一种酰胺类化合物降解酶ace123、编码基因及应用的制作方法
一种酰胺类化合物降解酶ace123、编码基因及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种酰胺类化合物降解酶ACE123、编码基因及降解酰胺类化合物的应用，所述降解酶ACE123的氨基酸序列为SEQ?ID?No.1所示；本发明所提供的酰胺类化合物降解酶ACE123具有高效且广谱降解酰胺类化合物的能力，为酰胺类化合物污染的修复提供了可靠的途径。所述基因的提出为酰胺类污染物高效降解工程菌株的构建提供基础。
【专利说明】—种酰胺类化合物降解酶ACE123、编码基因及应用
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酰胺类化合物降解酶ACE123、编码基因及应用。
(二)【背景技术】
[0002]酰胺类化合物是指氨或胺的氮原子上的氢被酰基取代后生成的化合物。酰胺也可以看作羧酸分子中的羟基被氨基或胺苯基取代后生成的化合物。常见的有甲酰胺(HCO-NH2)，乙酰胺[CH3-CO-NH2]，碳酰胺[CO-(NH2)2]等。比如酰胺类除草剂就是一类典型的酰胺类化合物。该类除草剂种类繁多，以含有酰胺基的除草剂品种而言，已达50余种；在全世界的年产量、应用范围和使用面积仅次于有机磷除草剂，居第2位。在国际市场中，销量最大的酰胺类除草剂品种是乙草胺、丁草胺、甲草胺，占该类除草剂总产量的96%。从结构分，酰胺类除草剂又可分为苯氧丙酰胺、烃基酰胺、芳基酰胺、磺酰胺和氯乙酰胺等。酰胺类除草剂具有中等到较高的水溶性及相对较低的土壤吸附常数，所以施到农田的酰胺类除草剂，容易通过渗透转移到浅层地下水或随雨水径流进入地表水而造成环境污染。酰胺类除草剂的除草效果好，但同时也给环境安全带来了严重的威胁，所以寻求一种有效的对酰胺类化合物污染治理技术显得十分必要且紧迫。
[0003]微生物法处理有机化合物污染以其廉价、无二次污染等优点为多数学者所提倡，而现阶段多数研究集中在筛选出可以降解某一种该类化合物的菌株及其降解特性上，对降解这一类化合物分子机制的研究较少。本发明从一株菌株中克隆出可以断裂酰胺键酶的编码基因，该基因具有新颖 性。利用常规技术方法，设计引物，构建了表达载体，纯化出了一种酰胺酶，该酶对乙草胺等酰胺类化合物具有较高的活性，可以有效的去除该类污染物或者用于对该类物质的绿色转化；所述新的酰胺酶基因为构建更高效且广谱的酰胺类污染物降解工程菌提供了保障。
(三)
【发明内容】
[0004]本发明目的是提供一种对酰胺类化合物具有广谱且高效降解能力的酶ACE123及其编码基因；同时提供该酰胺类化合物降解酶的应用。
[0005]本发明米用的技术方案是:本发明提供一种来源于申氏杆菌(Shinella sp.)HZA2的酰胺类化合物降解酶ACE123，所述降解酶ACE123的氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示。
[0006]由于氨基酸序列的特殊性，任何SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
[0007]本发明还涉及一种所述酰胺类化合物降解酶ACE123的编码基因acel23，所述编码基因acel23的核苷酸序列为SEQ ID N0.2所示。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ IDN0.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。
[0008]本发明涉及一种含有所述编码基因acel23的重组载体。
[0009]本发明提供一种用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
[0010]本发明所述酰胺类化合物降解酶ACE123的编码基因acel23在制备重组酰胺类化合物降解酶ACE123中的应用，具体所述的应用为:构建含有所述编码基因acel23的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组酰胺类化合物降解酶ACE123的菌体细胞。
[0011]本发明的要点在于提供了 SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列和SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，在已知该核苷酸序列和氨基酸序列的情况下，该核苷酸序列和氨基酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。
[0012]本发明还提供一种所述酰胺类化合物降解酶ACE123在降解酰胺类化合物中的应用，所述的应用为:
[0013](I)将含有酰胺类化合物降解酶ACE123编码基因的重组基因工程菌接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基，32~37°C培养8h后，以体积比1:50的接种量转接到IOOmL含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，32~37°C培养至OD6tltl达到0.5，加入IPTG (即异丙基硫代半乳糖苷)并使其终浓度为0.3~0.5mM,20~25°C诱导培养8~12h，诱导培养结束后将培养液离心，收集湿菌体，再将湿菌体超声破碎，离心，取上清液利用N1-NTA纯化树脂分离纯化，收集流出液，流出液减压浓缩去除洗脱剂，获得酰胺类化合物降解酶ACE123 ;(2)以酰胺类化合物为底物，以步骤(1)制备的酰胺类化合物降解酶ACE123为催化剂，于pH值为8的PBS缓冲液中构成转化体系，在37°C下转化反应2h，向反应液中添加质量浓度6mol/L的盐酸水溶液(盐酸水溶液的用量对本发明没有影响，能够抑制酶活即可，通常优选加入反应液体积的0.1~0.5倍)终止反应，将反应液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层获得含有降解产物的混合液，将混合液提纯(根据底物和产物的种类，采用本领域公知的分离提取方法进行)，获得降解产物。
[0014]本发明在37°C下转化反应2h后，向反应液中加入6mol/L的盐酸水溶液终止反应，然后乙酸乙酯萃取三次，取乙酸乙酯层用氮气吹干后无水甲醇定容至1ml，采用HPLC方法检测降解产物含量。HPLC检测条件:流动相为V (CH3OH): V (H2O) =80: 20，分析柱为Grace Alltima C18Column (4.6mmX 250mm, 5 μ m),检测波长 279nm,柱温 30°C，流速 0.8mT,/min,进样量20 μ L。
[0015]进一步，优选所述酰胺类化合物为对乙酰氨基酚、2-乙基-6甲基一N-乙氧基甲基-α -氯代乙酰替苯胺、N-(3’，4’ - 二氯苯基)丙酰胺或3-氯氨基甲酸异丙基酯。
[0016]进一步,优选所述反应体系中，底物的初始浓度为10mg/L,催化剂用量为lmg/L。
[0017]进一步，步骤(1)所述分离纯化的方法为:重组蛋白可通过N1-NTAResin(Novagen)进行纯化。将上清液加到纯化柱子，调节样品下流的流速为lmL/min,上样开始后，收集过滤液，保存(如果目的蛋白结合到柱子上较少，则部分存在于穿过液中，可重复过柱子)。依次用20倍柱床体积的结合液、咪唑终浓度为20mM的结合液、咪唑终浓度为40mM的结合液洗涤柱床，关闭流速阀，加入10倍柱床体积的咪唑浓度为300mM的结合液，搅动柱床，浸泡20min，打开流速阀，收集流出液，将流出液减压浓缩去除洗脱剂，获得纯化后的蛋白，即为酰胺类化合物降解酶ACE123。所述结合液为25mL的4M的NaCl水溶液，4mL的IMTris水溶液(pH8)和ImL的IM的咪唑水溶液，用去离子水定容到200mL配制而成。
[0018]与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在:
[0019]本发明所提供的酰胺类化合物降解酶ACE123具有高效且广谱降解酰胺类化合物的能力，为酰胺类化合物污染的修复提供了可靠的途径。所述基因的提出为酰胺类污染物高效降解工程菌株的构建提供基础。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1含acel23基因阳性克隆LB培养基生长图，点A即为阳性克隆。
[0021]图2克隆acel23基因的转化子对对乙酰氨基酚降解紫外图，曲线a、曲线b、曲线c分别表示0h、6h、12h转化子对对乙酰氨基酚降解紫外曲线。
[0022]图3实施例1中表达ace 123基因的转化子质粒电泳图，泳道M为DNA marker,泳道2为转化子质粒。
[0023]图4实施例2中表达蛋白ACE123的SDS-PAGE检测图，泳道M为蛋白marker，泳道I 为 ACE123 ο [0024]图5表达蛋白ACE123对几种底物降解活性，A为对乙酰氨基酚，B为2_乙基_6甲基一N-乙氧基甲基-α -氯代乙酰替苯胺,C为N-(3’ , 4’ - 二氯苯基)丙酰胺,D为3_氯氨基甲酸异丙基酯。
(五)【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0026]实施例1基因ace 123的克隆
[0027]本研究以对乙酰氨基酚为底物，采用鸟枪法构建菌株HZA2的DNA基因文库，克隆出能断裂酰胺键的功能基因。
[0028](I)总DNA的提取
[0029]申氏杆菌(Shinellasp.) HZA2 (见申请号:CN201210460684.4)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年10月15日，地址:湖北省武汉市珞珈山武汉大学，430072，保藏号为:CCTCCM2012405。
