处理油基钻屑的微生物复合菌剂、其制备方法及应用的制作方法
处理油基钻屑的微生物复合菌剂、其制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种处理油基钻屑的微生物复合菌剂、其制备方法及其应用。发明提供了一种处理油基钻屑的微生物复合菌剂，该复合菌剂包含保藏号为CGMCCNO：8983的铜绿假单胞菌和保藏号为CGMCCNO：8984的鲍曼不动杆菌。本发明还公开了上述微生物复合菌剂的制备方法，包括液态和固态菌剂的制备方法，以及所述复合菌剂在油基钻屑处理中的应用。
【专利说明】处理油基钻屑的微生物复合菌剂、其制备方法及应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及一种处理油基钻屑的微生物复合菌剂、其制备方法及其应用，具体涉 及根据微生物生态学原理，利用菌株之间的共生、互生、协同作用等相互作用关系构建成的 微生物复合菌剂、其制备方法及其应用，属于微生物领域。 【背景技术】
[0002] 随着我国油气勘探开发的发展，多分支井、水平井和复杂地质井钻井越来越多，井 壁稳定的问题越来越突出，油基钻井液技术受到越来越多的重视而不断的发展，相应产生 的废弃油基污染物的数量不断增加。其中油基钻屑含有大量的、重金属和有机物等污染物， 已被列入国家危险废弃物。
[0003] 油基钻屑一般暂存在井场中，由于渗漏、溢出、淹没等原因会对地下水、地表水、土 地、植被等造成严重的污染事故和安全隐患。油基钻屑中一般含油率在10% -30%，一般来 说一口中等深度的井产生废弃钻屑100-200m3,其中含有大量的苯系物、酚类、蒽、芘等有恶 臭的有毒致癌物质，成分十分复杂。油基钻屑直接排放将对环境的影响主要体现在以下几 个方面：1、有机污染物污染地表水和地下水资源；2、石油类对植物的生长有毒害作用，长 期滞留土壤抑制植物生长和土壤微生物繁殖；3、高浓度可溶性盐会造成周围土壤硬化，减 少土壤肥力；4、油基钻屑中含有大量的铜、铅、铬等重金属离子，进入土壤后被作物吸收最 终通过食物链作用进入人体，危害人体健康。
[0004] 随着我国对环境保护、安全的要求加强，解决油基钻屑的无害化、资源化利用问题 已经成为油气工业清洁生产与可持续发展面临的新课题。由于油基钻屑成分的复杂性和高 毒性，到目前为止，还没有成熟的技术能够将钻屑中的油类物质完全降解。目前油基钻屑无 害化处理主要分为物理处理、化学处理和生物处理三种方法。其中物化处理技术是国内外 如今普遍采用较成熟的方法，但该技术大多都存在处理费用高昂、二次污染严重、普适性差 等问题；生物处理技术被认为最经济和最具永续利用的环保型技术。该技术在国外起步较 早，现已得到较多应用，而国内对于油基钻屑的微生物处理技术应用还较为匮乏，因此开发 新型高效的油基钻屑的微生物处理技术与应用研究，对保障油气田勘探开发的正常进行、 保护油气田安全、绿色、和谐的可持续生产具有非常重要意义。
[0005] 微生物处理油基钻屑的核心是高效降油功能微生物菌种，通过分离筛选高效降油 功能菌株并优化组合配伍成微生物菌剂，再接种于油基钻屑中可以有效降低其含油量，实 现油基钻屑的无害化处理。
【发明内容】
[0006] 本发明的主要目的是为石油、天然气生产企业的油基钻屑提供一种符合环保要 求、可操控性强、经济适用、可持续利用的微生物复合菌剂，以及该复合菌剂的制备方法及 其应用。
[0007] 为实现本发明的上述目的，本发明提供了一种处理油基钻屑的微生物复合菌剂， 该复合菌剂包含保藏号为CGMCC NO :8983的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)和保 藏号为 CGMCC NO :8984 的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii)。
[0008] 进一步地，本发明所述的处理油基钻屑的微生物复合菌剂中，所述的铜绿假单胞 菌（Pseudomonas aeruginosa)和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii)的菌数比为 2 : 1 ?6 :1 〇
[0009] 其中涉及菌株是采用选择性培养基法筛选得到：在受油基钻屑污染的生境中 取土样，将土样加入含有柴油的选择性液体培养基中培养，通过长期胁迫生长，再将胁迫 培养的培养液通过含有柴油的选择性固体培养基分离得到高活性菌株一铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii)。
