大蹼铃蟾博玛津蛋白及其基因和在制药中的应用的制作方法
专利名称：大蹼铃蟾博玛津蛋白及其基因和在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种大蹼铃蟾(Bombina maxima)博玛津蛋白及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。
背景技术：
血小板是一种多功能的细胞。它的主要功能是参与止血与血栓形成，并且在动脉粥样硬化，癌转移和炎症反应等过程中起重要作用。血小板在这些生理，病理过程中所起的重要作用与血小板黏附，释放和聚集等功能密切相关。抑制血小板黏附，释放和聚集的抗血小板药物筛选一直是备受人们关注的研究热点，而血小板黏附，释放和聚集等功能的诱导剂则可作为筛选专一的，低毒的，作用机理明确的抗血小板药物的分子工具。
胃肠道炎症和溃疡，胃肠道肿瘤是危害人类健康的一类主要疾病，容易复发，很难彻底治愈，而且治疗药物匮乏，毒性大，副作用强，不稳定，给药途径受限制，所以针对这类疾病的高效低毒稳定的新药研究开发具有广阔的市场前景。
很多两栖类动物在中国属于传统中药，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)等。大蹼铃蟾主要分布在我国的云南省，四川省，是我国的特色资源动物之一，也是特色的民族民间药物。从这些传统中药中寻找特定药理活性的单体化合物是中药现代化的重要内容，在国外，两栖类动物皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点之一。
发明人将本发明的大蹼铃蟾含三叶环型结构域的蛋白质(博玛津)全序列结构经蛋白数据库进行搜寻比较，未能发现有任何相同多肽，将本发明的大蹼铃蟾含三叶环型结构域的蛋白质(博玛津)编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未能发现有任何相同基因。
发明内容
本发明的目的是基于上述现有的技术基础，提供一种具有血小板聚集诱导活性以及抗胃肠道炎症和溃疡的大蹼铃蟾含三叶环型结构域的大蹼铃蟾博玛津蛋白及其基因和在制药中的应用。
为了实现本发明之目的，本发明提供了如下技术方案大蹼铃蟾含三叶环型结构域的蛋白质(博玛津)，是我们首次从大蹼铃蟾(Bombinamaxima)皮肤分泌物中分离得到的一种单链蛋白质，含104个氨基酸，全序列一级结构甘氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-门冬氨酸-门冬酰胺-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-缬氨酸-门冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸-谷氨酸-精氨酸-缬氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-丙氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-丙氨酸-赖氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-丝氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸-门冬酰胺-苏氨酸-异亮氨酸-色氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-谷氨酸-丝氨酸-丙氨酸-门冬酰胺-丙氨酸-色氨酸-赖氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-缬氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-门冬酰胺-苏氨酸-精氨酸-缬氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-脯氨酸-丙氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-甘氨酸-赖氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-门冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸-酪氨酸-酪氨酸-甘氨酸-苏氨酸-缬氨酸-色氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸
(NH2GFPIYEIDNRPGCYVDPAERVACAGAGVTKAECKAKGCCFISARRNTIWCFKLKESADAWKCAVPMNTRVACAGAGVTPAECKGKGCCFYYGTV WCFKPQE-COOH)定义为SEQ NO1大蹼铃蟾含三叶环型结构域的蛋白质(博玛津)的制备方法，是将活体大蹼铃蟾用清水洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚，密闭容器3-5分钟，轻揉按摸动物，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集皮肤分泌物，离心(10000rpm，20分钟)，上清液经冷冻干燥，即得皮肤分泌物。将皮肤分泌物用3500D透析袋对50mM Tris-HCl，10mMEDTA，PH 7.2缓冲液于4℃透析，透析内液经DEAE-A50阴离子交换柱层析，收集穿透峰，经冻干后，再过Sephadex G50分子筛，收集第III峰，经HPLC-SP阳离子柱层析，收集箭头所示峰，再经HPLC-C8反相柱层析，收集箭头所示峰，抽干即得大蹼铃蟾含三叶环型结构域的蛋白质(博玛津)然后用电泳及HPLC鉴定其纯度并用氨基酸自动测序仪测定氨基酸序列结构。
大蹼铃蟾含三叶环型结构域的蛋白质(博玛津)可诱导血小板聚集，能对抗各类血小板功能缺陷所导致的出血性疾病，并可分子工具，筛选专一性抗血小板药物。其结构特性使其在药物制备，给药途径等方便可靠，这为其产业化大规模生产提供了坚实的基础。因而具有极其广阔的应用前景。
大蹼铃蟾含三叶环型结构域的蛋白质(博玛津)基因的克隆包括大蹼铃蟾皮肤总RNA提取，mRNA纯化及反转录，cDNA文库构建，在通过含三叶环型结构域的蛋白质N-端序列设计引物基础上，利用PCR方法筛选博玛津蛋白编码基因。根据N-端序列所设计的扩增引物长度为18个核苷酸，其序列为5’GGNTTCCCNATATACTGT 3’，其中N＝A，C，T，G，PCR另一扩增引物为位于克隆插入部分的3’端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG 3’。所获阳性克隆进行基因核苷酸序列测定。基因序列测定结果表明，其编码大蹼铃蟾博玛津蛋白的基因的cDNA由1061个核苷酸组成，其自5’端至3’端核苷酸序列为GGGTTTCCTGCCAAGCAAGATGATCTTCATAGTGATAATGGCATTGGCTATTGACTGTGCACATGGAGGTTTTCCAATCTATGAGATAGATAACAGACCTGGATGCTATGTTGACCCTGCAGAGAGAGTTGCATGTGCAGGTGCAGGAGTGACAAAAGCTGAATGCAAGGCTAAAGGCTGCTGTTTTATTTCAGCAAGGAGAAATACAATTTGGTGCTTTAAACTTAAAGAATCAGCGGATGCCTGGAAATGTGCTGTCCCCATGAATACGAGAGTTGCATGCGCTGGCGCAGGTGTCACACCTGCTGAATGCAAGGGAAAAGGTTGTTGTTTCAATTCAAGCTACTATGGAACAGTATGGTGCTTTAAACCTCAAGAATAACTCATCTATAAAATGGAATTGTTCAAGATCAGAACAAGGTTGATGATAAGTGCTCTATTACTGTCCACTTTTTCTTCTCCCCTTTTTTTTGTTTGTGCAAATGCTCCAGCATTTGCAAGCAGTGTACATTTATTTATTTTTTTTGGTCTATGGATCGTTTTAAAAATATAGTTTAAATTTGAGCAACATAAGGCTATTAAACATAGGCTATTATACAAAATGAATAATTAAAATTAGCAATTAAAGTGAAGGTAAACTTTTATGAATGAAAGCCCTGTTTTTTAATAGGCAAAATACAAAAATATGGGCACTGCTTGTAAATGCTGGAGCAGCATTTCCCCAATGTATTGTATATTTCTAGATCCAAAACATATCATAAGTTTTCAAATGGAAAAATTGTTAATTCTGCTATCATAAAGAAGGGGAATTTGTGTACTTGTGTGTAACTGGAAAGAAACAATTCTAATTGTATGTTTATATTTTGGATTACATTTGACCAAAGTAACTCCCACATTTGTATGCAAATTATATTTAAATTAATAAAATTGCAATATGCTTATGGTACATTTAAAAATATGTTTAACAATGTTACCAAAAATGTTTGGCAAAAAAATAAACATCCACTGGATCAGCACCTCTAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA定义为SEQ NO2，编码权利要求书1所述的成熟的含三叶环型结构域的蛋白质博玛津为第67-378位核苷酸，其编码的氨基酸序列为SEQ NO1大蹼铃蟾博玛津蛋白基因作为基因工程置备大蹼铃蟾博玛津蛋白的应用。
