S－亚硝基硫醇作为治疗循环机能障碍的药剂的制作方法
专利名称：S－亚硝基硫醇作为治疗循环机能障碍的药剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有血管舒张效果的青霉胺或谷胱甘肽的新型S-亚硝基硫醇衍生物，该衍生物可抑制血小板的凝集并因此适合用于制备治疗循环系统机能障碍的药物，特别是治疗心血管水平的机能障碍。
此外据介绍，从医学观点来看，含有S-亚硝基硫醇基团的特定衍生物具有有益的特性，因为它们能够在生物体中释放NO。
Radomski等在《英国药理学杂志(Br.J.Pharmacol.)》(1992)107，745-749中描述了S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)化合物能够抑制血小板的活性。
Golino等在《循环研究(Circulation Research)》71，No 6(1992)中描述了S-亚硝基半胱氨酸因其抗血栓形成作用而能够抑制血小板的活性。
Smith等在Met.Find.Exp.Cline.Pharmacy.(1994)，16，5中描述了GSNO可产生较强的小动脉松弛效果。
WO95/12394描述了肽的S-亚硝基加合物的用途，其中S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP)可用作抗外伤引起的血管发炎保护剂。
WO95/07691描述了不同S-亚硝基硫醇，特别是GSNO，在治疗和预防血小板作用和受损伤血管表面形成血栓中的用途。
WO93/09806描述了S-亚硝基化蛋白质或氨基酸残基，其能够释放NO，具有松弛肌肉系统的作用和对血小板凝集的抑制作用。
EP-B1-412699描述了具有以下通式的S-亚硝基硫醇 以及其作为抗心血管疾病、特别是抗高血压治疗剂和作为治疗心绞痛药剂的用途。属于所说结构式范围内的可能的化合物数量是巨大的并且说明书中仅直接描述了数十种产物。此外，仅公开了关于它们总体血管舒张效果的数据，而关于对血小板的活性只字未提。
上述文献中描述的S-亚硝基硫醇本身并不能解决治疗血管疾病、特别是心血管疾病中的所有复杂问题。因此，亟待开发更有潜力和更有效的新化合物。
此外，本发明的目的涉及新化合物在制备治疗与循环系统机能障碍有关疾病、特别是心血管疾病的药物中的用途。发明详述本发明的化合物是青霉胺或谷胱甘肽的S-亚硝基硫醇衍生物及其药用盐，所说的化合物具有以下通式(I) 其中A和B是苯基或一起形成构成六元环的残基-CH2-Q-CH2-，其中Q表示氧原子、硫原子或基团N-R3，其中R3是氢或C1-C4烷基；R1是酰基残基，其可以是C1-C5脂族酰基，或者是通过其非氨基酸羧基连接的谷氨酸的残基；R2是羟基或通过肽键连接的甘氨酸残基；前提条件是如果R1是脂族酰基残基，则R2是羟基，并且如果R1是谷氨酸的残基，则R2是甘氨酸残基。
因此，本发明的化合物对应于以下通式(II)或(III)或其药用盐 其中A和B具有如上所述的含义，并且R4是C1-C4烷基。
属于本发明化合物的优选实例如下N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-S-亚硝基巯基四氢吡喃)乙酸(1)； N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-S-亚硝基巯基-1-甲基哌啶)]乙酸(2)； N-乙酰基-2-氨基-3-苄基-3-S-亚硝基巯基-4-苯基-丁酸(2)； N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-2-(4-(4-S-亚硝基巯基)四氢吡喃))乙酰基]-甘氨酸(4) N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-2-(4-(4-S-亚硝基巯基-1-甲基-哌啶))乙酰基]-甘氨酸(5) N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-3-苄基-3-(-S-亚硝基巯基)-4-苯基丁酰基]-甘氨酸(6)。 对熟悉本领域的技术人员来说，本发明化合物显然包括手性中心，从而通过这个手性中心可以区分可能的异构体和/或其混合物。应当理解，无论是异构体混合物还是纯异构体，都属于本发明的目的。后者可以由异构体的混合物通过本领域技术人员公知的常规技术或者通过也是本领域技术人员公知的不对称合成来获得。
本发明的化合物可以按不同的方式来获得，并且根据其基本结构来选择具体的方式。
例如，可以按照以下路径所示的步骤顺序获得通式(II)的化合物
即从氨基酸的盐酸化物开始，其可以根据已知的方法(例如参见DE-A-3023830和DE-A-2801849)来获得，接着通过常规技术将氨基酸的氮基团酰化，例如通过酰基氯，并且最后一步将亚硝基引入到硫醇的硫上，这也通过使用常规技术。
关于通式(III)的化合物，它们可以按照以下路径所示的步骤顺序来获得 即从如上相同的氨基酸盐酸化物开始，接着通过形成对甲基苄基的硫醚来保护巯基。接着通过已知的Boc技术保护氨基酸的氮，之后通过已知技术在固相中与其余的谷氨酸和甘氨酸(氨基酸的C-末端)形成三肽(例如参见Barany，G.等，肽(The Peptides)，2，1，Gross，E.Meienhofer，Eds.Academic Press，NY(1980)；Stewart，J.M.等，固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)Freeman，San Francisco，CA(1969)；Bodanszky，M.等，肽合成(Peptide Synthesis)第2版，Wiley，NY(1976))。
三肽的形成包括以下步骤a)以叔丁氧羰基(Boc)衍生物的形式，将氨基酸C-末端甘氨酸(Gly)结合到对甲基苄基羟(hydryl)胺/聚苯乙烯树脂上；b)用三氟乙酸除去Boc基团并且中和；c)掺入中间体保护的改性氨基酸；d)通过茚三酮评价偶联反应(Kaiser，E.等，分析生物化学(Anal.Biochem.)，34，595(1970))；e)对掺入作为Boc-衍生物或苄基保护的(Boc-Glu-OBzl)的残余的γ-谷氨酸(γ-Glu)重复以上步骤；f)用无水HF酸解，使三肽脱保护并且从树脂上释放出来；g)纯化并且表征最终产物。
当三肽形成之后，进行最后一步，将从其保护基团中释放出来的巯基亚硝基化。
所进行的试验证明本发明的新型S-亚硝基化化合物具有血管舒张活性，该活性至少可与GSNO相当，并且在某些情形中远远超过GSNO。此外，它们对血小板凝集具有抑制效果，这种效果也类似或超过GSNO，在某些情形中明显优于后者。
这使得本发明的化合物可以非常有效地用于制造具有血管舒张和抗血栓形成效果的药物，用以治疗循环系统的机能障碍，特别是心血管和冠状水平的机能障碍。
所以，可以通过使用常规药学技术，使用通式(I)的化合物及其药用盐来制备可以按不同方式施用的药物。
作为实施例，它们可以诸如片剂、胶囊、糖浆和悬浮液的药物制剂形式口服给药。以诸如溶液或乳液等形式非肠道给药。它们还可以乳膏、香膏剂、香脂等的形式局部施用，并且经皮给药，例如通过使用贴片或绷带。它们还可以作为栓剂直接在直肠中施用。制剂中可以含有生理学可接受的载体、赋形剂、活化剂、螯合剂、稳定剂等。当注射使用时，它们可以掺加生理学可接受的缓冲剂、增溶剂或等渗剂。日剂量可以根据患者的具体症状、年龄、体重、具体的给药方式等来改变，并且成人的日正常剂量可以为0.1-500 mg，并且可以仅一次施用或者在一天内分成几份施用。
在工作实施例中(见下页)将详细描述获得通式(I)各种化合物的适宜过程，在这些实施例的基础上，通过适当改进本发明的工作实施例来获得本发明没有直接例举的化合物属于本领域技术人员的常识。
所以，本发明的工作实施例不应当理解为是对本发明范围的限制，而仅仅是一种进一步的详细解释，其引导本领域技术人员更深刻地理解本发明。
PyAOP7-氮杂苯并三唑-1-基-氧三(吡咯烷)鏻的六氟磷酸盐TBuOH叔丁醇TFA 三氟乙酸起始氨基酸的盐酸化物按德国专利申请DE-A-3023830和DE-A-2801849所述的方法合成。
核磁共振光谱在Varian Gemini-200设备上实现。
在1H-NMR光谱中，指出用以形成光谱的工作频率和所用溶剂。信号的位置以δ(ppm)来表示，使用溶剂质子的信号作为参比。氯仿的参比值为7.24ppm，氘二甲基亚砜的参比值为2.49ppm。在括号内指出相当于通过电子积分测定的各个信号的质子数，并且使用以下简写表示信号的类型s(单峰)，d(二重峰)，t(三重峰)，dd(双二重峰)，sb(单宽峰)，sc(单复合峰)，d.e.D2O(在添加几滴氘水后光谱确认期间消失)。
在13C-MNR光谱中，指出各个光谱的工作频率和溶剂。信号的位置以δ(ppm)来表示，使用溶剂质子的信号作为参比。氯仿的参比值为77.00ppm，氘二甲基亚砜的参比值为39.50ppm。
此外，使用附加质子试验(Attached Proton Test(APT))来完成核磁共振实验。
通过HPLC分析确定样品纯度在如下条件下进行A-总梯度柱RP-C18，Symmetry 150×3.9 mm，5μ，100A流动相H2O＋H3PO40.1％/CH3CN＋5％H2O＋0.1％H3PO4温度室温流速1mL/min注射体积10μLB-无梯度淋洗柱RP-C18，Symmetry 150×3.9 mm，5μ，100A流动相50％H2O＋H3PO40.1％至50％CH3CN＋5％H2O＋0.1％H3PO4温度室温流速1mL/min注射体积10μL在三肽的制备中，使用制备型色谱和HPLC技术来纯化粗产物并且通过质谱法和氨基酸分析来证实识别产物。三肽的纯度通过HPLC在以下条件下分析Nucleosyl，C18柱250×4mm，120A，10μm；流速1mL/min； 洗脱剂A＝H2O(+0.045％TFA)至B＝CH3CN(+0.036％TFA)。
紫外光谱(UV)通过使用Shimadazu UV-160A分光光度计来得到。对每种化合物，指出波长(λ)按nm计，和分子吸收(ε)按cm-1mol-1L计。
对高压液相色谱法(HPLC)，使用紫外线光电二极管Hewlett-Packard 1040 A检测器。实施例1制备N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-S-亚硝基巯基四氢吡喃)]乙酸(1) 步骤1) 在250mL装有磁力搅拌器的玻璃烧瓶中，加入4.0g(17.6mmol)2-氨基-2-(4-(4-巯基四氢吡喃))乙酸的盐酸化物和60mL0.5N氢氧化钾溶液。之后加入3.07g(21.8mmol)无水碳酸钾和60mLMeCN。将混合物在冰浴中冷却，并且逐滴加入1.42mL(19.7mmol)溶于25mL MeCN中的乙酰氯。滴加完毕，加入0.5N氢氧化钾直至pH 9-10。将该混合物在室温下搅拌2小时。之后加入2N盐酸直至pH＝6，并且减压除去溶剂。将获得的固体经五氧化二磷真空干燥，并且悬浮于150mL纯EtOH中并在室温下搅拌。过滤出不溶物并且用纯EtOH洗涤。减压除去溶剂。获得3.98g粗制中间产物N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-巯基四氢吡喃)]乙酸，经多次反相制备型色谱制备，获得80mg纯度90％的产物(HPLC梯度A，λ＝205nm)。
1H-NMR(200 Mhz，DMSO-d6)7.40(1H，d，J＝10Hz，NH)，4.13(1H，d，J＝10Hz，CH)，3.75-3.50(4H，s.c.，CH2)，1.90-1.80(4H，s.c.，CH2)，1.65(3H，s，CH3).
