一种甲基杆菌及其应用的制作方法
一种甲基杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了甲基杆菌，其分类命名为甲基杆菌(Methylobacterium?sp.)YCA-02，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC?No.8389，保藏日期为2013年10月24日。本发明一种甲基杆菌(Methylobacterium?sp.)YCA-02具有较广的降解谱，能使土壤中乙草胺的残留量降低90％以上，成功地解决了农业生产中农药残留超标和除草剂药害问题，保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求；适合在全国粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用；对于保护生态环境，保护人类的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。本发明一种甲基杆菌Methylobacterium?sp.)YCA-02培养条件简单、生产使用成本低，容易保存，使用方便，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
【专利说明】一种甲基杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，尤其涉及一种甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02及其在乙草胺降解中的应用。
【背景技术】
[0002]乙草胺是美国孟山都公司1971年开发的一种新型酰胺类除草剂，作为该类除草剂早期开发的品种，乙草胺占酰胺类除草剂当前销售量的最大份额，是目前世界上最重要的除草剂品种之一，也是目前我国使用量仅次于草甘磷的第二大类除草剂。可广泛用于玉米、水稻、甘蔗、花生、棉花、大豆、烟草、蔬菜等农作物芽前土壤处理和防除田间牛筋草、稗草、冤丝子、马唐、狗尾草、秋棱、马齿觅、臂形草、黎、鸭拓草、觅、紫香附子禾本科杂草和部分小粒种子的阔叶杂草。
[0003]进入环境的乙草胺及其代谢产物通过食物链在生物体内不断富集，可能会给哺乳动物、食草鸟类及水生生物带来不育、癌症和遗传病等严重的健康问题和环境问题。目前，国内外有关乙草胺在环境中降解动态方面的研究不多，而生物修复技术因微生物本身能对各类不同的有机污染物进行降解和转化而具有巨大的潜力。因此，从自然环境中筛选得到能够去除乙草胺的有效菌种具有重大的意义。
【发明内容】
[0004]发明目的:为了克服现有技术的不足，本发明的第一目的在于提供一种对乙草胺具有降解作用的甲基杆菌。
[0005]本发明的第二目的在于提供一种甲基杆菌在乙草胺降解中的应用。
[0006]技术方案:为了解决上述第一目的，本发明所采用的技术方案为:一种甲基杆菌，其分类命名为甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保藏编号为=CGMCC N0.8389，保藏日期为2013年10月24日。
[0007]为了解决上述的第二目的，本发明所采用的技术方案为:所述甲基杆菌在乙草胺降解中的应用。
[0008]具体应用为:
[0009](I)将降解乙草胺残留的甲基杆菌YCA-02的试管种接种于LB培养基中，振荡培养至对数期；
[0010](2)将步骤(I)培养好的菌种按10%的接种量接种入500L的种子罐，无菌空气的通气量为1:0.6-1:1.2，搅拌速度为180-240r/min，培养温度为30-35°C，培养时间为60h，培养至对数生长期，得到种子液；
[0011](3)将步骤(2)所得到种子液按10%的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，无菌空气的通气量为1:0.6-1:1.2，搅拌速度为180-240r/min，培养温度为30_35°C，培养时间为60h，发酵完成后的培养液即为应用于乙草胺降解中的甲基杆菌。
[0012]更进一步的，所述步骤(I)中LB培养基的配方为:1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨 10.0g,氯化钠 10.0g, pH7.0。
[0013]更进一步的，所述步骤(2)中种子罐所用培养基的配方为:葡萄糖0.8%，(NH4)2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值 7.2-7.5。
[0014]本发明中所述的甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02的生理活性特征如下:
[0015]所述甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02主要生物学特性为G-,无芽孢,无鞭毛，卵圆形，LB培养基上菌落成圆形，突起，边缘整齐，干燥，不透明，接触酶阳性，不能水解淀粉。
[0016]有益效果:与现有技术相比，本发明的优点是:
[0017](I)本发明公开的一种甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02具有较广的降解谱，能使土壤中乙草胺的残留量降低90%以上，可在农作物的生长过程中正常使用化学农药进行病虫害防治的同时保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求；适合在全国粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。本发明成功地解决了农业生产中农药残留超标和除草剂药害问题，既充分发挥了化学农药在植物病虫草害防治中的高效快速的作用，又可以生产出无毒无公害的绿色农产品。
[0018](2)甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02培养条件简单、生产使用成本低,容易保存，使用方便，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明菌株YCA-02菌体结晶紫染色照片(IOOOx)；
[0020]图2为本发明菌株YCA-02对乙草胺的摇瓶降解试验结果示意图；
