随访1、2、3、4年，其HBsAg清除率分别为3%、6%、8%和11%，而单独用拉米夫 定者对HBsAg清除率于停药后1、2、3、4年仅为0%、0%、0%和3%。因而该干扰素被认为 是治疗HBeAg阴性CHB患者最佳治疗选择。可见发现能够高效清除HBsAg的药物具有重大 的社会和经济效益。发明人以前曾完成多项抗乙肝病毒天然产物及其结构改造衍生物的专利和文 章，发现了多种抑制乙肝病毒或乙肝病毒表面抗原HBsAg活性的化合物，从而说明从天 然产物及其合成衍生物中筛选出抑制乙肝表面抗原、防治乙肝病毒感染的创新性药物 是可行的[参见“一类对映桉烷醇类倍半萜抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、刘光 明、于荣敏、李海波等；ZL 200610053827. 4) ；“2 β -羟基冬青酸抑制乙肝病毒的医药 用途”(李校堃、赵昱、黄可新、李海波等；ZL 200610053749. 8) ；“2 α，3 β - 二羟基-5， 11 (13)-二烯桉烷-12-酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、张礼和、孙汉董、李海波等； ZL200610053601.4)；“艾里莫芬烷内酯抑制乙肝病毒的用途及其药物组合物”(赵昱、李 海波、杨雷香、周长新等；ZL 03153691.3)；“一种艾里莫芬内酯酸天然产物及其应用”(赵 昱、周长新、施树云、王晓雨等；ZL 200610053575. 5)；“一种桉烷型倍半萜酸及其用途”(赵 昱、刘光明、李海波、巫秀美等；ZL 200610053579. 3)；“六棱菊属植物提取物抑制单纯疱 疹病毒及乙肝病毒的用途”(赵昱、周长新、于荣敏、白骅；CN 1989989Α) ；“1β-氧代_5， 11 (13)- 二烯桉烷-12-酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、李校堃、黄可新、李海波等； CN 1927197Α) ；“ 1 β -羟基冬青酸抑制乙肝病毒的医药用途”(赵昱、李校堃、黄可新、 巫秀美等；CN 1935131Α)；“对映艾里莫芬烷酸及其抑制乙肝表面抗原的医药用途”(黄 可新、李校堃、王晓雨、赵昱等；CN 101239054) ；“ 1_氧-取代苯甲酰奎尼酸化合物及其 抑制乙肝病毒用途”(李校堃、胡利红、巫秀美、赵昱等；CN101293836)；发明人已发表之 抑制 HBsAg 等活性文章参见“In VitroAntiviral Activity of Three Enantiomeric Sesquiterpene Lactones fromSenecio Species Against Hepatitis B Virus，，， Haibo Li (李海波)，Changxin Zhou(周长新)，Xiumei Wu(巫秀美)，Yu Zhao*(赵昱)等， Antiviral Chemistry&Chemotherapy, 2005,16, 277-282 "‘Evaluation of Antiviral Activity of Compounds Isolated fromRanunculus sieboldii Miq. and Ranunculus sceleratus L，，，Haibo Li (李海波)，Changxin Zhou (周长新)，Xiumei Wu (巫秀美)，Yu Zhao* (赵昱)等，Planta Medica, 2005, 71 (12), 1128-1133 ；"Application ofhigh-speed counter-current chromatography for the isolation of antiviraleremophiIenolides from Ligularia atroviolacea", Shi, Shu-Yun ( H W S ) Hai-Bo ( ^ ^ ), Zhao, Yu ( M S )等，Biomedical Chromatography, 2008, 22 (9), 985-991 ；"Purification and identification of antiviralcomponents from Laggera pterodonta by high-speed counter-currentchromatography，，, Shuyun Shi (施树云),Yu Zhao (赵昱)等，Journalof Chromatography B, 2007,859,119-124]。毋庸置疑，继续从天然产物及其结构改造衍生物 中寻找能够清除HBsAg的先导化合物是非常有必要性和紧迫性的，也因此被国家科技部列 为新药研制重大专项之一。
