羧酸酯酶、其编码基因及其应用的制作方法
羧酸酯酶、其编码基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的羧酸酯酶、编码上述羧酸酯酶的基因、包含上述基因的重组载体、包含上述基因的重组菌株和上述羧酸酯酶在邻苯二甲酸二异丁酯降解中的应用。本发明的羧酸酯酶基因CarEW来源于温泉环境，并证实其在45℃条件下具有很好的活性和稳定性，可用于环境中酞酸酯类化合物(邻苯二甲酸酯)，如邻苯二甲酸二异丁酯的降解，在环境污染治理方面具有重要意义。
【专利说明】羧酸酯酶、其编码基因及其应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于基因工程【技术领域】，尤其涉及一种羧酸酯酶、其编码基因及其应用。 【背景技术】
[0002] 邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate, DIBP)属于酞酸酯类化合物，是塑 料工业中广泛应用的增塑剂和软化剂，其作用是增加塑料的可塑性和韧性，提高塑料强度 (赵振华，环境化学，1991，10 (3) :64-68)。此外，DIBP在涂料、印染、化妆品和香料的生产过 程中应用也较为广泛。近年来研究表明，DIBP仅靠分子间作用与高分子塑料结合，随着时 间的推移该类物质可以通过食品包装材料直接迁移到食品中，也可通过含有该物质的塑料 制品迁移到环境中，从而对空气、水、土壤和食品等造成污染，并可通过呼吸、饮食和皮肤进 入人体内，对人体造成危害（Zhang et al·，Environ Geochem Health, 2014, 36:505-515)。 因此，寻找合理、有效的降解DIBP的方法和途径逐渐成为各国研究者所关注的问题。由于 生物降解是处理环境中DIBP类污染物的主要途径，因此筛选高效专性或兼性的DIBP类有 机污染物降解菌或降解酶成为研究的热点。
[0003] 羧酸酯酶（Carboxylesterases, EC3. L L 1)是一类能够催化水解羧酸酯生成 羧酸和醇的非特异性酯酶，与脂肪酶同属于α/β水解酶家族成员，其氨基酸序列含 有Ser-Asp-His三联体结构，Ser，Asp, His构成了羧酸酯酶的催化活性中心（Nardini et al·，Current Opinion in Structural Biology, 1999, 9:732-737)。羧酸酯酶广泛 分布于动物、植物和微生物中（Melloney et al·，Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2005, 32:261-270),在催化酯水解、酯合成和酯交换等过程中具有重要应用 价值，具有良好的区域选择性和立体选择性（Ramos et al·，Agricultural and Biological Chemistry, 1987, 51:1833-1838)。但迄今为止，关于羧酸酯酶对酞酸酯类化合物降解的研 究甚少。
[0004] 利用微生物降解酞酸酯类化合物大多数是依靠胞内酶解作用，但由于野生菌株产 酶能力有限、发酵周期长、纯化复杂、难以大量生产，生产成本高，限制了其推广应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种羧酸酯酶。
[0006] 本发明的再一目的是提供编码上述羧酸酯酶的基因。
[0007] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0008] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0009] 本发明的另一个目的是提供上述羧酸酯酶在邻苯二甲酸二异丁酯降解中的应用。
[0010] 本发明所述羧酸酯酶CarEW可得自芽孢杆菌（Bacillus sp.)，如Bacillus sp. ATCC31072,羧酸酯酶CarEW的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 本发明的羧酸酯酶CarEW总共含有488个氨基酸，理论分子量为53. 76kDa。该酶 以4-硝基苯丁酸酯（pNPC4)为最适底物；最适温度45°C ;最适pH值7. 5 ;终浓度ImM的金 属离子K+、Cu2+、Na+和Zn2+对羧酸酯酶CarEW有激活作用，Ag+、Hg 2+等对羧酸酯酶CarEW有 较强的抑制作用；在37°C和45°C下保温60min，羧酸酯酶的酶活分别保持在54%和58%以 上；在pH值5. 0?10. 0的缓冲液中处理60min，羧酸酯酶的酶活在pH值7. 0?8. 0之间比 较稳定，保持80%以上的酶活力；在pH值7. 5及45°C反应时，羧酸酯酶CarEW对0. 6mmol/ L的pNPC4比活力为636U±0. 01U/mg。此外，羧酸酯酶CarEW对α -乙酸萘酯、β -乙酸萘 酯、乙酸-4-硝基苯酯（pNPC2)、己酸-4-硝基苯酯（pNPC6)、4-硝基苯基辛酸酯（pNPC 8)、对 硝基苯酚癸酸酯（pNPC1(l)、月桂酸-4-硝基苯酯（pNPC12)等底物也具有很好的降解作用。
[0012] 本发明提供了编码上述羧酸酯酶的基因 CarEW，该基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0013] 本发明通过PCR的方法克隆了羧酸酯酶基因 CarEW，其全长1464bp，起始密码为 ATG，终止密码为TGA。