[0010] 其中涉及的相关保藏信息为：
[0011] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2014年4月1日；保藏编号： X7 (CGMCC NO :8983)和 XII (CGMCC NO :8984);分类名：X7 为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa), XII 为鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii) 〇
[0012] 所述菌剂既可以是液态的，也可以是固态的。
[0013] 本发明还提供了上述处理油基钻屑的微生物复合菌剂的制备方法，可以通过以下 技术方案来实现：
[0014] 1、所用的菌株为二株细菌，分别是：
[0015] X7 (CGMCC NO :8983)和 XII (CGMCC N0 :8984)，其中 X7 为铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)，XII 为鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii) 〇
[0016] 2、培养基
[0017] (1)牛肉膏蛋白胨固体培养基，用于菌种活化，其配方为：
[0018] 牛肉膏 5g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、琼脂 15-20g、水 1000mL、pH7. 0-7. 5。
[0019] (2)用于处理油基钻屑的微生物复合菌剂发酵的液体培养基组成包括：葡萄糖 5?10g、牛肉膏0.5?lg、蛋白胨2?5g、氯化钠2?5g、柴油20?30g、水lOOOmL，液体 培养基 PH6. 5-7. 0。
[0020] 3、菌剂的制备
[〇〇21] (1)将两种菌种分别接入牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基活化备用；
[0022] (2)将灭菌处理过的液体培养基定量备用；
[0023] (3)将活化后的菌种分别接入灭菌处理过的液体培养基中培养24小时；
[0024] (4)分别将培养好的各菌液计数调节，优选分别调二菌株的含菌量均为109CFU/ mL，然后将两种菌液进行组合，按铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的菌数比为2 :1?6 :1进 行组合，优选按菌数比2 :1进行组合，即得到处理油基钻屑的液态微生物复合菌剂。
[0025] 在液态微生物复合菌剂的基础上，进一步制备处理油基钻屑的固态微生物复合菌 齐U，制备步骤还包括：
[0026] (1)将灭菌处理过的麸皮或米糠或木屑或其混合物干燥定量，作吸附剂用；
[0027] (2)每升液态微生物复合菌剂中加入吸附剂1千克，搅拌混匀，然后在35°C恒温培 养箱中烘干培养20-24小时，至含水量为15-20%，即为烘干菌剂，再按每千克烘干菌剂加 入5g促进剂，搅拌均匀，即为固态微生物复合菌剂，定量封包低温保存。
[0028] 所述的吸附剂为经过灭菌处理的干燥麸皮或米糠或木屑或其混合物；所述的促进 剂为用于活化菌剂的酵母浸粉。
[0029] 上述制备的处理油基钻屑的微生物复合菌剂的主要指标为：
[0030] 处理油基钻屑的液态微生物复合菌剂：活菌数大于等于10亿CFU/mL ;pH6-7 ;悬 液、颜色乳白。
[0031] 处理油基钻屑的固态微生物复合菌剂：活菌数大于等于10亿CFU/g ;颗粒干燥、表 面暗红。
[0032] 4、使用方法及条件
[0033] 该处理油基钻屑的微生物复合菌剂用于油基钻屑中油类物质的降解。其使用方法 为：液态微生物复合菌剂按油基钻屑质量的1% -5%直接喷洒于油基钻屑堆体；固态微生 物复合菌剂按油基钻屑质量的1% -5%先用生理盐水把菌剂调匀，在30°C环境下活化3-5 小时，随后和油基钻屑充分混合均匀，成堆体处理。
[〇〇34] 本发明的优点在于：
[0035] (1)利用菌剂的生理代谢活动，将有毒有害的长链烃类物质或有机高分子油类物 质降解成为环境可接受的低分子、水和二氧化碳等无害物，实现对油基钻屑中油类物质的 低成本、无害化处理。
[0036] (2)实现了菌株的有效组合，组合后的菌剂比单菌使用范围得到扩大。
[〇〇37] (3)改进了菌剂的保藏方法，通过制成固态复合菌剂，延长了产品的使用寿命。
