一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法
专利名称：一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法
技术领域：
本发明涉及一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，尤其是涉及一种利 用微生物降解药渣中残留泰乐菌素的方法。
技术背景由于抗生素药渣有机质含量高，营养丰富，简单晾晒或堆放，极易引 起二次发酵，颜色变黑，并产生霉臭味。上世纪九十年代，人们将抗生素药渣的处理工艺主要集中在干燥技术的攻关上。1991年，山东鲁抗医药集 团公司抗生素药渣干燥工艺获得成功。1996年，山东鲁抗饲料厂又研究出 离心机结合流化床干燥青霉素湿渣，使干燥成本降低30%。随着各种药渣干燥设备的研制成功，国内有数家单位开展了抗生素药 渣用作高蛋白饲料原料及药物性添加剂的研究。1998-1999年，李月海等 利用鲁抗泰乐菌丝蛋白和头孢菌丝蛋白分别以1.5%、 3%的添加量代替等 量的豆粕用于产蛋鸡饲养，获得较好的饲喂效果；用泰乐菌素蛋白饲料饲 养肉仔鸡，肉鸡成活率、增重速度、料肉比均显著高于未添加组。然而，上述药渣的开发使用，均没有消除药渣中残留的抗生素。因为 动物长期食入残留抗生素的药渣后，会产生耐药菌、畜产品药物残留等种 种不良后果。这就意味着药渣作为再生饲料资源，必须首先降解其中所残 留的抗生素。近年来，国内外有关药渣中残留抗生素降解技术的研究报道甚少，但 在城市生活废水和工业废水中残留抗生素治理方面的研究报道较多。汤少 红等将药渣直接以肥料的形式用于花卉施用，也取得了较满意的施肥效 果，但药渣中残有抗生素，长期使用可能会对土壤微生态平衡产生负面影 响。研究表明四环素能在环境中蓄积，进而破坏水和土壤中的微生物平 衡；泰乐菌素能引起环境中耐药沙门氏菌数量大大增加。Kummerer等、 Ingerslev等、Drillia等采用生物法，对生活废水中残留环丙沙星、氧氟沙 星、甲硝哒唑、复方新诺明和兽用土霉素等的降解技术进行了研究，但所 得到的结果是不一致的。主要原因是①不同抗生素，其分子结构和稳定性是不一样的；②降解用菌株还有待进一步筛选与优化；③污水中无机、 有机质对不同菌株降解不同抗生素的影响可能有别； 温度、pH值、溶 解氧等对不同降解过程的影响。Lange等、Andreozzi等用臭氧对污水中残 留的大环内酯类抗生素哮如红霉素、克拉霉素、罗红霉素、林可霉素进行 无害化处理，取得了较为满意的治理效果，但这种方法是否适合药渣治理， 尚需研究。也有人采用电化氧化法处理废水中抗生素残留，发现用此方法 能有效降低废水中氧氟沙星含量，但对残留林可霉素无显著降解作用，但 这种方法不适合于工厂规模化处理，因能耗太大。Otker等、Polubesova 等用蒙脱石、沸石等多孔型硅酸盐矿物质吸附污水中残留四环素、恩诺沙 星等药物，进而使污水得以净化，但这种方法没有从根本上消除残留抗生 素，只是抗生素的存在位点发生了改变，也不适合于药渣中残留抗生素的 彻底治理。 发明内容本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种通过筛选，培育出能 够降解药渣中残留泰乐菌素的复合菌，然后再从复合菌中分离、纯化得到 降解泰乐菌素的菌株，配制相应的药渣培养基，接入降解菌发酵降解药渣 中残留的泰乐菌素。本发明通过如下方式实现一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，其特征在于该方法包括如下 步骤 .1) 土壤菌悬液的制备用四分取样法，称取堆放泰乐菌素药渣附近 土样l 10g，置于三角瓶中，加入100 200ml磷酸盐缓冲溶液，摇匀后，置于恒温摇床中，25 35:C下，200r/min振荡20 40min;2) 菌种选育培养基的配制将下述重量的原料混合而成即可得菌种 选育培养基泰乐菌素药渣200g，蛋白胨10g，葡萄糖10g， K2HPO40.1g， FeS04.7H20 0.2g,水800ml;3) 菌种驯化培养基的配制将下述原料按重量比混合而成即可得菌 种驯化培养基①一级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按1: 9的比例配 制；②二级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按2: 8的比例配制；③三级 驯化培养基泰乐菌素药渣与水按3: 7的比例配制；④四级驯化培养基:泰乐菌素药渣与水按4: 6的比例配制；4) 菌种筛选培养基的配制将下述重量的原料混合而成即可得菌种 筛选培养基①初筛分离培养基泰乐菌素药渣200g，琼脂20g，水800ml;②复筛分离培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，酒石酸泰 乐菌素标准品0.04g，水1000ml;③分离纯化培养基蛋白胨10g，葡萄 糖5g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml;5) 菌种活化复壮培养基的配制将下述重量的原料混合而成即可得 菌种活化复壮培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，泰乐菌素药渣浸出液励Oml;6) 药渣发酵培养基的配制将下述重量的原料混合而成即可得药渣发酵培养基泰乐菌素药渣700 900g，麸皮300 100g， K2HP04 0.1~0.2g， FeSO4.7H2O0.1~0.2g，水800 900ml;7) 取上述步骤1)制备的土壤菌悬液10~20ml，加入到100 200g上 述步骤2)制备的菌种选育培养基中，搅拌均匀，置25 35"C恒温摇床中， 120r/min下培养60 72h;取培养后的菌悬液，按2~5%的接种量接入到上 述步骤3)制备的一级菌种驯化培养基中，置25 35'C恒温摇床中， 120r/min培养60 72h，重复该步骤5 10次，所用菌种驯化培养基由一级 逐级升至四级；8) 取驯化后的培养液l~3ml，用磷酸盐缓冲溶液梯度稀释为10—、 10_2......10—1Q浓度，然后采用倾注平板法将稀释后菌液接种于初筛分离培养基，混合后倾注倒板，依据菌落形态及其生长周期的不同，依次编号并 将其接入液体复筛培养基，经培养传代后再采用涂布平板法接种到固体复 筛培养基，经再次分离后将其接入液体分离纯化培养基，培养传代后划线 接种到固体分离纯化培养基，并重复该步骤3 4次后，完成菌种的分离纯 化，即可筛选出降解泰乐菌素的菌株；9) 取上述步骤8)降解泰乐菌素的菌株，接入到上述步骤5)制备的 菌种活化复壮培养基中，置25~35。C恒温摇床中，120r/min下培养20~30h， 4000r/min离心15min后，悬浮于新的菌种活化复壮培养基中，25 35°C 恒温摇床中120r/min继续培养8 14h，即可得到泰乐菌素降解菌悬液；10) 取上述步骤6)制备的药渣发酵培养基100 200g，接入上述步骤9)制备的泰乐菌素降解菌悬液2~10ml，搅拌均匀，25~35°C发酵60 120h， 然后在60 100。C下烘干，粉碎后即可；所述步骤4)的泰乐菌素药渣浸出液是按照药渣湿重与水的比例为1: 2配制，具体步骤如下 'a. 取泰乐菌素药渣100g，加入200ml已灭菌的蒸馏水或去离子水，搅 拌均匀后在室温下浸泡12 20h;b. 将上述步骤a中浸泡液分装于离心管中，梯度离心30min，弃沉淀；c. 