一种新型水解酶超家族酰胺酶Azl13及其制备与应用的制作方法
一种新型水解酶超家族酰胺酶Azl13及其制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型腈水解酶超家族酰胺酶Azl13及其制备与应用。该酰胺酶Azl13的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其具有芳基酰基酰胺酶活性。酰胺酶Azl13的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。通过将酰胺酶Azl13的编码基因连接到原核表达载体中构建重组表达质粒，再将重组表达质粒转化到大肠杆菌中，经IPTG诱导表达得到酰胺酶Azl13。本发明的酰胺酶Azl13可用于治理苯胺酰胺类环境污染物，特别是敌稗。本发明采用基因工程菌生产酰胺酶Azl13，生产周期短，成本比较低，无环境污染，适合大规模培养；本发明的酰胺酶Azl13在环境农药污染物治理方面具有广泛的应用前景。
【专利说明】一种新型水解酶超家族酰胺酶Az 113及其制备与应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及分子生物学【技术领域】，特别涉及一种新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3及其制备与应用。
【背景技术】
[0003]在动物、植物、真菌的生物体内存在许多非肽类的碳氮键的水解反应，在该类反应中很多都是由腈水解酶超家族中的相关酶来催化完成的，其中植物生长素、生物素、丙氨酸以及其他天然产物的合成都与腈水解酶超家族有关，同时该家族还参与蛋白质的脱氨基反应。与动植物存在生态学关系的细菌和古生菌体内同样可以合成腈水解酶超家族中的相关蛋白，负责一系列腈和酰胺的水解反应以及多肽末端酰基支链的缩合反应。[0004]依据基于结构的序列分析，腈水解酶超家族可以分为13个分支，其中9个分支的底物特异性已知。尽管已往的分类将此类酶都归为腈水解酶超家族，但是事实上只有第一个分支具有腈水解酶活性，其他8个分支具有酰胺酶活性和酰胺合成酶活性。在这13个分支中有7个分支都含有融合的保守区域，这些融合的保守区域可能参与胺的产生与消耗两个过程的连接或蛋白与胞外信号分子的连接。
[0005]与腈水解酶相似的一类酶是腈水合酶，该酶是一类含有金属离子的酶，它能催化腈化合物的水解形成酰胺类化合物，但是此类酶不属于腈水解酶超家族。另外，尽管腈水解酶超家族中绝大多数都是酰胺酶，但是还有许多酰胺酶包括Ntn、Triad、AS酰胺酶和硫醇蛋白酶，它们都不属于腈水解酶超家族。由于脂肪族酰胺酶与腈水解酶有关，所以保留了腈水解酶这一词作为该家族的名称，同时其他含有Glu-Lys-Cys保守氨基酸残基的同源蛋白作为该家族的其他分支。
[0006]腈水解酶超家族的第一个分类依据就是根据序列分析和A-value值进行分类。对大量该家族中的序列进行分析，发现该家族可以分为13个分支，同时发现不同分支之间的E-Nalue值有明显区别，当两个序列的万-value值大于IX 10-25时,可以判断这两个序列不属于同一分支。
[0007]腈水解酶超家族中绝大多数分支的分类不光依据万-value值，还要参考活性位点周围相对保守的氨基酸残基进行分类。
[0008]腈水解酶超家族中有些分支包含有融合的保守区域，这些融合的保守区域赋予了该类蛋白具有额外的特殊的催化功能。根据它们所具有的融合区域的类型不同可以将该家族分为不同的分支。
[0009]在工业生产中，人们往往使用酰胺类化合物作为化学合成的前体。酰胺类化合物在自然界中具有致癌性、致畸性和神经毒性，因此酰胺类化合物的滥用和任意排放导致环境的严重污染，而腈水解酶超家族中的酰胺酶可以催化有毒的酰胺类化合物形成无毒的化合物，因此该家族中的酶在环境污染物的治理方面起着重要作用。[0010]利用酰胺酶的酰基转移酶活性可以催化底物形成相应的异羟肟酸，异羟肟酸是一种非常重要的化学疗法的药物。它可以作为生长因子、食品添加剂、肿瘤抑制因子、抗肺结核病、抗白血病等药物具有非常重要的生物学活性。微生物还可以利用其金属离子的螯合作用吸收环境中的金属离子，特别是在金属离子匮乏的环境中，具有重要的生理学意义。乙酰氧肟酸可以作为脲酶的不可逆抑制剂，而且可以用于治疗慢性泌尿系统感染等疾病。有些异羟肟酸在哮喘和Hiv治疗方面也有一定的疗效。
【发明内容】
[0011]本发明的首要目的在于提供一种新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3。本发明的另一目的在于提供上述酰胺酶Azll3的制备方法。本发明的目的还在于提供上述酰胺酶Azl 13的应用。