[0030]用高盐法提取细菌总DNA。取培养至对数期的菌液，12000r/min离心收集菌体；用TE缓冲液(IOmM Tris.HCl，0.1mM EDTA(pH8.0))洗涤菌体2遍后以1.5mL TE缓冲液悬浮菌体，同时加入120 μ L10%(ff/V)的SDS和12 μ L蛋白酶K (20mg/mL)于37°C水浴锅中水浴I~2h，再加入1/3体积的饱和NaCl水溶液剧烈振荡15s，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的离心管内，用体积比1:1的酚:氯仿抽提三次，直至界面上无白色沉淀，12000r/min离心收集上清液，加入2倍体积的冰冷无水乙醇沉淀DNA，12000r/min离心收集总DNA，且用体积浓度70%乙醇水溶液洗涤2次。待乙醇完全挥发后加入30 μ L TE缓冲液，放置于4°C环境过夜使之溶解后保存在_20°C冰箱，即为申氏杆菌HZA2的总DNA。
[0031](2)酶切体系的建立
[0032]用限制性内切酶Sau3AI酶切申氏杆菌HZA2总DNA，调整酶浓度和反应时间，以将
总DNA切成合适大小的条带。酶切体系如下:
[0033]
【权利要求】
1.一种酰胺类化合物降解酶ACE123，其特征在于所述降解酶ACE123的氨基酸序列为SEQ ID N0.1 所示。
2.—种权利要求1所述酰胺类化合物降解酶ACE123的编码基因acel23，其特征在于所述编码基因acel23的核苷酸序列为SEQ ID N0.2所示。
3.一种含有权利要求2所述编码基因acel23的重组载体。
4.一种用权利要求3所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
5.如权利要求2所述酰胺类化合物降解酶ACE123的编码基因acel23在制备重组酰胺类化合物降解酶ACE123中的应用。
6.一种权利要求1所述酰胺类化合物降解酶ACE123在降解酰胺类化合物中的应用，其特征在于所述的应用为: (I)将含有酰胺类化合物降解酶ACE123编码基因的重组基因工程菌接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，32~37°C培养8h，将培养液按体积比1:50转接到含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，培养至OD6tltl达到0.5，加入IPTG并使其终浓度为0.3~0.5mM, 20~25°C诱导培养8~12h，诱导培养结束后将培养液离心，收集湿菌体，再将湿菌体超声破碎，离心，取上清液利用N1-NTA纯化树脂分离纯化，收集流出液，流出液减压浓缩去除洗脱 剂，获得酰胺类化合物降解酶ACE123 ; (2)以酰胺类化合物为底物，以步骤(I)制备的酰胺类化合物降解酶ACE123为催化剂，于pH值为8的磷酸缓冲液中构成转化体系，在37°C下转化反应2h，向反应液中加入6mol/L的盐酸水溶液终止反应，将反应液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，获得含有降解产物的混合液，将混合液提纯，获得降解产物。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述酰胺类化合物为对乙酰氨基酚、2-乙基-6甲基一N-乙氧基甲基-α -氯代乙酰替苯胺、N-(3’，4’ - 二氯苯基)丙酰胺敌稗或3-氯氨基甲酸异丙基酯。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应体系中，底物的初始浓度为10mg/L，催化剂用量为lmg/L。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于步骤(1)所述分离纯化的方法为:将上清液加到N1-NTA纯化柱子，上样流速为lmL/min，上样结束后，依次用20倍柱床体积的结合液、咪唑终浓度为20mM的结合液、咪唑终浓度为40mM的结合液洗涤柱床，关闭流速阀，加入10倍柱床体积的咪唑浓度为300mM的结合液，搅动柱床，浸泡20min，打开流速阀，收集流出液，减压浓缩去除洗脱剂，获得纯化后的蛋白，即为酰胺类化合物降解酶ACE123;所述结合液为25mL的4M的NaCl水溶液，4mL的1Μ、ρΗ值8.0的Tris水溶液和ImL的IM的咪唑水溶液,用去离子水定容到200mL配制而成。
【文档编号】A62D101/26GK103981165SQ201410148056
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】马云, 温荣提, 张豆, 刘学虎 申请人:浙江工业大学