[0021]图3为本发明使用菌株YCA-02进行田间试验对乙草胺降解结果示意图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实验例详细阐述本发明甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA_02的应用。
[0023]甲基杆菌(Methylobacterium sp.) YCA-02的筛选、分离和鉴定:
[0024](I)取从生产乙草胺的某农药厂生产车间的废水处理池中得到的活性污泥3.0mL加入乙草胺浓度为100mg/L的IOOmL无机盐液体培养中，其配方为:IOOOmL蒸懼水、1.50gΚ2ΗΡ04、0.50g ΚΗ2Ρ04、0.20g MgSO4.7Η20、1.00g NaClU.00g (NH4) 2S04，ρΗ7.0，于 160r/min，30°C条件下振荡培养，每隔5天按3%的接种量转接到新鲜的无机盐培养基中，连续转接5次；
[0025](2)取上面得到的富集菌液1.0mL，加入9.0mL无菌水中，配成KT1的富集液，再吸取1.0mL配好的KT1的富集液加入9.0mL无菌水中，充分混匀配成10_2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1mL涂布于含乙草胺的浓度为IOOmg/L无机盐固体培养基(培养基配方为:1000mL蒸馏水、1.50g Κ2ΗΡ04、0.50gKH2P04、0.20gMgSO4.7Η20、1.0Og NaClU.0Og (NH4) 2S04, 20.0Og 琼脂，ρΗ7.0)上，30°C培养 7 天；
[0026](3) 7天后从上述无机盐固体培养基上挑取单菌落，于3.0mL的LB液体培养基中培养24小时后，LB液体培养基配方为:1000mL蒸馏水、NaCl 10.00g、蛋白胨10.00g、酵母粉
5.00g、pH7.0于8000r/min的条件下离心2min,倒去上清液,加入3.0mL的无菌水摇勻,仍于8000r/min的条件下离心2min,按此方法用无菌水洗两遍后,加入3.0mL无菌水重悬该菌。吸取1.0mL该菌液加入IOOmL乙草胺浓度为100mg/L的无机盐液体培养基中，于160r/min，30°C条件下振荡培养7天后，用高效液相色谱测其降解效果。将降解效率较高的一株囷株保存，进行后续实验；
[0027](4)将降解菌株接种于LB固体培养基上，其配方为:1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g,蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，pH7.0 ;30°C恒温培养48h后观察菌落形态，用光学显微镜观察菌体形态(1000X)。菌株的生理生化鉴定按照《常见细菌系统鉴定手册》进行。鉴定为甲基杆菌属(Methylobacterium sp.);命名为:YCA_02。其结晶紫染色照片如图1所示，主要生物学特性为G-，无芽孢，无鞭毛，卵圆形，LB培养基上菌落成圆形，突起，边缘整齐，干燥，不透明，接触酶阳性，不能水解淀粉。
[0028]将甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02进行摇瓶试验,检验其对乙草胺的降解效果:
[0029]在含100mg/L乙草胺的无机盐培养基中，其配方为:IOOOmL蒸懼水、1.50g Κ2ΗΡ04、0.50g ΚΗ2Ρ04、0.20g MgSO4.7Η20、1.00g NaClU.0Og(NH4)2SO4, ρΗ7.0，按 3% 的接种量接种YCA-02，于30°C振荡培养，48小时取样测定。与空白相比，如图2所示，处理样品的吸收峰明显下降，乙草胺被降解90%以上。
[0030]甲基杆菌(Methylobacterium sp.) YCA-02在乙草胺降解中的应用:
[0031]实施例1:
[0032](I)将甲基杆菌YCA-02的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mL LB培养基的IOOOmL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期；其中LB培养基的配方为:1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g, pH7.0 ；
[0033](2)准备接种种子罐，种子罐500升，投料量400升，其中培养基配方为:葡萄糖0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值7.2。投料完毕后121°C高压湿热灭菌，冷却至30°C后，培养60h，将上述培养好的摇瓶菌种按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为180r/min，无菌空气通入量为1:0.6 ;
[0034](3)将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1 kg/cm2的压力下，121°C高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35°C以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在30°C，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6，搅拌速度为180r/min，培养60h。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，即为应用于乙草胺降解中的菌剂。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
[0035]实施例2:[0036](I)将甲基杆菌YCA-02的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mL LB培养基的IOOOmL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期；其中LB培养基的配方为:1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g, pH7.0 ；
[0037](2)准备接种种子罐，种子罐500升，投料量400升，其中培养基配方为:葡萄糖