13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)171.50(CO-N)，168.90(CO)，63.69(CH2)，63.27(CH2)，62.80(CH)，49.18(C)，37.58(CH2)，36.12(CH2)，23.01(CH3).
步骤2) 将80mg(0.34mmol)N-乙酰基-2-氨基-2-(4-(4-巯基四氢吡喃))乙酸溶解于4000μL MeOH中，之后加入500μL 1N HCl溶液和136μL 5M NaNO2溶液。将所得溶液在超声浴中处理1分钟，之后加入50μL 10N NaOH和14μL H2O。
从所得的溶液中，分离出470μL的等分部分A，并且向剩余部分添加充足的水，冷冻并且冻干，获得190mg吸湿性固体B，其略微潮湿。
HPLC(梯度A)λ220nm馏分A的纯度68％λ339nm馏分A的纯度95％。
馏分B的NMR数据
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.OO-7.50(1H，s.c.，NH)，4.50-4.00(1H，s.c.，CH)，3.80-3.40(4H，s.c.，CH2)，2.40-1.80(4H，s.c.，CH2)，1.88(3H，s，CH3).
13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)173.00(CO)，169.52(CO)，67.69(CH2-O)，63.45(CH)，53.78(C)，32.17(CH2)，22.80(CH3).
实施例2制备N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-S-亚硝基巯基-1-甲基哌啶)]乙酸⑵ 步骤1) 在250mL装有磁力搅拌器的玻璃烧瓶中，加入3.69g(13mmol)2-氨基-2-[4-(4-巯基-1-甲基哌啶)]乙酸二盐酸化物和30mL0.5N氢氧化钾溶液。之后加入2.2g(16mmol)无水碳酸钾和30mLMeCN。将混合物在冰浴中冷却，并且逐滴加入1.0mL(14mmol)溶于10mL MeCN中的乙酰氯。滴加完毕，加入0.5N氢氧化钾直至pH9-10。将该混合物在室温下搅拌2小时。之后加入2N盐酸直至pH＝6，并且减压除去溶剂。将获得的固体经五氧化二磷真空干燥，并且将干燥的固体悬浮于100mL纯EtOH中并且在室温下搅拌。过滤出不溶残余物并且用纯EtOH洗涤。减压除去溶剂。获得2.8g粗制中间产物N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-巯基-1-甲基哌啶)]乙酸，经多次反相制备型色谱制备，获得0.5g纯度99％的产物(HPLC梯度A，λ＝205nm)。
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.35(1H，d，J＝10Hz，NH)，4.43(1H，d，J＝10Hz，CH)，3.35-3.00(4H，s.c.，CH2)，2.70(3H，s，CH3)，2.20-1.90(4H，s.c.，CH2)，1.85(3H，s，CH3).
13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)170.55(CO-N)，170.05(CO)，61.77(CH)，49.33(CH2)，49.28(CH2)，46.38(C)，42.26(CH3)，33.05(CH2)，33.14(CH2)，22.42(CH3).
步骤2) 将50mg(0.20mmol)N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-巯基-1-甲基哌啶)]乙酸溶解于800μL 1N HCl中，之后加入80μL 5M NaNO2溶液。将所得溶液在超声浴中处理1分钟，之后加入80μL 10N NaOH和40μL H2O。
从所得的溶液中，分离出100μL的等分部分A并且将剩余部分冷冻并且冻干，获得190mg固体B。
HPLC(梯度A)λ220nm馏分A的纯度90％，馏分B的纯度93％λ334nm馏分A的纯度98％，馏分B的纯度98％馏分B的NMR数据1H-NMR(200 Mhz，D2O)4.71(1H，s，CH)，2.70-2.20(8H，sc，CH2)，1.95(3H，s.，CH3-N)，1.71(3H，s，CH3-CO).
13C-NMR(50Mhz，D2O)172.51(CO)，171.52(CO)，61.08(CH)，58.18(C)，48.09(CH2-N)，48.01(CH2-N)，42.18(CH3-N)，30.44(CH2)，29.85(CH2)，20.17(CH3-CO).
实施例3制备N-乙酰基-2-氨基-3-苄基-3-S-亚硝基巯基-4-苯基-丁酸(3)
步骤1) 在100mL装有磁力搅拌器的玻璃烧瓶中，加入2.0g(5.9mmol)2-氨基-3-苄基-3-巯基-4-苯基-丁酸和20mL 0.5N氢氧化钾溶液。之后加入1.0g(7.2mmol)无水碳酸钾和20mL MeCN。将混合物在冰浴中冷却，并且逐滴加入0.5mL(6.5mmol)溶于8mL MeCN中的乙酰氯。滴加完毕，加入0.5N氢氧化钾直至pH12-13。将该混合物在室温下搅拌2小时。之后加入2N盐酸直至pH＝6，并且减压除去溶剂。将获得的粗产物悬浮于100mL纯EtOH中并且在室温下搅拌。过滤出不溶残余物并且用纯EtOH洗涤。减压除去溶剂。将残余物在水中重结晶。过滤不溶部分并且弃掉。将滤液冷冻并且冻干，获得1.64g中间产物，N-乙酰基-2-氨基-3-苄基-3-巯基-4-苯基-丁酸，产率81％。
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)7.68(1H，d，J＝8Hz，NH)，7.35-7.05(10H，sc，CHar)，4.36(1H，d，J＝8Hz，CH)，3.42-3.02(2H，sc，CH2-Car)，2.95-2.55(2H，sc，CH2)，1.82(3H，s，CH3)13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)172.94(CO-N)，169.08(CO)，138.55(Car)，138.16(Car)，132.36(2CHar)，131.89(2CHar)，127.78(2CHar)，127.53(2CHar)，126.44(CHar)，126.26(CHar)，60.16(CH)，55.62(C)，43.70(CH2)，42.94(CH2)，23.14(CH3).
步骤2) 将0.62g(1.8mmol)N-乙酰基-2-氨基-3-苄基-3-巯基-4-苯基-丁酸溶解于25mL MeOH中，之后加入25mL 1N HCl和250mgNaNO2的25mL水溶液。将所得溶液在室温下搅拌35分钟，过滤并且用水洗涤。在P2O5的存在下减压干燥后，获得0.33g固体。
HPLC(无梯度淋洗B)λ220nm纯度91％λ342nm纯度100％。
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.77(1H，d，J＝10Hz，NH)，7.28-7.00(10H，sc，CHar)，5.33(1H，d，J＝10Hz，CH)，4.12-3.90(2H，sc，CH2)，3.88-3.38(2H，sc，CH2)，1.86(3H，s，CH3)13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)171.55(CO-N)，169.67(CO-O)，135.51(Car)，135.27(Car)，131.52(CHar)，131.41(CHar)，128.15(CHar)，128.05(CHar)，127.04(CHar)，65.13(CH)，56.11(CH)，40.91(CH2)，40.15(CH2)，22.29(CH3).
实施例4制备N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-2-(4-(4-S-亚硝基巯基)四氢吡喃))乙酰基]-甘氨酸(4) 步骤1) 在250mL装有磁力搅拌器的玻璃烧瓶中，将5.8g(25.5mmol)2-氨基-2-(4-(4-巯基四氢吡喃))乙酸盐酸化物、4.7g(25.5mmol)α-溴-对二甲苯和100mL H2O/EtOH的3∶1混合物混合。加入11mL三乙胺，建立氩气环境，并且将混合物在室温下搅拌18小时。再加入50mL 3∶1的H2O/EtOH并且将混合物再搅拌2小时。过滤所得的悬浮液并且用100mL水和50mL EtOH洗涤。获得固体，减压干燥。在固体上添加300mL浓盐酸，并且减压除去溶剂。再次重复该酸处理过程，获得固体，将其减压干燥。获得1.59g所需的中间产物。
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.80-8.30(3H，sb，H3N+)，7.26(2H，d，J＝8Hz，CHar)，7.12(2H，d，J＝8Hz，CHar)，4.03(1H，s，CH-N)，3.85-3.55(6H，sc，CH2-Car，CH2-O)，2.26(3H，s，CH3)，2.05-1.08(4H，sc，CH2).