[0038] (4)符合生物安全法规，菌剂中包含的菌株均从被油基钻屑污染胁迫选择环境中 筛选得到，不会对周围环境和生态平衡造成危害。
[0039] (5)使用方面，包装、运输便利，易形成商品化。 【具体实施方式】
[0040] 实施例1
[0041] 该复合菌剂涉及菌株是采用选择性培养基法筛选得到，具体步骤如下：
[0042] (1)在受油基钻屑污染的生境中取土样10g。
[0043] (2)将10g 土样加入到200mL选择性液体培养基中振荡（35°C、120转/分钟）培 养30d，选择性液体培养基配方为：葡萄糖5g、牛肉膏0. 5g、蛋白胨2g、氯化钠2g、柴油20g、 水 1000mL，培养基 ρΗ6· 5。
[0044] (3)取培养30d的培养液，在选择性固体培养基上通过平板划线分离法筛选得到 高活性菌株一铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii)。选择性固体培养基配方为：葡萄糖5g、牛肉膏0. 5g、蛋白胨2g、氯化钠2g、柴 油20g、水1000mL，琼脂20g、培养基ρΗ6· 5。
[0045] 实施例2
[0046] (1)将高温灭菌处理（121°C、30分钟）的牛肉膏蛋白胨固体培养基定量备用，牛肉 膏蛋白胨固体培养基的配方为蛋白胨20g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、水1000mL、琼脂15-20g、 ρΗ6· 5-7. 0〇
[0047] (2)将菌种Χ7和XII分别接入灭菌处理过（121°C、30分钟）的牛肉膏蛋白胨固体 斜面培养基中活化备用。
[0048] (3)将高温灭菌处理过（121°C、30分钟）的液体培养基定量备用，液体培养基组分 包括：葡萄糖l〇g、牛肉膏lg、蛋白胨5g、氯化钠5g、柴油20g、水lOOOmL，pH6. 5-7. 0。
[0049] (4)将活化的菌种分别接入到液体培养基中振荡（35°C、140转/分钟）培养24小 时。
[0050] (5)将培养好的菌液计数，调二菌株的含菌量为109CFU/mL，按X7 :X11 = 2:1的体 积比进行组合成混合菌液，即为液态微生物复合菌剂。
[0051] 实施例3
[0052] 制备液态微生物复合菌剂的方法与实施例1相同，不同之处在于，液体培养基组 成包括：葡萄糖5g、牛肉膏0.5g、蛋白胨2g、氯化钠2g、柴油30g、水1000mL，pH6.5-7.0 ;X7 : XII的体积比为6:1。
[0053] 在制得液态微生物复合菌剂后，向其中加入干燥麸皮作为吸附剂，加入量为：每 1L液态微生物复合菌剂加入吸附剂lKg，然后在35°C的恒温培养箱中烘干（含水量为 15% -20% )，再按每千克烘干菌剂中加入5g酵母浸粉作为促进剂，搅拌均匀，最后封包低 温保存（4°C -KTC )。
[0054] 实施例4
[0055] 向装有50kg含油率为15%的油基（柴油）钻屑的处理装置（100L)中加入500g 液态微生物复合菌剂，直接喷洒于油基钻屑堆体；同时做不加菌剂的对照，10天、30天、50 天后分别测定油类物质浓度，测定结果如表1。
[0056] 表1菌剂降油效果
[0057]
【权利要求】
1. 处理油基钻屑的微生物复合菌剂，其特征在于：该复合菌剂中包含保藏号为CGMCC NO :8983的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)和保藏号为CGMCC NO :8984的鲍曼不 动杆菌（Acinetobacterbaumannii)。
2. 如权利要求1所述的处理油基钻屑的微生物复合菌剂，其特征在于：铜绿假单胞菌 和鲍曼不动杆菌的菌数比为2 :1?6 :1。
3. 根据权利要求2所述的处理油基钻屑的微生物复合菌剂，其特征在于：所述菌剂为 液态微生物复合菌剂或固态微生物复合菌剂。
4. 制备如权利要求3所述的处理油基钻屑的液态微生物复合菌剂的方法，其特征在 于，包括以下步骤： (1) 菌种活化：将铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌分别接入牛肉膏蛋白胨固体斜面培养 基进行活化培养； (2) 菌种繁殖：将活化后的菌种分别接入灭菌处理过的液体培养基中培养24小时； (3) 菌种复合：分别对菌液的含菌量进行调节，铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的菌数 比为2 :1?6 :1，再将两种菌液进行混合，制得液态微生物复合菌剂。