【专利摘要】本发明公开了一种酰胺类化合物降解酶ACE123、编码基因及降解酰胺类化合物的应用，所述降解酶ACE123的氨基酸序列为SEQ?ID?No.1所示；本发明所提供的酰胺类化合物降解酶ACE123具有高效且广谱降解酰胺类化合物的能力，为酰胺类化合物污染的修复提供了可靠的途径。所述基因的提出为酰胺类污染物高效降解工程菌株的构建提供基础。
【专利说明】—种酰胺类化合物降解酶ACE123、编码基因及应用
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酰胺类化合物降解酶ACE123、编码基因及应用。
(二)【背景技术】
[0002]酰胺类化合物是指氨或胺的氮原子上的氢被酰基取代后生成的化合物。酰胺也可以看作羧酸分子中的羟基被氨基或胺苯基取代后生成的化合物。常见的有甲酰胺(HCO-NH2)，乙酰胺[CH3-CO-NH2]，碳酰胺[CO-(NH2)2]等。比如酰胺类除草剂就是一类典型的酰胺类化合物。该类除草剂种类繁多，以含有酰胺基的除草剂品种而言，已达50余种；在全世界的年产量、应用范围和使用面积仅次于有机磷除草剂，居第2位。在国际市场中，销量最大的酰胺类除草剂品种是乙草胺、丁草胺、甲草胺，占该类除草剂总产量的96%。从结构分，酰胺类除草剂又可分为苯氧丙酰胺、烃基酰胺、芳基酰胺、磺酰胺和氯乙酰胺等。酰胺类除草剂具有中等到较高的水溶性及相对较低的土壤吸附常数，所以施到农田的酰胺类除草剂，容易通过渗透转移到浅层地下水或随雨水径流进入地表水而造成环境污染。酰胺类除草剂的除草效果好，但同时也给环境安全带来了严重的威胁，所以寻求一种有效的对酰胺类化合物污染治理技术显得十分必要且紧迫。
[0003]微生物法处理有机化合物污染以其廉价、无二次污染等优点为多数学者所提倡，而现阶段多数研究集中在筛选出可以降解某一种该类化合物的菌株及其降解特性上，对降解这一类化合物分子机制的研究较少。本发明从一株菌株中克隆出可以断裂酰胺键酶的编码基因，该基因具有新颖 性。利用常规技术方法，设计引物，构建了表达载体，纯化出了一种酰胺酶，该酶对乙草胺等酰胺类化合物具有较高的活性，可以有效的去除该类污染物或者用于对该类物质的绿色转化；所述新的酰胺酶基因为构建更高效且广谱的酰胺类污染物降解工程菌提供了保障。
(三)
【发明内容】
[0004]本发明目的是提供一种对酰胺类化合物具有广谱且高效降解能力的酶ACE123及其编码基因；同时提供该酰胺类化合物降解酶的应用。
[0005]本发明米用的技术方案是:本发明提供一种来源于申氏杆菌(Shinella sp.)HZA2的酰胺类化合物降解酶ACE123，所述降解酶ACE123的氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示。
[0006]由于氨基酸序列的特殊性，任何SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
[0007]本发明还涉及一种所述酰胺类化合物降解酶ACE123的编码基因acel23，所述编码基因acel23的核苷酸序列为SEQ ID N0.2所示。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ IDN0.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。
[0008]本发明涉及一种含有所述编码基因acel23的重组载体。
[0009]本发明提供一种用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
[0010]本发明所述酰胺类化合物降解酶ACE123的编码基因acel23在制备重组酰胺类化合物降解酶ACE123中的应用，具体所述的应用为:构建含有所述编码基因acel23的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组酰胺类化合物降解酶ACE123的菌体细胞。
[0011]本发明的要点在于提供了 SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列和SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，在已知该核苷酸序列和氨基酸序列的情况下，该核苷酸序列和氨基酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。
[0012]本发明还提供一种所述酰胺类化合物降解酶ACE123在降解酰胺类化合物中的应用，所述的应用为:
[0013](I)将含有酰胺类化合物降解酶ACE123编码基因的重组基因工程菌接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基，32~37°C培养8h后，以体积比1:50的接种量转接到IOOmL含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，32~37°C培养至OD6tltl达到0.5，加入IPTG (即异丙基硫代半乳糖苷)并使其终浓度为0.3~0.5mM,20~25°C诱导培养8~12h，诱导培养结束后将培养液离心，收集湿菌体，再将湿菌体超声破碎，离心，取上清液利用N1-NTA纯化树脂分离纯化，收集流出液，流出液减压浓缩去除洗脱剂，获得酰胺类化合物降解酶ACE123 ;(2)以酰胺类化合物为底物，以步骤(1)制备的酰胺类化合物降解酶ACE123为催化剂，于pH值为8的PBS缓冲液中构成转化体系，在37°C下转化反应2h，向反应液中添加质量浓度6mol/L的盐酸水溶液(盐酸水溶液的用量对本发明没有影响，能够抑制酶活即可，通常优选加入反应液体积的0.1~0.5倍)终止反应，将反应液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层获得含有降解产物的混合液，将混合液提纯(根据底物和产物的种类，采用本领域公知的分离提取方法进行)，获得降解产物。
[0014]本发明在37°C下转化反应2h后，向反应液中加入6mol/L的盐酸水溶液终止反应，然后乙酸乙酯萃取三次，取乙酸乙酯层用氮气吹干后无水甲醇定容至1ml，采用HPLC方法检测降解产物含量。HPLC检测条件:流动相为V (CH3OH): V (H2O) =80: 20，分析柱为Grace Alltima C18Column (4.6mmX 250mm, 5 μ m),检测波长 279nm,柱温 30°C，流速 0.8mT,/min,进样量20 μ L。
[0015]进一步，优选所述酰胺类化合物为对乙酰氨基酚、2-乙基-6甲基一N-乙氧基甲基-α -氯代乙酰替苯胺、N-(3’，4’ - 二氯苯基)丙酰胺或3-氯氨基甲酸异丙基酯。
[0016]进一步,优选所述反应体系中，底物的初始浓度为10mg/L,催化剂用量为lmg/L。
[0017]进一步，步骤(1)所述分离纯化的方法为:重组蛋白可通过N1-NTAResin(Novagen)进行纯化。将上清液加到纯化柱子，调节样品下流的流速为lmL/min,上样开始后，收集过滤液，保存(如果目的蛋白结合到柱子上较少，则部分存在于穿过液中，可重复过柱子)。依次用20倍柱床体积的结合液、咪唑终浓度为20mM的结合液、咪唑终浓度为40mM的结合液洗涤柱床，关闭流速阀，加入10倍柱床体积的咪唑浓度为300mM的结合液，搅动柱床，浸泡20min，打开流速阀，收集流出液，将流出液减压浓缩去除洗脱剂，获得纯化后的蛋白，即为酰胺类化合物降解酶ACE123。所述结合液为25mL的4M的NaCl水溶液，4mL的IMTris水溶液(pH8)和ImL的IM的咪唑水溶液，用去离子水定容到200mL配制而成。
[0018]与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在:
[0019]本发明所提供的酰胺类化合物降解酶ACE123具有高效且广谱降解酰胺类化合物的能力，为酰胺类化合物污染的修复提供了可靠的途径。所述基因的提出为酰胺类污染物高效降解工程菌株的构建提供基础。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1含acel23基因阳性克隆LB培养基生长图，点A即为阳性克隆。
[0021]图2克隆acel23基因的转化子对对乙酰氨基酚降解紫外图，曲线a、曲线b、曲线c分别表示0h、6h、12h转化子对对乙酰氨基酚降解紫外曲线。
[0022]图3实施例1中表达ace 123基因的转化子质粒电泳图，泳道M为DNA marker,泳道2为转化子质粒。
[0023]图4实施例2中表达蛋白ACE123的SDS-PAGE检测图，泳道M为蛋白marker，泳道I 为 ACE123 ο [0024]图5表达蛋白ACE123对几种底物降解活性，A为对乙酰氨基酚，B为2_乙基_6甲基一N-乙氧基甲基-α -氯代乙酰替苯胺,C为N-(3’ , 4’ - 二氯苯基)丙酰胺,D为3_氯氨基甲酸异丙基酯。
(五)【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0026]实施例1基因ace 123的克隆
[0027]本研究以对乙酰氨基酚为底物，采用鸟枪法构建菌株HZA2的DNA基因文库，克隆出能断裂酰胺键的功能基因。
[0028](I)总DNA的提取
[0029]申氏杆菌(Shinellasp.) HZA2 (见申请号:CN201210460684.4)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年10月15日，地址:湖北省武汉市珞珈山武汉大学，430072，保藏号为:CCTCCM2012405。