[0012]本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。该酶具有芳基酰基酰胺酶活性，其芳基酰基酰胺酶活性的最适作用PH值为8.0，最适作用温度为35-45。。。
[0013]上述新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的芳基酰基酰胺酶活性测定方法优选为:在20mM Tris-HCl pH 8.0UOOmM NaCl缓冲液中加入反应底物和酰胺酶Azll3，于35°C反应；再通过液相色谱检测酰胺酶Azll3催化效率。
[0014]上述新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0015]上述新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的制备方法包括如下步骤:将新型腈水解酶超家族酰胺酶Azl 13的编码基因(序列如SEQ ID N0.2所示)连接到原核表达载体中构建重组表达质粒；并将所形成的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，经IPTG诱导表达得到新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3。
[0016]优选的，新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的制备方法包括如下步骤:
(I)重组His-Azl 13质粒的构建
提取链霉菌211726的总DNA，利用特异性引物az 113_F和az 113-R对链霉菌211726的总DNA进行PCR扩增；PCR产物纯化后与原核表达载体pET28a (+)分别用Nde\和&oRI酶切，回收酶切片段，将这二片段用T4 DNA连接酶连接；将连接产物导入大肠杆菌DH10B，筛选转化子提取质粒，得到重组His-Azl 13质粒；
其中特异性引物azll3-F和azll3-R的5’端分别引入和&oRI限制性酶切位点，序列如下:azll3-F:5’ -GCACATATGAAGATCTCCGGACTCC-3?,azll3-R:5’ -GAGGAATTCGTCGTGGCCTGTTGC-3?。
[0017](2) Azll3的表达与制备
提取大肠杆菌DHlOB中的重组质粒His-Azll3，并用氯化钙转化法将重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，筛选转化菌株接种至含卡那霉素的LB液体培养基中37°C培养过夜；第二天接种种子液至IL含卡那霉素的LB液体培养基中37°C培养培养至0D_=0.6左右加入IPTG 16°C诱导20h ;诱导后培养物经超声破碎和镍柱纯化后得到目标蛋白酰胺酶Azll3。[0018]对由上述方法制备得到的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3进行了芳基酰基酰胺酶活性分析，发现酰胺酶Azll3具有较好的芳基酰基酰胺酶活性，对敌稗、对甲基乙酰苯胺和2’，6’ - 二甲基乙酰苯胺均具有较好的降解作用，尤其是对酰胺类农药敌稗具有很好的降解效果。敌稗是目前市面上应用广泛的酰胺类除草剂，Azll3对其的水解作用预示着该酶将在环境农药污染物治理方面具有广泛的应用前景。
[0019]基于酰胺酶Azll3的芳基酰基酰胺酶活性，本发明还提供上述新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3在环境污染物的治理中的应用，所述的环境污染物为苯胺酰胺类化合物。
[0020]优选的，所述的环境污染物为敌稗。
[0021]本发明具有如下优点:
(I)酰胺酶AZ113是一种新型的腈水解酶超家族酰胺酶，具有芳基酰基酰胺酶活性。
[0022](2)本发明的制备方法采用基因工程菌生产腈水解酶超家族酰胺酶适合大规模培养和分离提取，生产工艺不复杂，设备要求简单，生产周期短，成本比较低，无环境污染。
[0023](3)酰胺酶Azll3能降解苯胺酰胺类底物，如敌稗、对甲基乙酰苯胺和2’，6’ - 二甲基乙酰苯胺，特别是敌稗。敌稗是目前市面上应用广泛的酰胺类除草剂，Azll3对其的水解作用预示着该酶将在环境农药污染物治理方面具有广泛的应用前景。 【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是实施例1中制备的重组腈水解酶超家族酰胺酶Azl 13的SDS-PAGE图，泳道I:marker ;泳道 2:酰胺酶 Azll3。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
[0026]在本发明实施例中涉及到的常规性实验方法均采用如下方法:
(I)质粒提取、DNA (PCR产物)纯化、DNA片段从凝胶中回收皆采用“天根生化科技有限公司”的相应试剂盒。
[0027](2)所有限制性内切酶和连接酶均购自“New England Biolabs公司”,英国。
[0028]实施例1重组腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的制备 (I)总DNA的提取
将 100 μ L链霉菌211726菌丝体充分悬浮于500 μ L SET(75mM NaCl,25mM EDTA pH8.0，20mM Tris-HCl pH7.5)缓冲液中，加入10 μ L溶菌酶(50mg/mL)后于37°C水浴I小时。然后向其加入14 μ L的蛋白酶K溶液后充分混合均匀，加入60 μ L 10%SDS，再次混合均匀后于55°C水浴I小时。孵育后继续加入200 μ L 5M的氯化钠溶液，充分混匀。继续加入500 μ L的氯仿，混匀。于12000rpm离心10min,并将上清全部转移到一个新的离心管中。向其加入0.6倍体积的异丙醇,混匀后于12000rpm离心I min。去除上清,加入ImL 70%乙醇充分洗涤沉淀两次。去除上清，于室温将乙醇全部挥干后，将DNA用100 μ L无菌水充分溶解。
[0029](2)质粒 His-Azl 13 的构建
以链霉菌211726的总DNA为模板用购自“New England Biolabs公司”的fusion酶扩增片段，其特异性引物序列如下:azll3-F:5’ -GCACATATGAAGATCTCCGGACTCC-3’ ；
azll3-R:5’ -GAGGAATTCGTCGTGGCCTGTTGC-3?。
[0030]首先进行PCR 扩增，反应条件为:95°C 2min ；95°C 30s，58°C 30s, 72°C Imin 循环30次；最后72°C延伸lOmin。用PCR产物凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，用和EcoRl酶切扩增产物，与经同样酶酶切的原核表达载体pET28a(+)用T4 DNA连接酶于室温连接2-8小时。将连接产物导入到在大肠杆菌感受态细胞DHlOB中，通过蓝白斑筛选带有目的基因的质粒，提取的质粒产物经测序检测为腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的编码基因序列，如SEQ ID N0.2，得到重组质粒His-Azll3。
[0031](2)重组腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的表达和纯化: 提取大肠杆菌DHlOB中的重组质粒His-Azll3，并用氯化钙转化法将重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，并涂布于含有50mg/mL卡那霉素LB固体培养基上培养，筛选转化子。将选出的转化菌株接种至含50mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37°C培养过夜。第二天接种IOmL种子液至IL含50mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37°C培养培养2h至OD600=0.6左右加入IPTG至终浓度0.1mM 16°C诱导20h。将诱导培养物于4°C 6000rpm离心 10 分钟去上清，沉淀用 3OmL 的 binding buffer (20mM Tris-HCl pH 8.0,0.5mM NaCl，5mM咪唑)充分悬浮，在冰浴条件下，用超声波破碎细胞(条件为:工作时间3秒，间歇时间10秒，总次数120-200)。4°C 12000rpm离心20分钟以去除细胞碎片，上清与Ni2+亲和层析柱混合。上样后，分别用 binding buffer 和 wash buffer (20mM Tris-HCl pH 8.0,0.5mMNaCl, 50-100mmol/L 咪唑)洗脱杂蛋白质，用 elution buffer (20mM Tris-HCl pH 8.0,0.5mM NaCl，200mmol/L咪唑)洗脱目标蛋白质。回收目的蛋白经I3D-1O脱盐柱脱盐后得到高纯度的目的蛋白重组His6-Azll3蛋白(见图1)。
[0032]实施例2重组腈水解酶超家族酰胺酶Azll3芳基酰基酰胺酶活性的测定 以敌稗、对甲基乙酰苯胺和2’，6’ - 二甲基乙酰苯胺为反应底物，其反应体系和反应条
件如下:1μ g纯化后的重组His6-Azll3蛋白，0.2mM待检测底物在ImL反应缓冲液(20mMTris-HCl pH 8.0, IOOmM NaCl)中于35°C反应10分钟。反应结束后加入等体积乙酸乙酯萃取反应液，取上层有机相旋干，溶解于100 μ L甲醇中。反应后样品用液相检测，检测条件如下:
Waters 2998 PDA 二极管阵列检测器
Waters LC-20AD高效液相色谱仪
色谱柱:Thermo C18 反相柱(3μ ；2.1 X 150 mm)
分离反应产物所用流动相为水:甲醇=2:3 (V/V)
等度洗脱20min,流速0.2mL/min 检测波长250nm 柱温:25°C
甲醇(HPLC级、MS级)=Merck公司 水:去离子水
在不同的温度和PH条件下，对重组腈水解酶超家族酰胺酶Azll3进行了生物学分析，最适作用pH值为8.0，最适作用温度为35-45°C。
[0033]重组腈水解酶超家族酰胺酶Azll3对敌稗、对甲基乙酰苯胺和2’，6’ - 二甲基乙酰苯胺的水解活力分别为0.55U/mg、0.87U/mg和0.69U/mg。酰胺酶Azll3所具有的芳基酰基酰胺酶活性是之前已报道的腈水解酶超家族酰胺酶未发现的活性，其能降解苯胺酰胺类底物，可应用于治理环境污染物。
【权利要求】
1.一种新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3，其特征在于:氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.根据权利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3，其特征在于:该酶具有芳基酰基酰胺酶活性，芳基酰基酰胺酶活性的最适作用PH值为8.0,最适作用温度为35-45。。。
3.根据权利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3，其特征在于:该酶的芳基酰基酰胺酶活性测定方法为:在20mM Tris-HCl pH 8.0、IOOmM NaCl缓冲液中加入反应底物和酰胺酶Azll3，于35°C反应；再通过液相色谱检测酰胺酶Azll3催化效率。
4.权利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的编码基因，其特征在于:核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
5.权利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的制备方法，其特征在于包括如下步骤:将权利要求4所述的编码基因连接到原核表达载体中构建重组表达质粒；并将所形成的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达得到新型腈水解酶超家族酰胺酶Az 113。
6.根据权利要求5所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)重组His-Azl13质粒的构建 提取链霉菌211726的总DNA，利用特异性引物azll3_F和azll3_R对链霉菌211726的总DNA进行PCR扩增；PCR产物纯化后与原核表达载体pET28a (+)分别用Nde\和&oRI酶切，回收酶切片段，将这二片段用T4 DNA连接酶连接；将连接产物导入大肠杆菌DH10B，筛选转化子提取质粒，得到重组His-Azl 13质粒； 其中，特异性引物azll3-F和azll3-R如下:
azll3-F:5’ -GCACATATGAAGATCTCCGGACTCC-3’，
azll3-R:5’ -GAGGAATTCGTCGTGGCCTGTTGC-3’ ； (2)Azll3的表达与制备 提取大肠杆菌DHlOB中的重组质粒His-Azll3，并用氯化钙转化法将重组质粒转化至大肠杆菌BL21中，筛选转化菌株接种至含卡那霉素的LB液体培养基中37°C培养过夜；第二天接种种子液至IL含卡那霉素的LB液体培养基中37°C培养培养至OD6tltl=0.6加入IPTG16°C诱导20h ;诱导后培养物经超声破碎和镍柱纯化后得到目标蛋白酰胺酶Azll3。
7.权利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3在环境污染物的治理中的应用，其特征在于:所述的环境污染物为苯胺酰胺类化合物。
8.根据权利要求7所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3在环境污染物的治理中的应用，其特征在于:所述的环境污染物为敌稗。
【文档编号】A62D101/04GK103898083SQ201410160172
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月21日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】孙宇辉, 马艳玲, 邓子新 申请人:武汉大学