[0014] 本发明还提供了包含上述羧酸酯酶基因 CarEW的重组载体，优选为 pEASY?-E2-CarEW。将本发明的羧酸酯酶基因与pEASY?-E2进行T-A连接，使其核苷酸序列 与表达调控序列相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEASY?-E2-CarEW。
[0015] 本发明还提供了包含上述羧酸酯酶基因 CarEW的重组菌株，优选所述菌株为大肠 杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21 (DE3)/CarEW。
[0016] 本发明制备羧酸酯酶CarEW的方法按以下步骤进行：
[0017] 1)用上述重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
[0018] 2)培养重组菌株，诱导重组羧酸酯酶表达；
[0019] 3)回收并纯化所表达的羧酸酯酶CarEW。
[0020] 其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大 肠杆菌细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株BL21 (DE3) /CarEW。
[0021] 本发明提供了羧酸酯酶基因 CarEW，其编码的羧酸酯酶CarEW以4-硝基苯丁酸酯 (pNPC4)为最适底物；最适温度45°C ;最适pH7. 5 ;终浓度为ImM的金属离子K+、Cu2+、Na+和 Zn2+对羧酸酯酶CarEW有激活作用，Ag+、Hg2+等对羧酸酯酶CarEW有较强的抑制作用；在 37°C和45°C下保温60min，酶活分别保持在54%和58%以上；在pH5. 0-10. 0缓冲液中处 理60min，羧酸酯酶的酶活在pH7. 0-8. 0之间比较稳定，保持80 %以上的酶活力；在pH7. 5 及45°C反应时，羧酸酯酶CarEW对0. 6mmol/L pNPC4的比活力为636U±0. 01U/mg。此外， 羧酸酯酶CarEW对α -乙酸萘酯、β -乙酸萘酯、乙酸-4-硝基苯酯（pNPC2)、己酸-4-硝基 苯酯（pNPC6)、4-硝基苯基辛酸酯（pNPC 8)、对硝基苯酚癸酸酯（pNPC1(l)、月桂酸-4-硝基苯 酯（pNPC12)等底物也具有很好的降解作用。
[0022] 本发明的羧酸酯酶CarEW在邻苯二甲酸二异丁酯降解中的应用，其中，邻苯二甲 酸二异丁酯为增塑剂。
[0023] 其应用方法如下：
[0024] 取1U羧酸酯酶CarEW加入到含有浓度为30mg/L的增塑剂邻苯二甲酸二异丁酯的 10mmol/L、pH值7. 5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，总反应体系为0. 5mL，37°C反应，即可 对增塑剂邻苯二甲酸二异丁酯进行降解。
[0025] 取抽提液于气质联用（6(：/^5)上进行定量分析，结果表明，9〇1^11内有77%的邻苯 二甲酸二异丁酯被降解。
[0026] 本发明的羧酸酯酶基因 CarEW来源于温泉环境，并证实其在45°C条件下具有很好 的活性和稳定性，可用于环境中酞酸酯类化合物（邻苯二甲酸酯）的降解，尤其可高效降解 邻苯二甲酸二异丁酯，在环境污染治理方面具有重要意义。此外，酞酸酯类化合物对生物和 环境的危害近年来才逐渐被认知，相关研究报道较少，而生物降解是处理环境中DiBPs的 主要途径，因此本发明对开发微生物来源的羧酸酯酶对酞酸酯类化合物降解的应用具有重 要意义。同时，本发明具有培养周期短、易于获得纯蛋白等优点。 【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为在大肠杆菌中表达的重组羧酸酯酶CarEW的SDS-PAGE分析，其中，Μ :低分 子量蛋白质Marker ;1 :纯化的重组羧酸酯酶CarEW ;
[0028] 图2为羧酸酯酶的温度和酶活的曲线图；
[0029] 图3为羧酸酯酶的温度稳定性的曲线图；
[0030] 图4为羧酸酯酶的pH值和酶活的曲线图；
[0031] 图5为羧酸酯酶的pH稳定性试验结果；
[0032] 图6为羧酸酯酶CarEW的1/[S]与1/V的关系曲线图；
[0033] 图7为增塑剂邻苯二甲酸二异丁酯的标准曲线；
[0034] 图8为重组羧酸酯酶CarEW对邻苯二甲酸二异丁酯的降解曲线。 【具体实施方式】
[0035] 实验材料和试剂
[0036] 1、菌株及载体：芽孢杆菌（Bacillus sp.)同文献报道菌种性质，如Bacillus sp.ATCC31072;大肠杆菌 Escherichia coli BL21(DE3)购于 Novagen 公司；表达载体 pEASY?-E2购于全式金生物有限（TransGen)公司。
[0037] 2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；T4 连接酶购自Promega公司；α -乙酸萘酯、β -乙酸萘酯、乙酸-4-硝基苯酯（pNPC2)、4_硝 基苯丁酸酯（pNPC4)、己酸4-硝基苯酯（pNPC 6)、4-硝基苯基辛酸酯（pNPC8)、对硝基苯酚癸 酸酯（pNPC1Q)、月桂酸4-硝基苯酯（pNPC 12)购自Sigma公司；邻苯二甲酸二异丁酯溶液标 准品购自北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；其它试剂均购自国药集团。
[0038] 3、培养基：
[0039] LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠1%，ρΗ自然（约为7.0)。固体培 养基在此基础上加2.0% (w/v)琼脂。