取梯度离心后的上清液，再通过抽滤弃漂浮的杂质即可； 所述步骤7)泰乐菌素降解菌的驯化过程经历了两个阶段，其依次为菌株性状的稳定阶段和菌株对泰乐菌素降解能力的稳定阶段。泰乐菌素药渣经上述方法处理后，药渣中泰乐菌素含量测定方法如下1) 泰乐菌素标准曲线的制备配制浓度分别为Ojig/ml、 2吗/ml、 4|ug/ml、 6jig/ml、 8|ug/ml、 10|xg/ml、 14|ig/ml、 16^ig/ml、 18pg/ml和20|ig/ml的酒石酸泰乐菌素标准溶液，取 lOpl点样于指示菌为藤黄微球菌的SI固体培养基(培养基组成蛋白胨 8g,磷酸氢二钠5.3g,酵母粉5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，琼脂粉12g， 水1000ml)平板。30。C孵育16~20h，测定抑菌圈直径。由抑菌圈直径对泰乐菌素浓度作图，可得到回归方程和pe值。2) 取处理后的泰乐菌素药渣样品l.OOg，加入5ml 0.01mol/L酒石酸 溶液，搅拌后，浸泡5 8h，再搅拌后，静置10 30min。取lml浸出液， 5000r/min离心10min。取上清液1(^1点样于指示菌为藤黄微球菌的Sl固 体培养基平板。30°C孵育16~20h，测定抑菌圈直径。依据步骤(l)的回归 方程，得到处理后药渣中残留泰乐菌素含量。泰乐菌素药渣经筛选出的降解菌株处理，处理后药渣中未检测到残留 泰乐菌素的存在。本发明有如下效果1)方法独特本发明通过筛选，培育出能够降解药渣中残留泰乐菌 素的复合菌，然后再从复合菌中分离、纯化得到降解泰乐菌素的菌株，配 制相应的药渣培养基，接入降解菌发酵降解药渣中残留的泰乐菌素。2) 有效的降解了药渣中残留的泰乐菌素本发明采用微生物法对泰 乐菌素药渣进行降解处理，可以完全降解药渣中残留的泰乐菌素。3) 本发明可使泰乐菌素药渣再利用成为可能，实现泰乐菌素药渣零 排放。由于药渣中泰乐菌素的残留量较高，使泰乐菌素药渣不能直接作为 动物词料或肥料使用。若动物长期词喂未经处理的泰乐菌素药渣，所产肉、蛋、奶中泰乐菌素残留量高达0.5mg/kg左右，而美国食品和药物管理局 (FDA)规定，泰乐菌素在可食组织或蛋中的残留允许浓度为不高于 0.2mg/kg。若泰乐菌素药渣直接以肥料形式施肥，所残留的泰乐菌素可能 会引起环境中耐药沙门氏菌数量的增加。4) 本发明通过泰乐菌素降解菌处理药渣，不仅降解了药渣中残留的 泰乐菌素，同时还提高了药渣中蛋白质的含量。
具体实施方式
实例l-一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，该方法包括如下步骤1) 土壤菌悬液的制备称取堆放泰乐菌素药渣附近土样lg，置于三角瓶中，加入100ml磷酸盐缓冲溶液，摇匀后，置于恒温摇床中，3(TC下， 200r/min振荡20min;2) 菌种选育培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可得菌种选育培养基泰乐菌素药渣200g，蛋白胨10g,葡萄糖10g， K2HP04 O.lg， FeS04-7H20 0.2g，水謡ml;3) 菌种驯化培养基的配制将下述原料按重量比混合而成即可得菌 种驯化培养基①一级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按1: 9的比例配 制；②二级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按2: 8的比例配制；③三级 驯化培养基泰乐菌素药渣与水按3: 7的比例配制；④四级驯化培养基: 泰乐菌素药渣与水按4: 6的比例配制；4) 菌种筛选培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可 得菌种筛选培养基①初筛分离培养基泰乐菌素药渣200g，琼脂20g， 水800ml;②复筛分离培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g， 酒石酸泰乐菌素标准品0.04g，水1000ml;③分离纯化培养基蛋白胨10g， 葡萄糖5g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml;5) 菌种活化复壮培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成 即可得菌种活化复壮培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，泰乐菌素药 渣浸出液1000ml;6) 药渣发酵培养基的配制泰乐菌素药渣700g，麸皮300g， K2HP04 0.2g， FeSO4.7H2O0.1g，水900ml。7) 取上述步骤1)制备的土壤菌悬液20ml，加入到100g上述步骤2') 制备的菌种选育培养基中，搅拌均匀，置3(TC恒温摇床中，120r/min下培 养72h;取培养后的菌悬液，按5%的接种量接入到上述步骤3)制备的一 级菌种驯化培养基中，置3(TC恒温摇床中，120r/min培养72h。重复该步 骤10次，所用菌种驯化培养基由一级逐级升至四级；8) 取驯化后的培养液3ml，用磷酸盐缓冲溶液梯度稀释为10—、 10— 2......10—1()浓度，然后采用倾注平板法将稀释后菌液接种于初筛分离培养基，混合后倾注倒板，依据菌落形态及其生长周期的不同，依次编号并将 其接入液体复筛培养基，经培养传代后再采用涂布平板法接种到固体复筛 培养基，经再次分离后将其接入液体分离纯化培养基，培养传代后划线接 种到固体分离纯化培养基，并重复该步骤4次后，即可筛选出降解泰乐菌 素的菌株；9) 取上述步骤8)所得的泰乐菌素降解菌，接入到菌种活化复壮培养 基中，30。C下，120r/min恒温摇床中培养24h， 4000r/min离心15min后， 悬浮于新的菌种活化复壮培养基中，30°C恒温摇床中120r/min继续培养 10h，即可得到降解泰乐菌素的菌悬液。10) 取降解泰乐菌素的菌悬液2ml，接入到100g药渣发酵培养基中， 搅拌均匀。在30。C下，孵育96h。然后在80。C下烘干，粉碎后即可。经微生物法检测，处理后药渣中未检测到残留泰乐菌素的存在。 实例2:一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，该方法包括如下步骤1) 土壤菌悬液的制备称取堆放泰乐菌素药渣附近土样10g，置于三角瓶中，加入200ml磷酸盐缓冲溶液，摇匀后，置于恒温摇床中，28"C下， 200r/min振荡40min;2) 菌种选育培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可得菌种选育培养基泰乐菌素药渣200g，蛋白胨10g，葡萄糖10g， K2HP04 O.lg， FeS04-7H20 0.2g，水800ml;3) 菌种驯化培养基的配制将下述原料按重量比混合而成即可得菌 种驯化培养基①一级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按1: 9的比例配 制；②二级驯化培养基'泰乐菌素药渣与水按2: 8的比例配制；③三级 驯化培养基泰乐菌素药渣与水按3: 7的比例配制；④四级驯化培养基: 泰乐菌素药渣与水按4: 6的比例配制；4) 菌种筛选培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可 