【专利摘要】本发明公开了一种新型腈水解酶超家族酰胺酶Azl13及其制备与应用。该酰胺酶Azl13的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其具有芳基酰基酰胺酶活性。酰胺酶Azl13的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。通过将酰胺酶Azl13的编码基因连接到原核表达载体中构建重组表达质粒，再将重组表达质粒转化到大肠杆菌中，经IPTG诱导表达得到酰胺酶Azl13。本发明的酰胺酶Azl13可用于治理苯胺酰胺类环境污染物，特别是敌稗。本发明采用基因工程菌生产酰胺酶Azl13，生产周期短，成本比较低，无环境污染，适合大规模培养；本发明的酰胺酶Azl13在环境农药污染物治理方面具有广泛的应用前景。
【专利说明】一种新型水解酶超家族酰胺酶Az 113及其制备与应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及分子生物学【技术领域】，特别涉及一种新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3及其制备与应用。
【背景技术】
[0003]在动物、植物、真菌的生物体内存在许多非肽类的碳氮键的水解反应，在该类反应中很多都是由腈水解酶超家族中的相关酶来催化完成的，其中植物生长素、生物素、丙氨酸以及其他天然产物的合成都与腈水解酶超家族有关，同时该家族还参与蛋白质的脱氨基反应。与动植物存在生态学关系的细菌和古生菌体内同样可以合成腈水解酶超家族中的相关蛋白，负责一系列腈和酰胺的水解反应以及多肽末端酰基支链的缩合反应。[0004]依据基于结构的序列分析，腈水解酶超家族可以分为13个分支，其中9个分支的底物特异性已知。尽管已往的分类将此类酶都归为腈水解酶超家族，但是事实上只有第一个分支具有腈水解酶活性，其他8个分支具有酰胺酶活性和酰胺合成酶活性。在这13个分支中有7个分支都含有融合的保守区域，这些融合的保守区域可能参与胺的产生与消耗两个过程的连接或蛋白与胞外信号分子的连接。
[0005]与腈水解酶相似的一类酶是腈水合酶，该酶是一类含有金属离子的酶，它能催化腈化合物的水解形成酰胺类化合物，但是此类酶不属于腈水解酶超家族。另外，尽管腈水解酶超家族中绝大多数都是酰胺酶，但是还有许多酰胺酶包括Ntn、Triad、AS酰胺酶和硫醇蛋白酶，它们都不属于腈水解酶超家族。由于脂肪族酰胺酶与腈水解酶有关，所以保留了腈水解酶这一词作为该家族的名称，同时其他含有Glu-Lys-Cys保守氨基酸残基的同源蛋白作为该家族的其他分支。
[0006]腈水解酶超家族的第一个分类依据就是根据序列分析和A-value值进行分类。对大量该家族中的序列进行分析，发现该家族可以分为13个分支，同时发现不同分支之间的E-Nalue值有明显区别，当两个序列的万-value值大于IX 10-25时,可以判断这两个序列不属于同一分支。
[0007]腈水解酶超家族中绝大多数分支的分类不光依据万-value值，还要参考活性位点周围相对保守的氨基酸残基进行分类。
[0008]腈水解酶超家族中有些分支包含有融合的保守区域，这些融合的保守区域赋予了该类蛋白具有额外的特殊的催化功能。根据它们所具有的融合区域的类型不同可以将该家族分为不同的分支。
[0009]在工业生产中，人们往往使用酰胺类化合物作为化学合成的前体。酰胺类化合物在自然界中具有致癌性、致畸性和神经毒性，因此酰胺类化合物的滥用和任意排放导致环境的严重污染，而腈水解酶超家族中的酰胺酶可以催化有毒的酰胺类化合物形成无毒的化合物，因此该家族中的酶在环境污染物的治理方面起着重要作用。[0010]利用酰胺酶的酰基转移酶活性可以催化底物形成相应的异羟肟酸，异羟肟酸是一种非常重要的化学疗法的药物。它可以作为生长因子、食品添加剂、肿瘤抑制因子、抗肺结核病、抗白血病等药物具有非常重要的生物学活性。微生物还可以利用其金属离子的螯合作用吸收环境中的金属离子，特别是在金属离子匮乏的环境中，具有重要的生理学意义。乙酰氧肟酸可以作为脲酶的不可逆抑制剂，而且可以用于治疗慢性泌尿系统感染等疾病。有些异羟肟酸在哮喘和Hiv治疗方面也有一定的疗效。
【发明内容】
[0011]本发明的首要目的在于提供一种新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3。本发明的另一目的在于提供上述酰胺酶Azll3的制备方法。本发明的目的还在于提供上述酰胺酶Azl 13的应用。
[0012]本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。该酶具有芳基酰基酰胺酶活性，其芳基酰基酰胺酶活性的最适作用PH值为8.0，最适作用温度为35-45。。。