[0040] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0041] 实施例1 :羧酸酯酶基因 CarEW的克隆
[0042] 采用天根细菌基因组提取试剂盒（DP302)提取芽孢杆菌K91基因组DNA。
[0043] 根据芽孢杆菌K91全基因组测序及基因注释分析羧酸酯酶基因 CarEW并设计表达 引物 CarEW F 和 CarEW R :
[0044] 上游引物 CarEW F: 5，-ACTCATCAAATAGTAACGAC-3，
[0045] 下游引物 CarEW R:5, -TTCTCCTTTT GAAGGGAATA G-3'
[0046] 上游引物 T7:5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3 '
[0047] 下游引物 T7ter:5' -TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'
[0048] T7和T7ter为PCR检测阳性克隆子引物。
[0049] 以嗜热芽孢杆菌K91基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应参数为：94°C预 变性lmin30sec ;然后94°C变性30sec ;58°C退火（每个循环降0· 5°C )30sec ;72°C延伸 lmin40sec ;28 个循环后 94°C变性 30sec ;44°C退火 30sec ;72°C延伸 lmin30sec ;7 个循环 后 72°C保温 lOmin。
[0050] 取4 μ L PCR产物与1 μ L表达载体pEASY?-E2进行T-A连接，25°C连接lOmin，连 接产物全部转入Trans-I感受态细胞中，37°C温箱过夜培养。从转化板上挑取几株单菌落， 使用引物（本基因上游引物，T7ter)进行菌落PCR扩增，筛选正向连接的阳性克隆子。对 菌落PCR验证正确的克隆子采用T7和T7ter引物测序，由北京华大基因测序完成。对于测 序正确的阳性克隆子接种并提取质粒pEASY?-E2-CarEW，取0. OluL pEASY?-E2-CarEW质粒 转化到lOOuL BL21(DE3)表达感受态细胞中，涂布于含Απ^的LB固体平板上，37°C温箱过 夜培养，从转化板上挑取几株单菌落，进行菌落PCR扩增筛选阳性克隆子，从而获得重组大 肠杆菌菌株 BL21 (DE3) /CarEW。
[0051] 实施例2 :重组羧酸酯酶CarEW的制备
[0052] 取含有重组质粒pEASY?-E2-CarEW的BL21 (DE3)菌株和只含有pEASY?-E2的空质 粒BL21(DE3)菌株，以0. 1%的接种量接种于LB (含100ug/mL Amp。培养液中，37°C快速振 荡16h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB (含100ug/mL AmpO培养液中， 快速振荡培养约2 - 3h (0D6(KI达到0. 4-0. 7)后，加入终浓度0. 7mM的IPTG进行诱导，于20°C 继续振荡培养约20h。12000rpm离心lOmin，收集菌体。用适量的pH7. 0柠檬酸-Na2HP04缓 冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经12, OOOrpm离 心lOmin后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。对其进行SDS-PAGE分析， 结果参见图1，图1为在大肠杆菌中表达的重组羧酸酯酶CarEW的SDS-PAGE分析，图1表 明，重组羧酸酯酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。
[0053] 实施例3 :纯化的重组羧酸酯酶CarEW的性质测定
[0054] 1、重组羧酸酯酶CarEW的活性分析
[0055] 纯化的重组酯酶CarEW采用对硝基苯酚法（p-ni tropheno 1)进行活性测定：取 4只1. 5mL离心管，分别编号1、2、3、4,其中1、2、3号试管为实验组（3个重复），4号为对 照组。向四只离心管中分别加入420 μ L pH7. 5的由50mM柠檬酸-Na2HP04缓冲液、0. 4% Trion-100、0. 1 %阿拉伯胶组成的乳化液和30 μ LlOmM底物pNPC4, 37°C预热5min后，每隔 l〇s分别向1、2和3号管中加入50 μ L稀释适当倍数的酶液，4号对照管加等量水，37°C反 应5min后每隔10s向1、2、3实验管中加入50yL0. 1M Na2C03终止反应，4号对照管同样加 入等体积终止液后立即将4只离心管插到冰上，酶标仪405nm读取0D值。1个酶活单位（U/ mL)定义为一定条件下，每分钟分解底物pNPC4生成1 μ m〇L对硝基苯酚所需要的酶量。以 pNPC2、pNPC6、pNPC8、pNPC1(l、pNPC 12、α -乙酸萘酯和β -乙酸萘酯为底物测定方法及酶活力 计算同pNPC4。
[0056] 结果表明，在ρΗ7·5及45°C反应时，羧酸酯酶CarEW对0.6mmol/L ?即(；的比活力 为636U±0.01U/mg。同时，羧酸酯酶CarEW对α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、乙酸-4-硝基 苯酯（pNPC2)、己酸-4-硝基苯酯（pNPC6)、4-硝基苯基辛酸酯（pNPC 8)、对硝基苯酚癸酸酯 (pNPC1(l)、月桂酸-4-硝基苯酯（pNPC12)等底物也具有很好的降解作用。