13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)168.98(CO)，136.64(Car)，133.80(Car)，129.55(CHar)，129.29(CHar)，62.36(CH2-O)，59.85(CH-N)，49.15(C)32.03(CH2)，31.19(CH2)，30.84(CH2)，20.69(CH3).
步骤2) 将1004mg 2-氨基-2-(4-(4-(对甲基苄基巯基)四氢吡喃))乙酸的盐酸化物(3.029mmol)悬浮于20mL的2∶1 tBuOH/H2O中，并且加入5％NaOH直至pH＝9。之后加入3当量的Boc2O，并且让混合物反应30分钟，之后再次将pH调整至pH＝9。反应再延长30分钟，并且再次校正pH。通过使用薄层色谱法(TLC)与起始氨基酸比较证实反应已完成。
通过用50mL己烷连续两次萃取来分离产物，并且用pH＝2的1NHCl处理水相。之后进行三次萃取，每次用60ml AcOEt。将AcOEt溶液用无水MgSO4干燥，并且通过蒸发除去溶剂之后，将产物再溶解于DCM中并且再次蒸发。该步骤再重复两次，获得1191mg(3.015mmol)N-Boc保护的中间产物。
该中间产物表征为a)TLC，用CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5作为流动相。El Rf＝0.48，没有观察到起始原料的信号。
b)HPLC，10％-100％MeCN梯度淋洗30分钟＋100％MeCN无梯度淋洗5分钟。所得纯度为96％(220nm)。
c)通过FAB技术的质谱M计算＝395，(M＋H+)实验＝396.0d)NMR(CDCl3)7.18(2H，d，J＝8Hz)7.09(2H，d，J＝8Hz)，5.54(1H，d，J＝11.2Hz)，4.44(1H，d，J＝8.3Hz)，3.69(1H，d，J＝11.2Hz)，3.57(1H，d，J＝11.2Hz)，3.75-3.98(4H，sb)，2.32(3H，s)，1.26-2.19(4H，sb)，1.46(9H，s).
步骤3)通过固相合成技术制备三肽，由1595mg Boc-Gly-OCH2-Pam-树脂(Neosystem，参考号RP00801)开始，其取代度为0.63mmol/g。操作规模为1.005mmol。
添加剩余氨基的基本方法如下1)用DCM洗涤5次，每次0.5分钟，使树脂溶涨；2)用存在于DCM中的40％TFA除去Boc基团，1×1分钟＋1×20分钟；3)用DCM洗涤，5×0.5分钟；4)通过茚三酮测试；5)用DMF洗涤，3×1分钟；6)偶联1.5小时；7)用DMF洗涤，3×1分钟；8)用DCM洗涤，5×0.5分钟；9)通过茚三酮测试。
当最后一步通过茚三酮测试呈阳性时，重复步骤5-8进行重偶联。
使用6当量DIEA、3当量Boc-氨基酸和3当量活化剂实现偶联，此时活化剂是PyAOp(7-氮杂苯并三唑-1-基-氧三(吡咯烷)鏻的六氟磷酸盐)。对于偶联γ-Glu，使用Boc-Glu-(α-OBzl)。
中止偶联程序，用HF/对甲酚(9∶1)在0℃下将所得的肽基树脂酸解1小时。经蒸发后，用无水EtOEt萃取固体残余物，并且通过用10％AcOH萃取来分离肽。通过蒸发将体积降低之后，将粗产物冻干并且通过如下方法表征
a)HPLC，5％-65％MeCN梯度淋洗30分钟。
b)通过电雾化技术的MSM计算＝377，(M＋H+)实验＝378.2。
通过氨基酸分析确定肽的量m＝329mg(0.873mmol)。在所有肽的定量分析中，向待水解样品中添加Ile(异亮氨酸)的外标。
按制备规模，通过HPLC纯化三肽(分两批)。所用的本系如下-柱C18，Nucleosyl，200×20mm，120，10μm-洗脱剂A＝H2O(+0.1％TFA)，B＝MeCN(+0.1％TFA)-梯度0％无梯度B淋洗40分钟+0-10％梯度B淋洗40分钟-流速25ml/分钟。
获得总量227mg(0.602mmol)的中间三肽，其表征为a)HPLC，5％-45％MeCN梯度淋洗20分钟。所得纯度为95％(220nm)。随着逐渐稀释所施加的样品，8.4分钟时的小峰以相对的比例降低，直至消失。因此，结论是其相应于三肽的聚集(并且未氧化)，因此被认为是有效的产物。
b)电雾化MSM计算＝377，(M＋H+)实验＝378.2。
步骤4)向14.2mg(0.38mmol)步骤3所获得的三肽的800μL 1NHCl溶液中添加76μL 0.5M NaNO2溶液。室温下在超声浴中搅拌1分钟，之后加入80μL 10N NaOH溶液。将所得的溶液冷冻并且冻干，所获得的固体表征为1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.90-8.50(2H，sb，NH)，5.35(1H，d，J＝10Hz，CH)，4.10-3.00(3H，sc，CH2，CH)，1.95-1.65(4H，sc，2CH2).
13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)172.18(CO-N)，171.21(CO-N)，168.40(CO-O)，63.03(CH2)，62.31(C)，59.56(CH)，53.19(CH)，41.20(CH2)，32.94(CH2)，31.71(CH2)，31.41(CH2)，27.12(CH2).HPLC(方法A)λ220nm(纯度94％)；λ334nm(纯度95％)。UVλ346nm ε(H2O)502cm-1mol-1L实施例5制备N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-2-(4-(4-S-亚硝基巯基-1-甲基-哌啶))乙酰基]-甘氨酸(5) 步骤1) 在100mL装有磁力搅拌器的玻璃烧瓶中，将6.4g(23mmol)2-氨基-2-[4-(4-巯基-l-甲基哌啶)]乙酸的二盐酸化物、4.3g(23mmol)α-溴-对二甲苯和40mL H2O/EtOH的1∶1混合物混合。加入13mL三乙胺，建立氩气环境，并且将混合物在室温下搅拌42小时。从所得溶液中减压除去溶剂并且向所获得的粗产物中加入20mL纯EtOH。滤出所得的固体，并且连续用纯EtOH和EtOEt洗涤，并且将其减压干燥。获得2.11g中间产物2-氨基-2-[4-(4-(对甲基苄基巯基)-1-甲基哌啶)]乙酸的盐酸化物。产率29.6％。
在D2O中记录NMR光谱并且取4.75ppm作为HDO的参照。
1H-NMR(200Mhz，D2O)7.28(2H，d，J＝8Hz，CHar)，7.15(2H，d，J＝8Hz，Char)，3.64-3.74(2H，sc，CH2-Car)，3.62(1H，s，CH-N)，3.4-3.1(4H，sc，CH2-N)，2.76(3H，s，CH3-N)，2.24(3H，s，CH3)，2.15-1.92(4H，sc，CH2).
13C-NMR(50Mhz，D2O)173.15(CO)，141.00(Car)，136.39(Car)，132.58(CHar)，131.95(CHar)，63.57(CH-N)，52.48(CH2)+，50.65(C)，45.66(CH3-N)，34.05(CH2)，32.35(CH2)，31.28(CH2)，22.77(CH3).
步骤2) 由1016mg(2.958mmol)前一步骤获得的中间体开始，并且按与实施例4之步骤2所述的方式获得1016mg(2.490mmol)N-Boc保护的中间体，其表征为a)CCF(流动相CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。Rf＝0.32，没有观察到起始原料的信号。
b)HPLC，10％-100％MeCN梯度淋洗30分钟，纯度为96％(220nm)。
c)通过FAB技术的质谱M计算＝408，(M＋H+)实验＝408.9d)通过电雾化技术的MS(M＋H+)实验＝409.3。
步骤3)由794mg上述提及的树脂开始，使用实施例4之步骤3所述的方法，获得三肽中间体。操作规模为0.5mmol。由于溶解Boc-衍生物困难，在上述的偶联反应中选择使用N-甲基吗啉作为碱(3当量)来代替DIEA。在掺入γGlu后，装配三肽并且通过上述相同的方式酸解破坏肽-树脂键。最后，在10％AcOH中获得粗产物，之后将其冻干并且定量分析。获得137mg(0.35lmmol)中间体三肽并且表征为a)HPLC，0％无梯度淋洗10分钟+5％-65％MeCN淋洗30分钟。看到乙酸溶液中的注射产物首先洗脱出来，这使得必须冻干等分部分以消除酸并且将冻干物重溶解于1mM HCl中。按此方式可以通过色谱观察肽并且在所用的梯度中于6.8分钟时洗脱出来。
b)通过电雾化技术的MSM计算＝390，(M＋H+)实验＝391.2。
按制备规模，通过HPLC纯化粗产物，使用实施例4中所述的参数。也施加0％的无梯度B淋洗40分钟，接着0-10％梯度B淋洗40分钟。按此方式，获得107mg(0.274mmol)的产物，其表征为a)HPLC，0％-0％梯度淋洗10分钟，加上0％-30％梯度淋洗20分钟。纯度94％(220nm)。证实在8.0分钟处的附加的峰也对应三肽的聚集，因此为正确产物。
b)通过电雾化的MSM计算＝390，(M＋H+)实验＝391.1。
步骤4)由10.0mg(0.026mmol)前述步骤获得的三肽中间体开始，使用52μL 0.5M NaNO2，按实施例4之步骤4所述进行亚硝基化。所获得的产物表征为13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)171.57(CO-N)，170.99(CO-N)，170.76(CO-N)，168.20(CO-O)，60.23(C)，59.53(CH)，51.57(CH)，49.02(CH2)，42.20(CH3)，41.59(CH2)，30.49(CH2)，29.75(CH2)，29.31(CH2)，26.05(CH2)HPLC(方法B)λ220nm(纯度74％)；λ334nm(纯度88％)。
UVλ346nm，ε(H2O)198cm-1mol-1L实施例6制备N[N-γ-L-谷氨酰基-2-胺-3-苄基-3-(-S-亚硝基巯基)-4-苯基丁酰基]-甘氨酸(6) 步骤1) 在100mL装有磁力搅拌器的玻璃烧瓶中，将1.25g(3.7mmol)2-氨基-3-苄基-3-巯基-4-苯基丁酸的二盐酸化物、0.68g(3.7mmol)α-溴-对二甲苯和40mL H2O/EtOH的1∶1混合物混合。加入1.6mL三乙胺，并且溶解大部分悬浮固体。建立氩气环境，并且将混合物在室温下搅拌24小时。减压除去乙醇和部分三乙胺。将所得的水悬浮液过滤并且获得白色固体。用CH3CN-H2O经反相柱色谱法纯化。在所得的固体上面添加100mL 1∶1的MeOH/HCl并且减压除去溶剂。获得0.5g中间产物2-氨基-3-苄基-3-(4-甲基苄基巯基)-4-苯基丁酸的盐酸化物。
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.95-8.50(3H，sb，H3N+)，7.45-7.25(10H，sc，CHar)，7.08(2H，d，J＝10Hz，CHar)，6.98(2H，d，J＝10Hz，CHar)，4.05(1H，s，CH-N)，3.55-3.0(4H，sc，CH2-C6H5，CH2-Car)，2.90-2.60(2H，sc，CH2)，2.20(3H，s，CH3)13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)168.70(CO)，136.53(Car)，136.00(Car)，134.94(Car)，132.50(Car)，131.18(CHar)，129.169(CHar)，128.90(CHar)，128.26(CHar)，128.02(CHar)，127.07(CHar)，57.06(CH-N)，53.64(C)42.22(CH2)，41.65(CH2)，31.90(CH2S)，20.48(CH3).