0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值7.5。投料完毕后121°C高压湿热灭菌，冷却至35°C后，培养60h，将上述培养好的摇瓶菌种按10 %的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为240r/min，无菌空气通入量为1:1.2 ;
[0038](3)将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1 kg/cm2的压力下，121°C高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35°C以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在35°C，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.2，搅拌速度为240r/min，培养60h。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，即为应用于乙草胺降解中的菌剂。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
[0039]实施例3:
[0040](I)将甲基杆菌YCA-02的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mL LB培养基的IOOOmL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期；其中LB培养基的配方为:1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g, pH7.0 ；
[0041](2)准备接种种子罐，种子罐500升，投料量400升，其中培养基配方为:葡萄糖
0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值
7.4。投料完毕后121°C高压湿热灭菌，冷却至33°C后，培养60h，将上述培养好的摇瓶菌种按10 %的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220r/min，无菌空气通入量为1:0.9 ;
[0042](3)将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1 kg/cm2的压力下，121°C高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35°C以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在33°C，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.9，搅拌速度为220r/min，培养60h。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，即为应用于乙草胺降解中的菌剂。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
[0043]甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02在田间试验中对乙草胺降解的应用:
[0044]对此耕作土壤施用乙草胺原药，使乙草胺初始浓度为50mg/kg，搅拌均匀，喷施含lg/L的葡萄糖水溶液使其含水量达到饱和含水量的60%。然后将1#田平均划分为6块，向其中3块分别加入实施例2制备的菌剂60g ;另外3块分别加入同体积的灭菌处理(121°C，30min)的实施例2制备的菌剂。共两种处理，每个处理均是三个重复。分别于5d、10d、15d、20d、25d、30d后取样测定乙草胺在土壤中的降解率。如图3所示，加入菌体后，加入未灭活的菌剂的土壤中乙草胺降解明显，降解率可达90%，加入灭活后的菌剂的土壤中乙草胺没有明显降解。[0045] 本发明一种甲基杆菌(Methylobacterium sp.) YCA-O2可直接用于田间土壤中对乙草胺降解，成功地解决了农业生产中农药残留超标和除草剂药害问题，既充分发挥了化学农药在植物病虫草害防治中的高效快速的作用，又可以生产出无毒无公害的绿色农产品O
【权利要求】
1.一种甲基杆菌，其分类命名为甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCC N0.8389，保藏日期为2013年10月24日。
2.权利要求1所述的甲基杆菌在乙草胺降解中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用以下生产流程得到应用于乙草胺降解中的甲基杆菌: (1)将降解乙草胺残留的甲基杆菌YCA-02的试管种接种于LB培养基中，振荡培养至对数期； (2)将步骤(I)培养好的菌种按10%的接种量接种入500L的种子罐，无菌空气的通气量为1:0.6-1:1.2，搅拌速度为180-240r/min，培养温度为30_35°C，培养时间为60h，培养至对数生长期，得到种子液； (3)将步骤(2)所得到种子液按10%的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，无菌空气的通气量为1:0.6-1:1.2，搅拌速度为180-240r/min,培养温度为30-35°C,培养时间为60h,发酵完成后的培养液即为应用于乙草胺降解中的甲基杆菌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述步骤(I)中LB培养基的配方为:IOOOmL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g, pH7.0。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述步骤(2)中种子罐所用培养基的配方为:葡萄糖 0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏.0.02%, pH 值 7.2-7.5。
【文档编号】A62D101/28GK103834595SQ201410084284
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】马爱军, 何任红, 张小华 申请人:江苏农林职业技术学院