[0057] 2、重组羧酸酯酶CarEW的最适温度和热稳定性的测定
[0058] 酶的最适温度测定：将重组羧酸酯酶CarEW在50mM pH7. 5的柠檬酸-Na2HP04缓 冲液条件下，分别在 〇°C、10°C、20°C、30°C、37°C、45°C、50°C、60°C、70°C、75°C下进行酶促反 应。结果参见图2,图2为羧酸酯酶的温度和酶活的曲线图，由图2可知，羧酸酯酶CarEW的 最适温度为45 °C。
[0059] 温度稳定性的测定：将重组酯酶CarEW在50mM pH7. 5的柠檬酸-Na2HP04缓冲液条 件下，在 37°C、45°C和 55°C三个温度下分别保温 10min、20min、30min、40min、50min 和 60min 后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPC4为底物，反应5min，测定重组羧酸酯 酶CarEW的酶学性质。结果参见图3,图3为羧酸酯酶的温度稳定性的曲线图，由图3可知， 该酶在37°C和45°C处理60min后仍剩余50%以上的活性；55°C保温60min后，酶活性保持 在30%以上。
[0060] 3、重组羧酸酯酶CarEW的最适pH和pH稳定性的测定
[0061] 酶的最适pH的测定：将重组羧酸酯酶CarEW在37 °C，分别在ρΗ5· 0、6. 0、7. 0、7. 5、 8. 0的50mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、ρΗ8. 0、9. 0的50mM Tris-HCL缓冲液以及 pH9. 35、10. 0的50mM硼酸-硼砂的缓冲液中进行酶促反应。结果参见图4,图4为羧酸酯 酶的pH值和酶活的曲线图，由图4可知，羧酸酯酶CarEW的最适pH值为7. 5。
[0062] pH稳定性的测定：将重组羧酸酯酶CarEW用ρΗ5· 0、6· 0、7· 0、7· 5、8· 0的50mM柠檬 酸-Na2HP04 缓冲液；pH8. 0、9. 0 的 50mM Tris-HCL 缓冲液；pH9. 35、10. 0、的 50mM 硼酸-硼 砂缓冲液稀释适当倍数后分别在37°C下耐受60min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为 对照。以pNPC 4为底物，反应5min，测定纯化的重组羧酸酯酶CarEW的酶学性质。结果参见 图5,图5为羧酸酯酶的pH稳定性试验结果，由图5可知，经pH7. 0、7. 5、8. 0的50mM柠檬 酸-Na2HP04缓冲液；pH8. OTris-HCl缓冲液37°C条件下处理60min后仍然保持80%以上的 活性，重组羧酸酯酶CarEW在pH7. 0-8. 0之间酶学性质比较稳定。
[0063] 4、不同金属离子及化学试剂对重组羧酸酯酶CarEW活性的影响
[0064] 在酶促反应体系中加入终浓度ImM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影 响。以pNPC 4为底物，在45°C，pH7. 5条件下，反应5min，测定纯化的重组羧酸酯酶CarEW的 酶活力。结果参见表1和表2,表1为不同金属离子及化学试剂对羧酸酯酶活性影响的检测 结果，表2为不同有机试剂对羧酸酯酶活性影响的检测结果。
[〇〇65] 表1不同金属离子及化学试剂对羧酸酯酶活性影响的检测结果 [0066]
【权利要求】
1. 一种羧酸酯酶，其特征在于，其具有（I)或（II)所示的氨基酸序列中任意一个： (I)具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； (Π )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸 获得的氨基酸序列。
2. -种编码如权利要求1所述的羧酸酯酶的基因。
3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示或者由 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个碱基获得。
4. 包含权利要求2或3所述基因的重组载体。
5. 含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6. 包含权利要求2或3所述基因的菌株。
7. 根据权利要求6所述的菌株，其特征在于，所述菌株为重组菌株。
8. 根据权利要求7所述的菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌 或乳酸杆菌。
9. 权利要求1所述的羧酸酯酶在邻苯二甲酸二异丁酯降解中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，其具体方法为：将羧酸酯酶加入到含有 邻苯二甲酸二异丁酯的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中进行反应。
【文档编号】A62D101/28GK104109659SQ201410352516
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】黄遵锡, 丁俊美, 王超凡, 李俊俊, 慕跃林, 杨云娟 申请人:云南师范大学