5. 如权利要求4所述的制备处理油基钻屑的液态微生物复合菌剂的方法，其特征在 于：所述液体培养基组成包括葡萄糖5?10g、牛肉膏0. 5?lg、蛋白胨2?5g、氯化钠2? 5g、柴油 20 ?30g、水 lOOOmL，ρΗ6· 5-7. 0。
6. -种如权利要求4或5所述方法制备的液态微生物复合菌剂的应用，其特征在于，将 液态微生物复合菌剂按油基钻屑质量的1% -5%直接喷洒于油基钻屑堆体。
7. 制备如权利要求3所述的处理油基钻屑的固态微生物复合菌剂的方法，其特征在 于，包括以下步骤： (1) 菌种活化：将铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌分别接入牛肉膏蛋白胨固体斜面培养 基进行活化培养； (2) 菌种繁殖：将活化后的菌种分别接入灭菌处理过的液体培养基中培养24小时； (3) 菌种复合：分别对菌液的含菌量进行调节，铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的菌数 比为2 :1?6 :1，再将两种菌液进行混合，制得液态微生物复合菌剂； (4) 向液态微生物复合菌剂中加入经灭菌处理过的吸附剂，搅拌混匀，然后在35°C恒 温培养箱中烘干培养20-24小时，至含水量为15-20%，制得烘干菌剂；再向烘干菌剂中加 入促进剂，搅拌均匀，制得固态微生物复合菌剂。
8. 如权利要求7所述的制备处理油基钻屑的固态微生物复合菌剂的方法，其特征在 于：所述液体培养基组成包括葡萄糖5?10g、牛肉膏0. 5?lg、蛋白胨2?5g、氯化钠2? 5g、柴油 20 ?30g、水 lOOOmL，ρΗ6· 5-7. 0。
9. 一种如权利要求7或8所述方法制备的固态微生物复合菌剂的应用，其特征在于： 将固态微生物复合菌剂先用生理盐水调匀，固态微生物复合菌剂的质量为油基钻屑质量的 1% -5%，在30°C环境下活化3-5小时，随后和油基钻屑充分混合均匀，成堆体处理。
【文档编号】A62D3/02GK104059867SQ201410270862
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】闫志英, 袁月祥, 操卫平, 张博廉, 许力山, 李 东, 刘晓风 申请人:中国科学院成都生物研究所, 四川仁智油田技术服务股份有限公司
【专利摘要】本发明涉及一种处理油基钻屑的微生物复合菌剂、其制备方法及其应用。发明提供了一种处理油基钻屑的微生物复合菌剂，该复合菌剂包含保藏号为CGMCCNO：8983的铜绿假单胞菌和保藏号为CGMCCNO：8984的鲍曼不动杆菌。本发明还公开了上述微生物复合菌剂的制备方法，包括液态和固态菌剂的制备方法，以及所述复合菌剂在油基钻屑处理中的应用。
【专利说明】处理油基钻屑的微生物复合菌剂、其制备方法及应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及一种处理油基钻屑的微生物复合菌剂、其制备方法及其应用，具体涉 及根据微生物生态学原理，利用菌株之间的共生、互生、协同作用等相互作用关系构建成的 微生物复合菌剂、其制备方法及其应用，属于微生物领域。 【背景技术】
[0002] 随着我国油气勘探开发的发展，多分支井、水平井和复杂地质井钻井越来越多，井 壁稳定的问题越来越突出，油基钻井液技术受到越来越多的重视而不断的发展，相应产生 的废弃油基污染物的数量不断增加。其中油基钻屑含有大量的、重金属和有机物等污染物， 已被列入国家危险废弃物。
[0003] 油基钻屑一般暂存在井场中，由于渗漏、溢出、淹没等原因会对地下水、地表水、土 地、植被等造成严重的污染事故和安全隐患。油基钻屑中一般含油率在10% -30%，一般来 说一口中等深度的井产生废弃钻屑100-200m3,其中含有大量的苯系物、酚类、蒽、芘等有恶 臭的有毒致癌物质，成分十分复杂。油基钻屑直接排放将对环境的影响主要体现在以下几 个方面：1、有机污染物污染地表水和地下水资源；2、石油类对植物的生长有毒害作用，长 期滞留土壤抑制植物生长和土壤微生物繁殖；3、高浓度可溶性盐会造成周围土壤硬化，减 少土壤肥力；4、油基钻屑中含有大量的铜、铅、铬等重金属离子，进入土壤后被作物吸收最 终通过食物链作用进入人体，危害人体健康。