[0013]上述新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的芳基酰基酰胺酶活性测定方法优选为:在20mM Tris-HCl pH 8.0UOOmM NaCl缓冲液中加入反应底物和酰胺酶Azll3，于35°C反应；再通过液相色谱检测酰胺酶Azll3催化效率。
[0014]上述新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0015]上述新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的制备方法包括如下步骤:将新型腈水解酶超家族酰胺酶Azl 13的编码基因(序列如SEQ ID N0.2所示)连接到原核表达载体中构建重组表达质粒；并将所形成的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，经IPTG诱导表达得到新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3。
[0016]优选的，新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的制备方法包括如下步骤:
(I)重组His-Azl 13质粒的构建
提取链霉菌211726的总DNA，利用特异性引物az 113_F和az 113-R对链霉菌211726的总DNA进行PCR扩增；PCR产物纯化后与原核表达载体pET28a (+)分别用Nde\和&oRI酶切，回收酶切片段，将这二片段用T4 DNA连接酶连接；将连接产物导入大肠杆菌DH10B，筛选转化子提取质粒，得到重组His-Azl 13质粒；
其中特异性引物azll3-F和azll3-R的5’端分别引入和&oRI限制性酶切位点，序列如下:azll3-F:5’ -GCACATATGAAGATCTCCGGACTCC-3?,azll3-R:5’ -GAGGAATTCGTCGTGGCCTGTTGC-3?。
[0017](2) Azll3的表达与制备
提取大肠杆菌DHlOB中的重组质粒His-Azll3，并用氯化钙转化法将重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，筛选转化菌株接种至含卡那霉素的LB液体培养基中37°C培养过夜；第二天接种种子液至IL含卡那霉素的LB液体培养基中37°C培养培养至0D_=0.6左右加入IPTG 16°C诱导20h ;诱导后培养物经超声破碎和镍柱纯化后得到目标蛋白酰胺酶Azll3。[0018]对由上述方法制备得到的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3进行了芳基酰基酰胺酶活性分析，发现酰胺酶Azll3具有较好的芳基酰基酰胺酶活性，对敌稗、对甲基乙酰苯胺和2’，6’ - 二甲基乙酰苯胺均具有较好的降解作用，尤其是对酰胺类农药敌稗具有很好的降解效果。敌稗是目前市面上应用广泛的酰胺类除草剂，Azll3对其的水解作用预示着该酶将在环境农药污染物治理方面具有广泛的应用前景。
[0019]基于酰胺酶Azll3的芳基酰基酰胺酶活性，本发明还提供上述新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3在环境污染物的治理中的应用，所述的环境污染物为苯胺酰胺类化合物。
[0020]优选的，所述的环境污染物为敌稗。
[0021]本发明具有如下优点:
(I)酰胺酶AZ113是一种新型的腈水解酶超家族酰胺酶，具有芳基酰基酰胺酶活性。
[0022](2)本发明的制备方法采用基因工程菌生产腈水解酶超家族酰胺酶适合大规模培养和分离提取，生产工艺不复杂，设备要求简单，生产周期短，成本比较低，无环境污染。
[0023](3)酰胺酶Azll3能降解苯胺酰胺类底物，如敌稗、对甲基乙酰苯胺和2’，6’ - 二甲基乙酰苯胺，特别是敌稗。敌稗是目前市面上应用广泛的酰胺类除草剂，Azll3对其的水解作用预示着该酶将在环境农药污染物治理方面具有广泛的应用前景。 【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是实施例1中制备的重组腈水解酶超家族酰胺酶Azl 13的SDS-PAGE图，泳道I:marker ;泳道 2:酰胺酶 Azll3。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
[0026]在本发明实施例中涉及到的常规性实验方法均采用如下方法:
(I)质粒提取、DNA (PCR产物)纯化、DNA片段从凝胶中回收皆采用“天根生化科技有限公司”的相应试剂盒。
