一种有机磷酯水解酶、基因、重组表达转化体及其应用的制作方法
一种有机磷酯水解酶、基因、重组表达转化体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及有机磷酯水解酶、突变体、编码基因及其在有机磷农药降解中的应用；本发明的有机磷酯水解酶PoOPH来源于食油假单胞菌，其突变体是在具有如序列表中SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列的蛋白质的第250位和第263位氨基酸经过单位点取代或双位点取代获得的具有有机磷酯水解酶活性的由其衍生的蛋白质。相较于母本，本发明中的PoOPH突变体对甲基对硫磷和乙基对氧磷的催化活性分别提高了5680倍和37.5倍，同时PoOPH突变体保持了母本优良的热稳定性，本发明中的PoOPH突变体同时具备活力高和热稳定性佳两种属性，在降解有机磷农药领域具有很好的应用前景。
【专利说明】一种有机磷酯水解酶、基因、重组表达转化体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，尤其是涉及一种有机磷酯水解酶、基因、重组表达转化体及其应用。
【背景技术】
[0002]有机磷农药具有价格低廉、高效、广谱等特点，是广泛生产、应用的农药杀虫剂，占据38%的世界杀虫剂市场份额。2010年国内农药的总产量为226.22万吨，其中有机磷农药产品占到总量的80%。有机磷农药的广泛使用有效防治了农作物病虫害，显著提高了农作物的产量，但长期和大量的使用给食品安全以及生态环境带来了许多负面的影响。一方面，国内蔬菜农药残留检测超标的事件时有发生，严重影响人们的健康；另一方面，农田喷洒的农药除了少量被农作物吸收，大量农药聚集在土壤中，并通过降雨、排水等途径进入大气和湖泊，造成土壤、大气污染和水体生态的严重破坏。据统计，目前我国被农药污染的土地面积已达1300~1600万公顷，由此带来的经济损失超过十亿元。
[0003]根据农业部禁用高毒农药的1586号公告，我国自2011年10月31日起，全面停止包括苯线磷、地虫硫磷、甲基硫环磷、硫线磷、蝇毒磷、治螟磷、特丁硫磷等在内的高毒有机磷农药的生产，并在2013年10月31日起停止其销售和使用。尽管如此，如何处理和销毁已生产的高毒性、高残留、难降解的有机磷农药，如何修复已被污染的土壤、水体生态已成为棘手的问题。高温焚烧、掩埋等传统农药销毁方法不仅价格昂贵，而且极易造成二次污染。以微生物或酶制剂为代表的生物降解和修复技术由于其高效率、低成本和环境友好等特点，显示出广阔的前景。但是目前满足应用需要的有机磷降解酶仍十分有限，因此寻找具有高催化效率、高稳定性的有机磷降解菌株或有机磷降解酶，是有机磷农药治理的必然趋势。
[0004]有机磷农药属于磷酸三酯化合物，一般分为两类:其中一类，磷原子通过双键和氧原子结合，如乙基对氧磷、氧乐果、灭蝇磷、磷胺、久效磷等；另一种是磷原子通过双键和硫原子结合，如甲基对硫磷、乐果、马拉硫磷、毒死蜱等。当有机磷农药发生水解反应时，磷酸酯键断裂，水解产物极性增强，磷酸化能力减弱，因而毒性降低。所以，有机磷农药的水解反应一般即为解毒反应。
[0005]目前发现的微生物来源的有机磷酯水解酶包括两大类:磷酸三酯酶(PTE)，属于酰胺水解酶超家族；甲基对硫磷水解酶(MPH)和有机磷酯水解酶C2(0PHC2)，属于β-内酰胺酶超家族。PTE的最适底物是乙基对氧磷，活力为1760U/mg(The Journal ofBiological Chemistry, 1992 ，267，13278-13283)，MPH 的最适底物为甲基对硫磷，活力为50U/mg (Journal of Molecular Biology, 2005，353:655-663)。两种酶均表现出较高的有机磷水解活性，但是他们的T5tl值(保温15分钟残余活力为50%时的保温温度)分别为48°C和 62°C，热稳定性不够理想(Biochimica et Biophysica Acta, 2005,1594 =207-218 ；FEBS Journal, 2010, 277 =4901-4908)。0PHC2虽然表现出较好的热稳定性，75°C保温30分钟残余活力仍达60%，但其对最适底物甲基对硫磷的活力仅为2U/mg，限制了其实际应用价值(Protein Expression andPurif ication, 2006,49:9-14)。伍宁丰等对来自类产喊假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的 0PHC2 进行改造，在 Leu57、Metl88 和 Metl91位点进行突变，突变体对乙基对硫磷的活力从0.062U/mg提高至0.280U/mg,但对甲基对硫磷的活力下降至1.187U/mg(CN101914509B)。进一步筛选具有较高活性和热稳定性的有机磷酯水解酶，进而利用理性的进化分析和蛋白质工程手段，开发具有高有机磷酯水解酶活性、高稳定性的酶突变体，是亟待解决的问题，具有较大的实际应用价值。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是针对已报道的有机磷酯水解酶活性不高、热稳定性不佳的问题，而提供一种有机磷酯水解酶、基因、重组表达转化体及其应用。