在上述治疗CHB药物中，还有一类是保肝类药物，其临床大量使用之典型为存在 于菊科植物水飞蓟的种子中的水飞蓟素。水飞蓟已在临床上广泛应用，在市场上其商品 名为Legalon 利肝隆或Flavobion ，其代表性化合物当属黄酮木脂素水飞蓟宾。黄酮 木脂素化合物属于杂木质素类，是由一分子苯丙素和一分子黄酮结合而成的一类天然产 物。水飞蓟中水飞蓟宾含量最多，活性也最高。该药作用主要有以下几点(一)抗自由 基活性水飞蓟素对于由四氯化碳、半乳糖胺、醇类和其他肝毒素造成的肝损害具有保护 作用。1990年Lotteron等人报道了在小鼠肝微粒体内，水飞蓟素能减少由四氯化碳代 谢引起的体外脂质过氧化及由还原型辅酶单独引起的过氧化作用，这些都表明水飞蓟素 为链中断抗氧化剂或为自由基清除剂。(二)保护肝细胞膜通过抗脂质过氧化反应维 持细胞膜的流动性，保护肝细胞膜。还能阻断真菌毒素鬼笔毒环肽和α-鹅膏蕈碱等与 肝细胞上特异受体的结合，抑制其对肝细胞的攻击及跨膜转运，中断其肝肠循环，从而增 强肝细胞膜对于多种损害因素的抵抗力。(三)促进肝细胞的修复和再生水飞蓟宾进 入细胞后可以与雌二醇受体结合，并使之激活，活化的受体可以增强肝细胞核内RNA聚合 酶1的活性，使RNA转录增强，促进酶及蛋白质的合成，并间接促进DNA的合成，有利于肝 细胞的修复和再生。(四)抗肿瘤作用各种活性氧能氧化鸟嘌呤形成8-羟基鸟嘌呤， 造成DNA损伤，进而引起肿瘤，水飞蓟宾作为一个有效的抗自由基物质也显示了预防和治 疗肿瘤的作用。三十多年的临床实验证明该药具有确切的疗效和低毒性(参阅Flora， K.等，Am. J. Gastroenterol，1998，93，139-143 ;Saller R.等，Drugs，2001，61 (14)，
2035-2063 ；Gazak,'R·等，Curr. Med. Chem. 2007，14，315-338 ；Svagera:, Ζ·等，Phytother. Res. 2003，17，524-530 ； Gazak, R.等，Bioorg. Med. Chem. 2004，12，5677-5687 ；Varga, Z.等；Phytothe. Res. 2001，15，608-612. Singh，R. P.等，Curr. Cancer Drug Tar. 2004, 4，1-11)。因此，以水飞蓟宾为代表的黄酮木脂素类化合物引起了越来越多的关注，如发 明人于2006年制备并报道的多个系列水飞蓟宾类衍生物也具有显著的抗氧化活性(杨 雷香、赵昱等，"Design，Synthesis and Examinationof Neuron Protective Properties of Alkenylated and AmidatedDehydro-Silybin Derivatives，，，Journal of Medicinal Chemistry，2009，52(23)，7732-7752 ；汪峰，赵昱等，“Pr 印 aration of C-23 esterified silybinderivatives and evaluation of their lipid peroxidation inhibitory and DNAprotective properties", Bioorganic&Medicinal Chemistry,2009,17(17)， 6380-6389 ；杨雷香，赵昱等，"Synthesis and Antioxidant PropertiesEvaluation of Novel Silybin Analogues”， Journal of Enzyme Inhibitionand Medicinal Chemistry, 2006，21(4), 399-404 ；等等)。