[0004] 随着我国对环境保护、安全的要求加强，解决油基钻屑的无害化、资源化利用问题 已经成为油气工业清洁生产与可持续发展面临的新课题。由于油基钻屑成分的复杂性和高 毒性，到目前为止，还没有成熟的技术能够将钻屑中的油类物质完全降解。目前油基钻屑无 害化处理主要分为物理处理、化学处理和生物处理三种方法。其中物化处理技术是国内外 如今普遍采用较成熟的方法，但该技术大多都存在处理费用高昂、二次污染严重、普适性差 等问题；生物处理技术被认为最经济和最具永续利用的环保型技术。该技术在国外起步较 早，现已得到较多应用，而国内对于油基钻屑的微生物处理技术应用还较为匮乏，因此开发 新型高效的油基钻屑的微生物处理技术与应用研究，对保障油气田勘探开发的正常进行、 保护油气田安全、绿色、和谐的可持续生产具有非常重要意义。
[0005] 微生物处理油基钻屑的核心是高效降油功能微生物菌种，通过分离筛选高效降油 功能菌株并优化组合配伍成微生物菌剂，再接种于油基钻屑中可以有效降低其含油量，实 现油基钻屑的无害化处理。
【发明内容】
[0006] 本发明的主要目的是为石油、天然气生产企业的油基钻屑提供一种符合环保要 求、可操控性强、经济适用、可持续利用的微生物复合菌剂，以及该复合菌剂的制备方法及 其应用。
[0007] 为实现本发明的上述目的，本发明提供了一种处理油基钻屑的微生物复合菌剂， 该复合菌剂包含保藏号为CGMCC NO :8983的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)和保 藏号为 CGMCC NO :8984 的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii)。
[0008] 进一步地，本发明所述的处理油基钻屑的微生物复合菌剂中，所述的铜绿假单胞 菌（Pseudomonas aeruginosa)和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii)的菌数比为 2 : 1 ?6 :1 〇
[0009] 其中涉及菌株是采用选择性培养基法筛选得到：在受油基钻屑污染的生境中 取土样，将土样加入含有柴油的选择性液体培养基中培养，通过长期胁迫生长，再将胁迫 培养的培养液通过含有柴油的选择性固体培养基分离得到高活性菌株一铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii)。
[0010] 其中涉及的相关保藏信息为：
[0011] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2014年4月1日；保藏编号： X7 (CGMCC NO :8983)和 XII (CGMCC NO :8984);分类名：X7 为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa), XII 为鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii) 〇
[0012] 所述菌剂既可以是液态的，也可以是固态的。
[0013] 本发明还提供了上述处理油基钻屑的微生物复合菌剂的制备方法，可以通过以下 技术方案来实现：
[0014] 1、所用的菌株为二株细菌，分别是：
[0015] X7 (CGMCC NO :8983)和 XII (CGMCC N0 :8984)，其中 X7 为铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)，XII 为鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii) 〇
[0016] 2、培养基
[0017] (1)牛肉膏蛋白胨固体培养基，用于菌种活化，其配方为：
[0018] 牛肉膏 5g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、琼脂 15-20g、水 1000mL、pH7. 0-7. 5。
[0019] (2)用于处理油基钻屑的微生物复合菌剂发酵的液体培养基组成包括：葡萄糖 5?10g、牛肉膏0.5?lg、蛋白胨2?5g、氯化钠2?5g、柴油20?30g、水lOOOmL，液体 培养基 PH6. 5-7. 0。
[0020] 3、菌剂的制备
[〇〇21] (1)将两种菌种分别接入牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基活化备用；
[0022] (2)将灭菌处理过的液体培养基定量备用；
[0023] (3)将活化后的菌种分别接入灭菌处理过的液体培养基中培养24小时；