[0007]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0008]本发明采取的技术方案之一是:一种有机磷酯水解酶，为具有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的具备有机磷酯水解酶活性的蛋白质。[0009]所述蛋白质的制备可以是从自然界天然存在的蛋白质分离获得，也可以从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得，也可以是人工合成获得。SEQ ID N0.1所示氨基酸序列所组成的蛋白质筛选自本课题组保藏的菌株食油假单胞菌(Pseudomonas oleovoransDSM50188)。该蛋白质拥有较低的有机磷酯水解酶活性，对甲基对硫磷的比活力为0.01U/mg，但T5tl值为76 °C，具有很好的热稳定性，命名为PoOPH。该酶与0PHC2相比，有5个氨基酸残基的差异:0PHC2的第193位、224位、250位、263位和305位的氨基酸残基为谷氨酰胺、脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸；而PoOPH中相应位点的氨基酸残基分别为精氨酸、丝氨酸、组氨酸、异亮氨酸和谷氨酸。
[0010]本发明采取的技术方案之二是:一种有机磷酯水解酶，其是在SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的蛋白质的第250位和第263位氨基酸残基中的一位或两位经过取代一个氨基酸残基且具备有机磷酯水解酶活性的由其衍生的蛋白质。
[0011 ] 与0PHC2相比，PoOPH的有机磷酯水解酶活性相对较低。为了提高PoOPH蛋白的有机磷酯水解酶活性，我们通过对PoOPH进行序列和构效分析，选择对底物结合位点的250位组氨酸和263位异亮氨酸进行饱和突变，即突变为其他19种氨基酸，进而将两个位点突变组合，从中筛选有机磷水解活性提高，同时保持酶的热稳定性的PoOPH突变体。
[0012]其中所述蛋白质较佳的为:将具有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的第250位的组氨酸突变为异亮氨酸(PoOPH，H250I)，其对甲基对硫磷的活力为0.43U/mg ;所述氨基酸序列中的第263位的异亮氨酸突变为色氨酸(PoOPH，I263W)，其对甲基对硫磷的活力为2.62U/mg ;所述氨基酸序列的第250位的组氨酸突变为异亮氨酸，同时第263位的异亮氨酸突变为色氨酸，获得的突变蛋白质(PoOPH，H250I/I263W)，其对甲基对硫磷的活力为56.8U/mg，远高于 0PHC2。
[0013]蛋白质0PHC2的第250位和第263位的氨基酸残基分别为亮氨酸和苯丙氨酸，因此本发明所述蛋白质的第250位和第263位的氨基酸残基均不同于0PHC2的相应位点的氨基酸残基。突变蛋白质PoOPH(H250I/I263W)对甲基对硫磷的活力比PoOPH提高了近6000倍，比0PHC2提高了超过10倍，同时保持了 PoOPH的良好的热稳定性。
[0014]本发明采取的技术方案之三是:一种有机磷酯水解酶基因，为一种核酸，所述核酸是SEQ ID N0.2所示核苷酸组成的核酸或具有点突变的核酸，以及编码SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的蛋白质的第250位、第263位氨基酸中的一位或两位经过取代一个氨基酸且具备有机磷酯水解酶活性的由其衍生的蛋白质的核酸。
[0015]所述的核酸的制备方法较佳为:可以从自然界微生物的基因组中分离获得，也可以从含编码表达所述蛋白的氨基酸序列的表达质粒或重组转化体中分离获得，也可以通过全基因序列合成获得。