步骤2) 由前面步骤中获得的两种馏分开始(纯度83％的馏分180mg，纯度94％的馏分530mg)，并且按实施例4之步骤2所述的方式进行，获得733mg(1.45mmol)N-Boc保护的产物，其表征为a)CCF(流动相CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。Rf＝0.63。
b) HPLC，10％-100％MeCN梯度淋洗30分钟，100％无梯度淋洗5分钟，纯度为91％(220nm)。
c)EM-MALDI-TOF(质谱)二羟基苯甲酸基质，M计算＝505，(M＋H+)实验＝528.585(M＋Na)d) NMR证实存在Boc基团。
步骤3)由0.43mmol上述提及的树脂开始，使用实施例4之步骤3所述的方法，获得三肽中间体。在酸解步骤之后，分离得到粗产物，其含有14.4mg(29.96μmol)三肽中间体，其表征为
a)HPLC分析，5％-65％梯度淋洗30分钟，纯度大约95％。
b)EM-电雾化M计算＝487(M＋H+)，M实验＝488.3。
步骤4)由5.7mg(0.012mmol)前述步骤获得的三肽中间体开始，使用24μL 0.5M NaNO2，按实施例4之步骤4所述进行亚硝基化。所获得的产物表征为HPLC(方法A)λ220nm，纯度68％；λ334nm，纯度86％。
UVλ345nm，ε(H2O)368cm-1mol-1L试验中所用的方法与以下参考文献中描述的基本上相同。
*Furchgot，R.F.″一氧化氮的研究方法(Methods in nitric oxideresearch)″，Feelisch & Stamier编，John Wiley & Sons，Chichester，England，pp 567-581*Trongvanichnam，K.等，日本药理学杂志(Jpn J.Pharmacol.)1996；71167-173*Salas，E.等，欧洲药理学杂志(Eur.J.Pharmacol.)1994；25847-55将化合物按5种浓度进行试验，以0.001至10mM的浓度范围，对每种化合物使用6-9个动脉环。将获得的结果与由S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)获得的结果进行比较，所说的S-亚硝基谷胱甘肽用作对照产物。
结果示于下表1中并且按CE50(有效浓度50)给出，其是各个受测试化合物使50％的动脉环产生血管舒张时的浓度，其中所说的动脉环预先用1μM去甲肾上腺素收缩。
可以看出，所有受测试化合物均具有有效的血管舒张活性，其活性类似或超过对照化合物(GSNO)的活性，并且化合物2的血管舒张活性远远优于对照产物的活性。实施例8抑制血小板凝集的体外试验试验中所用的方法与以下参考文献中描述的基本上相同。
*Loscalzo J.等，″一氧化氮的研究方法(Methods in nitric oxideresearch)″，Feelisch & Stamier编，John Wiley & Sons，Chichester，England.，pp 583-591*Radomski，MW等，英国药理学杂志(Br J.Pharmacol.)1987；92181-187*Salas，E.等，英国药理学杂志(Br.J.Pharmacol.)1994；1121071-1076测试4种不同浓度的化合物，使用5-23种不同供体的血小板。将所得结果与由S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)获得的结果进行比较，所说的S-亚硝基谷胱甘肽用作对照产物。
结果示于下表2中并且以CI50(抑制50的浓度)表达，其是各个测试化合物对用次最大胶原浓度(1μg/mL)获得的凝集产生50％抑制时的浓度。
正如表2中看出的，所有测试化合物对血小板凝集均具有有效的抑制活性，其活性类似或超过对照化合物(GSNO)的活性，并且化合物1和5的血小板凝集抑制活性远远优于对照产物的活性。实施例9增加血小板内GMPc含量的体外试验对实施例5获得的化合物5进行体外试验，测试其在人分离血小板制剂中增加血小板内GMPc含量的能力。
本试验中使用的方法与实施例8中所提及的参考文献中描述的方法基本上相同。
使用来自5种不同供体的血小板测试4种不同浓度的化合物。将所得的结果与GSNO(对照产物)的结果及基本值比较。结果示于下表3中，以pmol/109血小板表达。
化合物5以与GSNO对照物类似的方式增加血小板内GMP含量。应当注意对接近于IC50的值来说，化合物5引发的GMPc含量低于GSNO当其在接近于其IC50的浓度下使用时引发的GMPc含量。实施例10阻滞血小板凝集抑制的体外试验本试验中使用的方法与实施例8中所提及的参考文献中描述的方法基本上相同，以及参考文献*Moro MA等，Pr Nat Acad Sc USA.1996；931480-5。
体外测试ODQ对所得产物在人分离血小板制剂中所达到的血小板凝集抑制作用的阻滞。
测试3种不同浓度的实施例5获得的化合物5，在ODQ(1μM)的存在下或没有ODQ的存在，使用5种不同供体的血小板。将所得的结果与GSNO(对照产物)的结果及不存在ODQ时的值比较。结果示于表4和5并且以最大凝集抑制百分比来表达。
当使用IC50浓度的化合物时，ODQ(1μM)能够阻滞GSNO和化合物5的抑制效果。在比IC50高的浓度下，化合物5凝集抑制效果比对照产物更好地受到阻滞。
权利要求
1.青霉胺或谷胱甘肽的S-亚硝基硫醇衍生物及其药用盐，该化合物具有以下通式(I) 其中A和B是苯基或一起形成构成六元环的残基-CH2-Q-CH2-，其中Q表示氧原子、硫原子或基团N-R3，其中R3是氢或C1-C4烷基；R1是酰基残基，其可以是C1-C5脂族酰基，或者是通过其非氨基酸羧基连接的谷氨酸的残基；R2是羟基或通过肽键连接的甘氨酸残基；前提条件是如果R1是脂族酰基残基，则R2是羟基，并且如果R1是谷氨酸的残基，则R2是甘氨酸残基。
2.权利要求1的S-亚硝基硫醇，其具有以下通式(II) 其中A和B具有如上所述的含义，并且R4是C1-C4烷基。
3.权利要求1或2任一项的S-亚硝基硫醇，其为N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-S-亚硝基巯基四氢吡喃)]乙酸(1)。
4.权利要求1或2任一项的S-亚硝基硫醇，其是N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-S-亚硝基巯基-1-甲基哌啶)]乙酸(2)。
5.权利要求1或2任一项的S-亚硝基硫醇，其是N-乙酰基-2-氨基-3-苄基-3-S-亚硝基巯基-4-苯基-丁酸(3)。
6.权利要求1的S-亚硝基硫醇，其具有以下通式(III) 其中A和B具有如上所述的含义。
7.权利要求1或6任一项的S-亚硝基硫醇，其是N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-2-(4-(4-S-亚硝基巯基)四氢吡喃))乙酰基]-甘氨酸(4)。
8.权利要求1或6任一项的S-亚硝基硫醇，其是N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-2(4-(4-S-亚硝基巯基-1-甲基-哌啶))乙酰基]-甘氨酸(5)。
9.权利要求1或6任一项的S-亚硝基硫醇，其是N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-3-苄基-3-(-S-亚硝基巯基)-4-苯基丁酰基]-甘氨酸(6)。
10.上述权利要求任一项的S-亚硝基硫醇在制备治疗循环系统机能障碍的药物中的用途。
11.权利要求10的用途，用于制备治疗心血管系统机能障碍的药物。
全文摘要
本发明涉及通式(I)的衍生自青霉胺或谷胱甘肽的新型S－亚硝基硫醇,其中A和B是苯基或一起形成构成六元环的基团－CH
文档编号A61P9/10GK1337946SQ00803084
公开日2002年2月27日 申请日期2000年1月19日 优先权日1999年1月27日
发明者何塞·雷波列斯·莫利纳, 爱德华多·萨拉斯·佩雷斯－拉西利亚, 弗朗西斯科·普比尔·科伊, 胡安－安东尼奥·塞尔达－瑞达沃兹, 克里斯蒂纳·内格里·罗弗斯, 莉迪亚·卡韦萨·略伦特, 艾丽西亚·费雷尔·西索, 努里亚·特里亚斯·阿德罗埃尔, 马尔切利·卡尔沃·巴纽斯, 赫苏斯·缪拉·莫雷诺, 佩德罗·米切莱纳·利亚古诺 申请人:雷瑟尔股份有限公司
技术领域：
本发明涉及具有血管舒张效果的青霉胺或谷胱甘肽的新型S-亚硝基硫醇衍生物，该衍生物可抑制血小板的凝集并因此适合用于制备治疗循环系统机能障碍的药物，特别是治疗心血管水平的机能障碍。
此外据介绍，从医学观点来看，含有S-亚硝基硫醇基团的特定衍生物具有有益的特性，因为它们能够在生物体中释放NO。
Radomski等在《英国药理学杂志(Br.J.Pharmacol.)》(1992)107，745-749中描述了S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)化合物能够抑制血小板的活性。
Golino等在《循环研究(Circulation Research)》71，No 6(1992)中描述了S-亚硝基半胱氨酸因其抗血栓形成作用而能够抑制血小板的活性。
Smith等在Met.Find.Exp.Cline.Pharmacy.(1994)，16，5中描述了GSNO可产生较强的小动脉松弛效果。
WO95/12394描述了肽的S-亚硝基加合物的用途，其中S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP)可用作抗外伤引起的血管发炎保护剂。
WO95/07691描述了不同S-亚硝基硫醇，特别是GSNO，在治疗和预防血小板作用和受损伤血管表面形成血栓中的用途。
WO93/09806描述了S-亚硝基化蛋白质或氨基酸残基，其能够释放NO，具有松弛肌肉系统的作用和对血小板凝集的抑制作用。