下面用本发明的大蹼铃蟾博玛津蛋白的药理实验结果来说明本发明的药效作用和有益效果1.大蹼铃蟾博玛津蛋白诱导人血小板聚集的作用将待测化合物用生理盐水进行5倍倍比稀释，共6个稀释度，每个稀释度设3个重复，每管加入200μL人富血小板血浆或洗涤人血小板，37℃保温20分钟，用比浊法在血小板聚集仪上测定不同浓度的待测化合物在5分钟内诱导人血小板聚集的聚集率。EC50是对血小板产生一半最大聚集作用时的药物浓度。
表1大蹼铃蟾博玛津蛋白诱导人血小板聚集的作用
由表1可见，大蹼铃蟾博玛津蛋白第一步DEAE-A50离子交换粗样品及不同批号的纯化的博玛津蛋白均具有显著的诱导人血小板聚集的作用。迄今为止，在全世界范围内，大蹼铃蟾博玛津蛋白是第一个来自两栖类动物的血小板聚集诱导剂。
2.大蹼铃蟾博玛津蛋白对盐酸诱导的大鼠急性胃炎和应急性胃炎的保护作用取体重300克左右的雄性Wistar大鼠，每组3只，给药组尾静脉注射不同剂量的大蹼铃蟾博玛津蛋白，对照组注射生理盐水。在全麻，无菌操作下，结扎幽门，术后将动物分笼单独饲养，禁食，禁水，防止吞食鼠粪。19h后，用麻醉法将动物迅速处死。剖检胃粘膜病变，测量各个溃疡的长径，求其总和，作为溃疡指数进行比较。EC50是指大鼠溃疡指数降低50％的药物剂量μg/kg表2大蹼铃蟾博玛津蛋白对盐酸诱导的大鼠急性胃炎和应急性胃炎的保护作用
表1
实施例一1.制备大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白博玛津活体大蹼铃蟾用清水洗干净，用乙醚加轻揉按摸法刺激，收集皮肤分泌物，离心，冷冻干燥，低温保存。
第一步DEAE SephadexA-50离子交换按上述方法获得原材料大蹼铃蟾皮肤分泌物冻干粉溶解于50mMTris-HCl，10mMEDTA，PH＝7.2缓冲液，装与3500D透析袋中，对同样缓冲液透析24小时，离心，取上清液上样于经同样缓冲液平衡的DEAESephadex A-50(Pharmacia产品)阴离子交换柱(500mm长，直径26mm)，经两个柱体积同样缓冲液冲洗，收集穿透峰。
第二步分子筛Sephadex G-50层析穿透峰经冻干浓缩，溶解于0.15M PBS，PH＝6.0缓冲液中，离心，取上清液上样于经同一缓冲液缓冲液平衡的Sephadex G-50(Pharmacia产品)分子筛柱(1000mm长，直径26mm)经同样缓冲液冲洗，收集III峰。
第三步阳离子高压液相层析(Cation exchange-HPLC)分子筛Sephadex G-50层析所得III峰经冻干浓缩，溶解于20mM PBS，PH＝6.0缓冲液中，对同样缓冲液透析24小时，离心，取上清液上样于经同样缓冲液平衡的SP柱(75mm长，直径7.5mm)，经两个柱体积同样缓冲液冲洗后，再用含NaCL的PBS缓冲液进行梯度洗脱，收集箭头所示峰。
第四步反相高压液相层析(RP-HPLC)经阳离子高压液相(Cationexchange-HPLC)层析所得收集峰以水(含0.1％三氟乙酸)乙晴(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，收集箭头所示峰即为纯化的大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白博玛津。
纯化的三叶环型结构域蛋白博玛津用SDS-PAGE电泳测定其分子量，并与HPLC方法鉴定其纯度，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列。
通过上述方法制备的大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白博玛津，是我们首次从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，含104个氨基酸，多肽氨基酸全序列结构为甘氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-门冬氨酸-门冬酰胺-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-缬氨酸-门冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸-谷氨酸-精氨酸-缬氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-丙氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-丙氨酸-赖氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-丝氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸-门冬酰胺-苏氨酸-异亮氨酸-色氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-谷氨酸-丝氨酸-丙氨酸-门冬酰胺-丙氨酸-色氨酸-赖氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-缬氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-门冬酰胺-苏氨酸-精氨酸-缬氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-脯氨酸-丙氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-甘氨酸-赖氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-门冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸-酪氨酸-酪氨酸-甘氨酸-苏氨酸-缬氨酸-色氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸。
(NH2GFPIYEIDNRPGCYVDPAERVACAGAGVTKAECKAKGCCFISARRNTIWCFKLKESADAWKCAVPMNTRVACAGAGVTPAECKGKGCCFYYGTVWCFKPQECOOH)，SEQ ID NO1，大蹼铃蟾博玛津蛋白可作为研究血小板生理病理功能及信号传导的分子工具，筛选抗血小板药物的分子探针，抗胃溃疡药物。
实施例二1.大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白博玛津基因克隆1)大蹼铃蟾皮肤总RNA的提取活体大蹼铃蟾用清水洗干净，投入液氮中4小时后取皮肤组织，称重，取30mg皮肤组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟，加入等体积的酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清液加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4C，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为大蹼铃蟾皮肤总RNA。