[0016]如本领域技术人员所知:由于密码子的简并性，编码SEQ ID N0.1的氨基酸序列的碱基序列不仅限于一种，还可以适当引入替换来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换来制得。
[0017]具有点突变的核酸的制备方法较佳为:以序列表中SEQ ID N0.2所示核苷酸组成的核酸为模板，利用含有突变碱基的突变引物(选取需要进行突变的氨基酸上下游各15~20bp的一段碱基序列，将突变位点的氨基酸密码子碱基替换为突变后的氨基酸密码子碱基，作为PCR正向引物，其反向互补序列作为PCR反向引物)，通过PCR扩增，得到具有点突变的核酸。其中所述含有突变点的突变引物序列分别如序列表中SEQ ID N0.3~SEQ IDN0.6所示。[0018]其中所述含有突变碱基的引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为人工合成。
[0019]其中所述PCR扩增为本领域常规技术，反应体系(25μ1)较佳为:上述模板25ng, 10XBuffer2.5μ 1，dNTPs (2mM) 2.5 μ I，一对点突变引物(lOpmol/μ I)各 0.75 μ 1，KOD-pIus-酶0.5U，蒸馏水补足至25 μ I。PCR扩增程序较佳地为:(I) 94 V 2min ；
(2)98°C IOsec ； (3) 55°C 30sec ； (4) 68°C 7min ;步骤(2)~(4)进行 12 个循环。
[0020]本发明采取的技术方案之四是:一种包含本发明所述的核酸序列的重组表达质粒。
[0021]其可通过本领域常规方法制备，即将本发明所述的有机磷酯水解酶基因和突变体的核酸连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种质粒，优选质粒 pET_28a (+)。
[0022]本发明采取的技术方案之五是:一种包含上述重组表达质粒的重组表达转化体。
[0023]其可通过将上述重组表达质粒转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达质粒可稳定地自行复制，且所携带的本发明的基因可被有效表达即可。较佳地为大肠杆菌，更佳地为大肠杆菌E.coli BL2KDE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株。其中所述的转化方法为本领域常规方法，如热激法，电转法等，较佳地为热激法。
[0024]本发明采取的技术方案之六是:一种重组有机磷酯水解酶的制备方法，其中包括如下步骤:培养本发明所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组有机磷酯水解酶。
[0025]其中所述的制备方法可采用本领域常规的培养方法。对于大肠杆菌，较佳地为:将上述重组表达转化体接种至含有50μ g/ml卡那霉素的LB培养基中，30~40°C，150~200rpm培养，培养液的光密度OD600达到0.5~1.0 (较佳地为0.8)，加入0.05~1.0mM (较佳地为0.2mM)的异丙基_β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为16~37°C (优选16°C )，诱导8~24小时即可得到高效表达的重组有机磷酯水解酶。
[0026] 与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于:针对目前有机磷酯水解酶难以同时满足闻活性和闻稳定性的问题，以具有良好热稳定性的有机憐酷水解酶PoOPH作为蛋白质工程改造的起点，通过单点饱和突变以及组合突变，显著提高了有机磷酯水解酶PoOPH的活力，最优的突变体Po0PH(H250I/I263W)对甲基对硫磷的活力达56.8U/mg，对乙基对氧磷活力达1.5U/mg,同时突变体保留了母本的热稳定性，T50值为76°C，Tm值(解链温度)为96.5°C，表现出优良的热稳定性。进化得到的有机磷酯水解酶突变体同时具有高的有机磷水解活性和高的热稳定性，具有很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为食油假单胞菌降解甲基对硫磷分析示意图；
[0028]图2为基因PoOPH的PCR扩增电泳图谱；
[0029]图3为PoOPH的250位点饱和突变筛选结果；
[0030]图4为PoOPH的263位点饱和突变筛选结果；
[0031 ]图5为PoOPH的组合半饱和突变体库筛选结果；
[0032]图6为PoOPH及其突变体的热稳定性表征结果。
【具体实施方式】