[0024] (4)分别将培养好的各菌液计数调节，优选分别调二菌株的含菌量均为109CFU/ mL，然后将两种菌液进行组合，按铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的菌数比为2 :1?6 :1进 行组合，优选按菌数比2 :1进行组合，即得到处理油基钻屑的液态微生物复合菌剂。
[0025] 在液态微生物复合菌剂的基础上，进一步制备处理油基钻屑的固态微生物复合菌 齐U，制备步骤还包括：
[0026] (1)将灭菌处理过的麸皮或米糠或木屑或其混合物干燥定量，作吸附剂用；
[0027] (2)每升液态微生物复合菌剂中加入吸附剂1千克，搅拌混匀，然后在35°C恒温培 养箱中烘干培养20-24小时，至含水量为15-20%，即为烘干菌剂，再按每千克烘干菌剂加 入5g促进剂，搅拌均匀，即为固态微生物复合菌剂，定量封包低温保存。
[0028] 所述的吸附剂为经过灭菌处理的干燥麸皮或米糠或木屑或其混合物；所述的促进 剂为用于活化菌剂的酵母浸粉。
[0029] 上述制备的处理油基钻屑的微生物复合菌剂的主要指标为：
[0030] 处理油基钻屑的液态微生物复合菌剂：活菌数大于等于10亿CFU/mL ;pH6-7 ;悬 液、颜色乳白。
[0031] 处理油基钻屑的固态微生物复合菌剂：活菌数大于等于10亿CFU/g ;颗粒干燥、表 面暗红。
[0032] 4、使用方法及条件
[0033] 该处理油基钻屑的微生物复合菌剂用于油基钻屑中油类物质的降解。其使用方法 为：液态微生物复合菌剂按油基钻屑质量的1% -5%直接喷洒于油基钻屑堆体；固态微生 物复合菌剂按油基钻屑质量的1% -5%先用生理盐水把菌剂调匀，在30°C环境下活化3-5 小时，随后和油基钻屑充分混合均匀，成堆体处理。
[〇〇34] 本发明的优点在于：
[0035] (1)利用菌剂的生理代谢活动，将有毒有害的长链烃类物质或有机高分子油类物 质降解成为环境可接受的低分子、水和二氧化碳等无害物，实现对油基钻屑中油类物质的 低成本、无害化处理。
[0036] (2)实现了菌株的有效组合，组合后的菌剂比单菌使用范围得到扩大。
[〇〇37] (3)改进了菌剂的保藏方法，通过制成固态复合菌剂，延长了产品的使用寿命。
[0038] (4)符合生物安全法规，菌剂中包含的菌株均从被油基钻屑污染胁迫选择环境中 筛选得到，不会对周围环境和生态平衡造成危害。
[0039] (5)使用方面，包装、运输便利，易形成商品化。 【具体实施方式】
[0040] 实施例1
[0041] 该复合菌剂涉及菌株是采用选择性培养基法筛选得到，具体步骤如下：
[0042] (1)在受油基钻屑污染的生境中取土样10g。
[0043] (2)将10g 土样加入到200mL选择性液体培养基中振荡（35°C、120转/分钟）培 养30d，选择性液体培养基配方为：葡萄糖5g、牛肉膏0. 5g、蛋白胨2g、氯化钠2g、柴油20g、 水 1000mL，培养基 ρΗ6· 5。
[0044] (3)取培养30d的培养液，在选择性固体培养基上通过平板划线分离法筛选得到 高活性菌株一铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii)。选择性固体培养基配方为：葡萄糖5g、牛肉膏0. 5g、蛋白胨2g、氯化钠2g、柴 油20g、水1000mL，琼脂20g、培养基ρΗ6· 5。
[0045] 实施例2
[0046] (1)将高温灭菌处理（121°C、30分钟）的牛肉膏蛋白胨固体培养基定量备用，牛肉 膏蛋白胨固体培养基的配方为蛋白胨20g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、水1000mL、琼脂15-20g、 ρΗ6· 5-7. 0〇
[0047] (2)将菌种Χ7和XII分别接入灭菌处理过（121°C、30分钟）的牛肉膏蛋白胨固体 斜面培养基中活化备用。
[0048] (3)将高温灭菌处理过（121°C、30分钟）的液体培养基定量备用，液体培养基组分 包括：葡萄糖l〇g、牛肉膏lg、蛋白胨5g、氯化钠5g、柴油20g、水lOOOmL，pH6. 5-7. 0。
[0049] (4)将活化的菌种分别接入到液体培养基中振荡（35°C、140转/分钟）培养24小 时。
[0050] (5)将培养好的菌液计数，调二菌株的含菌量为109CFU/mL，按X7 :X11 = 2:1的体 积比进行组合成混合菌液，即为液态微生物复合菌剂。
[0051] 实施例3
[0052] 制备液态微生物复合菌剂的方法与实施例1相同，不同之处在于，液体培养基组 成包括：葡萄糖5g、牛肉膏0.5g、蛋白胨2g、氯化钠2g、柴油30g、水1000mL，pH6.5-7.0 ;X7 : XII的体积比为6:1。