得菌种筛选培养基①初筛分离培养基泰乐菌素药渣200g，琼脂20g，水800ml;②复筛分离培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g， 酒石酸泰乐菌素标准品0.04g，水1000ml;③分离纯化培养基蛋白胨10g， 葡萄糖5g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml;5) 菌种活化复壮培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成 即可得菌种活化复壮培f基酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，泰乐菌素药 渣浸出液1000ml;6) 药渣发酵培养基的配制泰乐菌素药渣800g，麸皮200g， K2HP04 0.15g， FeSO4'7H2O0.15g，水850ml;7) 取上述步骤1)制备的土壤菌悬液lOml，加入到200g上述步骤2) 制备的菌种选育培养基中，搅拌均匀，置28t:恒温摇床中，120r/min下培 养72h;取培养后的菌悬液，按2%的接种量接入到上述步骤3)制备的一 级菌种驯化培养基中，置28t:恒温摇床中，120r/min培养72h。重复该步 骤8次，所用菌种驯化培养基由一级逐级升至四级；8) 取驯化后的培养液lml，用磷酸盐缓冲溶液梯度稀释为l(T1、 10— 2......10_1Q浓度，然后采用倾注平板法将稀释后菌液接种于初筛分离培养基，混合后倾注倒板，依据菌落形态及其生长周期的不同，依次编号并将 其接入液体复筛培养基，经培养传代后再采用涂布平板法接种到固体复筛 培养基，经再次分离后将其接入液体分离纯化培养基，培养传代后划线接 种到固体分离纯化培养基，并重复该步骤3次后，即可筛选出降解泰乐菌 素的菌株；9) 取上述步骤8)降解泰乐菌素的菌株，接入到上述步骤5)制备的菌种活化复壮培养基中，.28。C下，120r/min恒温摇床中培养26h，4000r/min 离心15min后，悬浮于新的菌种活化复壮培养基中，28°C恒温摇床中 120r/min继续培养10h，即可得到降解泰乐菌素的菌悬液。10)取降解泰乐菌素的菌悬液10ml，接入到200g药渣发酵培养基中， 搅拌均匀。在28。C下，孵育108h。然后在80。C下烘干，粉碎后即可。经微生物法检测，处理后药渣中未检测到残留泰乐菌素的存在。实例3:一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，该方法包括如下步骤1) 土壤菌悬液的制备称取堆放泰乐菌素药渣附近土样5g，置于三 角瓶中，加入150ml磷酸盐缓冲溶液，摇匀后，置于恒温摇床中，35-C下， 200r/min振荡30min;2) 菌种选育培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可 得菌种选育培养基泰乐菌素药渣200g，蛋白胨10g，葡萄糖10g， K2HP04 O.lg， FeS04.7H20 0.2g，水謂ml;3) 菌种驯化培养基的配制将下述原料按重量比混合而成即可得菌 种驯化培养基①一级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按1: 9的比例配 制；②二级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按2: 8的比例配制；③三级 驯化培养基泰乐菌素药渣与水按3: 7的比例配制；④四级驯化培养基 泰乐菌素药渣与水按4: 6的比例配制；4) 菌种筛选培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可 得菌种筛选培养基①初筛分离培养基泰乐菌素药渣200g，琼脂20g，水800ml;②复筛分离培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g, 酒石酸泰乐菌素标准品0.04g,水1000ml; (D分离纯化培养基蛋白胨10g， 葡萄糖5g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml;5) 菌种活化复壮培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成 即可得菌种活化复壮培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，泰乐菌素药 渣浸出液1000ml;6) 药渣发酵培养基的配制泰乐菌素药渣900g，麸皮100g， K2HP04 O.lg， FeS04.7H20 0.2g，水800ml;7) 取上述步骤1)制备的土壤菌悬液lOml，加入到150g上述步骤2)制备的菌种选育培养基中，搅拌均匀，置35'C恒温摇床中，120r/min下培 养60h;取培养后的菌悬液，按3%的接种量接入到上述步骤3)制备的一 级菌种驯化培养基中，置35'C恒温摇床中，120r/min培养60h。重复该步 骤5次，所用菌种驯化培养基由一级逐级升至四级；8) 取驯化后的培养液2ml，用磷酸盐缓冲溶液梯度稀释为10—\ 10— 2......10—1Q浓度，然后采用倾注平板法将稀释后菌液接种于初筛分离培养基，混合后倾注倒板，依据菌落形态及其生长周期的不同，依次编号并将 其接入液体复筛培养基，经培养传代后再采用涂布平板法接种到固体复筛 培养基，经再次分离后将其接入液体分离纯化培养基，培养传代后划线接 种到固体分离纯化培养基，并重复该步骤3次后，即可筛选出降解泰乐菌 素的菌株；9) 取上述步骤8)降解泰乐菌素的菌株，接入到上述步骤5)制备的 菌种活化复壮培养基中，35。C下，120r/min恒温摇床中培养20h，4000r/min 离心15min后，悬浮于新的菌种活化复壮培养基中，35°C恒温摇床+ 120r/min继续培养8h，即可得到降解泰乐菌素的菌悬液。10) 取降解泰乐菌素的菌悬液8ml，接入到150g药渣发酵培养基中， 搅拌均匀。在35。C下，i瞎育60h。然后在100。C下烘干，粉碎后即可。经微生物法检测，处理后药渣中未检测到残留泰乐菌素的存在。 实例4:一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，该方法包括如下步骤1) 土壤菌悬液的制备称取堆放泰乐菌素药渣附近土样8g，置于三角瓶中，加入200ml磷酸盐缓冲溶液，摇匀后，置于恒温摇床中，25"C下， 200r/min振荡40min;2) 菌种选育培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可 得菌种选育培养基泰乐菌素药渣200g,蛋白胨10g，葡萄糖10g， K2HP04 O.lg， FeS04'7H20 0.2g，.