[0033]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0034]下列实施例中的菌种、试剂和材料来源:
[0035]食油假单胞菌DSM50188 (Pseudomonas oleovorans DSM50188),来源于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，由本实验室另行保藏。
[0036]表达质粒pET_28a(+)购自上海Novagen公司。
[0037]E.coli DH5 α感受态细胞，Ε.coli BL21 (DE3)感受态细胞，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。
[0038]限制性内切酶BamHI，HindIII，DpnI购自大连宝生物工程有限公司。
[0039]KOD-pIus酶购自上海Τ0Υ0Β0公司。
[0040]实施例1
[0041]有机磷酯水解酶PoOPH的筛选及基因克隆
[0042]选取本课题组保藏的菌株，接种至改良的无机盐培养基中，加入终浓度为IOOppm的甲基对硫磷，在30°C，200rpm条件下培养1_2周，传代三次，利用薄层层析和高效液相色谱鉴定菌株对甲基对硫磷的降解效果。
[0043]改良的无机盐培养基成分为:lg/LNaCl, Ig/L NH4NO3,1.5g/L K2HPO4,0.5g/LKH2PO4,0.2g/L MgSO4.7H20，I g/L 酵母膏。
[0044]培养菌液用氯仿-乙醚(I: 1，v/v)萃取三次，室温挥发萃取剂后，加入甲醇溶解，用于薄层层析和高效液相色谱分析。
[0045]薄层层析展开剂为正己烷:氯仿:甲醇(7: 2: 1，v/v/v)，紫外灯295nm下观察底物或降解产物。高效液相色谱条件为:C18柱，流动相乙腈/水(70: 30，v/v)，流速
1.0ml/min,检测波长273nm。甲基对硫磷出峰时间6.8min。[0046]我们从89株所选菌株中，筛选得到I株能够降解甲基对硫磷的菌株，即食油假单胞菌DSM50188。降解效果如图1所示。
[0047]设计基因克隆引物如下:
[0048]
【权利要求】
1.一种有机磷酯水解酶，其特征在于，为具备有机磷酯水解酶活性的蛋白质，具体为: (a)具有SEQID N0.1所不氣基酸序列的蛋白质；或 (b)具有SEQID N0.1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸替换后形成的新氨基酸序列的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的一种有机磷酯水解酶，其特征在于，所述的蛋白质为具有SEQID N0.1所示氨基酸序列的第250位或第263位氨基酸残基经过一个氨基酸替换后形成的新氨基酸序列的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的一种有机磷酯水解酶，其特征在于，所述的蛋白质为具有SEQID N0.1所示氨基酸序列的第250位及第263位氨基酸残基分别经过一个氨基酸替换后形成的新氨基酸序列的蛋白质。
4.根据权利要求2或3所述的一种有机磷酯水解酶，其特征在于，SEQID N0.1所示氨基酸序列的第250位的组氨酸替换为异亮氨酸:SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的第263位的异亮氨酸替换为色氨酸。
5.一种有机磷酯水解酶基因，其特征在于，为由SEQ ID No:2所示核苷酸序列组成的核酸；或编码如权利要求1所述的有机磷酯水解酶的核酸。
6.一种包含如权利要求5所述的有机磷酯水解酶基因的重组表达质粒。
7.一种包含如权利要求6所述的重组表达质粒的重组表达转化体。
8.—种如权利要求1所述的有机磷酯水解酶的制备方法，其特征在于，首先培养包含有机磷酯水解酶基因的重组表达转化体，然后从培养物中分离获得重组有机磷酯水解酶。
9.一种如权利要求1所述的有机磷酯水解酶的应用，其特征在于，所述的有机磷酯水解酶用于降解有机磷农药。
10.根据权利要求9所述的一种有机磷酯水解酶的应用，其特征在于，所述的有机磷农药为甲基对硫磷、三唑磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、丙溴磷、毒死蜱、二嗪磷、敌敌畏、乐果或辛硫磷。
【文档编号】A62D3/02GK103923893SQ201410167955
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】许建和, 罗晓晶, 潘江, 张志钧 申请人:华东理工大学