2)大蹼铃蟾皮肤mRNA的纯化采用美国PROMEGA公司的mRNA分离纯化试剂盒，取大蹼铃蟾皮肤总RNA500μg溶于500ul DEPC水中，放入65C水浴10分钟，加入3ulOligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液，磁珠(SA-PMP)的洗涤将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加入0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，弃上清，最后加入0.1ml 0.5×SSC，称之为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.11×SSC洗涤四次，最后弃上清，加入0.1ml DEPC C水悬浮，至磁力架吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15mlDEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，再加入0.15mlDEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，将上清移至新的试管，纯化的大蹼铃蟾皮肤mRNA即含于上清中。加入1/10体积的PH5.2的3M乙酸钠，等体积的异午醇，于-70C放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶于10μl DEPC水中。
3)大蹼铃蟾皮肤cDNA文库的构建采用美国GIBCOBRL公司的SuperScriptTM质粒cDNA文库构建试剂盒，但操作方法有改进。CDNA第一链合成(mRNA反转录)，于1.5ml试管中加入2μlNotI引物和7μlmRNA，3ulDEPC水，70℃保温10分钟，立即放入冰浴冷却，然后加入4μl 5X第一链合成缓冲液，2μl 0.1M DTT，1ul 10mM dNTP混合物，再加入1μl SuperScriptII反转录酶，于37℃保温1小时后放入冰浴。CDNA第二链合成，在第一链合成试管中加入95μl DEPC水，30μl 5X第二链合成缓冲液，3μl10mMdNTP混合物，1μl大肠杆菌DNA连接酶，4μl大肠杆菌DNA多聚酶I，1μl大肠杆菌RNA酶，反应总体积150μl，混匀后于16℃保温2小时；加入2μlT4DNA多聚酶继续保温5分钟.DNA的抽提和乙醇沉淀，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm离心5分钟，取140μl上层溶液转移倒干净试管中，加入70μl7.5M乙酸铵，0.5ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干。Sal I adapter的连接，上述沉淀溶于25μl DEPC水中，加入10μl5XT4DNA连接酶缓冲液，10μl Sal II adapter，5μlT4DNA连接酶，反应总体积50μl，于16℃保温16小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于41μl DEPC水中.Not I酶，反应体积50μl，于cDNA溶液中加入5μlReact3缓冲液，4μl Not I酶，反应体积50μl，于37℃保温2小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于100μl TEN缓冲液中。将cDNA样品过DNA分级分离柱(试剂盒含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA。cDNA大于300bp核苷酸的组分合并，体积为20μl，加入5μl酵母tRNA，100μl7.5M乙酸铵，0.6ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μlTEN缓冲液中.合成的cDNA连接酶缓冲液，1μlpSPORT1质粒(Not I-Sal酶水解，50ng)，4μl 5X T4DNA连接酶，反应体积20μl，室温3小时，可准备转化大肠杆菌HB101感受态细胞.感受态细胞的制备，挑取单个HB101菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50mlLB培养液中，37℃振荡2小时，待菌液540nmOD值为0.4时，4℃，2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1MCaCl2重悬，分装后置冰浴内备用.连接产物的转化取上述连接产物5μl加入100μl感受态细胞冰浴60分钟，42℃热休克60秒，再置冰浴5分钟，加入无氨苄青霉素的SOC培养基0.9ml，37℃培养1小时，取200μl涂布于含氨苄青霉素的LB平皿(15cm直径)，37℃培养16小时，每个LB平皿用5mlLB液体培养基洗涤菌落，加10％甘油冻存构建的cDNA大约含4×104个单独克隆。
4)大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白博玛津基因克隆筛选利用PCR筛选法筛选大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白“博玛津”基因，所用正向引物P1，根据大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白“博玛津”N-端6个氨基酸序列的可能的编码核苷酸所设计，长度为18个核苷酸，其序列为5′GGNTTCCCNATNTATTGC3′，其中N＝A、C、G、T；和位于克隆插入部分的3’端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。PCR反应在如下条件下进行94℃1分钟，50℃1分钟和72℃1分钟，30个循环。首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μl/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(大约5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选和第二轮筛选)，在96孔培养板(Costar)上按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。
2.大蹼铃蟾博玛津蛋白基因序列测定和结果提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国Applied Biosystem373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为SP6和T7启动子，SP6启动子序列5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG 3’，T7启动子序列5’TAATACGACTCTATAGGGA 3’克隆筛选和基因测序结果表明，有一个基因可编码大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白博玛津，其cDNA序列自5’端至3’(见图4)。图5所示大蹼铃蟾博玛津蛋白基因核苷酸的序列表为基因(SEQ ID NO2)序列长度1061个核苷酸，序列类型核酸，链数单链，拓扑学直线链状，序列种类cDNA，来源大蹼铃蟾皮肤，序列特征编码成熟大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白博玛津为第367-678位核苷酸，其氨基酸序列见图5。
大蹼铃蟾博玛津蛋白基因作为基因工程制备血小板激活蛋白及抗胃溃疡的应用。
说明书序列表<110>中国科学院昆明动物研究所<120>博玛津蛋白及其基因和在制药中的应用<160>3<210>1<211>1061<212>DNA<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)<220>