在发明人报道的这些文章中，经发明人设计并合成出的多个 系列之A环、B环、E环和23位取代的黄酮木脂素类化合物都显示出强效捕获DPPH自由基 和超氧阴离子自由基的活性、抗氧化活性、以及保护PC12细胞的活性。但是显而易见上述 研究仅集中于研究水飞蓟宾类黄酮木脂素的抗氧化作用和细胞保护作用。近期(2006年)，谢军报道了联合应用具有抗病毒和免疫调节双重作用的干扰素 和保肝护肝的水飞蓟宾磷脂复合物治疗慢性乙肝，发现对对患者体内ALT、AST值降低比单 独用干扰素效果明显，说明水飞蓟宾磷脂复合物能加强干扰素的治疗慢性乙肝。但是，类似 的治疗方案仍是将水飞蓟宾等黄酮木脂素作为辅助用药，主要是用于保护肝细胞膜而非直 接用其实施抗病毒作用。左国营等(左国营，刘树玲，徐贵丽，世界华人消化杂志，2006年14卷13期，1241-1246页)综述了近20年来药用植物成分体外抗HBV活性的研究进展，文 中论及多种天然产物，其中并没有报道任何黄酮木脂素类化合物具有抗HBV活性的相关记 录，尤其是水飞蓟宾类天然产物及其衍生物，国内几乎无人涉及，仅由发明人团队对其进行 了前人未加注意的结构改造和抗氧化活性研究。以水飞蓟宾为代表的黄酮木脂素化合物虽然具有以上所述之抗氧化疗效，然而其 见报于抗病毒治疗方面之文献相对较少。黄酮木脂素类化合物治疗DNA类病毒感染尤其是 其用于抗乙肝病毒方面(包括抑制乙肝表面抗原HBsAg)的新用途尚未得到有效开发，故此 从黄酮木脂素中寻找抗乙肝病毒领域的活性化合物、也即将黄酮木脂素结构改造使其具有 抗DNA类病毒活性是一个崭新的领域。从其中发现抑制HBsAg的先导化合物更是千人所未 尝试过的挑战。为了探索这个领域，我们设计并制备了与水飞蓟宾结构有所差异的一种新 的黄酮木脂素衍生物，也即在黄酮木脂素水飞蓟宾E环引入新的甲氧基取代基，由此便形 成了 E环上含有两个甲氧基的木质素二氢黄酮醇类化合物(新型黄酮木脂素化合物)，以期 发现能降低HBsAg的黄酮木脂素先导化合物，从而将其进一步开发成具有能清除HBsAgJg 疗CHB的创新性药物，据此完成本发明。
发明内容
本发明的目的是提供式(1)所示的黄酮木脂素或其可药用盐在制备治疗乙型病 毒性肝炎药物或用于制备降低乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg的药物之新用途。其特征为 式(1)化合物的名称为(士)-2-[2，3_ 二氢-3-(3，5_ 二甲氧基-4-羟基苯 基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6] -2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃_4_酮。式(1)化合物可以由化学合成方法得到。本发明的另一个目的是提供了一种用于降低乙肝表面抗原、防治乙型病毒性肝炎 的药物组合物，其特征为由含有治疗有效量的作为活性成分的式(1)化合物或者它的可药 用盐和可药用辅料组成的混合物。其药物剂型可以是片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、 膜剂、滴丸剂、贴片剂、皮下植埋剂、外用搽剂、口服液或软膏剂，还可以采用现代制药界所 公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。本发明的黄酮木脂素化合物(1)与天然产物水飞蓟宾相比较，具有诸多结构和物 化性质上差异化的特征，包括其疏水性、吉布斯自由能、氢键受体、电性、分子间范德华力、 以及3D构象等特质均与水飞蓟宾有着明显不同；且化合物(1)分子量比水飞蓟宾增大了 30个质量单位。上述特征都决定了式(1)所示之化合物三维构象与HBsAg之3D空间结构 相结合之配体_受体结合复合物形态和结合方式都可能产生较大的差别，其结合位点和结 合模式、其结合自由能等均会产生较大的改变，因而可能在抑制HBsAg方面有着意想不到 的效果。