水800ml;3) 菌种驯化培养基的配制将下述原料按重量比混合而成即可得菌 种驯化培养基①一级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按1: 9的比例配 制；②二级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按2: 8的比例配制；③三级 驯化培养基泰乐菌素药渣与水按3: 7的比例配制；④四级驯化培养基:12泰乐菌素药渣与水按4: 6的比例配制；4) 菌种筛选培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可 得菌种筛选培养基①初筛分离培养基泰乐菌素药渣200g，琼脂20g，水800ml;②复筛分离培^基酵母浸出粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g， 酒石酸泰乐菌素标准品0.04g，水1000ml;③分离纯化培养基蛋白胨10g， 葡萄糖5g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml;5) 菌种活化复壮培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成 即可得菌种活化复壮培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml;6) 药渣发酵培养基的配制泰乐菌素药渣800g，麸皮200g， K2HP04 0.2g， FeSO4-7H2O0.1g，水800ml;7) 取上述步骤1)制备的土壤菌悬液15ml，加入到200g上述步骤2) 制备的菌种选育培养基中，搅拌均匀，置25"C恒温摇床中，120r/min下培 养72h;取培养后的菌悬液，按4%的接种量接入到上述步骤3)制备的一 级菌种驯化培养基中，置25'C恒温摇床中，120r/min培养72h。重复该步 骤8次，所用菌种驯化培养基由一级逐级升至四级；8) 取驯化后的培养液2ml，用磷酸盐缓冲溶液梯度稀释为10—\ 10— 2......10_1()浓度，然后采用倾注平板法将稀释后菌液接种于初筛分离培养基，混合后倾注倒板，依据菌落形态及其生长周期的不同，依次编号并将 其接入液体复筛培养基，经培养传代后再采用涂布平板法接种到固体复筛 培养基，经再次分离后将其接入液体分离纯化培养基，培养传代后划线接 种到固体分离纯化培养基，并重复该步骤4次后，即可筛选出降解泰乐菌 素的菌株；9) 取上述步骤8)降解泰乐菌素的菌株，接入到上述步骤5)制备的 菌种活化复壮培养基中，25。C下，120r/min恒温摇床中培养30h，4000r/min 离心15min后，悬浮于新的菌种活化复壮培养基中，25°C恒温摇床中 120r/min继续培养14h，即可得到降解泰乐菌素的菌悬液。10) 取降解泰乐菌素的菌悬液10ml，接入到100g药渣发酵培养基中， 搅拌均匀。在25。C下，孵育120h。然后在60。C下烘干，粉碎后即可。，经微生物法检测，处理后药渣中未检测到残留泰乐菌素的存在。实例5:一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，该方法包括如下步骤1) 土壤菌悬液的制备称取堆放泰乐菌素药渣附近土样3g，置于三角瓶中，加入100ml磷酸盐缓冲溶液，摇匀后，置于恒温摇床中，32'C下， 200r/min振荡25min;2) 菌种选育培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可得菌种选育培养基泰乐菌素药渣200g，蛋白胨10g，葡萄糖10g， K2HP04 O.lg， FeS04'7H20 0.2g，水800ml;3) 菌种驯化培养基的配制将下述原料按重量比混合而成即可得菌 种驯化培养基①一级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按1: 9的比例配 制；②二级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按2: 8的比例配制；③三级 驯化培养基泰乐菌素药渣与水按3: 7的比例配制；④四级驯化培养基 泰乐菌素药渣与水按4: 6的比例配制；4) 菌种筛选培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可 得菌种筛选培养基①初筛分离培养基泰乐菌素药渣200g，琼脂20g，水800ml;②复筛分离培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨20g,葡萄糖20g， 酒石酸泰乐菌素标准品0.04g，水1000ml;③分离纯化培养基蛋白胨10g， 葡萄糖5g,泰乐菌素药渣浸出液1000ml;5) 菌种活化复壮培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成 即可得菌种活化复壮培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml;6) 药渣发酵培养基的配制泰乐菌素药渣700g，麸皮300g， K2HP04 0.15g， FeSO4'7H2O0.15g，水850ml;7) 取上述步骤1)制备的土壤菌悬液15ml，加入到100g上述步骤2) 制备的菌种选育培养基中，搅拌均匀，置32。C恒温摇床中，120r/min下培 养60h;取培养后的菌悬液，按4%的接种量接入到上述步骤3)制备的一 级菌种驯化培养基中，置32。C恒温摇床中，120r/min培养60h。重复该步 骤8次，所用菌种驯化培养基由一级逐级升至四级；8) 取驯化后的培养液3ml，用磷酸盐缓冲溶液梯度稀释为10—、 10— 2......10—1()浓度，然后采用倾注平板法将稀释后菌液接种于初筛分离培养基，混合后倾注倒板，依据菌落形态及其生长周期的不同，依次编号并将 其接入液体复筛培养基，经培养传代后再采用涂布平板法接种到固体复筛 培养基，经再次分离后将其接入液体分离纯化培养基，培养传代后划线接 种到固体分离纯化培养基，并重复该步骤4次后，即可筛选出降解泰乐菌素的菌株；9) 取上述步骤8)降解泰乐菌素的菌株，接入到上述步骤5)制备的 菌种活化复壮培养基中，32°C下，120r/min恒温摇床中培养24h， 4000r/min 离心15min后，悬浮于新的菌种活化复壮培养基中，32°C恒温摇床中 120r/min继续培养10h，即可得到降解泰乐菌素的菌悬液。10) 取降解泰乐菌素的菌悬液7ml，接入到100g药渣发酵培养基中， 搅拌均匀。在32。C下，孵育72h。然后在100。C下烘干，粉碎后即可。经微生物法检测，处理后药渣中未检测到残留泰乐菌素的存在。 上述步骤4)的泰乐菌素药渣浸出液是按照药渣湿重与水的比例为1: 2配制，具体步骤如下-a. 取泰乐菌素药渣100g，加入200ml已灭菌的蒸馏水或去离子水，搅 拌均匀后在室温下浸泡li2 20h;b. 将上述步骤a中浸泡液分装于离心管中，梯度离心30min，弃沉淀；c. 取梯度离心后的上清液，再通过抽滤弃漂浮的杂质即可； 上述步骤7)泰乐菌素降解菌的驯化过程经历了两个阶段，其依次为菌株性状的稳定阶段和菌株对泰乐菌素降解能力的稳定阶段。
权利要求