【专利摘要】本发明涉及有机磷酯水解酶、突变体、编码基因及其在有机磷农药降解中的应用；本发明的有机磷酯水解酶PoOPH来源于食油假单胞菌，其突变体是在具有如序列表中SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列的蛋白质的第250位和第263位氨基酸经过单位点取代或双位点取代获得的具有有机磷酯水解酶活性的由其衍生的蛋白质。相较于母本，本发明中的PoOPH突变体对甲基对硫磷和乙基对氧磷的催化活性分别提高了5680倍和37.5倍，同时PoOPH突变体保持了母本优良的热稳定性，本发明中的PoOPH突变体同时具备活力高和热稳定性佳两种属性，在降解有机磷农药领域具有很好的应用前景。
【专利说明】一种有机磷酯水解酶、基因、重组表达转化体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，尤其是涉及一种有机磷酯水解酶、基因、重组表达转化体及其应用。
【背景技术】
[0002]有机磷农药具有价格低廉、高效、广谱等特点，是广泛生产、应用的农药杀虫剂，占据38%的世界杀虫剂市场份额。2010年国内农药的总产量为226.22万吨，其中有机磷农药产品占到总量的80%。有机磷农药的广泛使用有效防治了农作物病虫害，显著提高了农作物的产量，但长期和大量的使用给食品安全以及生态环境带来了许多负面的影响。一方面，国内蔬菜农药残留检测超标的事件时有发生，严重影响人们的健康；另一方面，农田喷洒的农药除了少量被农作物吸收，大量农药聚集在土壤中，并通过降雨、排水等途径进入大气和湖泊，造成土壤、大气污染和水体生态的严重破坏。据统计，目前我国被农药污染的土地面积已达1300~1600万公顷，由此带来的经济损失超过十亿元。
[0003]根据农业部禁用高毒农药的1586号公告，我国自2011年10月31日起，全面停止包括苯线磷、地虫硫磷、甲基硫环磷、硫线磷、蝇毒磷、治螟磷、特丁硫磷等在内的高毒有机磷农药的生产，并在2013年10月31日起停止其销售和使用。尽管如此，如何处理和销毁已生产的高毒性、高残留、难降解的有机磷农药，如何修复已被污染的土壤、水体生态已成为棘手的问题。高温焚烧、掩埋等传统农药销毁方法不仅价格昂贵，而且极易造成二次污染。以微生物或酶制剂为代表的生物降解和修复技术由于其高效率、低成本和环境友好等特点，显示出广阔的前景。但是目前满足应用需要的有机磷降解酶仍十分有限，因此寻找具有高催化效率、高稳定性的有机磷降解菌株或有机磷降解酶，是有机磷农药治理的必然趋势。
[0004]有机磷农药属于磷酸三酯化合物，一般分为两类:其中一类，磷原子通过双键和氧原子结合，如乙基对氧磷、氧乐果、灭蝇磷、磷胺、久效磷等；另一种是磷原子通过双键和硫原子结合，如甲基对硫磷、乐果、马拉硫磷、毒死蜱等。当有机磷农药发生水解反应时，磷酸酯键断裂，水解产物极性增强，磷酸化能力减弱，因而毒性降低。所以，有机磷农药的水解反应一般即为解毒反应。
[0005]目前发现的微生物来源的有机磷酯水解酶包括两大类:磷酸三酯酶(PTE)，属于酰胺水解酶超家族；甲基对硫磷水解酶(MPH)和有机磷酯水解酶C2(0PHC2)，属于β-内酰胺酶超家族。PTE的最适底物是乙基对氧磷，活力为1760U/mg(The Journal ofBiological Chemistry, 1992 ，267，13278-13283)，MPH 的最适底物为甲基对硫磷，活力为50U/mg (Journal of Molecular Biology, 2005，353:655-663)。两种酶均表现出较高的有机磷水解活性，但是他们的T5tl值(保温15分钟残余活力为50%时的保温温度)分别为48°C和 62°C，热稳定性不够理想(Biochimica et Biophysica Acta, 2005,1594 =207-218 ；FEBS Journal, 2010, 277 =4901-4908)。0PHC2虽然表现出较好的热稳定性，75°C保温30分钟残余活力仍达60%，但其对最适底物甲基对硫磷的活力仅为2U/mg，限制了其实际应用价值(Protein Expression andPurif ication, 2006,49:9-14)。伍宁丰等对来自类产喊假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的 0PHC2 进行改造，在 Leu57、Metl88 和 Metl91位点进行突变，突变体对乙基对硫磷的活力从0.062U/mg提高至0.280U/mg,但对甲基对硫磷的活力下降至1.187U/mg(CN101914509B)。进一步筛选具有较高活性和热稳定性的有机磷酯水解酶，进而利用理性的进化分析和蛋白质工程手段，开发具有高有机磷酯水解酶活性、高稳定性的酶突变体，是亟待解决的问题，具有较大的实际应用价值。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是针对已报道的有机磷酯水解酶活性不高、热稳定性不佳的问题，而提供一种有机磷酯水解酶、基因、重组表达转化体及其应用。