[0030]用高盐法提取细菌总DNA。取培养至对数期的菌液，12000r/min离心收集菌体；用TE缓冲液(IOmM Tris.HCl，0.1mM EDTA(pH8.0))洗涤菌体2遍后以1.5mL TE缓冲液悬浮菌体，同时加入120 μ L10%(ff/V)的SDS和12 μ L蛋白酶K (20mg/mL)于37°C水浴锅中水浴I~2h，再加入1/3体积的饱和NaCl水溶液剧烈振荡15s，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的离心管内，用体积比1:1的酚:氯仿抽提三次，直至界面上无白色沉淀，12000r/min离心收集上清液，加入2倍体积的冰冷无水乙醇沉淀DNA，12000r/min离心收集总DNA，且用体积浓度70%乙醇水溶液洗涤2次。待乙醇完全挥发后加入30 μ L TE缓冲液，放置于4°C环境过夜使之溶解后保存在_20°C冰箱，即为申氏杆菌HZA2的总DNA。
[0031](2)酶切体系的建立
[0032]用限制性内切酶Sau3AI酶切申氏杆菌HZA2总DNA，调整酶浓度和反应时间，以将
总DNA切成合适大小的条带。酶切体系如下:
[0033]
【权利要求】
1.一种酰胺类化合物降解酶ACE123，其特征在于所述降解酶ACE123的氨基酸序列为SEQ ID N0.1 所示。
2.—种权利要求1所述酰胺类化合物降解酶ACE123的编码基因acel23，其特征在于所述编码基因acel23的核苷酸序列为SEQ ID N0.2所示。
3.一种含有权利要求2所述编码基因acel23的重组载体。
4.一种用权利要求3所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
5.如权利要求2所述酰胺类化合物降解酶ACE123的编码基因acel23在制备重组酰胺类化合物降解酶ACE123中的应用。
6.一种权利要求1所述酰胺类化合物降解酶ACE123在降解酰胺类化合物中的应用，其特征在于所述的应用为: (I)将含有酰胺类化合物降解酶ACE123编码基因的重组基因工程菌接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，32~37°C培养8h，将培养液按体积比1:50转接到含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，培养至OD6tltl达到0.5，加入IPTG并使其终浓度为0.3~0.5mM, 20~25°C诱导培养8~12h，诱导培养结束后将培养液离心，收集湿菌体，再将湿菌体超声破碎，离心，取上清液利用N1-NTA纯化树脂分离纯化，收集流出液，流出液减压浓缩去除洗脱 剂，获得酰胺类化合物降解酶ACE123 ; (2)以酰胺类化合物为底物，以步骤(I)制备的酰胺类化合物降解酶ACE123为催化剂，于pH值为8的磷酸缓冲液中构成转化体系，在37°C下转化反应2h，向反应液中加入6mol/L的盐酸水溶液终止反应，将反应液用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，获得含有降解产物的混合液，将混合液提纯，获得降解产物。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述酰胺类化合物为对乙酰氨基酚、2-乙基-6甲基一N-乙氧基甲基-α -氯代乙酰替苯胺、N-(3’，4’ - 二氯苯基)丙酰胺敌稗或3-氯氨基甲酸异丙基酯。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应体系中，底物的初始浓度为10mg/L，催化剂用量为lmg/L。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于步骤(1)所述分离纯化的方法为:将上清液加到N1-NTA纯化柱子，上样流速为lmL/min，上样结束后，依次用20倍柱床体积的结合液、咪唑终浓度为20mM的结合液、咪唑终浓度为40mM的结合液洗涤柱床，关闭流速阀，加入10倍柱床体积的咪唑浓度为300mM的结合液，搅动柱床，浸泡20min，打开流速阀，收集流出液，减压浓缩去除洗脱剂，获得纯化后的蛋白，即为酰胺类化合物降解酶ACE123;所述结合液为25mL的4M的NaCl水溶液，4mL的1Μ、ρΗ值8.0的Tris水溶液和ImL的IM的咪唑水溶液,用去离子水定容到200mL配制而成。
【文档编号】A62D101/26GK103981165SQ201410148056
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年4月14日 优先权日:2014年4月14日
【发明者】马云, 温荣提, 张豆, 刘学虎 申请人:浙江工业大学
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