1.一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，其特征在于该方法包括如下步骤1)土壤菌悬液的制备用四分取样法，称取堆放泰乐菌素药渣附近土样1～10g，置于三角瓶中，加入100～200ml磷酸盐缓冲溶液，摇匀后，置于恒温摇床中，25～35℃下，200r/min振荡20～40min；2)菌种选育培养基的配制将下述重量的原料混合而成即可得菌种选育培养基泰乐菌素药渣200g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，K2HPO40.1g，FeSO4·7H2O 0.2g，水800ml；3)菌种驯化培养基的配制将下述原料按重量比混合而成即可得菌种驯化培养基①一级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按1∶9的比例配制；②二级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按2∶8的比例配制；③三级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按3∶7的比例配制；④四级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按4∶6的比例配制；4)菌种筛选培养基的配制将下述重量的原料混合而成即可得菌种筛选培养基①初筛分离培养基泰乐菌素药渣200g，琼脂20g，水800ml；②复筛分离培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，酒石酸泰乐菌素标准品0.04g，水1000ml；③分离纯化培养基蛋白胨10g，葡萄糖5g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml；5)菌种活化复壮培养基的配制将下述重量的原料混合而成即可得菌种活化复壮培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml；6)药渣发酵培养基的配制将下述重量的原料混合而成即可得药渣发酵培养基泰乐菌素药渣700～900g，麸皮300～100g，K2HPO40.1～0.2g，FeSO4·7H2O 0.1～0.2g，水800～900ml；7)取上述步骤1)制备的土壤菌悬液10～20ml，加入到100～200g上述步骤2)制备的菌种选育培养基中，搅拌均匀，置25～35℃恒温摇床中，120r/min下培养60～72h；取培养后的菌悬液，按2～5％的接种量接入到上述步骤3)制备的一级菌种驯化培养基中，置25～35℃恒温摇床中，120r/min培养60～72h，重复该步骤5～10次，所用菌种驯化培养基由一级逐级升至四级；8)取驯化后的培养液1～3ml，用磷酸盐缓冲溶液梯度稀释为10-1、10-2……10-10浓度，然后采用倾注平板法将稀释后菌液接种于初筛分离培养基，混合后倾注倒板，依据菌落形态及其生长周期的不同，依次编号并将其接入液体复筛培养基，经培养传代后再采用涂布平板法接种到固体复筛培养基，经再次分离后将其接入液体分离纯化培养基，培养传代后划线接种到固体分离纯化培养基，并重复该步骤3～4次后，完成菌种的分离纯化，即可筛选出降解泰乐菌素的菌株；9)取上述步骤8)降解泰乐菌素的菌株，接入到上述步骤5)制备的菌种活化复壮培养基中，置25～35℃恒温摇床中，120r/min下培养20～30h，4000r/min离心15min后，悬浮于新的菌种活化复壮培养基中，25～35℃恒温摇床中120r/min继续培养8～14h，即可得到泰乐菌素降解菌悬液；10)取上述步骤6)制备的药渣发酵培养基100～200g，接入上述步骤9)制备的泰乐菌素降解菌悬液2～10ml，搅拌均匀，25～35℃发酵60～120h，然后在60～100℃下烘干，粉碎后即可。
2. 如权利要求1所述的一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，其特 征在于所述步骤4)的泰乐菌素药渣浸出液是按照药渣湿重与水的比例为1: 2配制，具体步骤如下a. 取泰乐菌素药渣100g,加入200ml已灭菌的蒸馏水或去离子水，搅 拌均匀后在室温下浸泡12 20h; 'b. 将上述步骤a中浸泡液分装于离心管中，梯度离心30min，弃沉淀;c. 取梯度离心后的上清液，再通过抽滤弃漂浮的杂质即可。
3. 如权利要求1所^E的一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，其特 征在于所述步骤7)泰乐菌素降解菌的驯化过程经历了两个阶段，其依 次为菌株性状的稳定阶段和菌株对泰乐菌素降解能力的稳定阶段。
全文摘要
本发明涉及一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，尤其是涉及一种利用微生物降解药渣中残留泰乐菌素的方法，主要包括土壤菌悬液的制备、菌种选育培养基的配制、菌种驯化培养基的配制、菌种筛选培养基的配制、菌种活化复壮培养基的配制、药渣发酵培养基的配制、降解菌株的筛选等步骤；本发明提供一种通过筛选，培育出能够降解药渣中残留泰乐菌素的复合菌，然后再从复合菌中分离、纯化得到降解泰乐菌素的菌株，配制相应的药渣培养基，接入降解菌发酵降解药渣中残留的泰乐菌素。
文档编号A62D101/20GK101259313SQ20081009339
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月16日 优先权日2008年4月16日
发明者刘宁普, 张作义, 丽 谢, 马玉龙 申请人:宁夏大学
技术领域：
本发明涉及一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，尤其是涉及一种利 用微生物降解药渣中残留泰乐菌素的方法。
技术背景由于抗生素药渣有机质含量高，营养丰富，简单晾晒或堆放，极易引 起二次发酵，颜色变黑，并产生霉臭味。上世纪九十年代，人们将抗生素药渣的处理工艺主要集中在干燥技术的攻关上。1991年，山东鲁抗医药集 团公司抗生素药渣干燥工艺获得成功。1996年，山东鲁抗饲料厂又研究出 离心机结合流化床干燥青霉素湿渣，使干燥成本降低30%。随着各种药渣干燥设备的研制成功，国内有数家单位开展了抗生素药 渣用作高蛋白饲料原料及药物性添加剂的研究。1998-1999年，李月海等 利用鲁抗泰乐菌丝蛋白和头孢菌丝蛋白分别以1.5%、 3%的添加量代替等 量的豆粕用于产蛋鸡饲养，获得较好的饲喂效果；用泰乐菌素蛋白饲料饲 养肉仔鸡，肉鸡成活率、增重速度、料肉比均显著高于未添加组。然而，上述药渣的开发使用，均没有消除药渣中残留的抗生素。因为 动物长期食入残留抗生素的药渣后，会产生耐药菌、畜产品药物残留等种 种不良后果。这就意味着药渣作为再生饲料资源，必须首先降解其中所残 留的抗生素。近年来，国内外有关药渣中残留抗生素降解技术的研究报道甚少，但 在城市生活废水和工业废水中残留抗生素治理方面的研究报道较多。汤少 红等将药渣直接以肥料的形式用于花卉施用，也取得了较满意的施肥效 果，但药渣中残有抗生素，长期使用可能会对土壤微生态平衡产生负面影 响。研究表明四环素能在环境中蓄积，进而破坏水和土壤中的微生物平 衡；泰乐菌素能引起环境中耐药沙门氏菌数量大大增加。Kummerer等、 Ingerslev等、Drillia等采用生物法，对生活废水中残留环丙沙星、氧氟沙 星、甲硝哒唑、复方新诺明和兽用土霉素等的降解技术进行了研究，但所 得到的结果是不一致的。主要原因是①不同抗生素，其分子结构和稳定性是不一样的；②降解用菌株还有待进一步筛选与优化；③污水中无机、 有机质对不同菌株降解不同抗生素的影响可能有别； 温度、pH值、溶 解氧等对不同降解过程的影响。Lange等、Andreozzi等用臭氧对污水中残 留的大环内酯类抗生素哮如红霉素、克拉霉素、罗红霉素、林可霉素进行 无害化处理，取得了较为满意的治理效果，但这种方法是否适合药渣治理， 尚需研究。也有人采用电化氧化法处理废水中抗生素残留，发现用此方法 能有效降低废水中氧氟沙星含量，但对残留林可霉素无显著降解作用，但 这种方法不适合于工厂规模化处理，因能耗太大。Otker等、Polubesova 等用蒙脱石、沸石等多孔型硅酸盐矿物质吸附污水中残留四环素、恩诺沙 星等药物，进而使污水得以净化，但这种方法没有从根本上消除残留抗生 素，只是抗生素的存在位点发生了改变，也不适合于药渣中残留抗生素的 彻底治理。 