[0007]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0008]本发明采取的技术方案之一是:一种有机磷酯水解酶，为具有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的具备有机磷酯水解酶活性的蛋白质。[0009]所述蛋白质的制备可以是从自然界天然存在的蛋白质分离获得，也可以从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得，也可以是人工合成获得。SEQ ID N0.1所示氨基酸序列所组成的蛋白质筛选自本课题组保藏的菌株食油假单胞菌(Pseudomonas oleovoransDSM50188)。该蛋白质拥有较低的有机磷酯水解酶活性，对甲基对硫磷的比活力为0.01U/mg，但T5tl值为76 °C，具有很好的热稳定性，命名为PoOPH。该酶与0PHC2相比，有5个氨基酸残基的差异:0PHC2的第193位、224位、250位、263位和305位的氨基酸残基为谷氨酰胺、脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸；而PoOPH中相应位点的氨基酸残基分别为精氨酸、丝氨酸、组氨酸、异亮氨酸和谷氨酸。
[0010]本发明采取的技术方案之二是:一种有机磷酯水解酶，其是在SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的蛋白质的第250位和第263位氨基酸残基中的一位或两位经过取代一个氨基酸残基且具备有机磷酯水解酶活性的由其衍生的蛋白质。
[0011 ] 与0PHC2相比，PoOPH的有机磷酯水解酶活性相对较低。为了提高PoOPH蛋白的有机磷酯水解酶活性，我们通过对PoOPH进行序列和构效分析，选择对底物结合位点的250位组氨酸和263位异亮氨酸进行饱和突变，即突变为其他19种氨基酸，进而将两个位点突变组合，从中筛选有机磷水解活性提高，同时保持酶的热稳定性的PoOPH突变体。
[0012]其中所述蛋白质较佳的为:将具有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的第250位的组氨酸突变为异亮氨酸(PoOPH，H250I)，其对甲基对硫磷的活力为0.43U/mg ;所述氨基酸序列中的第263位的异亮氨酸突变为色氨酸(PoOPH，I263W)，其对甲基对硫磷的活力为2.62U/mg ;所述氨基酸序列的第250位的组氨酸突变为异亮氨酸，同时第263位的异亮氨酸突变为色氨酸，获得的突变蛋白质(PoOPH，H250I/I263W)，其对甲基对硫磷的活力为56.8U/mg，远高于 0PHC2。
[0013]蛋白质0PHC2的第250位和第263位的氨基酸残基分别为亮氨酸和苯丙氨酸，因此本发明所述蛋白质的第250位和第263位的氨基酸残基均不同于0PHC2的相应位点的氨基酸残基。突变蛋白质PoOPH(H250I/I263W)对甲基对硫磷的活力比PoOPH提高了近6000倍，比0PHC2提高了超过10倍，同时保持了 PoOPH的良好的热稳定性。
[0014]本发明采取的技术方案之三是:一种有机磷酯水解酶基因，为一种核酸，所述核酸是SEQ ID N0.2所示核苷酸组成的核酸或具有点突变的核酸，以及编码SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的蛋白质的第250位、第263位氨基酸中的一位或两位经过取代一个氨基酸且具备有机磷酯水解酶活性的由其衍生的蛋白质的核酸。
[0015]所述的核酸的制备方法较佳为:可以从自然界微生物的基因组中分离获得，也可以从含编码表达所述蛋白的氨基酸序列的表达质粒或重组转化体中分离获得，也可以通过全基因序列合成获得。
[0016]如本领域技术人员所知:由于密码子的简并性，编码SEQ ID N0.1的氨基酸序列的碱基序列不仅限于一种，还可以适当引入替换来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换来制得。