【专利摘要】本发明提供了一种氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的羧酸酯酶、编码上述羧酸酯酶的基因、包含上述基因的重组载体、包含上述基因的重组菌株和上述羧酸酯酶在邻苯二甲酸二异丁酯降解中的应用。本发明的羧酸酯酶基因CarEW来源于温泉环境，并证实其在45℃条件下具有很好的活性和稳定性，可用于环境中酞酸酯类化合物(邻苯二甲酸酯)，如邻苯二甲酸二异丁酯的降解，在环境污染治理方面具有重要意义。
【专利说明】羧酸酯酶、其编码基因及其应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于基因工程【技术领域】，尤其涉及一种羧酸酯酶、其编码基因及其应用。 【背景技术】
[0002] 邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate, DIBP)属于酞酸酯类化合物，是塑 料工业中广泛应用的增塑剂和软化剂，其作用是增加塑料的可塑性和韧性，提高塑料强度 (赵振华，环境化学，1991，10 (3) :64-68)。此外，DIBP在涂料、印染、化妆品和香料的生产过 程中应用也较为广泛。近年来研究表明，DIBP仅靠分子间作用与高分子塑料结合，随着时 间的推移该类物质可以通过食品包装材料直接迁移到食品中，也可通过含有该物质的塑料 制品迁移到环境中，从而对空气、水、土壤和食品等造成污染，并可通过呼吸、饮食和皮肤进 入人体内，对人体造成危害（Zhang et al·，Environ Geochem Health, 2014, 36:505-515)。 因此，寻找合理、有效的降解DIBP的方法和途径逐渐成为各国研究者所关注的问题。由于 生物降解是处理环境中DIBP类污染物的主要途径，因此筛选高效专性或兼性的DIBP类有 机污染物降解菌或降解酶成为研究的热点。
[0003] 羧酸酯酶（Carboxylesterases, EC3. L L 1)是一类能够催化水解羧酸酯生成 羧酸和醇的非特异性酯酶，与脂肪酶同属于α/β水解酶家族成员，其氨基酸序列含 有Ser-Asp-His三联体结构，Ser，Asp, His构成了羧酸酯酶的催化活性中心（Nardini et al·，Current Opinion in Structural Biology, 1999, 9:732-737)。羧酸酯酶广泛 分布于动物、植物和微生物中（Melloney et al·，Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2005, 32:261-270),在催化酯水解、酯合成和酯交换等过程中具有重要应用 价值，具有良好的区域选择性和立体选择性（Ramos et al·，Agricultural and Biological Chemistry, 1987, 51:1833-1838)。但迄今为止，关于羧酸酯酶对酞酸酯类化合物降解的研 究甚少。
[0004] 利用微生物降解酞酸酯类化合物大多数是依靠胞内酶解作用，但由于野生菌株产 酶能力有限、发酵周期长、纯化复杂、难以大量生产，生产成本高，限制了其推广应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种羧酸酯酶。
[0006] 本发明的再一目的是提供编码上述羧酸酯酶的基因。
[0007] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0008] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0009] 本发明的另一个目的是提供上述羧酸酯酶在邻苯二甲酸二异丁酯降解中的应用。
[0010] 本发明所述羧酸酯酶CarEW可得自芽孢杆菌（Bacillus sp.)，如Bacillus sp. ATCC31072,羧酸酯酶CarEW的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 本发明的羧酸酯酶CarEW总共含有488个氨基酸，理论分子量为53. 76kDa。该酶 以4-硝基苯丁酸酯（pNPC4)为最适底物；最适温度45°C ;最适pH值7. 5 ;终浓度ImM的金 属离子K+、Cu2+、Na+和Zn2+对羧酸酯酶CarEW有激活作用，Ag+、Hg 2+等对羧酸酯酶CarEW有 较强的抑制作用；在37°C和45°C下保温60min，羧酸酯酶的酶活分别保持在54%和58%以 上；在pH值5. 0?10. 0的缓冲液中处理60min，羧酸酯酶的酶活在pH值7. 0?8. 0之间比 较稳定，保持80%以上的酶活力；在pH值7. 5及45°C反应时，羧酸酯酶CarEW对0. 6mmol/ L的pNPC4比活力为636U±0. 01U/mg。此外，羧酸酯酶CarEW对α -乙酸萘酯、β -乙酸萘 酯、乙酸-4-硝基苯酯（pNPC2)、己酸-4-硝基苯酯（pNPC6)、4-硝基苯基辛酸酯（pNPC 8)、对 硝基苯酚癸酸酯（pNPC1(l)、月桂酸-4-硝基苯酯（pNPC12)等底物也具有很好的降解作用。
[0012] 本发明提供了编码上述羧酸酯酶的基因 CarEW，该基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0013] 本发明通过PCR的方法克隆了羧酸酯酶基因 CarEW，其全长1464bp，起始密码为 ATG，终止密码为TGA。