<221>CDS<222>(20)...(382)<400>1gggtttcctg ccaagcaag atg atc ttc ata gtg ata atg gca ttg gct att gac 55Met Ile Phe Ile Val Ile Met Ala Leu Ala Ile Asp1 5 10tgt gca cat gga ggt ttt cca atc tat gag ata gat aac aga cct gga tgc106Cys Ala His Gly Gly Phe Pro Ile Tyr Glu Ile Asp Asn Arg Pro Gly Cys15 20 25tat gtt gac cct gca gag aga gtt gca tgt gca ggt gca gga gtg aca aaa157Tyr Val Asp Pro Ala Glu Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Lys30 35 40 45gct gaa tgc aag gct aaa ggc tgc tgt ttt att tca gca agg aga aat aca208Ala Glu Cys Lys Ala Lys Gly Cys Cys Phe Ile Ser Ala Arg Arg Asn Thr50 55 60att tgg tgc ttt aaa ctt aaa gaa tca gcg gat gcc tgg aaa tgt gct gtc259Ile Trp Cys Phe Lys Leu Lys Glu Ser Ala Asp Ala Trp Lys Cys Ala Val65 70 75 80ccc atg aat acg aga gtt gca tgc gct ggc gca ggt gtc aca cct gct gaa310Pro Met Asn Thr Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Pro Ala Glu85 90 95tgc aag gga aaa ggt tgt tgt ttc aat tca agc tac tat gga aca gta tgg361Cys Lys Gly Lys Gly Cys Cys Phe Asn Ser Ser Tyr tyr Gly Thr Val Trp100 105 110tgc ttt aaa cct caa gaa taa382Cys Phe Lys Pro Gln Glu *115 120ctcatctata aaatggaatt gttcaagatc agaacaaggt tgatgataag tgctctatta 442ctgtccactt tttcttctcc cctttttttt gtttgtgcaa atgctccagc atttgcaagc 502agtgtacatt tatttatttt ttttggtcta tggatcgttt taaaaatata gtttaaattt 562gagcaacata aggctattaa acataggcta ttatacaaaa tgaataatta aaattagcaa 622ttaaagtgaa ggtaaacttt tatgaatgaa agccctgttt tttaataggc aaaatacaaa 682aatatgggca ctgcttgtaa atgctggagc agcatttccc caatgtattg tatatttcta 742gatccaaaac atatcataag ttttcaaatg gaaaaattgt taattctgct atcataaaga 802aggggaattt gtgtacttgt gtgtaactgg aaagaaacaa ttctaattgt atgtttatat 862tttggattac atttgaccaa agtaactccc acatttgtat gcaaattata tttaaattaa 922taaaattgca atatgcttat ggtaatttaa aaatatgttt aacaatgtta ccaaaaatgt 982ttggcaaaaa aataaacatc cactggatca gcacctctaa caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1042aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1061<210>2<211>104<212>PRT<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)<220>
<221>PRPTEIN<222>(17)...(120)<400>2Met Ile Phe Ile Val Ile Met Ala Leu Ala Ile Asp Cys Ala His Gly1 5 10 15Gly Phe Pro Ile Tyr Glu Ile Asp Asn Arg Pro Gly Cys Tyr Val Asp20 25 30Pro Ala Glu Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Lys Ala Glu35 40 45Cys Lys Ala Lys Gly Cys Cys Phe Ile Ser Ala Arg Arg Asn Thr Ile50 55 60
Trp Cys Phe Lys Leu Lys Glu Ser Ala Asp Ala Trp Lys Cys Ala Val65 70 75 80Pro Met Asn Thr Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Pro Ala85 90 95Glu Cys Lys Gly Lys Gly Cys Cys Phe Asn Ser Ser Tyr tyr Gly Thr100 105 110Val Trp Cys Phe Lys Pro Gln Glu *115 120<210>3<211>103<212>PRT<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)<220>
<221>
<222>(104)<400> 3Gly Phe Pro Ile Tyr Glu Ile Asp Asn Arg Pro Gly Cys Tyr Val Asp1 5 10 15Pro Ala Glu Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Lys Ala Glu20 25 30Cys Lys Ala Lys Gly Cys Cys Phe Ile Ser Ala Arg Arg Asn Thr Ile35 40 45Trp Cys Phe Lys Leu Lys Glu Ser Ala Asp Ala Trp Lys Cys Ala Val50 55 60Pro Met Asn Thr Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Pro Ala65 70 75 80Glu Cys Lys Gly Lys Gly Cys Cys Phe Asn Ser Ser Tyr tyr Gly Thr85 90 95Val Trp Cys Phe Lys Pro Gln Glu100 10权利要求
1.大蹼铃蟾博玛津蛋白，其特征是从中国特产两栖动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离纯化得到的一种单链蛋白，含104个氨基酸，其多肽氨基酸全序列一级结构为SEQ ID NO1。
2.大蹼铃蟾博玛津蛋白基因核苷酸序列，其特征在于编码大蹼铃蟾博玛津蛋白的基因的cDNA由1061个核苷酸组成，其自5’端至3’端核苷酸序列为SEQ NO2。
3.权利要求2所述的大蹼铃蟾博玛津蛋白的基因核苷酸序列，其特征在于编码成熟的大蹼铃蟾博玛津蛋白为SEQ NO2中的第67-378位核苷酸，其氨基酸序列为SEQ NO1。
4.权利要求1所述的大蹼铃蟾博玛津蛋白，其特征在于该蛋白可作为血小板聚集诱导剂。
5.权利要求1所述的大蹼铃蟾博玛津蛋白，其特征在于该蛋白可作为制备胃溃疡药物的应用。
全文摘要
本发明涉及一种大蹼铃蟾博玛津蛋白及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。大蹼铃蟾博玛津蛋白是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，氨基酸全序列为NH
文档编号A61P7/02GK1629190SQ20041004053