发明内容本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种通过筛选，培育出能 够降解药渣中残留泰乐菌素的复合菌，然后再从复合菌中分离、纯化得到 降解泰乐菌素的菌株，配制相应的药渣培养基，接入降解菌发酵降解药渣 中残留的泰乐菌素。本发明通过如下方式实现一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，其特征在于该方法包括如下 步骤 .1) 土壤菌悬液的制备用四分取样法，称取堆放泰乐菌素药渣附近 土样l 10g，置于三角瓶中，加入100 200ml磷酸盐缓冲溶液，摇匀后，置于恒温摇床中，25 35:C下，200r/min振荡20 40min;2) 菌种选育培养基的配制将下述重量的原料混合而成即可得菌种 选育培养基泰乐菌素药渣200g，蛋白胨10g，葡萄糖10g， K2HPO40.1g， FeS04.7H20 0.2g,水800ml;3) 菌种驯化培养基的配制将下述原料按重量比混合而成即可得菌 种驯化培养基①一级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按1: 9的比例配 制；②二级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按2: 8的比例配制；③三级 驯化培养基泰乐菌素药渣与水按3: 7的比例配制；④四级驯化培养基:泰乐菌素药渣与水按4: 6的比例配制；4) 菌种筛选培养基的配制将下述重量的原料混合而成即可得菌种 筛选培养基①初筛分离培养基泰乐菌素药渣200g，琼脂20g，水800ml;②复筛分离培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，酒石酸泰 乐菌素标准品0.04g，水1000ml;③分离纯化培养基蛋白胨10g，葡萄 糖5g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml;5) 菌种活化复壮培养基的配制将下述重量的原料混合而成即可得 菌种活化复壮培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，泰乐菌素药渣浸出液励Oml;6) 药渣发酵培养基的配制将下述重量的原料混合而成即可得药渣发酵培养基泰乐菌素药渣700 900g，麸皮300 100g， K2HP04 0.1~0.2g， FeSO4.7H2O0.1~0.2g，水800 900ml;7) 取上述步骤1)制备的土壤菌悬液10~20ml，加入到100 200g上 述步骤2)制备的菌种选育培养基中，搅拌均匀，置25 35"C恒温摇床中， 120r/min下培养60 72h;取培养后的菌悬液，按2~5%的接种量接入到上 述步骤3)制备的一级菌种驯化培养基中，置25 35'C恒温摇床中， 120r/min培养60 72h，重复该步骤5 10次，所用菌种驯化培养基由一级 逐级升至四级；8) 取驯化后的培养液l~3ml，用磷酸盐缓冲溶液梯度稀释为10—、 10_2......10—1Q浓度，然后采用倾注平板法将稀释后菌液接种于初筛分离培养基，混合后倾注倒板，依据菌落形态及其生长周期的不同，依次编号并 将其接入液体复筛培养基，经培养传代后再采用涂布平板法接种到固体复 筛培养基，经再次分离后将其接入液体分离纯化培养基，培养传代后划线 接种到固体分离纯化培养基，并重复该步骤3 4次后，完成菌种的分离纯 化，即可筛选出降解泰乐菌素的菌株；9) 取上述步骤8)降解泰乐菌素的菌株，接入到上述步骤5)制备的 菌种活化复壮培养基中，置25~35。C恒温摇床中，120r/min下培养20~30h， 4000r/min离心15min后，悬浮于新的菌种活化复壮培养基中，25 35°C 恒温摇床中120r/min继续培养8 14h，即可得到泰乐菌素降解菌悬液；10) 取上述步骤6)制备的药渣发酵培养基100 200g，接入上述步骤9)制备的泰乐菌素降解菌悬液2~10ml，搅拌均匀，25~35°C发酵60 120h， 然后在60 100。C下烘干，粉碎后即可；所述步骤4)的泰乐菌素药渣浸出液是按照药渣湿重与水的比例为1: 2配制，具体步骤如下 'a. 取泰乐菌素药渣100g，加入200ml已灭菌的蒸馏水或去离子水，搅 拌均匀后在室温下浸泡12 20h;b. 将上述步骤a中浸泡液分装于离心管中，梯度离心30min，弃沉淀；c. 取梯度离心后的上清液，再通过抽滤弃漂浮的杂质即可； 所述步骤7)泰乐菌素降解菌的驯化过程经历了两个阶段，其依次为菌株性状的稳定阶段和菌株对泰乐菌素降解能力的稳定阶段。泰乐菌素药渣经上述方法处理后，药渣中泰乐菌素含量测定方法如下1) 泰乐菌素标准曲线的制备配制浓度分别为Ojig/ml、 2吗/ml、 4|ug/ml、 6jig/ml、 8|ug/ml、 10|xg/ml、 14|ig/ml、 16^ig/ml、 18pg/ml和20|ig/ml的酒石酸泰乐菌素标准溶液，取 lOpl点样于指示菌为藤黄微球菌的SI固体培养基(培养基组成蛋白胨 8g,磷酸氢二钠5.3g,酵母粉5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，琼脂粉12g， 水1000ml)平板。30。C孵育16~20h，测定抑菌圈直径。由抑菌圈直径对泰乐菌素浓度作图，可得到回归方程和pe值。2) 取处理后的泰乐菌素药渣样品l.OOg，加入5ml 0.01mol/L酒石酸 溶液，搅拌后，浸泡5 8h，再搅拌后，静置10 30min。取lml浸出液， 5000r/min离心10min。取上清液1(^1点样于指示菌为藤黄微球菌的Sl固 体培养基平板。30°C孵育16~20h，测定抑菌圈直径。依据步骤(l)的回归 方程，得到处理后药渣中残留泰乐菌素含量。泰乐菌素药渣经筛选出的降解菌株处理，处理后药渣中未检测到残留 泰乐菌素的存在。本发明有如下效果1)方法独特本发明通过筛选，培育出能够降解药渣中残留泰乐菌 素的复合菌，然后再从复合菌中分离、纯化得到降解泰乐菌素的菌株，配 制相应的药渣培养基，接入降解菌发酵降解药渣中残留的泰乐菌素。2) 有效的降解了药渣中残留的泰乐菌素本发明采用微生物法对泰 乐菌素药渣进行降解处理，可以完全降解药渣中残留的泰乐菌素。3) 本发明可使泰乐菌素药渣再利用成为可能，实现泰乐菌素药渣零 排放。由于药渣中泰乐菌素的残留量较高，使泰乐菌素药渣不能直接作为 动物词料或肥料使用。若动物长期词喂未经处理的泰乐菌素药渣，所产肉、蛋、奶中泰乐菌素残留量高达0.5mg/kg左右，而美国食品和药物管理局 (FDA)规定，泰乐菌素在可食组织或蛋中的残留允许浓度为不高于 0.2mg/kg。若泰乐菌素药渣直接以肥料形式施肥，所残留的泰乐菌素可能 会引起环境中耐药沙门氏菌数量的增加。4) 本发明通过泰乐菌素降解菌处理药渣，不仅降解了药渣中残留的 泰乐菌素，同时还提高了药渣中蛋白质的含量。
具体实施方式