【专利摘要】本发明公开了甲基杆菌，其分类命名为甲基杆菌(Methylobacterium?sp.)YCA-02，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC?No.8389，保藏日期为2013年10月24日。本发明一种甲基杆菌(Methylobacterium?sp.)YCA-02具有较广的降解谱，能使土壤中乙草胺的残留量降低90％以上，成功地解决了农业生产中农药残留超标和除草剂药害问题，保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求；适合在全国粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用；对于保护生态环境，保护人类的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。本发明一种甲基杆菌Methylobacterium?sp.)YCA-02培养条件简单、生产使用成本低，容易保存，使用方便，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
【专利说明】一种甲基杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，尤其涉及一种甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02及其在乙草胺降解中的应用。
【背景技术】
[0002]乙草胺是美国孟山都公司1971年开发的一种新型酰胺类除草剂，作为该类除草剂早期开发的品种，乙草胺占酰胺类除草剂当前销售量的最大份额，是目前世界上最重要的除草剂品种之一，也是目前我国使用量仅次于草甘磷的第二大类除草剂。可广泛用于玉米、水稻、甘蔗、花生、棉花、大豆、烟草、蔬菜等农作物芽前土壤处理和防除田间牛筋草、稗草、冤丝子、马唐、狗尾草、秋棱、马齿觅、臂形草、黎、鸭拓草、觅、紫香附子禾本科杂草和部分小粒种子的阔叶杂草。
[0003]进入环境的乙草胺及其代谢产物通过食物链在生物体内不断富集，可能会给哺乳动物、食草鸟类及水生生物带来不育、癌症和遗传病等严重的健康问题和环境问题。目前，国内外有关乙草胺在环境中降解动态方面的研究不多，而生物修复技术因微生物本身能对各类不同的有机污染物进行降解和转化而具有巨大的潜力。因此，从自然环境中筛选得到能够去除乙草胺的有效菌种具有重大的意义。
【发明内容】
[0004]发明目的:为了克服现有技术的不足，本发明的第一目的在于提供一种对乙草胺具有降解作用的甲基杆菌。
[0005]本发明的第二目的在于提供一种甲基杆菌在乙草胺降解中的应用。
[0006]技术方案:为了解决上述第一目的，本发明所采用的技术方案为:一种甲基杆菌，其分类命名为甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保藏编号为=CGMCC N0.8389，保藏日期为2013年10月24日。
[0007]为了解决上述的第二目的，本发明所采用的技术方案为:所述甲基杆菌在乙草胺降解中的应用。
[0008]具体应用为:
[0009](I)将降解乙草胺残留的甲基杆菌YCA-02的试管种接种于LB培养基中，振荡培养至对数期；
[0010](2)将步骤(I)培养好的菌种按10%的接种量接种入500L的种子罐，无菌空气的通气量为1:0.6-1:1.2，搅拌速度为180-240r/min，培养温度为30-35°C，培养时间为60h，培养至对数生长期，得到种子液；
[0011](3)将步骤(2)所得到种子液按10%的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，无菌空气的通气量为1:0.6-1:1.2，搅拌速度为180-240r/min，培养温度为30_35°C，培养时间为60h，发酵完成后的培养液即为应用于乙草胺降解中的甲基杆菌。
[0012]更进一步的，所述步骤(I)中LB培养基的配方为:1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨 10.0g,氯化钠 10.0g, pH7.0。
[0013]更进一步的，所述步骤(2)中种子罐所用培养基的配方为:葡萄糖0.8%，(NH4)2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值 7.2-7.5。
[0014]本发明中所述的甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02的生理活性特征如下:
[0015]所述甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02主要生物学特性为G-,无芽孢,无鞭毛，卵圆形，LB培养基上菌落成圆形，突起，边缘整齐，干燥，不透明，接触酶阳性，不能水解淀粉。
[0016]有益效果:与现有技术相比，本发明的优点是:
[0017](I)本发明公开的一种甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02具有较广的降解谱，能使土壤中乙草胺的残留量降低90%以上，可在农作物的生长过程中正常使用化学农药进行病虫害防治的同时保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求；适合在全国粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。本发明成功地解决了农业生产中农药残留超标和除草剂药害问题，既充分发挥了化学农药在植物病虫草害防治中的高效快速的作用，又可以生产出无毒无公害的绿色农产品。
[0018](2)甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02培养条件简单、生产使用成本低,容易保存，使用方便，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明菌株YCA-02菌体结晶紫染色照片(IOOOx)；
[0020]图2为本发明菌株YCA-02对乙草胺的摇瓶降解试验结果示意图；
[0021]图3为本发明使用菌株YCA-02进行田间试验对乙草胺降解结果示意图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实验例详细阐述本发明甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA_02的应用。