公开日2005年6月22日 申请日期2004年8月23日 优先权日2004年8月23日
发明者张云, 张 杰, 李文辉 申请人:中国科学院昆明动物研究所
技术领域：
本发明涉及一种大蹼铃蟾(Bombina maxima)博玛津蛋白及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。
背景技术：
血小板是一种多功能的细胞。它的主要功能是参与止血与血栓形成，并且在动脉粥样硬化，癌转移和炎症反应等过程中起重要作用。血小板在这些生理，病理过程中所起的重要作用与血小板黏附，释放和聚集等功能密切相关。抑制血小板黏附，释放和聚集的抗血小板药物筛选一直是备受人们关注的研究热点，而血小板黏附，释放和聚集等功能的诱导剂则可作为筛选专一的，低毒的，作用机理明确的抗血小板药物的分子工具。
胃肠道炎症和溃疡，胃肠道肿瘤是危害人类健康的一类主要疾病，容易复发，很难彻底治愈，而且治疗药物匮乏，毒性大，副作用强，不稳定，给药途径受限制，所以针对这类疾病的高效低毒稳定的新药研究开发具有广阔的市场前景。
很多两栖类动物在中国属于传统中药，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)等。大蹼铃蟾主要分布在我国的云南省，四川省，是我国的特色资源动物之一，也是特色的民族民间药物。从这些传统中药中寻找特定药理活性的单体化合物是中药现代化的重要内容，在国外，两栖类动物皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点之一。
发明人将本发明的大蹼铃蟾含三叶环型结构域的蛋白质(博玛津)全序列结构经蛋白数据库进行搜寻比较，未能发现有任何相同多肽，将本发明的大蹼铃蟾含三叶环型结构域的蛋白质(博玛津)编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未能发现有任何相同基因。
发明内容
本发明的目的是基于上述现有的技术基础，提供一种具有血小板聚集诱导活性以及抗胃肠道炎症和溃疡的大蹼铃蟾含三叶环型结构域的大蹼铃蟾博玛津蛋白及其基因和在制药中的应用。
为了实现本发明之目的，本发明提供了如下技术方案大蹼铃蟾含三叶环型结构域的蛋白质(博玛津)，是我们首次从大蹼铃蟾(Bombinamaxima)皮肤分泌物中分离得到的一种单链蛋白质，含104个氨基酸，全序列一级结构甘氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-门冬氨酸-门冬酰胺-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-缬氨酸-门冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸-谷氨酸-精氨酸-缬氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-丙氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-丙氨酸-赖氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-丝氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸-门冬酰胺-苏氨酸-异亮氨酸-色氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-谷氨酸-丝氨酸-丙氨酸-门冬酰胺-丙氨酸-色氨酸-赖氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-缬氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-门冬酰胺-苏氨酸-精氨酸-缬氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-脯氨酸-丙氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-甘氨酸-赖氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-门冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸-酪氨酸-酪氨酸-甘氨酸-苏氨酸-缬氨酸-色氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸
(NH2GFPIYEIDNRPGCYVDPAERVACAGAGVTKAECKAKGCCFISARRNTIWCFKLKESADAWKCAVPMNTRVACAGAGVTPAECKGKGCCFYYGTV WCFKPQE-COOH)定义为SEQ NO1大蹼铃蟾含三叶环型结构域的蛋白质(博玛津)的制备方法，是将活体大蹼铃蟾用清水洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚，密闭容器3-5分钟，轻揉按摸动物，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集皮肤分泌物，离心(10000rpm，20分钟)，上清液经冷冻干燥，即得皮肤分泌物。将皮肤分泌物用3500D透析袋对50mM Tris-HCl，10mMEDTA，PH 7.2缓冲液于4℃透析，透析内液经DEAE-A50阴离子交换柱层析，收集穿透峰，经冻干后，再过Sephadex G50分子筛，收集第III峰，经HPLC-SP阳离子柱层析，收集箭头所示峰，再经HPLC-C8反相柱层析，收集箭头所示峰，抽干即得大蹼铃蟾含三叶环型结构域的蛋白质(博玛津)然后用电泳及HPLC鉴定其纯度并用氨基酸自动测序仪测定氨基酸序列结构。
大蹼铃蟾含三叶环型结构域的蛋白质(博玛津)可诱导血小板聚集，能对抗各类血小板功能缺陷所导致的出血性疾病，并可分子工具，筛选专一性抗血小板药物。其结构特性使其在药物制备，给药途径等方便可靠，这为其产业化大规模生产提供了坚实的基础。因而具有极其广阔的应用前景。
大蹼铃蟾含三叶环型结构域的蛋白质(博玛津)基因的克隆包括大蹼铃蟾皮肤总RNA提取，mRNA纯化及反转录，cDNA文库构建，在通过含三叶环型结构域的蛋白质N-端序列设计引物基础上，利用PCR方法筛选博玛津蛋白编码基因。根据N-端序列所设计的扩增引物长度为18个核苷酸，其序列为5’GGNTTCCCNATATACTGT 3’，其中N＝A，C，T，G，PCR另一扩增引物为位于克隆插入部分的3’端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG 3’。所获阳性克隆进行基因核苷酸序列测定。基因序列测定结果表明，其编码大蹼铃蟾博玛津蛋白的基因的cDNA由1061个核苷酸组成，其自5’端至3’端核苷酸序列为GGGTTTCCTGCCAAGCAAGATGATCTTCATAGTGATAATGGCATTGGCTATTGACTGTGCACATGGAGGTTTTCCAATCTATGAGATAGATAACAGACCTGGATGCTATGTTGACCCTGCAGAGAGAGTTGCATGTGCAGGTGCAGGAGTGACAAAAGCTGAATGCAAGGCTAAAGGCTGCTGTTTTATTTCAGCAAGGAGAAATACAATTTGGTGCTTTAAACTTAAAGAATCAGCGGATGCCTGGAAATGTGCTGTCCCCATGAATACGAGAGTTGCATGCGCTGGCGCAGGTGTCACACCTGCTGAATGCAAGGGAAAAGGTTGTTGTTTCAATTCAAGCTACTATGGAACAGTATGGTGCTTTAAACCTCAAGAATAACTCATCTATAAAATGGAATTGTTCAAGATCAGAACAAGGTTGATGATAAGTGCTCTATTACTGTCCACTTTTTCTTCTCCCCTTTTTTTTGTTTGTGCAAATGCTCCAGCATTTGCAAGCAGTGTACATTTATTTATTTTTTTTGGTCTATGGATCGTTTTAAAAATATAGTTTAAATTTGAGCAACATAAGGCTATTAAACATAGGCTATTATACAAAATGAATAATTAAAATTAGCAATTAAAGTGAAGGTAAACTTTTATGAATGAAAGCCCTGTTTTTTAATAGGCAAAATACAAAAATATGGGCACTGCTTGTAAATGCTGGAGCAGCATTTCCCCAATGTATTGTATATTTCTAGATCCAAAACATATCATAAGTTTTCAAATGGAAAAATTGTTAATTCTGCTATCATAAAGAAGGGGAATTTGTGTACTTGTGTGTAACTGGAAAGAAACAATTCTAATTGTATGTTTATATTTTGGATTACATTTGACCAAAGTAACTCCCACATTTGTATGCAAATTATATTTAAATTAATAAAATTGCAATATGCTTATGGTACATTTAAAAATATGTTTAACAATGTTACCAAAAATGTTTGGCAAAAAAATAAACATCCACTGGATCAGCACCTCTAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA定义为SEQ NO2，编码权利要求书1所述的成熟的含三叶环型结构域的蛋白质博玛津为第67-378位核苷酸，其编码的氨基酸序列为SEQ NO1大蹼铃蟾博玛津蛋白基因作为基因工程置备大蹼铃蟾博玛津蛋白的应用。