我们测试了该化合物对H印G2. 2. 15细胞的生长抑制作用，同时测试了其对 H印G2. 2. 15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原HBsAg的抑制活性。试验结果发现本发明中合 成得到的木质素二氢黄酮醇类化合物即(士)_2-[2，3- 二氢-3- (3，5- 二甲氧基-4-羟基苯 基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6] -2，3- 二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃_4_酮 对H印G2. 2. 15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原HBsAg具有强效的抑制活性，超过阳性对照 (也是临床治疗乙肝病毒患者一线用药)拉米夫啶和α-干扰素，从而预期其可以作为抗乙 肝病毒药物先导化合物继续开发。经本发明人详细的文献查阅，到目前为止，尚无有关该黄 酮木脂素化合物治疗乙肝病毒感染性疾病和制备抗乙肝病毒药物的报道。综上所述，我们从头合成的该黄酮木脂素既有结构上的独特性，又有抗病毒作用 方面研究的新颖性，并在抗乙肝病毒活性测试中发现了超乎寻常的抑制乙肝病毒表面抗原 的活性，有望成为降低HBsAg及治疗CHB之先导化合物。本发明的有益之处在于首次发现了制备出的黄酮木脂素化合物(士)-2_[2， 3- 二氢-3-(3，5- 二甲氧基-4-羟基苯基)-2_羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6]_2，3_ 二 氢-3，5，7-三羟基-4Η-1-苯并吡喃-4-酮在抑制HBsAg方面的药效活性，对于开发治疗乙 型病毒性肝炎药物或开发降低乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg药物提供了新的物质基础。具 有潜在的巨大社会效益和经济效益。本发明再一特点为该化合物可由简单原料经几步合 成改造而得，原料来源方便易得，制备步骤简便，成本低，产率较高，利于产业化。
具体实施例方式本发明人通过多步合成，并通过层析手段得到该有效抑制乙肝表面抗原(HBsAg) 的分泌活性的黄酮木脂素类活性化合物，又经质谱和核磁共振波谱等综合解析推导出其化 学结构。本发明人发现，式(1)化合物对H印G2. 2. 15细胞的生长无明显抑制作用，表明 式(1)化合物对H印G2. 2. 15细胞无明显细胞毒性；而其对H印G2. 2. 15细胞分泌的乙肝表 面抗原(HBsAg)的分泌具有显著的抑制作用，提示该化合物具有降低乙肝病毒表面抗原高 效、用药安全的特点。因此，根据本发明人的研究，发明人所设计并合成的式(1)所示之黄 酮木脂素化合物可以用于治疗乙肝病毒感染性疾病和用于制备治疗乙肝病毒感染性疾病 的药物。为了更好地理解本发明的实质，下面分别用式(1)化合物的制备及其对 H印G2. 2. 15细胞生长抑制作用以及对H印G2. 2. 15细胞分泌的HBsAg之抑制作用试验的结 果，说明其在制药领域中的新用途。实施例给出了式(1)化合物的部分合成、结构鉴定、和 活性数据，其中OM是指甲氧基、OMOM是指甲氧甲氧基。必须说明，本发明的实施例是用于 说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本 发明要求保护的范围。实施例1 式(1)化合物(士)-2-[2，3_ 二氢-3-(3，5_ 二甲氧基-4-羟基苯 基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6] -2，3- 二氢-3，5，7-三羟基-4Η-1-苯并吡喃_4_酮 的制备仪器与试剂紫外光谱用Shimadzu UV-240紫外分光光度计测定；核磁共振氢 谱1H-NMR由INOVA型超导核磁共振波谱仪(VARIAN IN0VA-400MHz)测定(四甲基硅醚 TMS为内标)；电喷雾质谱ESI-MS由Bruker Esquire 3000+质谱仪测定，柱层析用硅胶