[0014] 本发明还提供了包含上述羧酸酯酶基因 CarEW的重组载体，优选为 pEASY?-E2-CarEW。将本发明的羧酸酯酶基因与pEASY?-E2进行T-A连接，使其核苷酸序列 与表达调控序列相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEASY?-E2-CarEW。
[0015] 本发明还提供了包含上述羧酸酯酶基因 CarEW的重组菌株，优选所述菌株为大肠 杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21 (DE3)/CarEW。
[0016] 本发明制备羧酸酯酶CarEW的方法按以下步骤进行：
[0017] 1)用上述重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
[0018] 2)培养重组菌株，诱导重组羧酸酯酶表达；
[0019] 3)回收并纯化所表达的羧酸酯酶CarEW。
[0020] 其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大 肠杆菌细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株BL21 (DE3) /CarEW。
[0021] 本发明提供了羧酸酯酶基因 CarEW，其编码的羧酸酯酶CarEW以4-硝基苯丁酸酯 (pNPC4)为最适底物；最适温度45°C ;最适pH7. 5 ;终浓度为ImM的金属离子K+、Cu2+、Na+和 Zn2+对羧酸酯酶CarEW有激活作用，Ag+、Hg2+等对羧酸酯酶CarEW有较强的抑制作用；在 37°C和45°C下保温60min，酶活分别保持在54%和58%以上；在pH5. 0-10. 0缓冲液中处 理60min，羧酸酯酶的酶活在pH7. 0-8. 0之间比较稳定，保持80 %以上的酶活力；在pH7. 5 及45°C反应时，羧酸酯酶CarEW对0. 6mmol/L pNPC4的比活力为636U±0. 01U/mg。此外， 羧酸酯酶CarEW对α -乙酸萘酯、β -乙酸萘酯、乙酸-4-硝基苯酯（pNPC2)、己酸-4-硝基 苯酯（pNPC6)、4-硝基苯基辛酸酯（pNPC 8)、对硝基苯酚癸酸酯（pNPC1(l)、月桂酸-4-硝基苯 酯（pNPC12)等底物也具有很好的降解作用。
[0022] 本发明的羧酸酯酶CarEW在邻苯二甲酸二异丁酯降解中的应用，其中，邻苯二甲 酸二异丁酯为增塑剂。
[0023] 其应用方法如下：
[0024] 取1U羧酸酯酶CarEW加入到含有浓度为30mg/L的增塑剂邻苯二甲酸二异丁酯的 10mmol/L、pH值7. 5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，总反应体系为0. 5mL，37°C反应，即可 对增塑剂邻苯二甲酸二异丁酯进行降解。
[0025] 取抽提液于气质联用（6(：/^5)上进行定量分析，结果表明，9〇1^11内有77%的邻苯 二甲酸二异丁酯被降解。
[0026] 本发明的羧酸酯酶基因 CarEW来源于温泉环境，并证实其在45°C条件下具有很好 的活性和稳定性，可用于环境中酞酸酯类化合物（邻苯二甲酸酯）的降解，尤其可高效降解 邻苯二甲酸二异丁酯，在环境污染治理方面具有重要意义。此外，酞酸酯类化合物对生物和 环境的危害近年来才逐渐被认知，相关研究报道较少，而生物降解是处理环境中DiBPs的 主要途径，因此本发明对开发微生物来源的羧酸酯酶对酞酸酯类化合物降解的应用具有重 要意义。同时，本发明具有培养周期短、易于获得纯蛋白等优点。 【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为在大肠杆菌中表达的重组羧酸酯酶CarEW的SDS-PAGE分析，其中，Μ :低分 子量蛋白质Marker ;1 :纯化的重组羧酸酯酶CarEW ;
[0028] 图2为羧酸酯酶的温度和酶活的曲线图；
[0029] 图3为羧酸酯酶的温度稳定性的曲线图；
[0030] 图4为羧酸酯酶的pH值和酶活的曲线图；
[0031] 图5为羧酸酯酶的pH稳定性试验结果；
[0032] 图6为羧酸酯酶CarEW的1/[S]与1/V的关系曲线图；
[0033] 图7为增塑剂邻苯二甲酸二异丁酯的标准曲线；
[0034] 图8为重组羧酸酯酶CarEW对邻苯二甲酸二异丁酯的降解曲线。 【具体实施方式】
[0035] 实验材料和试剂
[0036] 1、菌株及载体：芽孢杆菌（Bacillus sp.)同文献报道菌种性质，如Bacillus sp.ATCC31072;大肠杆菌 Escherichia coli BL21(DE3)购于 Novagen 公司；表达载体 pEASY?-E2购于全式金生物有限（TransGen)公司。
[0037] 2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；T4 连接酶购自Promega公司；α -乙酸萘酯、β -乙酸萘酯、乙酸-4-硝基苯酯（pNPC2)、4_硝 基苯丁酸酯（pNPC4)、己酸4-硝基苯酯（pNPC 6)、4-硝基苯基辛酸酯（pNPC8)、对硝基苯酚癸 酸酯（pNPC1Q)、月桂酸4-硝基苯酯（pNPC 12)购自Sigma公司；邻苯二甲酸二异丁酯溶液标 准品购自北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；其它试剂均购自国药集团。
[0038] 3、培养基：
[0039] LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠1%，ρΗ自然（约为7.0)。固体培 养基在此基础上加2.0% (w/v)琼脂。