[0027](2)所有限制性内切酶和连接酶均购自“New England Biolabs公司”,英国。
[0028]实施例1重组腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的制备 (I)总DNA的提取
将 100 μ L链霉菌211726菌丝体充分悬浮于500 μ L SET(75mM NaCl,25mM EDTA pH8.0，20mM Tris-HCl pH7.5)缓冲液中，加入10 μ L溶菌酶(50mg/mL)后于37°C水浴I小时。然后向其加入14 μ L的蛋白酶K溶液后充分混合均匀，加入60 μ L 10%SDS，再次混合均匀后于55°C水浴I小时。孵育后继续加入200 μ L 5M的氯化钠溶液，充分混匀。继续加入500 μ L的氯仿，混匀。于12000rpm离心10min,并将上清全部转移到一个新的离心管中。向其加入0.6倍体积的异丙醇,混匀后于12000rpm离心I min。去除上清,加入ImL 70%乙醇充分洗涤沉淀两次。去除上清，于室温将乙醇全部挥干后，将DNA用100 μ L无菌水充分溶解。
[0029](2)质粒 His-Azl 13 的构建
以链霉菌211726的总DNA为模板用购自“New England Biolabs公司”的fusion酶扩增片段，其特异性引物序列如下:azll3-F:5’ -GCACATATGAAGATCTCCGGACTCC-3’ ；
azll3-R:5’ -GAGGAATTCGTCGTGGCCTGTTGC-3?。
[0030]首先进行PCR 扩增，反应条件为:95°C 2min ；95°C 30s，58°C 30s, 72°C Imin 循环30次；最后72°C延伸lOmin。用PCR产物凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，用和EcoRl酶切扩增产物，与经同样酶酶切的原核表达载体pET28a(+)用T4 DNA连接酶于室温连接2-8小时。将连接产物导入到在大肠杆菌感受态细胞DHlOB中，通过蓝白斑筛选带有目的基因的质粒，提取的质粒产物经测序检测为腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的编码基因序列，如SEQ ID N0.2，得到重组质粒His-Azll3。
[0031](2)重组腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的表达和纯化: 提取大肠杆菌DHlOB中的重组质粒His-Azll3，并用氯化钙转化法将重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，并涂布于含有50mg/mL卡那霉素LB固体培养基上培养，筛选转化子。将选出的转化菌株接种至含50mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37°C培养过夜。第二天接种IOmL种子液至IL含50mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37°C培养培养2h至OD600=0.6左右加入IPTG至终浓度0.1mM 16°C诱导20h。将诱导培养物于4°C 6000rpm离心 10 分钟去上清，沉淀用 3OmL 的 binding buffer (20mM Tris-HCl pH 8.0,0.5mM NaCl，5mM咪唑)充分悬浮，在冰浴条件下，用超声波破碎细胞(条件为:工作时间3秒，间歇时间10秒，总次数120-200)。4°C 12000rpm离心20分钟以去除细胞碎片，上清与Ni2+亲和层析柱混合。上样后，分别用 binding buffer 和 wash buffer (20mM Tris-HCl pH 8.0,0.5mMNaCl, 50-100mmol/L 咪唑)洗脱杂蛋白质，用 elution buffer (20mM Tris-HCl pH 8.0,0.5mM NaCl，200mmol/L咪唑)洗脱目标蛋白质。回收目的蛋白经I3D-1O脱盐柱脱盐后得到高纯度的目的蛋白重组His6-Azll3蛋白(见图1)。
[0032]实施例2重组腈水解酶超家族酰胺酶Azll3芳基酰基酰胺酶活性的测定 以敌稗、对甲基乙酰苯胺和2’，6’ - 二甲基乙酰苯胺为反应底物，其反应体系和反应条
件如下:1μ g纯化后的重组His6-Azll3蛋白，0.2mM待检测底物在ImL反应缓冲液(20mMTris-HCl pH 8.0, IOOmM NaCl)中于35°C反应10分钟。反应结束后加入等体积乙酸乙酯萃取反应液，取上层有机相旋干，溶解于100 μ L甲醇中。反应后样品用液相检测，检测条件如下:
Waters 2998 PDA 二极管阵列检测器