下面用本发明的大蹼铃蟾博玛津蛋白的药理实验结果来说明本发明的药效作用和有益效果1.大蹼铃蟾博玛津蛋白诱导人血小板聚集的作用将待测化合物用生理盐水进行5倍倍比稀释，共6个稀释度，每个稀释度设3个重复，每管加入200μL人富血小板血浆或洗涤人血小板，37℃保温20分钟，用比浊法在血小板聚集仪上测定不同浓度的待测化合物在5分钟内诱导人血小板聚集的聚集率。EC50是对血小板产生一半最大聚集作用时的药物浓度。
表1大蹼铃蟾博玛津蛋白诱导人血小板聚集的作用
由表1可见，大蹼铃蟾博玛津蛋白第一步DEAE-A50离子交换粗样品及不同批号的纯化的博玛津蛋白均具有显著的诱导人血小板聚集的作用。迄今为止，在全世界范围内，大蹼铃蟾博玛津蛋白是第一个来自两栖类动物的血小板聚集诱导剂。
2.大蹼铃蟾博玛津蛋白对盐酸诱导的大鼠急性胃炎和应急性胃炎的保护作用取体重300克左右的雄性Wistar大鼠，每组3只，给药组尾静脉注射不同剂量的大蹼铃蟾博玛津蛋白，对照组注射生理盐水。在全麻，无菌操作下，结扎幽门，术后将动物分笼单独饲养，禁食，禁水，防止吞食鼠粪。19h后，用麻醉法将动物迅速处死。剖检胃粘膜病变，测量各个溃疡的长径，求其总和，作为溃疡指数进行比较。EC50是指大鼠溃疡指数降低50％的药物剂量μg/kg表2大蹼铃蟾博玛津蛋白对盐酸诱导的大鼠急性胃炎和应急性胃炎的保护作用
表1
实施例一1.制备大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白博玛津活体大蹼铃蟾用清水洗干净，用乙醚加轻揉按摸法刺激，收集皮肤分泌物，离心，冷冻干燥，低温保存。
第一步DEAE SephadexA-50离子交换按上述方法获得原材料大蹼铃蟾皮肤分泌物冻干粉溶解于50mMTris-HCl，10mMEDTA，PH＝7.2缓冲液，装与3500D透析袋中，对同样缓冲液透析24小时，离心，取上清液上样于经同样缓冲液平衡的DEAESephadex A-50(Pharmacia产品)阴离子交换柱(500mm长，直径26mm)，经两个柱体积同样缓冲液冲洗，收集穿透峰。
第二步分子筛Sephadex G-50层析穿透峰经冻干浓缩，溶解于0.15M PBS，PH＝6.0缓冲液中，离心，取上清液上样于经同一缓冲液缓冲液平衡的Sephadex G-50(Pharmacia产品)分子筛柱(1000mm长，直径26mm)经同样缓冲液冲洗，收集III峰。
第三步阳离子高压液相层析(Cation exchange-HPLC)分子筛Sephadex G-50层析所得III峰经冻干浓缩，溶解于20mM PBS，PH＝6.0缓冲液中，对同样缓冲液透析24小时，离心，取上清液上样于经同样缓冲液平衡的SP柱(75mm长，直径7.5mm)，经两个柱体积同样缓冲液冲洗后，再用含NaCL的PBS缓冲液进行梯度洗脱，收集箭头所示峰。
第四步反相高压液相层析(RP-HPLC)经阳离子高压液相(Cationexchange-HPLC)层析所得收集峰以水(含0.1％三氟乙酸)乙晴(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，收集箭头所示峰即为纯化的大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白博玛津。
纯化的三叶环型结构域蛋白博玛津用SDS-PAGE电泳测定其分子量，并与HPLC方法鉴定其纯度，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列。
通过上述方法制备的大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白博玛津，是我们首次从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，含104个氨基酸，多肽氨基酸全序列结构为甘氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-门冬氨酸-门冬酰胺-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-缬氨酸-门冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸-谷氨酸-精氨酸-缬氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-丙氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-丙氨酸-赖氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-丝氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸-门冬酰胺-苏氨酸-异亮氨酸-色氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-谷氨酸-丝氨酸-丙氨酸-门冬酰胺-丙氨酸-色氨酸-赖氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-缬氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-门冬酰胺-苏氨酸-精氨酸-缬氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-脯氨酸-丙氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-甘氨酸-赖氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-门冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸-酪氨酸-酪氨酸-甘氨酸-苏氨酸-缬氨酸-色氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸。
(NH2GFPIYEIDNRPGCYVDPAERVACAGAGVTKAECKAKGCCFISARRNTIWCFKLKESADAWKCAVPMNTRVACAGAGVTPAECKGKGCCFYYGTVWCFKPQECOOH)，SEQ ID NO1，大蹼铃蟾博玛津蛋白可作为研究血小板生理病理功能及信号传导的分子工具，筛选抗血小板药物的分子探针，抗胃溃疡药物。
实施例二1.大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白博玛津基因克隆1)大蹼铃蟾皮肤总RNA的提取活体大蹼铃蟾用清水洗干净，投入液氮中4小时后取皮肤组织，称重，取30mg皮肤组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟，加入等体积的酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清液加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4C，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为大蹼铃蟾皮肤总RNA。