EP-B1-412699描述了具有以下通式的S-亚硝基硫醇 以及其作为抗心血管疾病、特别是抗高血压治疗剂和作为治疗心绞痛药剂的用途。属于所说结构式范围内的可能的化合物数量是巨大的并且说明书中仅直接描述了数十种产物。此外，仅公开了关于它们总体血管舒张效果的数据，而关于对血小板的活性只字未提。
上述文献中描述的S-亚硝基硫醇本身并不能解决治疗血管疾病、特别是心血管疾病中的所有复杂问题。因此，亟待开发更有潜力和更有效的新化合物。
此外，本发明的目的涉及新化合物在制备治疗与循环系统机能障碍有关疾病、特别是心血管疾病的药物中的用途。发明详述本发明的化合物是青霉胺或谷胱甘肽的S-亚硝基硫醇衍生物及其药用盐，所说的化合物具有以下通式(I) 其中A和B是苯基或一起形成构成六元环的残基-CH2-Q-CH2-，其中Q表示氧原子、硫原子或基团N-R3，其中R3是氢或C1-C4烷基；R1是酰基残基，其可以是C1-C5脂族酰基，或者是通过其非氨基酸羧基连接的谷氨酸的残基；R2是羟基或通过肽键连接的甘氨酸残基；前提条件是如果R1是脂族酰基残基，则R2是羟基，并且如果R1是谷氨酸的残基，则R2是甘氨酸残基。
因此，本发明的化合物对应于以下通式(II)或(III)或其药用盐 其中A和B具有如上所述的含义，并且R4是C1-C4烷基。
属于本发明化合物的优选实例如下N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-S-亚硝基巯基四氢吡喃)乙酸(1)； N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-S-亚硝基巯基-1-甲基哌啶)]乙酸(2)； N-乙酰基-2-氨基-3-苄基-3-S-亚硝基巯基-4-苯基-丁酸(2)； N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-2-(4-(4-S-亚硝基巯基)四氢吡喃))乙酰基]-甘氨酸(4) N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-2-(4-(4-S-亚硝基巯基-1-甲基-哌啶))乙酰基]-甘氨酸(5) N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-3-苄基-3-(-S-亚硝基巯基)-4-苯基丁酰基]-甘氨酸(6)。 对熟悉本领域的技术人员来说，本发明化合物显然包括手性中心，从而通过这个手性中心可以区分可能的异构体和/或其混合物。应当理解，无论是异构体混合物还是纯异构体，都属于本发明的目的。后者可以由异构体的混合物通过本领域技术人员公知的常规技术或者通过也是本领域技术人员公知的不对称合成来获得。
本发明的化合物可以按不同的方式来获得，并且根据其基本结构来选择具体的方式。
例如，可以按照以下路径所示的步骤顺序获得通式(II)的化合物
即从氨基酸的盐酸化物开始，其可以根据已知的方法(例如参见DE-A-3023830和DE-A-2801849)来获得，接着通过常规技术将氨基酸的氮基团酰化，例如通过酰基氯，并且最后一步将亚硝基引入到硫醇的硫上，这也通过使用常规技术。
关于通式(III)的化合物，它们可以按照以下路径所示的步骤顺序来获得 即从如上相同的氨基酸盐酸化物开始，接着通过形成对甲基苄基的硫醚来保护巯基。接着通过已知的Boc技术保护氨基酸的氮，之后通过已知技术在固相中与其余的谷氨酸和甘氨酸(氨基酸的C-末端)形成三肽(例如参见Barany，G.等，肽(The Peptides)，2，1，Gross，E.Meienhofer，Eds.Academic Press，NY(1980)；Stewart，J.M.等，固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)Freeman，San Francisco，CA(1969)；Bodanszky，M.等，肽合成(Peptide Synthesis)第2版，Wiley，NY(1976))。
三肽的形成包括以下步骤a)以叔丁氧羰基(Boc)衍生物的形式，将氨基酸C-末端甘氨酸(Gly)结合到对甲基苄基羟(hydryl)胺/聚苯乙烯树脂上；b)用三氟乙酸除去Boc基团并且中和；c)掺入中间体保护的改性氨基酸；d)通过茚三酮评价偶联反应(Kaiser，E.等，分析生物化学(Anal.Biochem.)，34，595(1970))；e)对掺入作为Boc-衍生物或苄基保护的(Boc-Glu-OBzl)的残余的γ-谷氨酸(γ-Glu)重复以上步骤；f)用无水HF酸解，使三肽脱保护并且从树脂上释放出来；g)纯化并且表征最终产物。
当三肽形成之后，进行最后一步，将从其保护基团中释放出来的巯基亚硝基化。
所进行的试验证明本发明的新型S-亚硝基化化合物具有血管舒张活性，该活性至少可与GSNO相当，并且在某些情形中远远超过GSNO。此外，它们对血小板凝集具有抑制效果，这种效果也类似或超过GSNO，在某些情形中明显优于后者。
这使得本发明的化合物可以非常有效地用于制造具有血管舒张和抗血栓形成效果的药物，用以治疗循环系统的机能障碍，特别是心血管和冠状水平的机能障碍。
所以，可以通过使用常规药学技术，使用通式(I)的化合物及其药用盐来制备可以按不同方式施用的药物。
作为实施例，它们可以诸如片剂、胶囊、糖浆和悬浮液的药物制剂形式口服给药。以诸如溶液或乳液等形式非肠道给药。它们还可以乳膏、香膏剂、香脂等的形式局部施用，并且经皮给药，例如通过使用贴片或绷带。它们还可以作为栓剂直接在直肠中施用。制剂中可以含有生理学可接受的载体、赋形剂、活化剂、螯合剂、稳定剂等。当注射使用时，它们可以掺加生理学可接受的缓冲剂、增溶剂或等渗剂。日剂量可以根据患者的具体症状、年龄、体重、具体的给药方式等来改变，并且成人的日正常剂量可以为0.1-500 mg，并且可以仅一次施用或者在一天内分成几份施用。
在工作实施例中(见下页)将详细描述获得通式(I)各种化合物的适宜过程，在这些实施例的基础上，通过适当改进本发明的工作实施例来获得本发明没有直接例举的化合物属于本领域技术人员的常识。
所以，本发明的工作实施例不应当理解为是对本发明范围的限制，而仅仅是一种进一步的详细解释，其引导本领域技术人员更深刻地理解本发明。
PyAOP7-氮杂苯并三唑-1-基-氧三(吡咯烷)鏻的六氟磷酸盐TBuOH叔丁醇TFA 三氟乙酸起始氨基酸的盐酸化物按德国专利申请DE-A-3023830和DE-A-2801849所述的方法合成。
核磁共振光谱在Varian Gemini-200设备上实现。
在1H-NMR光谱中，指出用以形成光谱的工作频率和所用溶剂。信号的位置以δ(ppm)来表示，使用溶剂质子的信号作为参比。氯仿的参比值为7.24ppm，氘二甲基亚砜的参比值为2.49ppm。在括号内指出相当于通过电子积分测定的各个信号的质子数，并且使用以下简写表示信号的类型s(单峰)，d(二重峰)，t(三重峰)，dd(双二重峰)，sb(单宽峰)，sc(单复合峰)，d.e.D2O(在添加几滴氘水后光谱确认期间消失)。
在13C-MNR光谱中，指出各个光谱的工作频率和溶剂。信号的位置以δ(ppm)来表示，使用溶剂质子的信号作为参比。氯仿的参比值为77.00ppm，氘二甲基亚砜的参比值为39.50ppm。
此外，使用附加质子试验(Attached Proton Test(APT))来完成核磁共振实验。
通过HPLC分析确定样品纯度在如下条件下进行A-总梯度柱RP-C18，Symmetry 150×3.9 mm，5μ，100A流动相H2O＋H3PO40.1％/CH3CN＋5％H2O＋0.1％H3PO4温度室温流速1mL/min注射体积10μLB-无梯度淋洗柱RP-C18，Symmetry 150×3.9 mm，5μ，100A流动相50％H2O＋H3PO40.1％至50％CH3CN＋5％H2O＋0.1％H3PO4温度室温流速1mL/min注射体积10μL在三肽的制备中，使用制备型色谱和HPLC技术来纯化粗产物并且通过质谱法和氨基酸分析来证实识别产物。三肽的纯度通过HPLC在以下条件下分析Nucleosyl，C18柱250×4mm，120A，10μm；流速1mL/min； 洗脱剂A＝H2O(+0.045％TFA)至B＝CH3CN(+0.036％TFA)。
紫外光谱(UV)通过使用Shimadazu UV-160A分光光度计来得到。对每种化合物，指出波长(λ)按nm计，和分子吸收(ε)按cm-1mol-1L计。
对高压液相色谱法(HPLC)，使用紫外线光电二极管Hewlett-Packard 1040 A检测器。实施例1制备N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-S-亚硝基巯基四氢吡喃)]乙酸(1) 步骤1) 在250mL装有磁力搅拌器的玻璃烧瓶中，加入4.0g(17.6mmol)2-氨基-2-(4-(4-巯基四氢吡喃))乙酸的盐酸化物和60mL0.5N氢氧化钾溶液。之后加入3.07g(21.8mmol)无水碳酸钾和60mLMeCN。将混合物在冰浴中冷却，并且逐滴加入1.42mL(19.7mmol)溶于25mL MeCN中的乙酰氯。滴加完毕，加入0.5N氢氧化钾直至pH 9-10。将该混合物在室温下搅拌2小时。之后加入2N盐酸直至pH＝6，并且减压除去溶剂。将获得的固体经五氧化二磷真空干燥，并且悬浮于150mL纯EtOH中并在室温下搅拌。过滤出不溶物并且用纯EtOH洗涤。减压除去溶剂。获得3.98g粗制中间产物N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-巯基四氢吡喃)]乙酸，经多次反相制备型色谱制备，获得80mg纯度90％的产物(HPLC梯度A，λ＝205nm)。
1H-NMR(200 Mhz，DMSO-d6)7.40(1H，d，J＝10Hz，NH)，4.13(1H，d，J＝10Hz，CH)，3.75-3.50(4H，s.c.，CH2)，1.90-1.80(4H，s.c.，CH2)，1.65(3H，s，CH3).