实例l-一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，该方法包括如下步骤1) 土壤菌悬液的制备称取堆放泰乐菌素药渣附近土样lg，置于三角瓶中，加入100ml磷酸盐缓冲溶液，摇匀后，置于恒温摇床中，3(TC下， 200r/min振荡20min;2) 菌种选育培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可得菌种选育培养基泰乐菌素药渣200g，蛋白胨10g,葡萄糖10g， K2HP04 O.lg， FeS04-7H20 0.2g，水謡ml;3) 菌种驯化培养基的配制将下述原料按重量比混合而成即可得菌 种驯化培养基①一级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按1: 9的比例配 制；②二级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按2: 8的比例配制；③三级 驯化培养基泰乐菌素药渣与水按3: 7的比例配制；④四级驯化培养基: 泰乐菌素药渣与水按4: 6的比例配制；4) 菌种筛选培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可 得菌种筛选培养基①初筛分离培养基泰乐菌素药渣200g，琼脂20g， 水800ml;②复筛分离培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g， 酒石酸泰乐菌素标准品0.04g，水1000ml;③分离纯化培养基蛋白胨10g， 葡萄糖5g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml;5) 菌种活化复壮培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成 即可得菌种活化复壮培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，泰乐菌素药 渣浸出液1000ml;6) 药渣发酵培养基的配制泰乐菌素药渣700g，麸皮300g， K2HP04 0.2g， FeSO4.7H2O0.1g，水900ml。7) 取上述步骤1)制备的土壤菌悬液20ml，加入到100g上述步骤2') 制备的菌种选育培养基中，搅拌均匀，置3(TC恒温摇床中，120r/min下培 养72h;取培养后的菌悬液，按5%的接种量接入到上述步骤3)制备的一 级菌种驯化培养基中，置3(TC恒温摇床中，120r/min培养72h。重复该步 骤10次，所用菌种驯化培养基由一级逐级升至四级；8) 取驯化后的培养液3ml，用磷酸盐缓冲溶液梯度稀释为10—、 10— 2......10—1()浓度，然后采用倾注平板法将稀释后菌液接种于初筛分离培养基，混合后倾注倒板，依据菌落形态及其生长周期的不同，依次编号并将 其接入液体复筛培养基，经培养传代后再采用涂布平板法接种到固体复筛 培养基，经再次分离后将其接入液体分离纯化培养基，培养传代后划线接 种到固体分离纯化培养基，并重复该步骤4次后，即可筛选出降解泰乐菌 素的菌株；9) 取上述步骤8)所得的泰乐菌素降解菌，接入到菌种活化复壮培养 基中，30。C下，120r/min恒温摇床中培养24h， 4000r/min离心15min后， 悬浮于新的菌种活化复壮培养基中，30°C恒温摇床中120r/min继续培养 10h，即可得到降解泰乐菌素的菌悬液。10) 取降解泰乐菌素的菌悬液2ml，接入到100g药渣发酵培养基中， 搅拌均匀。在30。C下，孵育96h。然后在80。C下烘干，粉碎后即可。经微生物法检测，处理后药渣中未检测到残留泰乐菌素的存在。 实例2:一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，该方法包括如下步骤1) 土壤菌悬液的制备称取堆放泰乐菌素药渣附近土样10g，置于三角瓶中，加入200ml磷酸盐缓冲溶液，摇匀后，置于恒温摇床中，28"C下， 200r/min振荡40min;2) 菌种选育培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可得菌种选育培养基泰乐菌素药渣200g，蛋白胨10g，葡萄糖10g， K2HP04 O.lg， FeS04-7H20 0.2g，水800ml;3) 菌种驯化培养基的配制将下述原料按重量比混合而成即可得菌 种驯化培养基①一级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按1: 9的比例配 制；②二级驯化培养基'泰乐菌素药渣与水按2: 8的比例配制；③三级 驯化培养基泰乐菌素药渣与水按3: 7的比例配制；④四级驯化培养基: 泰乐菌素药渣与水按4: 6的比例配制；4) 菌种筛选培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可 得菌种筛选培养基①初筛分离培养基泰乐菌素药渣200g，琼脂20g，水800ml;②复筛分离培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g， 酒石酸泰乐菌素标准品0.04g，水1000ml;③分离纯化培养基蛋白胨10g， 葡萄糖5g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml;5) 菌种活化复壮培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成 即可得菌种活化复壮培f基酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，泰乐菌素药 渣浸出液1000ml;6) 药渣发酵培养基的配制泰乐菌素药渣800g，麸皮200g， K2HP04 0.15g， FeSO4'7H2O0.15g，水850ml;7) 取上述步骤1)制备的土壤菌悬液lOml，加入到200g上述步骤2) 制备的菌种选育培养基中，搅拌均匀，置28t:恒温摇床中，120r/min下培 养72h;取培养后的菌悬液，按2%的接种量接入到上述步骤3)制备的一 级菌种驯化培养基中，置28t:恒温摇床中，120r/min培养72h。重复该步 骤8次，所用菌种驯化培养基由一级逐级升至四级；8) 取驯化后的培养液lml，用磷酸盐缓冲溶液梯度稀释为l(T1、 10— 2......10_1Q浓度，然后采用倾注平板法将稀释后菌液接种于初筛分离培养基，混合后倾注倒板，依据菌落形态及其生长周期的不同，依次编号并将 其接入液体复筛培养基，经培养传代后再采用涂布平板法接种到固体复筛 培养基，经再次分离后将其接入液体分离纯化培养基，培养传代后划线接 种到固体分离纯化培养基，并重复该步骤3次后，即可筛选出降解泰乐菌 素的菌株；9) 取上述步骤8)降解泰乐菌素的菌株，接入到上述步骤5)制备的菌种活化复壮培养基中，.28。C下，120r/min恒温摇床中培养26h，4000r/min 离心15min后，悬浮于新的菌种活化复壮培养基中，28°C恒温摇床中 120r/min继续培养10h，即可得到降解泰乐菌素的菌悬液。10)取降解泰乐菌素的菌悬液10ml，接入到200g药渣发酵培养基中， 搅拌均匀。在28。C下，孵育108h。然后在80。C下烘干，粉碎后即可。经微生物法检测，处理后药渣中未检测到残留泰乐菌素的存在。