2)大蹼铃蟾皮肤mRNA的纯化采用美国PROMEGA公司的mRNA分离纯化试剂盒，取大蹼铃蟾皮肤总RNA500μg溶于500ul DEPC水中，放入65C水浴10分钟，加入3ulOligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液，磁珠(SA-PMP)的洗涤将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加入0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，弃上清，最后加入0.1ml 0.5×SSC，称之为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.11×SSC洗涤四次，最后弃上清，加入0.1ml DEPC C水悬浮，至磁力架吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15mlDEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，再加入0.15mlDEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，将上清移至新的试管，纯化的大蹼铃蟾皮肤mRNA即含于上清中。加入1/10体积的PH5.2的3M乙酸钠，等体积的异午醇，于-70C放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶于10μl DEPC水中。
3)大蹼铃蟾皮肤cDNA文库的构建采用美国GIBCOBRL公司的SuperScriptTM质粒cDNA文库构建试剂盒，但操作方法有改进。CDNA第一链合成(mRNA反转录)，于1.5ml试管中加入2μlNotI引物和7μlmRNA，3ulDEPC水，70℃保温10分钟，立即放入冰浴冷却，然后加入4μl 5X第一链合成缓冲液，2μl 0.1M DTT，1ul 10mM dNTP混合物，再加入1μl SuperScriptII反转录酶，于37℃保温1小时后放入冰浴。CDNA第二链合成，在第一链合成试管中加入95μl DEPC水，30μl 5X第二链合成缓冲液，3μl10mMdNTP混合物，1μl大肠杆菌DNA连接酶，4μl大肠杆菌DNA多聚酶I，1μl大肠杆菌RNA酶，反应总体积150μl，混匀后于16℃保温2小时；加入2μlT4DNA多聚酶继续保温5分钟.DNA的抽提和乙醇沉淀，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm离心5分钟，取140μl上层溶液转移倒干净试管中，加入70μl7.5M乙酸铵，0.5ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干。Sal I adapter的连接，上述沉淀溶于25μl DEPC水中，加入10μl5XT4DNA连接酶缓冲液，10μl Sal II adapter，5μlT4DNA连接酶，反应总体积50μl，于16℃保温16小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于41μl DEPC水中.Not I酶，反应体积50μl，于cDNA溶液中加入5μlReact3缓冲液，4μl Not I酶，反应体积50μl，于37℃保温2小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于100μl TEN缓冲液中。将cDNA样品过DNA分级分离柱(试剂盒含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA。cDNA大于300bp核苷酸的组分合并，体积为20μl，加入5μl酵母tRNA，100μl7.5M乙酸铵，0.6ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μlTEN缓冲液中.合成的cDNA连接酶缓冲液，1μlpSPORT1质粒(Not I-Sal酶水解，50ng)，4μl 5X T4DNA连接酶，反应体积20μl，室温3小时，可准备转化大肠杆菌HB101感受态细胞.感受态细胞的制备，挑取单个HB101菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50mlLB培养液中，37℃振荡2小时，待菌液540nmOD值为0.4时，4℃，2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1MCaCl2重悬，分装后置冰浴内备用.连接产物的转化取上述连接产物5μl加入100μl感受态细胞冰浴60分钟，42℃热休克60秒，再置冰浴5分钟，加入无氨苄青霉素的SOC培养基0.9ml，37℃培养1小时，取200μl涂布于含氨苄青霉素的LB平皿(15cm直径)，37℃培养16小时，每个LB平皿用5mlLB液体培养基洗涤菌落，加10％甘油冻存构建的cDNA大约含4×104个单独克隆。
4)大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白博玛津基因克隆筛选利用PCR筛选法筛选大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白“博玛津”基因，所用正向引物P1，根据大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白“博玛津”N-端6个氨基酸序列的可能的编码核苷酸所设计，长度为18个核苷酸，其序列为5′GGNTTCCCNATNTATTGC3′，其中N＝A、C、G、T；和位于克隆插入部分的3’端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。PCR反应在如下条件下进行94℃1分钟，50℃1分钟和72℃1分钟，30个循环。首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μl/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(大约5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选和第二轮筛选)，在96孔培养板(Costar)上按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。
2.大蹼铃蟾博玛津蛋白基因序列测定和结果提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国Applied Biosystem373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为SP6和T7启动子，SP6启动子序列5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG 3’，T7启动子序列5’TAATACGACTCTATAGGGA 3’克隆筛选和基因测序结果表明，有一个基因可编码大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白博玛津，其cDNA序列自5’端至3’(见图4)。图5所示大蹼铃蟾博玛津蛋白基因核苷酸的序列表为基因(SEQ ID NO2)序列长度1061个核苷酸，序列类型核酸，链数单链，拓扑学直线链状，序列种类cDNA，来源大蹼铃蟾皮肤，序列特征编码成熟大蹼铃蟾含三叶环型结构域蛋白博玛津为第367-678位核苷酸，其氨基酸序列见图5。
大蹼铃蟾博玛津蛋白基因作为基因工程制备血小板激活蛋白及抗胃溃疡的应用。
说明书序列表<110>中国科学院昆明动物研究所<120>博玛津蛋白及其基因和在制药中的应用<160>3<210>1<211>1061<212>DNA<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)<220>