[0053] 在制得液态微生物复合菌剂后，向其中加入干燥麸皮作为吸附剂，加入量为：每 1L液态微生物复合菌剂加入吸附剂lKg，然后在35°C的恒温培养箱中烘干（含水量为 15% -20% )，再按每千克烘干菌剂中加入5g酵母浸粉作为促进剂，搅拌均匀，最后封包低 温保存（4°C -KTC )。
[0054] 实施例4
[0055] 向装有50kg含油率为15%的油基（柴油）钻屑的处理装置（100L)中加入500g 液态微生物复合菌剂，直接喷洒于油基钻屑堆体；同时做不加菌剂的对照，10天、30天、50 天后分别测定油类物质浓度，测定结果如表1。
[0056] 表1菌剂降油效果
[0057]
【权利要求】
1. 处理油基钻屑的微生物复合菌剂，其特征在于：该复合菌剂中包含保藏号为CGMCC NO :8983的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)和保藏号为CGMCC NO :8984的鲍曼不 动杆菌（Acinetobacterbaumannii)。
2. 如权利要求1所述的处理油基钻屑的微生物复合菌剂，其特征在于：铜绿假单胞菌 和鲍曼不动杆菌的菌数比为2 :1?6 :1。
3. 根据权利要求2所述的处理油基钻屑的微生物复合菌剂，其特征在于：所述菌剂为 液态微生物复合菌剂或固态微生物复合菌剂。
4. 制备如权利要求3所述的处理油基钻屑的液态微生物复合菌剂的方法，其特征在 于，包括以下步骤： (1) 菌种活化：将铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌分别接入牛肉膏蛋白胨固体斜面培养 基进行活化培养； (2) 菌种繁殖：将活化后的菌种分别接入灭菌处理过的液体培养基中培养24小时； (3) 菌种复合：分别对菌液的含菌量进行调节，铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的菌数 比为2 :1?6 :1，再将两种菌液进行混合，制得液态微生物复合菌剂。
5. 如权利要求4所述的制备处理油基钻屑的液态微生物复合菌剂的方法，其特征在 于：所述液体培养基组成包括葡萄糖5?10g、牛肉膏0. 5?lg、蛋白胨2?5g、氯化钠2? 5g、柴油 20 ?30g、水 lOOOmL，ρΗ6· 5-7. 0。
6. -种如权利要求4或5所述方法制备的液态微生物复合菌剂的应用，其特征在于，将 液态微生物复合菌剂按油基钻屑质量的1% -5%直接喷洒于油基钻屑堆体。
7. 制备如权利要求3所述的处理油基钻屑的固态微生物复合菌剂的方法，其特征在 于，包括以下步骤： (1) 菌种活化：将铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌分别接入牛肉膏蛋白胨固体斜面培养 基进行活化培养； (2) 菌种繁殖：将活化后的菌种分别接入灭菌处理过的液体培养基中培养24小时； (3) 菌种复合：分别对菌液的含菌量进行调节，铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的菌数 比为2 :1?6 :1，再将两种菌液进行混合，制得液态微生物复合菌剂； (4) 向液态微生物复合菌剂中加入经灭菌处理过的吸附剂，搅拌混匀，然后在35°C恒 温培养箱中烘干培养20-24小时，至含水量为15-20%，制得烘干菌剂；再向烘干菌剂中加 入促进剂，搅拌均匀，制得固态微生物复合菌剂。
8. 如权利要求7所述的制备处理油基钻屑的固态微生物复合菌剂的方法，其特征在 于：所述液体培养基组成包括葡萄糖5?10g、牛肉膏0. 5?lg、蛋白胨2?5g、氯化钠2? 5g、柴油 20 ?30g、水 lOOOmL，ρΗ6· 5-7. 0。
9. 一种如权利要求7或8所述方法制备的固态微生物复合菌剂的应用，其特征在于： 将固态微生物复合菌剂先用生理盐水调匀，固态微生物复合菌剂的质量为油基钻屑质量的 1% -5%，在30°C环境下活化3-5小时，随后和油基钻屑充分混合均匀，成堆体处理。
【文档编号】A62D3/02GK104059867SQ201410270862
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】闫志英, 袁月祥, 操卫平, 张博廉, 许力山, 李 东, 刘晓风 申请人:中国科学院成都生物研究所, 四川仁智油田技术服务股份有限公司
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