7(100-200，200-300和300-400目)以及薄层层析用硅胶GF254(10_40目)均由青岛海 洋化工厂生产；所用试剂均为分析纯，其中石油醚沸程为60-90°C ；薄层制备层析(PTLC) 用Merck公司的铝箔硅胶板；柱色谱用葡聚糖凝胶S印hadex LH-20采用瑞典Amersham PharmaciaBiotech AB 公司产品；反相硅胶 RP-18 采用日本 Fuji Silysia Chemical 公司 的Chromatorex产品；MCI为日本三菱化工公司产品，薄板(TLC)检测用254nm和365nm的 紫外灯；显色剂用碘蒸气、10%硫酸-乙醇以及磷钼酸溶液。本发明用从头合成法制备了式 (1)所示之黄酮木脂素化合物，除此方法之外，还可以用以市售taxifolin直接进行最后耦 合反应，一步生成式(1)化合物。具体合成步骤如下1. 1化合物2即3，4，2'，4'，6'-五甲氧甲氧基查尔酮的合成的制备 8. 4克氢氧化钾溶于100毫升无水甲醇中，搅拌降至室温后加入溶解有3克2，4， 6_三甲氧甲氧基苯乙酮和2. 3克3，4_ 二甲氧甲氧基苯甲醛的20毫升甲醇溶液，于室温 搅拌10小时，减压蒸去溶剂，残留物中加入50毫升水，醋酸乙酯提取，合并有机相，饱和食 盐水洗涤，无水硫酸钠Na2SO4干燥，过滤，浓缩得棕色残留物，经柱层析得黄色油状物3. 8 克。收率77% ;Rf(石油醚/醋酸乙酯=3/1) :0. 10 ；核磁共振氢谱1H NMR(400MHz，氘代 氯仿，δ in ppm) δ :3· 36 (单峰，6Η, OCH3)，3· 47 (单峰，9Η, OCH3)，5· 14 (单峰，4Η, OCH2O)， 5. 22 (单峰，2Η, OCH2O)，5. 25 (单峰，4Η, OCH2O)，6. 58 (单峰，2Η，Η-3 ‘，5 ‘ )，6. 83 (双峰， J = 16. 0Hz, 1Η, H- α ), 7. 16 (双峰，J = 8. OHz, 1Η, Η-5)，7. 24 (双双峰，J = 2. 0,8. OHz, 1Η，Η-6)，7. 26 (双峰，J = 16. OHz，1Η，H- β )，7. 45 (双峰，J = 2. OHz，1Η，Η-2)；电喷雾质谱 ESI-MS :m/z 507[M+H] +。1.2化合物3即3，4，2' ,4' ,6'-五甲氧甲氧基环氧查尔酮的制备 取1. 1步骤中得到的化合物2即3，4，2' ,4' ,6'-五甲氧甲氧基查尔酮2. 5克 溶解于60毫升甲醇中，于搅拌状态下加入2N氢氧化钠3毫升以及30%过氧化氢4毫升， 于室温搅拌5小时，取样做紫外分析，UV (MeOH) λ max nm 由209，330变为209，282，当330nm 的吸收峰完全消失后说明反应完全，减压蒸去溶剂，在残留物中加入50毫升水，醋酸乙酯 提取(3X30毫升)。合并有机相后用饱和食盐水(40毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤， 浓缩得黄色油状物2. 4克，收率88%。产物直接用于下一步反应。1.3化合物4即(士)-tranS-3，5，7，3'，4'-五羟基二氢黄酮醇的制备 取1.2步骤中得到的化合物3即3，4，2'，4'，6'-五甲氧甲氧基环氧查尔酮 2. 4克溶解于60毫升甲醇和20毫升四氢呋喃的混合溶剂中，向其中滴加3毫升浓盐酸， 于50-55°C搅拌15分钟，减压蒸去溶剂，醋酸乙酯提取(3X30毫升)，合并有机相后依次 用水，饱和食盐水(各40毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩，残留物用氯仿-甲醇 (10 1)作洗脱剂，经柱层析得到浅黄色固体1克，收率73% ;Rf (氯仿甲醇=10 1) 0. 30 ；核磁共振氢谱 1H NMR(400MHz，氘代丙酮，δ inppm) 4. 61 (双双峰，J = 4. 4，11. 6Hz， 1Η，Η-3)，4· 71 (双峰，J = 4. 4Hz, 1Η，3-0Η)，5. 02(双峰，J = 11. 6Ηζ, 1Η，Η_2)，5· 95(双峰， J = 2. 4Ηζ，Η-6)，5· 98 (双峰，J = 2. 4Hz, 1Η, Η_8)，6. 85-7. 07 (多重峰，3Η, Ar-H)，11· 71 (单 峰，1Η，5-0Η)；电喷雾质谱 ESI-MS :m/z 303[M_H] +。