Waters LC-20AD高效液相色谱仪
色谱柱:Thermo C18 反相柱(3μ ；2.1 X 150 mm)
分离反应产物所用流动相为水:甲醇=2:3 (V/V)
等度洗脱20min,流速0.2mL/min 检测波长250nm 柱温:25°C
甲醇(HPLC级、MS级)=Merck公司 水:去离子水
在不同的温度和PH条件下，对重组腈水解酶超家族酰胺酶Azll3进行了生物学分析，最适作用pH值为8.0，最适作用温度为35-45°C。
[0033]重组腈水解酶超家族酰胺酶Azll3对敌稗、对甲基乙酰苯胺和2’，6’ - 二甲基乙酰苯胺的水解活力分别为0.55U/mg、0.87U/mg和0.69U/mg。酰胺酶Azll3所具有的芳基酰基酰胺酶活性是之前已报道的腈水解酶超家族酰胺酶未发现的活性，其能降解苯胺酰胺类底物，可应用于治理环境污染物。
【权利要求】
1.一种新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3，其特征在于:氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.根据权利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3，其特征在于:该酶具有芳基酰基酰胺酶活性，芳基酰基酰胺酶活性的最适作用PH值为8.0,最适作用温度为35-45。。。
3.根据权利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3，其特征在于:该酶的芳基酰基酰胺酶活性测定方法为:在20mM Tris-HCl pH 8.0、IOOmM NaCl缓冲液中加入反应底物和酰胺酶Azll3，于35°C反应；再通过液相色谱检测酰胺酶Azll3催化效率。
4.权利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的编码基因，其特征在于:核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
5.权利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的制备方法，其特征在于包括如下步骤:将权利要求4所述的编码基因连接到原核表达载体中构建重组表达质粒；并将所形成的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达得到新型腈水解酶超家族酰胺酶Az 113。
6.根据权利要求5所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)重组His-Azl13质粒的构建 提取链霉菌211726的总DNA，利用特异性引物azll3_F和azll3_R对链霉菌211726的总DNA进行PCR扩增；PCR产物纯化后与原核表达载体pET28a (+)分别用Nde\和&oRI酶切，回收酶切片段，将这二片段用T4 DNA连接酶连接；将连接产物导入大肠杆菌DH10B，筛选转化子提取质粒，得到重组His-Azl 13质粒； 其中，特异性引物azll3-F和azll3-R如下:
azll3-F:5’ -GCACATATGAAGATCTCCGGACTCC-3’，
azll3-R:5’ -GAGGAATTCGTCGTGGCCTGTTGC-3’ ； (2)Azll3的表达与制备 提取大肠杆菌DHlOB中的重组质粒His-Azll3，并用氯化钙转化法将重组质粒转化至大肠杆菌BL21中，筛选转化菌株接种至含卡那霉素的LB液体培养基中37°C培养过夜；第二天接种种子液至IL含卡那霉素的LB液体培养基中37°C培养培养至OD6tltl=0.6加入IPTG16°C诱导20h ;诱导后培养物经超声破碎和镍柱纯化后得到目标蛋白酰胺酶Azll3。
7.权利要求1所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3在环境污染物的治理中的应用，其特征在于:所述的环境污染物为苯胺酰胺类化合物。
8.根据权利要求7所述的新型腈水解酶超家族酰胺酶Azll3在环境污染物的治理中的应用，其特征在于:所述的环境污染物为敌稗。
【文档编号】A62D101/04GK103898083SQ201410160172
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月21日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】孙宇辉, 马艳玲, 邓子新 申请人:武汉大学
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