[0040] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0041] 实施例1 :羧酸酯酶基因 CarEW的克隆
[0042] 采用天根细菌基因组提取试剂盒（DP302)提取芽孢杆菌K91基因组DNA。
[0043] 根据芽孢杆菌K91全基因组测序及基因注释分析羧酸酯酶基因 CarEW并设计表达 引物 CarEW F 和 CarEW R :
[0044] 上游引物 CarEW F: 5，-ACTCATCAAATAGTAACGAC-3，
[0045] 下游引物 CarEW R:5, -TTCTCCTTTT GAAGGGAATA G-3'
[0046] 上游引物 T7:5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3 '
[0047] 下游引物 T7ter:5' -TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'
[0048] T7和T7ter为PCR检测阳性克隆子引物。
[0049] 以嗜热芽孢杆菌K91基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应参数为：94°C预 变性lmin30sec ;然后94°C变性30sec ;58°C退火（每个循环降0· 5°C )30sec ;72°C延伸 lmin40sec ;28 个循环后 94°C变性 30sec ;44°C退火 30sec ;72°C延伸 lmin30sec ;7 个循环 后 72°C保温 lOmin。
[0050] 取4 μ L PCR产物与1 μ L表达载体pEASY?-E2进行T-A连接，25°C连接lOmin，连 接产物全部转入Trans-I感受态细胞中，37°C温箱过夜培养。从转化板上挑取几株单菌落， 使用引物（本基因上游引物，T7ter)进行菌落PCR扩增，筛选正向连接的阳性克隆子。对 菌落PCR验证正确的克隆子采用T7和T7ter引物测序，由北京华大基因测序完成。对于测 序正确的阳性克隆子接种并提取质粒pEASY?-E2-CarEW，取0. OluL pEASY?-E2-CarEW质粒 转化到lOOuL BL21(DE3)表达感受态细胞中，涂布于含Απ^的LB固体平板上，37°C温箱过 夜培养，从转化板上挑取几株单菌落，进行菌落PCR扩增筛选阳性克隆子，从而获得重组大 肠杆菌菌株 BL21 (DE3) /CarEW。
[0051] 实施例2 :重组羧酸酯酶CarEW的制备
[0052] 取含有重组质粒pEASY?-E2-CarEW的BL21 (DE3)菌株和只含有pEASY?-E2的空质 粒BL21(DE3)菌株，以0. 1%的接种量接种于LB (含100ug/mL Amp。培养液中，37°C快速振 荡16h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB (含100ug/mL AmpO培养液中， 快速振荡培养约2 - 3h (0D6(KI达到0. 4-0. 7)后，加入终浓度0. 7mM的IPTG进行诱导，于20°C 继续振荡培养约20h。12000rpm离心lOmin，收集菌体。用适量的pH7. 0柠檬酸-Na2HP04缓 冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经12, OOOrpm离 心lOmin后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。对其进行SDS-PAGE分析， 结果参见图1，图1为在大肠杆菌中表达的重组羧酸酯酶CarEW的SDS-PAGE分析，图1表 明，重组羧酸酯酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。
[0053] 实施例3 :纯化的重组羧酸酯酶CarEW的性质测定
[0054] 1、重组羧酸酯酶CarEW的活性分析
[0055] 纯化的重组酯酶CarEW采用对硝基苯酚法（p-ni tropheno 1)进行活性测定：取 4只1. 5mL离心管，分别编号1、2、3、4,其中1、2、3号试管为实验组（3个重复），4号为对 照组。向四只离心管中分别加入420 μ L pH7. 5的由50mM柠檬酸-Na2HP04缓冲液、0. 4% Trion-100、0. 1 %阿拉伯胶组成的乳化液和30 μ LlOmM底物pNPC4, 37°C预热5min后，每隔 l〇s分别向1、2和3号管中加入50 μ L稀释适当倍数的酶液，4号对照管加等量水，37°C反 应5min后每隔10s向1、2、3实验管中加入50yL0. 1M Na2C03终止反应，4号对照管同样加 入等体积终止液后立即将4只离心管插到冰上，酶标仪405nm读取0D值。1个酶活单位（U/ mL)定义为一定条件下，每分钟分解底物pNPC4生成1 μ m〇L对硝基苯酚所需要的酶量。以 pNPC2、pNPC6、pNPC8、pNPC1(l、pNPC 12、α -乙酸萘酯和β -乙酸萘酯为底物测定方法及酶活力 计算同pNPC4。
[0056] 结果表明，在ρΗ7·5及45°C反应时，羧酸酯酶CarEW对0.6mmol/L ?即(；的比活力 为636U±0.01U/mg。同时，羧酸酯酶CarEW对α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、乙酸-4-硝基 苯酯（pNPC2)、己酸-4-硝基苯酯（pNPC6)、4-硝基苯基辛酸酯（pNPC 8)、对硝基苯酚癸酸酯 (pNPC1(l)、月桂酸-4-硝基苯酯（pNPC12)等底物也具有很好的降解作用。