13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)171.50(CO-N)，168.90(CO)，63.69(CH2)，63.27(CH2)，62.80(CH)，49.18(C)，37.58(CH2)，36.12(CH2)，23.01(CH3).
步骤2) 将80mg(0.34mmol)N-乙酰基-2-氨基-2-(4-(4-巯基四氢吡喃))乙酸溶解于4000μL MeOH中，之后加入500μL 1N HCl溶液和136μL 5M NaNO2溶液。将所得溶液在超声浴中处理1分钟，之后加入50μL 10N NaOH和14μL H2O。
从所得的溶液中，分离出470μL的等分部分A，并且向剩余部分添加充足的水，冷冻并且冻干，获得190mg吸湿性固体B，其略微潮湿。
HPLC(梯度A)λ220nm馏分A的纯度68％λ339nm馏分A的纯度95％。
馏分B的NMR数据
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.OO-7.50(1H，s.c.，NH)，4.50-4.00(1H，s.c.，CH)，3.80-3.40(4H，s.c.，CH2)，2.40-1.80(4H，s.c.，CH2)，1.88(3H，s，CH3).
13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)173.00(CO)，169.52(CO)，67.69(CH2-O)，63.45(CH)，53.78(C)，32.17(CH2)，22.80(CH3).
实施例2制备N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-S-亚硝基巯基-1-甲基哌啶)]乙酸⑵ 步骤1) 在250mL装有磁力搅拌器的玻璃烧瓶中，加入3.69g(13mmol)2-氨基-2-[4-(4-巯基-1-甲基哌啶)]乙酸二盐酸化物和30mL0.5N氢氧化钾溶液。之后加入2.2g(16mmol)无水碳酸钾和30mLMeCN。将混合物在冰浴中冷却，并且逐滴加入1.0mL(14mmol)溶于10mL MeCN中的乙酰氯。滴加完毕，加入0.5N氢氧化钾直至pH9-10。将该混合物在室温下搅拌2小时。之后加入2N盐酸直至pH＝6，并且减压除去溶剂。将获得的固体经五氧化二磷真空干燥，并且将干燥的固体悬浮于100mL纯EtOH中并且在室温下搅拌。过滤出不溶残余物并且用纯EtOH洗涤。减压除去溶剂。获得2.8g粗制中间产物N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-巯基-1-甲基哌啶)]乙酸，经多次反相制备型色谱制备，获得0.5g纯度99％的产物(HPLC梯度A，λ＝205nm)。
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.35(1H，d，J＝10Hz，NH)，4.43(1H，d，J＝10Hz，CH)，3.35-3.00(4H，s.c.，CH2)，2.70(3H，s，CH3)，2.20-1.90(4H，s.c.，CH2)，1.85(3H，s，CH3).
13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)170.55(CO-N)，170.05(CO)，61.77(CH)，49.33(CH2)，49.28(CH2)，46.38(C)，42.26(CH3)，33.05(CH2)，33.14(CH2)，22.42(CH3).
步骤2) 将50mg(0.20mmol)N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-巯基-1-甲基哌啶)]乙酸溶解于800μL 1N HCl中，之后加入80μL 5M NaNO2溶液。将所得溶液在超声浴中处理1分钟，之后加入80μL 10N NaOH和40μL H2O。
从所得的溶液中，分离出100μL的等分部分A并且将剩余部分冷冻并且冻干，获得190mg固体B。
HPLC(梯度A)λ220nm馏分A的纯度90％，馏分B的纯度93％λ334nm馏分A的纯度98％，馏分B的纯度98％馏分B的NMR数据1H-NMR(200 Mhz，D2O)4.71(1H，s，CH)，2.70-2.20(8H，sc，CH2)，1.95(3H，s.，CH3-N)，1.71(3H，s，CH3-CO).
13C-NMR(50Mhz，D2O)172.51(CO)，171.52(CO)，61.08(CH)，58.18(C)，48.09(CH2-N)，48.01(CH2-N)，42.18(CH3-N)，30.44(CH2)，29.85(CH2)，20.17(CH3-CO).
实施例3制备N-乙酰基-2-氨基-3-苄基-3-S-亚硝基巯基-4-苯基-丁酸(3)
步骤1) 在100mL装有磁力搅拌器的玻璃烧瓶中，加入2.0g(5.9mmol)2-氨基-3-苄基-3-巯基-4-苯基-丁酸和20mL 0.5N氢氧化钾溶液。之后加入1.0g(7.2mmol)无水碳酸钾和20mL MeCN。将混合物在冰浴中冷却，并且逐滴加入0.5mL(6.5mmol)溶于8mL MeCN中的乙酰氯。滴加完毕，加入0.5N氢氧化钾直至pH12-13。将该混合物在室温下搅拌2小时。之后加入2N盐酸直至pH＝6，并且减压除去溶剂。将获得的粗产物悬浮于100mL纯EtOH中并且在室温下搅拌。过滤出不溶残余物并且用纯EtOH洗涤。减压除去溶剂。将残余物在水中重结晶。过滤不溶部分并且弃掉。将滤液冷冻并且冻干，获得1.64g中间产物，N-乙酰基-2-氨基-3-苄基-3-巯基-4-苯基-丁酸，产率81％。
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)7.68(1H，d，J＝8Hz，NH)，7.35-7.05(10H，sc，CHar)，4.36(1H，d，J＝8Hz，CH)，3.42-3.02(2H，sc，CH2-Car)，2.95-2.55(2H，sc，CH2)，1.82(3H，s，CH3)13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)172.94(CO-N)，169.08(CO)，138.55(Car)，138.16(Car)，132.36(2CHar)，131.89(2CHar)，127.78(2CHar)，127.53(2CHar)，126.44(CHar)，126.26(CHar)，60.16(CH)，55.62(C)，43.70(CH2)，42.94(CH2)，23.14(CH3).
步骤2) 将0.62g(1.8mmol)N-乙酰基-2-氨基-3-苄基-3-巯基-4-苯基-丁酸溶解于25mL MeOH中，之后加入25mL 1N HCl和250mgNaNO2的25mL水溶液。将所得溶液在室温下搅拌35分钟，过滤并且用水洗涤。在P2O5的存在下减压干燥后，获得0.33g固体。
HPLC(无梯度淋洗B)λ220nm纯度91％λ342nm纯度100％。
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.77(1H，d，J＝10Hz，NH)，7.28-7.00(10H，sc，CHar)，5.33(1H，d，J＝10Hz，CH)，4.12-3.90(2H，sc，CH2)，3.88-3.38(2H，sc，CH2)，1.86(3H，s，CH3)13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)171.55(CO-N)，169.67(CO-O)，135.51(Car)，135.27(Car)，131.52(CHar)，131.41(CHar)，128.15(CHar)，128.05(CHar)，127.04(CHar)，65.13(CH)，56.11(CH)，40.91(CH2)，40.15(CH2)，22.29(CH3).
实施例4制备N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-2-(4-(4-S-亚硝基巯基)四氢吡喃))乙酰基]-甘氨酸(4) 步骤1) 在250mL装有磁力搅拌器的玻璃烧瓶中，将5.8g(25.5mmol)2-氨基-2-(4-(4-巯基四氢吡喃))乙酸盐酸化物、4.7g(25.5mmol)α-溴-对二甲苯和100mL H2O/EtOH的3∶1混合物混合。加入11mL三乙胺，建立氩气环境，并且将混合物在室温下搅拌18小时。再加入50mL 3∶1的H2O/EtOH并且将混合物再搅拌2小时。过滤所得的悬浮液并且用100mL水和50mL EtOH洗涤。获得固体，减压干燥。在固体上添加300mL浓盐酸，并且减压除去溶剂。再次重复该酸处理过程，获得固体，将其减压干燥。获得1.59g所需的中间产物。
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.80-8.30(3H，sb，H3N+)，7.26(2H，d，J＝8Hz，CHar)，7.12(2H，d，J＝8Hz，CHar)，4.03(1H，s，CH-N)，3.85-3.55(6H，sc，CH2-Car，CH2-O)，2.26(3H，s，CH3)，2.05-1.08(4H，sc，CH2).
13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)168.98(CO)，136.64(Car)，133.80(Car)，129.55(CHar)，129.29(CHar)，62.36(CH2-O)，59.85(CH-N)，49.15(C)32.03(CH2)，31.19(CH2)，30.84(CH2)，20.69(CH3).