<221>CDS<222>(20)...(382)<400>1gggtttcctg ccaagcaag atg atc ttc ata gtg ata atg gca ttg gct att gac 55Met Ile Phe Ile Val Ile Met Ala Leu Ala Ile Asp1 5 10tgt gca cat gga ggt ttt cca atc tat gag ata gat aac aga cct gga tgc106Cys Ala His Gly Gly Phe Pro Ile Tyr Glu Ile Asp Asn Arg Pro Gly Cys15 20 25tat gtt gac cct gca gag aga gtt gca tgt gca ggt gca gga gtg aca aaa157Tyr Val Asp Pro Ala Glu Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Lys30 35 40 45gct gaa tgc aag gct aaa ggc tgc tgt ttt att tca gca agg aga aat aca208Ala Glu Cys Lys Ala Lys Gly Cys Cys Phe Ile Ser Ala Arg Arg Asn Thr50 55 60att tgg tgc ttt aaa ctt aaa gaa tca gcg gat gcc tgg aaa tgt gct gtc259Ile Trp Cys Phe Lys Leu Lys Glu Ser Ala Asp Ala Trp Lys Cys Ala Val65 70 75 80ccc atg aat acg aga gtt gca tgc gct ggc gca ggt gtc aca cct gct gaa310Pro Met Asn Thr Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Pro Ala Glu85 90 95tgc aag gga aaa ggt tgt tgt ttc aat tca agc tac tat gga aca gta tgg361Cys Lys Gly Lys Gly Cys Cys Phe Asn Ser Ser Tyr tyr Gly Thr Val Trp100 105 110tgc ttt aaa cct caa gaa taa382Cys Phe Lys Pro Gln Glu *115 120ctcatctata aaatggaatt gttcaagatc agaacaaggt tgatgataag tgctctatta 442ctgtccactt tttcttctcc cctttttttt gtttgtgcaa atgctccagc atttgcaagc 502agtgtacatt tatttatttt ttttggtcta tggatcgttt taaaaatata gtttaaattt 562gagcaacata aggctattaa acataggcta ttatacaaaa tgaataatta aaattagcaa 622ttaaagtgaa ggtaaacttt tatgaatgaa agccctgttt tttaataggc aaaatacaaa 682aatatgggca ctgcttgtaa atgctggagc agcatttccc caatgtattg tatatttcta 742gatccaaaac atatcataag ttttcaaatg gaaaaattgt taattctgct atcataaaga 802aggggaattt gtgtacttgt gtgtaactgg aaagaaacaa ttctaattgt atgtttatat 862tttggattac atttgaccaa agtaactccc acatttgtat gcaaattata tttaaattaa 922taaaattgca atatgcttat ggtaatttaa aaatatgttt aacaatgtta ccaaaaatgt 982ttggcaaaaa aataaacatc cactggatca gcacctctaa caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1042aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1061<210>2<211>104<212>PRT<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)<220>
<221>PRPTEIN<222>(17)...(120)<400>2Met Ile Phe Ile Val Ile Met Ala Leu Ala Ile Asp Cys Ala His Gly1 5 10 15Gly Phe Pro Ile Tyr Glu Ile Asp Asn Arg Pro Gly Cys Tyr Val Asp20 25 30Pro Ala Glu Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Lys Ala Glu35 40 45Cys Lys Ala Lys Gly Cys Cys Phe Ile Ser Ala Arg Arg Asn Thr Ile50 55 60
Trp Cys Phe Lys Leu Lys Glu Ser Ala Asp Ala Trp Lys Cys Ala Val65 70 75 80Pro Met Asn Thr Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Pro Ala85 90 95Glu Cys Lys Gly Lys Gly Cys Cys Phe Asn Ser Ser Tyr tyr Gly Thr100 105 110Val Trp Cys Phe Lys Pro Gln Glu *115 120<210>3<211>103<212>PRT<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)<220>
<221>
<222>(104)<400> 3Gly Phe Pro Ile Tyr Glu Ile Asp Asn Arg Pro Gly Cys Tyr Val Asp1 5 10 15Pro Ala Glu Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Lys Ala Glu20 25 30Cys Lys Ala Lys Gly Cys Cys Phe Ile Ser Ala Arg Arg Asn Thr Ile35 40 45Trp Cys Phe Lys Leu Lys Glu Ser Ala Asp Ala Trp Lys Cys Ala Val50 55 60Pro Met Asn Thr Arg Val Ala Cys Ala Gly Ala Gly Val Thr Pro Ala65 70 75 80Glu Cys Lys Gly Lys Gly Cys Cys Phe Asn Ser Ser Tyr tyr Gly Thr85 90 95Val Trp Cys Phe Lys Pro Gln Glu100 10权利要求
1.大蹼铃蟾博玛津蛋白，其特征是从中国特产两栖动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离纯化得到的一种单链蛋白，含104个氨基酸，其多肽氨基酸全序列一级结构为SEQ ID NO1。
2.大蹼铃蟾博玛津蛋白基因核苷酸序列，其特征在于编码大蹼铃蟾博玛津蛋白的基因的cDNA由1061个核苷酸组成，其自5’端至3’端核苷酸序列为SEQ NO2。
3.权利要求2所述的大蹼铃蟾博玛津蛋白的基因核苷酸序列，其特征在于编码成熟的大蹼铃蟾博玛津蛋白为SEQ NO2中的第67-378位核苷酸，其氨基酸序列为SEQ NO1。
4.权利要求1所述的大蹼铃蟾博玛津蛋白，其特征在于该蛋白可作为血小板聚集诱导剂。
5.权利要求1所述的大蹼铃蟾博玛津蛋白，其特征在于该蛋白可作为制备胃溃疡药物的应用。
全文摘要
本发明涉及一种大蹼铃蟾博玛津蛋白及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。大蹼铃蟾博玛津蛋白是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，氨基酸全序列为NH
文档编号A61P7/02GK1629190SQ20041004053
公开日2005年6月22日 申请日期2004年8月23日 优先权日2004年8月23日
发明者张云, 张 杰, 李文辉 申请人:中国科学院昆明动物研究所
最新回复(0)