[0057] 2、重组羧酸酯酶CarEW的最适温度和热稳定性的测定
[0058] 酶的最适温度测定：将重组羧酸酯酶CarEW在50mM pH7. 5的柠檬酸-Na2HP04缓 冲液条件下，分别在 〇°C、10°C、20°C、30°C、37°C、45°C、50°C、60°C、70°C、75°C下进行酶促反 应。结果参见图2,图2为羧酸酯酶的温度和酶活的曲线图，由图2可知，羧酸酯酶CarEW的 最适温度为45 °C。
[0059] 温度稳定性的测定：将重组酯酶CarEW在50mM pH7. 5的柠檬酸-Na2HP04缓冲液条 件下，在 37°C、45°C和 55°C三个温度下分别保温 10min、20min、30min、40min、50min 和 60min 后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPC4为底物，反应5min，测定重组羧酸酯 酶CarEW的酶学性质。结果参见图3,图3为羧酸酯酶的温度稳定性的曲线图，由图3可知， 该酶在37°C和45°C处理60min后仍剩余50%以上的活性；55°C保温60min后，酶活性保持 在30%以上。
[0060] 3、重组羧酸酯酶CarEW的最适pH和pH稳定性的测定
[0061] 酶的最适pH的测定：将重组羧酸酯酶CarEW在37 °C，分别在ρΗ5· 0、6. 0、7. 0、7. 5、 8. 0的50mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、ρΗ8. 0、9. 0的50mM Tris-HCL缓冲液以及 pH9. 35、10. 0的50mM硼酸-硼砂的缓冲液中进行酶促反应。结果参见图4,图4为羧酸酯 酶的pH值和酶活的曲线图，由图4可知，羧酸酯酶CarEW的最适pH值为7. 5。
[0062] pH稳定性的测定：将重组羧酸酯酶CarEW用ρΗ5· 0、6· 0、7· 0、7· 5、8· 0的50mM柠檬 酸-Na2HP04 缓冲液；pH8. 0、9. 0 的 50mM Tris-HCL 缓冲液；pH9. 35、10. 0、的 50mM 硼酸-硼 砂缓冲液稀释适当倍数后分别在37°C下耐受60min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为 对照。以pNPC 4为底物，反应5min，测定纯化的重组羧酸酯酶CarEW的酶学性质。结果参见 图5,图5为羧酸酯酶的pH稳定性试验结果，由图5可知，经pH7. 0、7. 5、8. 0的50mM柠檬 酸-Na2HP04缓冲液；pH8. OTris-HCl缓冲液37°C条件下处理60min后仍然保持80%以上的 活性，重组羧酸酯酶CarEW在pH7. 0-8. 0之间酶学性质比较稳定。
[0063] 4、不同金属离子及化学试剂对重组羧酸酯酶CarEW活性的影响
[0064] 在酶促反应体系中加入终浓度ImM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影 响。以pNPC 4为底物，在45°C，pH7. 5条件下，反应5min，测定纯化的重组羧酸酯酶CarEW的 酶活力。结果参见表1和表2,表1为不同金属离子及化学试剂对羧酸酯酶活性影响的检测 结果，表2为不同有机试剂对羧酸酯酶活性影响的检测结果。
[〇〇65] 表1不同金属离子及化学试剂对羧酸酯酶活性影响的检测结果 [0066]
【权利要求】
1. 一种羧酸酯酶，其特征在于，其具有（I)或（II)所示的氨基酸序列中任意一个： (I)具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； (Π )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸 获得的氨基酸序列。
2. -种编码如权利要求1所述的羧酸酯酶的基因。
3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示或者由 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个碱基获得。
4. 包含权利要求2或3所述基因的重组载体。
5. 含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6. 包含权利要求2或3所述基因的菌株。
7. 根据权利要求6所述的菌株，其特征在于，所述菌株为重组菌株。
8. 根据权利要求7所述的菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌 或乳酸杆菌。
9. 权利要求1所述的羧酸酯酶在邻苯二甲酸二异丁酯降解中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，其具体方法为：将羧酸酯酶加入到含有 邻苯二甲酸二异丁酯的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中进行反应。
【文档编号】A62D101/28GK104109659SQ201410352516
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】黄遵锡, 丁俊美, 王超凡, 李俊俊, 慕跃林, 杨云娟 申请人:云南师范大学
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