步骤2) 将1004mg 2-氨基-2-(4-(4-(对甲基苄基巯基)四氢吡喃))乙酸的盐酸化物(3.029mmol)悬浮于20mL的2∶1 tBuOH/H2O中，并且加入5％NaOH直至pH＝9。之后加入3当量的Boc2O，并且让混合物反应30分钟，之后再次将pH调整至pH＝9。反应再延长30分钟，并且再次校正pH。通过使用薄层色谱法(TLC)与起始氨基酸比较证实反应已完成。
通过用50mL己烷连续两次萃取来分离产物，并且用pH＝2的1NHCl处理水相。之后进行三次萃取，每次用60ml AcOEt。将AcOEt溶液用无水MgSO4干燥，并且通过蒸发除去溶剂之后，将产物再溶解于DCM中并且再次蒸发。该步骤再重复两次，获得1191mg(3.015mmol)N-Boc保护的中间产物。
该中间产物表征为a)TLC，用CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5作为流动相。El Rf＝0.48，没有观察到起始原料的信号。
b)HPLC，10％-100％MeCN梯度淋洗30分钟＋100％MeCN无梯度淋洗5分钟。所得纯度为96％(220nm)。
c)通过FAB技术的质谱M计算＝395，(M＋H+)实验＝396.0d)NMR(CDCl3)7.18(2H，d，J＝8Hz)7.09(2H，d，J＝8Hz)，5.54(1H，d，J＝11.2Hz)，4.44(1H，d，J＝8.3Hz)，3.69(1H，d，J＝11.2Hz)，3.57(1H，d，J＝11.2Hz)，3.75-3.98(4H，sb)，2.32(3H，s)，1.26-2.19(4H，sb)，1.46(9H，s).
步骤3)通过固相合成技术制备三肽，由1595mg Boc-Gly-OCH2-Pam-树脂(Neosystem，参考号RP00801)开始，其取代度为0.63mmol/g。操作规模为1.005mmol。
添加剩余氨基的基本方法如下1)用DCM洗涤5次，每次0.5分钟，使树脂溶涨；2)用存在于DCM中的40％TFA除去Boc基团，1×1分钟＋1×20分钟；3)用DCM洗涤，5×0.5分钟；4)通过茚三酮测试；5)用DMF洗涤，3×1分钟；6)偶联1.5小时；7)用DMF洗涤，3×1分钟；8)用DCM洗涤，5×0.5分钟；9)通过茚三酮测试。
当最后一步通过茚三酮测试呈阳性时，重复步骤5-8进行重偶联。
使用6当量DIEA、3当量Boc-氨基酸和3当量活化剂实现偶联，此时活化剂是PyAOp(7-氮杂苯并三唑-1-基-氧三(吡咯烷)鏻的六氟磷酸盐)。对于偶联γ-Glu，使用Boc-Glu-(α-OBzl)。
中止偶联程序，用HF/对甲酚(9∶1)在0℃下将所得的肽基树脂酸解1小时。经蒸发后，用无水EtOEt萃取固体残余物，并且通过用10％AcOH萃取来分离肽。通过蒸发将体积降低之后，将粗产物冻干并且通过如下方法表征
a)HPLC，5％-65％MeCN梯度淋洗30分钟。
b)通过电雾化技术的MSM计算＝377，(M＋H+)实验＝378.2。
通过氨基酸分析确定肽的量m＝329mg(0.873mmol)。在所有肽的定量分析中，向待水解样品中添加Ile(异亮氨酸)的外标。
按制备规模，通过HPLC纯化三肽(分两批)。所用的本系如下-柱C18，Nucleosyl，200×20mm，120，10μm-洗脱剂A＝H2O(+0.1％TFA)，B＝MeCN(+0.1％TFA)-梯度0％无梯度B淋洗40分钟+0-10％梯度B淋洗40分钟-流速25ml/分钟。
获得总量227mg(0.602mmol)的中间三肽，其表征为a)HPLC，5％-45％MeCN梯度淋洗20分钟。所得纯度为95％(220nm)。随着逐渐稀释所施加的样品，8.4分钟时的小峰以相对的比例降低，直至消失。因此，结论是其相应于三肽的聚集(并且未氧化)，因此被认为是有效的产物。
b)电雾化MSM计算＝377，(M＋H+)实验＝378.2。
步骤4)向14.2mg(0.38mmol)步骤3所获得的三肽的800μL 1NHCl溶液中添加76μL 0.5M NaNO2溶液。室温下在超声浴中搅拌1分钟，之后加入80μL 10N NaOH溶液。将所得的溶液冷冻并且冻干，所获得的固体表征为1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.90-8.50(2H，sb，NH)，5.35(1H，d，J＝10Hz，CH)，4.10-3.00(3H，sc，CH2，CH)，1.95-1.65(4H，sc，2CH2).
13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)172.18(CO-N)，171.21(CO-N)，168.40(CO-O)，63.03(CH2)，62.31(C)，59.56(CH)，53.19(CH)，41.20(CH2)，32.94(CH2)，31.71(CH2)，31.41(CH2)，27.12(CH2).HPLC(方法A)λ220nm(纯度94％)；λ334nm(纯度95％)。UVλ346nm ε(H2O)502cm-1mol-1L实施例5制备N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-2-(4-(4-S-亚硝基巯基-1-甲基-哌啶))乙酰基]-甘氨酸(5) 步骤1) 在100mL装有磁力搅拌器的玻璃烧瓶中，将6.4g(23mmol)2-氨基-2-[4-(4-巯基-l-甲基哌啶)]乙酸的二盐酸化物、4.3g(23mmol)α-溴-对二甲苯和40mL H2O/EtOH的1∶1混合物混合。加入13mL三乙胺，建立氩气环境，并且将混合物在室温下搅拌42小时。从所得溶液中减压除去溶剂并且向所获得的粗产物中加入20mL纯EtOH。滤出所得的固体，并且连续用纯EtOH和EtOEt洗涤，并且将其减压干燥。获得2.11g中间产物2-氨基-2-[4-(4-(对甲基苄基巯基)-1-甲基哌啶)]乙酸的盐酸化物。产率29.6％。
在D2O中记录NMR光谱并且取4.75ppm作为HDO的参照。
1H-NMR(200Mhz，D2O)7.28(2H，d，J＝8Hz，CHar)，7.15(2H，d，J＝8Hz，Char)，3.64-3.74(2H，sc，CH2-Car)，3.62(1H，s，CH-N)，3.4-3.1(4H，sc，CH2-N)，2.76(3H，s，CH3-N)，2.24(3H，s，CH3)，2.15-1.92(4H，sc，CH2).
13C-NMR(50Mhz，D2O)173.15(CO)，141.00(Car)，136.39(Car)，132.58(CHar)，131.95(CHar)，63.57(CH-N)，52.48(CH2)+，50.65(C)，45.66(CH3-N)，34.05(CH2)，32.35(CH2)，31.28(CH2)，22.77(CH3).
步骤2) 由1016mg(2.958mmol)前一步骤获得的中间体开始，并且按与实施例4之步骤2所述的方式获得1016mg(2.490mmol)N-Boc保护的中间体，其表征为a)CCF(流动相CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。Rf＝0.32，没有观察到起始原料的信号。
b)HPLC，10％-100％MeCN梯度淋洗30分钟，纯度为96％(220nm)。
c)通过FAB技术的质谱M计算＝408，(M＋H+)实验＝408.9d)通过电雾化技术的MS(M＋H+)实验＝409.3。
步骤3)由794mg上述提及的树脂开始，使用实施例4之步骤3所述的方法，获得三肽中间体。操作规模为0.5mmol。由于溶解Boc-衍生物困难，在上述的偶联反应中选择使用N-甲基吗啉作为碱(3当量)来代替DIEA。在掺入γGlu后，装配三肽并且通过上述相同的方式酸解破坏肽-树脂键。最后，在10％AcOH中获得粗产物，之后将其冻干并且定量分析。获得137mg(0.35lmmol)中间体三肽并且表征为a)HPLC，0％无梯度淋洗10分钟+5％-65％MeCN淋洗30分钟。看到乙酸溶液中的注射产物首先洗脱出来，这使得必须冻干等分部分以消除酸并且将冻干物重溶解于1mM HCl中。按此方式可以通过色谱观察肽并且在所用的梯度中于6.8分钟时洗脱出来。
b)通过电雾化技术的MSM计算＝390，(M＋H+)实验＝391.2。
按制备规模，通过HPLC纯化粗产物，使用实施例4中所述的参数。也施加0％的无梯度B淋洗40分钟，接着0-10％梯度B淋洗40分钟。按此方式，获得107mg(0.274mmol)的产物，其表征为a)HPLC，0％-0％梯度淋洗10分钟，加上0％-30％梯度淋洗20分钟。纯度94％(220nm)。证实在8.0分钟处的附加的峰也对应三肽的聚集，因此为正确产物。
b)通过电雾化的MSM计算＝390，(M＋H+)实验＝391.1。
步骤4)由10.0mg(0.026mmol)前述步骤获得的三肽中间体开始，使用52μL 0.5M NaNO2，按实施例4之步骤4所述进行亚硝基化。所获得的产物表征为13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)171.57(CO-N)，170.99(CO-N)，170.76(CO-N)，168.20(CO-O)，60.23(C)，59.53(CH)，51.57(CH)，49.02(CH2)，42.20(CH3)，41.59(CH2)，30.49(CH2)，29.75(CH2)，29.31(CH2)，26.05(CH2)HPLC(方法B)λ220nm(纯度74％)；λ334nm(纯度88％)。
UVλ346nm，ε(H2O)198cm-1mol-1L实施例6制备N[N-γ-L-谷氨酰基-2-胺-3-苄基-3-(-S-亚硝基巯基)-4-苯基丁酰基]-甘氨酸(6) 步骤1) 在100mL装有磁力搅拌器的玻璃烧瓶中，将1.25g(3.7mmol)2-氨基-3-苄基-3-巯基-4-苯基丁酸的二盐酸化物、0.68g(3.7mmol)α-溴-对二甲苯和40mL H2O/EtOH的1∶1混合物混合。加入1.6mL三乙胺，并且溶解大部分悬浮固体。建立氩气环境，并且将混合物在室温下搅拌24小时。减压除去乙醇和部分三乙胺。将所得的水悬浮液过滤并且获得白色固体。用CH3CN-H2O经反相柱色谱法纯化。在所得的固体上面添加100mL 1∶1的MeOH/HCl并且减压除去溶剂。获得0.5g中间产物2-氨基-3-苄基-3-(4-甲基苄基巯基)-4-苯基丁酸的盐酸化物。
1H-NMR(200Mhz，DMSO-d6)8.95-8.50(3H，sb，H3N+)，7.45-7.25(10H，sc，CHar)，7.08(2H，d，J＝10Hz，CHar)，6.98(2H，d，J＝10Hz，CHar)，4.05(1H，s，CH-N)，3.55-3.0(4H，sc，CH2-C6H5，CH2-Car)，2.90-2.60(2H，sc，CH2)，2.20(3H，s，CH3)13C-NMR(50Mhz，DMSO-d6)168.70(CO)，136.53(Car)，136.00(Car)，134.94(Car)，132.50(Car)，131.18(CHar)，129.169(CHar)，128.90(CHar)，128.26(CHar)，128.02(CHar)，127.07(CHar)，57.06(CH-N)，53.64(C)42.22(CH2)，41.65(CH2)，31.90(CH2S)，20.48(CH3).