[0023]甲基杆菌(Methylobacterium sp.) YCA-02的筛选、分离和鉴定:
[0024](I)取从生产乙草胺的某农药厂生产车间的废水处理池中得到的活性污泥3.0mL加入乙草胺浓度为100mg/L的IOOmL无机盐液体培养中，其配方为:IOOOmL蒸懼水、1.50gΚ2ΗΡ04、0.50g ΚΗ2Ρ04、0.20g MgSO4.7Η20、1.00g NaClU.00g (NH4) 2S04，ρΗ7.0，于 160r/min，30°C条件下振荡培养，每隔5天按3%的接种量转接到新鲜的无机盐培养基中，连续转接5次；
[0025](2)取上面得到的富集菌液1.0mL，加入9.0mL无菌水中，配成KT1的富集液，再吸取1.0mL配好的KT1的富集液加入9.0mL无菌水中，充分混匀配成10_2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1mL涂布于含乙草胺的浓度为IOOmg/L无机盐固体培养基(培养基配方为:1000mL蒸馏水、1.50g Κ2ΗΡ04、0.50gKH2P04、0.20gMgSO4.7Η20、1.0Og NaClU.0Og (NH4) 2S04, 20.0Og 琼脂，ρΗ7.0)上，30°C培养 7 天；
[0026](3) 7天后从上述无机盐固体培养基上挑取单菌落，于3.0mL的LB液体培养基中培养24小时后，LB液体培养基配方为:1000mL蒸馏水、NaCl 10.00g、蛋白胨10.00g、酵母粉
5.00g、pH7.0于8000r/min的条件下离心2min,倒去上清液,加入3.0mL的无菌水摇勻,仍于8000r/min的条件下离心2min,按此方法用无菌水洗两遍后,加入3.0mL无菌水重悬该菌。吸取1.0mL该菌液加入IOOmL乙草胺浓度为100mg/L的无机盐液体培养基中，于160r/min，30°C条件下振荡培养7天后，用高效液相色谱测其降解效果。将降解效率较高的一株囷株保存，进行后续实验；
[0027](4)将降解菌株接种于LB固体培养基上，其配方为:1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g,蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，pH7.0 ;30°C恒温培养48h后观察菌落形态，用光学显微镜观察菌体形态(1000X)。菌株的生理生化鉴定按照《常见细菌系统鉴定手册》进行。鉴定为甲基杆菌属(Methylobacterium sp.);命名为:YCA_02。其结晶紫染色照片如图1所示，主要生物学特性为G-，无芽孢，无鞭毛，卵圆形，LB培养基上菌落成圆形，突起，边缘整齐，干燥，不透明，接触酶阳性，不能水解淀粉。
[0028]将甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02进行摇瓶试验,检验其对乙草胺的降解效果:
[0029]在含100mg/L乙草胺的无机盐培养基中，其配方为:IOOOmL蒸懼水、1.50g Κ2ΗΡ04、0.50g ΚΗ2Ρ04、0.20g MgSO4.7Η20、1.00g NaClU.0Og(NH4)2SO4, ρΗ7.0，按 3% 的接种量接种YCA-02，于30°C振荡培养，48小时取样测定。与空白相比，如图2所示，处理样品的吸收峰明显下降，乙草胺被降解90%以上。
[0030]甲基杆菌(Methylobacterium sp.) YCA-02在乙草胺降解中的应用:
[0031]实施例1:
[0032](I)将甲基杆菌YCA-02的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mL LB培养基的IOOOmL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期；其中LB培养基的配方为:1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g, pH7.0 ；
[0033](2)准备接种种子罐，种子罐500升，投料量400升，其中培养基配方为:葡萄糖0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值7.2。投料完毕后121°C高压湿热灭菌，冷却至30°C后，培养60h，将上述培养好的摇瓶菌种按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为180r/min，无菌空气通入量为1:0.6 ;
[0034](3)将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1 kg/cm2的压力下，121°C高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35°C以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在30°C，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6，搅拌速度为180r/min，培养60h。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，即为应用于乙草胺降解中的菌剂。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
[0035]实施例2:[0036](I)将甲基杆菌YCA-02的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mL LB培养基的IOOOmL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期；其中LB培养基的配方为:1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g, pH7.0 ；
[0037](2)准备接种种子罐，种子罐500升，投料量400升，其中培养基配方为:葡萄糖
0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值7.5。投料完毕后121°C高压湿热灭菌，冷却至35°C后，培养60h，将上述培养好的摇瓶菌种按10 %的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为240r/min，无菌空气通入量为1:1.2 ;