1.4化合物(1)即(士)-2-[2，3_ 二氢-3-(3，5_ 二甲氧基-4-羟基苯基)-2_羟甲 基-1，4-苯并二氧六环-6] -2，3- 二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃_4_酮的制备 在干燥氮气保护的反应瓶中加入0.6克步骤1.3中得到的化合物4即 (±)-tranS-3，5，7，3'，4' _五羟基二氢黄酮醇和5-甲氧基松柏醇0. 75克，用无水丙酮 40毫升和无水苯120毫升溶解，于55-60°C搅拌20分钟，再加入1. 5克碳酸银，继续搅拌12 小时，过滤，母液浓缩，经柱层析得浅黄色粉末0. 30克，收率30 %。浅黄色粉末；C26H24O11 ； Rf值(氯仿醋酸乙酯草酸=25 1 0. 25) :0. 12 ；核磁共振氢谱1H-NMIU氘代丙 酮，400MHz) δ 3. 55(1Η，多重峰，H_23a)，3. 77 (1H,多重峰，H_23b)，3. 86 (6H,单峰，OCH3)， 4. 16 (1H,多重峰，H-10) ,4. 66 (1H,双峰，J = 11. 6Hz, Η_3)，4· 99 (1Η,双峰，J = 8. OHz, H-11) ,5. 11 (1H，双峰，J = 11. 6Hz，H-2)，5. 97 (1H，双峰，J = 2. 0Hz,H-6) ,6. 00 (1Η，双峰，J =2. ΟΗζ,Η-8) ,6. 85-7. 34 (5Η，多重峰，Ar_H)，11. 69 (1H，单峰，5-0H)；电喷雾质谱 ESI-MS m/z 511[M-H]+。实施例2 化合物(1)对H印G2. 2. 15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑 制作用2. 1细胞培养将H印G2. 2. 15细胞培养于含10%灭活胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升 链霉素，100微克/毫升G418的DMEM培养基中，置37°C，5% C02，100%相对湿度的培养箱
中培养。2. 2采用MTT法测定式(1)化合物对H印G2. 2. 15细胞生长的抑制作用
9
取对数生长期的H印G2. 2. 15细胞，用培养基将细胞稀释成1 X IO5个/毫升，接种 于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37°C，5% CO2,100%相对湿度的培养箱中培养24小 时后加入用培养基稀释的化合物(1)，浓度分别为1000微克/毫升，200微克/毫升，40微 克/毫升和8微克/毫升，每孔200微升，每个浓度设三个复孔，置于37°C，5% CO2,100% 相对湿度的培养箱中培养，培养72小时后，每孔加入MTT试剂10微升，继续培养4小时，弃 去培养基，每孔加入DMS0200微升，用振荡器振荡20分钟，在570nm波长下用酶标仪测定OD 值。以只加培养基的培养孔为对照孔。抑制率(％)=(对照孔OD值-实验组OD值)/对 照孔OD值X 100%。实验重复三次。测定化合物对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抑制作用。取对数生长期的 H印G2. 2. 15细胞，用培养基将细胞稀释成IX IO5/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100 毫升，在37°C，5% C02，100%相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的样 品，浓度分别为20微克/毫升，4微克/毫升和0. 8微克/毫升，每孔200微升，每个浓度 设三个复孔，置于37°C，5% C02，100%相对湿度的培养箱中培养，每4天换含相同浓度样品 的培养基，将同一样品同一浓度的换出的培养基等体积混勻，作为待测样品。