[0017]具有点突变的核酸的制备方法较佳为:以序列表中SEQ ID N0.2所示核苷酸组成的核酸为模板，利用含有突变碱基的突变引物(选取需要进行突变的氨基酸上下游各15~20bp的一段碱基序列，将突变位点的氨基酸密码子碱基替换为突变后的氨基酸密码子碱基，作为PCR正向引物，其反向互补序列作为PCR反向引物)，通过PCR扩增，得到具有点突变的核酸。其中所述含有突变点的突变引物序列分别如序列表中SEQ ID N0.3~SEQ IDN0.6所示。[0018]其中所述含有突变碱基的引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为人工合成。
[0019]其中所述PCR扩增为本领域常规技术，反应体系(25μ1)较佳为:上述模板25ng, 10XBuffer2.5μ 1，dNTPs (2mM) 2.5 μ I，一对点突变引物(lOpmol/μ I)各 0.75 μ 1，KOD-pIus-酶0.5U，蒸馏水补足至25 μ I。PCR扩增程序较佳地为:(I) 94 V 2min ；
(2)98°C IOsec ； (3) 55°C 30sec ； (4) 68°C 7min ;步骤(2)~(4)进行 12 个循环。
[0020]本发明采取的技术方案之四是:一种包含本发明所述的核酸序列的重组表达质粒。
[0021]其可通过本领域常规方法制备，即将本发明所述的有机磷酯水解酶基因和突变体的核酸连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种质粒，优选质粒 pET_28a (+)。
[0022]本发明采取的技术方案之五是:一种包含上述重组表达质粒的重组表达转化体。
[0023]其可通过将上述重组表达质粒转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达质粒可稳定地自行复制，且所携带的本发明的基因可被有效表达即可。较佳地为大肠杆菌，更佳地为大肠杆菌E.coli BL2KDE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株。其中所述的转化方法为本领域常规方法，如热激法，电转法等，较佳地为热激法。
[0024]本发明采取的技术方案之六是:一种重组有机磷酯水解酶的制备方法，其中包括如下步骤:培养本发明所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组有机磷酯水解酶。
[0025]其中所述的制备方法可采用本领域常规的培养方法。对于大肠杆菌，较佳地为:将上述重组表达转化体接种至含有50μ g/ml卡那霉素的LB培养基中，30~40°C，150~200rpm培养，培养液的光密度OD600达到0.5~1.0 (较佳地为0.8)，加入0.05~1.0mM (较佳地为0.2mM)的异丙基_β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为16~37°C (优选16°C )，诱导8~24小时即可得到高效表达的重组有机磷酯水解酶。
[0026] 与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于:针对目前有机磷酯水解酶难以同时满足闻活性和闻稳定性的问题，以具有良好热稳定性的有机憐酷水解酶PoOPH作为蛋白质工程改造的起点，通过单点饱和突变以及组合突变，显著提高了有机磷酯水解酶PoOPH的活力，最优的突变体Po0PH(H250I/I263W)对甲基对硫磷的活力达56.8U/mg，对乙基对氧磷活力达1.5U/mg,同时突变体保留了母本的热稳定性，T50值为76°C，Tm值(解链温度)为96.5°C，表现出优良的热稳定性。进化得到的有机磷酯水解酶突变体同时具有高的有机磷水解活性和高的热稳定性，具有很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为食油假单胞菌降解甲基对硫磷分析示意图；
[0028]图2为基因PoOPH的PCR扩增电泳图谱；
[0029]图3为PoOPH的250位点饱和突变筛选结果；
[0030]图4为PoOPH的263位点饱和突变筛选结果；
[0031 ]图5为PoOPH的组合半饱和突变体库筛选结果；
[0032]图6为PoOPH及其突变体的热稳定性表征结果。
【具体实施方式】
[0033]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0034]下列实施例中的菌种、试剂和材料来源:
[0035]食油假单胞菌DSM50188 (Pseudomonas oleovorans DSM50188),来源于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，由本实验室另行保藏。
[0036]表达质粒pET_28a(+)购自上海Novagen公司。
[0037]E.coli DH5 α感受态细胞，Ε.coli BL21 (DE3)感受态细胞，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。
[0038]限制性内切酶BamHI，HindIII，DpnI购自大连宝生物工程有限公司。
[0039]KOD-pIus酶购自上海Τ0Υ0Β0公司。
[0040]实施例1
[0041]有机磷酯水解酶PoOPH的筛选及基因克隆
[0042]选取本课题组保藏的菌株，接种至改良的无机盐培养基中，加入终浓度为IOOppm的甲基对硫磷，在30°C，200rpm条件下培养1_2周，传代三次，利用薄层层析和高效液相色谱鉴定菌株对甲基对硫磷的降解效果。
[0043]改良的无机盐培养基成分为:lg/LNaCl, Ig/L NH4NO3,1.5g/L K2HPO4,0.5g/LKH2PO4,0.2g/L MgSO4.7H20，I g/L 酵母膏。
[0044]培养菌液用氯仿-乙醚(I: 1，v/v)萃取三次，室温挥发萃取剂后，加入甲醇溶解，用于薄层层析和高效液相色谱分析。
[0045]薄层层析展开剂为正己烷:氯仿:甲醇(7: 2: 1，v/v/v)，紫外灯295nm下观察底物或降解产物。高效液相色谱条件为:C18柱，流动相乙腈/水(70: 30，v/v)，流速
1.0ml/min,检测波长273nm。甲基对硫磷出峰时间6.8min。[0046]我们从89株所选菌株中，筛选得到I株能够降解甲基对硫磷的菌株，即食油假单胞菌DSM50188。降解效果如图1所示。
[0047]设计基因克隆引物如下:
[0048]
【权利要求】
1.一种有机磷酯水解酶，其特征在于，为具备有机磷酯水解酶活性的蛋白质，具体为: (a)具有SEQID N0.1所不氣基酸序列的蛋白质；或 (b)具有SEQID N0.1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸替换后形成的新氨基酸序列的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的一种有机磷酯水解酶，其特征在于，所述的蛋白质为具有SEQID N0.1所示氨基酸序列的第250位或第263位氨基酸残基经过一个氨基酸替换后形成的新氨基酸序列的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的一种有机磷酯水解酶，其特征在于，所述的蛋白质为具有SEQID N0.1所示氨基酸序列的第250位及第263位氨基酸残基分别经过一个氨基酸替换后形成的新氨基酸序列的蛋白质。
4.根据权利要求2或3所述的一种有机磷酯水解酶，其特征在于，SEQID N0.1所示氨基酸序列的第250位的组氨酸替换为异亮氨酸:SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的第263位的异亮氨酸替换为色氨酸。
5.一种有机磷酯水解酶基因，其特征在于，为由SEQ ID No:2所示核苷酸序列组成的核酸；或编码如权利要求1所述的有机磷酯水解酶的核酸。
6.一种包含如权利要求5所述的有机磷酯水解酶基因的重组表达质粒。
7.一种包含如权利要求6所述的重组表达质粒的重组表达转化体。
8.—种如权利要求1所述的有机磷酯水解酶的制备方法，其特征在于，首先培养包含有机磷酯水解酶基因的重组表达转化体，然后从培养物中分离获得重组有机磷酯水解酶。
9.一种如权利要求1所述的有机磷酯水解酶的应用，其特征在于，所述的有机磷酯水解酶用于降解有机磷农药。
10.根据权利要求9所述的一种有机磷酯水解酶的应用，其特征在于，所述的有机磷农药为甲基对硫磷、三唑磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、丙溴磷、毒死蜱、二嗪磷、敌敌畏、乐果或辛硫磷。
【文档编号】A62D3/02GK103923893SQ201410167955
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】许建和, 罗晓晶, 潘江, 张志钧 申请人:华东理工大学
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