[0038](3)将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1 kg/cm2的压力下，121°C高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35°C以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在35°C，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.2，搅拌速度为240r/min，培养60h。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，即为应用于乙草胺降解中的菌剂。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
[0039]实施例3:
[0040](I)将甲基杆菌YCA-02的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mL LB培养基的IOOOmL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期；其中LB培养基的配方为:1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g, pH7.0 ；
[0041](2)准备接种种子罐，种子罐500升，投料量400升，其中培养基配方为:葡萄糖
0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值
7.4。投料完毕后121°C高压湿热灭菌，冷却至33°C后，培养60h，将上述培养好的摇瓶菌种按10 %的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220r/min，无菌空气通入量为1:0.9 ;
[0042](3)将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1 kg/cm2的压力下，121°C高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35°C以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在33°C，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.9，搅拌速度为220r/min，培养60h。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，即为应用于乙草胺降解中的菌剂。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
[0043]甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02在田间试验中对乙草胺降解的应用:
[0044]对此耕作土壤施用乙草胺原药，使乙草胺初始浓度为50mg/kg，搅拌均匀，喷施含lg/L的葡萄糖水溶液使其含水量达到饱和含水量的60%。然后将1#田平均划分为6块，向其中3块分别加入实施例2制备的菌剂60g ;另外3块分别加入同体积的灭菌处理(121°C，30min)的实施例2制备的菌剂。共两种处理，每个处理均是三个重复。分别于5d、10d、15d、20d、25d、30d后取样测定乙草胺在土壤中的降解率。如图3所示，加入菌体后，加入未灭活的菌剂的土壤中乙草胺降解明显，降解率可达90%，加入灭活后的菌剂的土壤中乙草胺没有明显降解。[0045] 本发明一种甲基杆菌(Methylobacterium sp.) YCA-O2可直接用于田间土壤中对乙草胺降解，成功地解决了农业生产中农药残留超标和除草剂药害问题，既充分发挥了化学农药在植物病虫草害防治中的高效快速的作用，又可以生产出无毒无公害的绿色农产品O
【权利要求】
1.一种甲基杆菌，其分类命名为甲基杆菌(Methylobacterium sp.)YCA-02,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCC N0.8389，保藏日期为2013年10月24日。
2.权利要求1所述的甲基杆菌在乙草胺降解中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用以下生产流程得到应用于乙草胺降解中的甲基杆菌: (1)将降解乙草胺残留的甲基杆菌YCA-02的试管种接种于LB培养基中，振荡培养至对数期； (2)将步骤(I)培养好的菌种按10%的接种量接种入500L的种子罐，无菌空气的通气量为1:0.6-1:1.2，搅拌速度为180-240r/min，培养温度为30_35°C，培养时间为60h，培养至对数生长期，得到种子液； (3)将步骤(2)所得到种子液按10%的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，无菌空气的通气量为1:0.6-1:1.2，搅拌速度为180-240r/min,培养温度为30-35°C,培养时间为60h,发酵完成后的培养液即为应用于乙草胺降解中的甲基杆菌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述步骤(I)中LB培养基的配方为:IOOOmL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g, pH7.0。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述步骤(2)中种子罐所用培养基的配方为:葡萄糖 0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏.0.02%, pH 值 7.2-7.5。
【文档编号】A62D101/28GK103834595SQ201410084284
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】马爱军, 何任红, 张小华 申请人:江苏农林职业技术学院
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