用ELISA试剂 盒测定培养基中HBsAg浓度，以P/N表示；以拉米呋啶(3-TC)为阳性对照1 (注拉米夫啶 测试浓度为100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升)；以α-干扰素为阳性对照 2 (注α -干扰素测试浓度为10000单位/毫升，5000单位/毫升和1000单位/毫升)。2. 3实验结果实验结果如表1所示，式(1)化合物有显著的抑制乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的 作用。其对H印G2. 2. 15细胞的生长无明显抑制作用，但对H印G2. 2. 15细胞分泌的乙型肝 炎表面抗原HBsAg在第八天时高、中、低剂量下抑制活性都高于拉米呋啶。表1.样品对H印G2. 2. 15分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抑制率 该实施例结果说明式(1)所示之黄酮木脂素化合物(士)-2-[2，3_ 二氢_3-(3， 5- 二甲氧基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6] -2，3- 二氢-3，5，7-三羟 基-4Η-1-苯并吡喃-4-酮对H印G2. 2. 15细胞分泌的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有显著 的抑制作用，其在极低浓度(4微克/毫升)时对HBsAg抑制活性即远超过拉米夫定，而在较低浓度(20微克/毫升)时对HBsAg抑制活性将近是阳性对照药物拉米夫定的五倍，比 α -干扰素最高测试浓度10000单位/毫升浓度下相应的HBsAg抑制活性高三倍；在此较 低浓度(20微克/毫升)下有50%的HBsAg活性被式(1)化合物抑制，可见该黄酮木脂素 有很强的抑制病毒分泌表面抗原活性。HBsAg清除是临床上最接近治愈的状态，对于乙肝患 者，其HBsAg清除成为非常有价值的CHB治疗终点。因而式(1)所示之黄酮木脂素化合物 可预期发展为降低乙型肝炎表面抗原、控制病毒性乙型肝炎症状的药物。
在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际 操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应 用包括所有一般变化、配合，或改进。
权利要求
式(1)所示的黄酮木脂素或其可药用盐用于制备治疗乙型病毒性肝炎药物之用途，其特征为式(1)化合物的名称为(±) 2 [2，3 二氢 3 (3，5 二甲氧基 4 羟基苯基) 2 羟甲基 1，4 苯并二氧六环 6] 2，3 二氢 3，5，7 三羟基 4H 1 苯并吡喃 4 酮。FSA00000134306600011.tif
2.式(1)所示的黄酮木脂素或其可药用盐用于制备降低乙型肝炎病^ 药物之用途，其特征为■表面抗原HBsAg 式(1)化合物的名称为(士)-2-[2，3-二氢-3-(3，5-二甲氧基-4-羟基苯基)-2_羟 甲基-1,4-苯并二氧六环-6] -2，3- 二氢-3，5，7-三羟基-4H—1-苯并吡喃_4_酮。
全文摘要
本发明涉及一种黄酮木脂素用于制备防治乙型病毒性肝炎药物的用途，具体而言，本发明涉及(±)-2-[2，3-二氢-3-(3，5-二甲氧基-4-羟基苯基)-2-羟甲基-1，4-苯并二氧六环-6]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮或其可药用盐用于制备治疗乙型病毒性肝炎药物或用于制备降低乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg药物之用途。由于该黄酮木脂素具有高效抑制乙肝病毒表面抗原HBsAg活性，从而可预期用于制备治疗乙型肝炎病毒感染疾病的药物用途。
文档编号A61P31/20GK101912384SQ20101018174
公开日2010年12月15日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者刘蜻蜻, 巫秀美, 廖晓辉, 曾苏, 李海波, 王成军, 赵军, 赵昱 申请人:大理学院
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