步骤2) 由前面步骤中获得的两种馏分开始(纯度83％的馏分180mg，纯度94％的馏分530mg)，并且按实施例4之步骤2所述的方式进行，获得733mg(1.45mmol)N-Boc保护的产物，其表征为a)CCF(流动相CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。Rf＝0.63。
b) HPLC，10％-100％MeCN梯度淋洗30分钟，100％无梯度淋洗5分钟，纯度为91％(220nm)。
c)EM-MALDI-TOF(质谱)二羟基苯甲酸基质，M计算＝505，(M＋H+)实验＝528.585(M＋Na)d) NMR证实存在Boc基团。
步骤3)由0.43mmol上述提及的树脂开始，使用实施例4之步骤3所述的方法，获得三肽中间体。在酸解步骤之后，分离得到粗产物，其含有14.4mg(29.96μmol)三肽中间体，其表征为
a)HPLC分析，5％-65％梯度淋洗30分钟，纯度大约95％。
b)EM-电雾化M计算＝487(M＋H+)，M实验＝488.3。
步骤4)由5.7mg(0.012mmol)前述步骤获得的三肽中间体开始，使用24μL 0.5M NaNO2，按实施例4之步骤4所述进行亚硝基化。所获得的产物表征为HPLC(方法A)λ220nm，纯度68％；λ334nm，纯度86％。
UVλ345nm，ε(H2O)368cm-1mol-1L试验中所用的方法与以下参考文献中描述的基本上相同。
*Furchgot，R.F.″一氧化氮的研究方法(Methods in nitric oxideresearch)″，Feelisch & Stamier编，John Wiley & Sons，Chichester，England，pp 567-581*Trongvanichnam，K.等，日本药理学杂志(Jpn J.Pharmacol.)1996；71167-173*Salas，E.等，欧洲药理学杂志(Eur.J.Pharmacol.)1994；25847-55将化合物按5种浓度进行试验，以0.001至10mM的浓度范围，对每种化合物使用6-9个动脉环。将获得的结果与由S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)获得的结果进行比较，所说的S-亚硝基谷胱甘肽用作对照产物。
结果示于下表1中并且按CE50(有效浓度50)给出，其是各个受测试化合物使50％的动脉环产生血管舒张时的浓度，其中所说的动脉环预先用1μM去甲肾上腺素收缩。
可以看出，所有受测试化合物均具有有效的血管舒张活性，其活性类似或超过对照化合物(GSNO)的活性，并且化合物2的血管舒张活性远远优于对照产物的活性。实施例8抑制血小板凝集的体外试验试验中所用的方法与以下参考文献中描述的基本上相同。
*Loscalzo J.等，″一氧化氮的研究方法(Methods in nitric oxideresearch)″，Feelisch & Stamier编，John Wiley & Sons，Chichester，England.，pp 583-591*Radomski，MW等，英国药理学杂志(Br J.Pharmacol.)1987；92181-187*Salas，E.等，英国药理学杂志(Br.J.Pharmacol.)1994；1121071-1076测试4种不同浓度的化合物，使用5-23种不同供体的血小板。将所得结果与由S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)获得的结果进行比较，所说的S-亚硝基谷胱甘肽用作对照产物。
结果示于下表2中并且以CI50(抑制50的浓度)表达，其是各个测试化合物对用次最大胶原浓度(1μg/mL)获得的凝集产生50％抑制时的浓度。
正如表2中看出的，所有测试化合物对血小板凝集均具有有效的抑制活性，其活性类似或超过对照化合物(GSNO)的活性，并且化合物1和5的血小板凝集抑制活性远远优于对照产物的活性。实施例9增加血小板内GMPc含量的体外试验对实施例5获得的化合物5进行体外试验，测试其在人分离血小板制剂中增加血小板内GMPc含量的能力。
本试验中使用的方法与实施例8中所提及的参考文献中描述的方法基本上相同。
使用来自5种不同供体的血小板测试4种不同浓度的化合物。将所得的结果与GSNO(对照产物)的结果及基本值比较。结果示于下表3中，以pmol/109血小板表达。
化合物5以与GSNO对照物类似的方式增加血小板内GMP含量。应当注意对接近于IC50的值来说，化合物5引发的GMPc含量低于GSNO当其在接近于其IC50的浓度下使用时引发的GMPc含量。实施例10阻滞血小板凝集抑制的体外试验本试验中使用的方法与实施例8中所提及的参考文献中描述的方法基本上相同，以及参考文献*Moro MA等，Pr Nat Acad Sc USA.1996；931480-5。
体外测试ODQ对所得产物在人分离血小板制剂中所达到的血小板凝集抑制作用的阻滞。
测试3种不同浓度的实施例5获得的化合物5，在ODQ(1μM)的存在下或没有ODQ的存在，使用5种不同供体的血小板。将所得的结果与GSNO(对照产物)的结果及不存在ODQ时的值比较。结果示于表4和5并且以最大凝集抑制百分比来表达。
当使用IC50浓度的化合物时，ODQ(1μM)能够阻滞GSNO和化合物5的抑制效果。在比IC50高的浓度下，化合物5凝集抑制效果比对照产物更好地受到阻滞。
权利要求
1.青霉胺或谷胱甘肽的S-亚硝基硫醇衍生物及其药用盐，该化合物具有以下通式(I) 其中A和B是苯基或一起形成构成六元环的残基-CH2-Q-CH2-，其中Q表示氧原子、硫原子或基团N-R3，其中R3是氢或C1-C4烷基；R1是酰基残基，其可以是C1-C5脂族酰基，或者是通过其非氨基酸羧基连接的谷氨酸的残基；R2是羟基或通过肽键连接的甘氨酸残基；前提条件是如果R1是脂族酰基残基，则R2是羟基，并且如果R1是谷氨酸的残基，则R2是甘氨酸残基。
2.权利要求1的S-亚硝基硫醇，其具有以下通式(II) 其中A和B具有如上所述的含义，并且R4是C1-C4烷基。
3.权利要求1或2任一项的S-亚硝基硫醇，其为N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-S-亚硝基巯基四氢吡喃)]乙酸(1)。
4.权利要求1或2任一项的S-亚硝基硫醇，其是N-乙酰基-2-氨基-2-[4-(4-S-亚硝基巯基-1-甲基哌啶)]乙酸(2)。
5.权利要求1或2任一项的S-亚硝基硫醇，其是N-乙酰基-2-氨基-3-苄基-3-S-亚硝基巯基-4-苯基-丁酸(3)。
6.权利要求1的S-亚硝基硫醇，其具有以下通式(III) 其中A和B具有如上所述的含义。
7.权利要求1或6任一项的S-亚硝基硫醇，其是N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-2-(4-(4-S-亚硝基巯基)四氢吡喃))乙酰基]-甘氨酸(4)。
8.权利要求1或6任一项的S-亚硝基硫醇，其是N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-2(4-(4-S-亚硝基巯基-1-甲基-哌啶))乙酰基]-甘氨酸(5)。
9.权利要求1或6任一项的S-亚硝基硫醇，其是N[N-γ-L-谷氨酰基-2-氨基-3-苄基-3-(-S-亚硝基巯基)-4-苯基丁酰基]-甘氨酸(6)。
10.上述权利要求任一项的S-亚硝基硫醇在制备治疗循环系统机能障碍的药物中的用途。
11.权利要求10的用途，用于制备治疗心血管系统机能障碍的药物。
全文摘要
本发明涉及通式(I)的衍生自青霉胺或谷胱甘肽的新型S－亚硝基硫醇,其中A和B是苯基或一起形成构成六元环的基团－CH
文档编号A61P9/10GK1337946SQ00803084
公开日2002年2月27日 申请日期2000年1月19日 优先权日1999年1月27日
发明者何塞·雷波列斯·莫利纳, 爱德华多·萨拉斯·佩雷斯－拉西利亚, 弗朗西斯科·普比尔·科伊, 胡安－安东尼奥·塞尔达－瑞达沃兹, 克里斯蒂纳·内格里·罗弗斯, 莉迪亚·卡韦萨·略伦特, 艾丽西亚·费雷尔·西索, 努里亚·特里亚斯·阿德罗埃尔, 马尔切利·卡尔沃·巴纽斯, 赫苏斯·缪拉·莫雷诺, 佩德罗·米切莱纳·利亚古诺 申请人:雷瑟尔股份有限公司
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