实例3:一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，该方法包括如下步骤1) 土壤菌悬液的制备称取堆放泰乐菌素药渣附近土样5g，置于三 角瓶中，加入150ml磷酸盐缓冲溶液，摇匀后，置于恒温摇床中，35-C下， 200r/min振荡30min;2) 菌种选育培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可 得菌种选育培养基泰乐菌素药渣200g，蛋白胨10g，葡萄糖10g， K2HP04 O.lg， FeS04.7H20 0.2g，水謂ml;3) 菌种驯化培养基的配制将下述原料按重量比混合而成即可得菌 种驯化培养基①一级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按1: 9的比例配 制；②二级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按2: 8的比例配制；③三级 驯化培养基泰乐菌素药渣与水按3: 7的比例配制；④四级驯化培养基 泰乐菌素药渣与水按4: 6的比例配制；4) 菌种筛选培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可 得菌种筛选培养基①初筛分离培养基泰乐菌素药渣200g，琼脂20g，水800ml;②复筛分离培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g, 酒石酸泰乐菌素标准品0.04g,水1000ml; (D分离纯化培养基蛋白胨10g， 葡萄糖5g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml;5) 菌种活化复壮培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成 即可得菌种活化复壮培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，泰乐菌素药 渣浸出液1000ml;6) 药渣发酵培养基的配制泰乐菌素药渣900g，麸皮100g， K2HP04 O.lg， FeS04.7H20 0.2g，水800ml;7) 取上述步骤1)制备的土壤菌悬液lOml，加入到150g上述步骤2)制备的菌种选育培养基中，搅拌均匀，置35'C恒温摇床中，120r/min下培 养60h;取培养后的菌悬液，按3%的接种量接入到上述步骤3)制备的一 级菌种驯化培养基中，置35'C恒温摇床中，120r/min培养60h。重复该步 骤5次，所用菌种驯化培养基由一级逐级升至四级；8) 取驯化后的培养液2ml，用磷酸盐缓冲溶液梯度稀释为10—\ 10— 2......10—1Q浓度，然后采用倾注平板法将稀释后菌液接种于初筛分离培养基，混合后倾注倒板，依据菌落形态及其生长周期的不同，依次编号并将 其接入液体复筛培养基，经培养传代后再采用涂布平板法接种到固体复筛 培养基，经再次分离后将其接入液体分离纯化培养基，培养传代后划线接 种到固体分离纯化培养基，并重复该步骤3次后，即可筛选出降解泰乐菌 素的菌株；9) 取上述步骤8)降解泰乐菌素的菌株，接入到上述步骤5)制备的 菌种活化复壮培养基中，35。C下，120r/min恒温摇床中培养20h，4000r/min 离心15min后，悬浮于新的菌种活化复壮培养基中，35°C恒温摇床+ 120r/min继续培养8h，即可得到降解泰乐菌素的菌悬液。10) 取降解泰乐菌素的菌悬液8ml，接入到150g药渣发酵培养基中， 搅拌均匀。在35。C下，i瞎育60h。然后在100。C下烘干，粉碎后即可。经微生物法检测，处理后药渣中未检测到残留泰乐菌素的存在。 实例4:一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，该方法包括如下步骤1) 土壤菌悬液的制备称取堆放泰乐菌素药渣附近土样8g，置于三角瓶中，加入200ml磷酸盐缓冲溶液，摇匀后，置于恒温摇床中，25"C下， 200r/min振荡40min;2) 菌种选育培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可 得菌种选育培养基泰乐菌素药渣200g,蛋白胨10g，葡萄糖10g， K2HP04 O.lg， FeS04'7H20 0.2g，.水800ml;3) 菌种驯化培养基的配制将下述原料按重量比混合而成即可得菌 种驯化培养基①一级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按1: 9的比例配 制；②二级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按2: 8的比例配制；③三级 驯化培养基泰乐菌素药渣与水按3: 7的比例配制；④四级驯化培养基:12泰乐菌素药渣与水按4: 6的比例配制；4) 菌种筛选培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可 得菌种筛选培养基①初筛分离培养基泰乐菌素药渣200g，琼脂20g，水800ml;②复筛分离培^基酵母浸出粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g， 酒石酸泰乐菌素标准品0.04g，水1000ml;③分离纯化培养基蛋白胨10g， 葡萄糖5g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml;5) 菌种活化复壮培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成 即可得菌种活化复壮培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml;6) 药渣发酵培养基的配制泰乐菌素药渣800g，麸皮200g， K2HP04 0.2g， FeSO4-7H2O0.1g，水800ml;7) 取上述步骤1)制备的土壤菌悬液15ml，加入到200g上述步骤2) 制备的菌种选育培养基中，搅拌均匀，置25"C恒温摇床中，120r/min下培 养72h;取培养后的菌悬液，按4%的接种量接入到上述步骤3)制备的一 级菌种驯化培养基中，置25'C恒温摇床中，120r/min培养72h。重复该步 骤8次，所用菌种驯化培养基由一级逐级升至四级；8) 取驯化后的培养液2ml，用磷酸盐缓冲溶液梯度稀释为10—\ 10— 2......10_1()浓度，然后采用倾注平板法将稀释后菌液接种于初筛分离培养基，混合后倾注倒板，依据菌落形态及其生长周期的不同，依次编号并将 其接入液体复筛培养基，经培养传代后再采用涂布平板法接种到固体复筛 培养基，经再次分离后将其接入液体分离纯化培养基，培养传代后划线接 种到固体分离纯化培养基，并重复该步骤4次后，即可筛选出降解泰乐菌 素的菌株；9) 取上述步骤8)降解泰乐菌素的菌株，接入到上述步骤5)制备的 菌种活化复壮培养基中，25。C下，120r/min恒温摇床中培养30h，4000r/min 离心15min后，悬浮于新的菌种活化复壮培养基中，25°C恒温摇床中 120r/min继续培养14h，即可得到降解泰乐菌素的菌悬液。10) 取降解泰乐菌素的菌悬液10ml，接入到100g药渣发酵培养基中， 搅拌均匀。在25。C下，孵育120h。然后在60。C下烘干，粉碎后即可。，经微生物法检测，处理后药渣中未检测到残留泰乐菌素的存在。实例5:一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，该方法包括如下步骤1) 土壤菌悬液的制备称取堆放泰乐菌素药渣附近土样3g，置于三角瓶中，加入100ml磷酸盐缓冲溶液，摇匀后，置于恒温摇床中，32'C下， 200r/min振荡25min;2) 菌种选育培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可得菌种选育培养基泰乐菌素药渣200g，蛋白胨10g，葡萄糖10g， K2HP04 O.lg， FeS04'7H20 0.2g，水800ml;3) 菌种驯化培养基的配制将下述原料按重量比混合而成即可得菌 种驯化培养基①一级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按1: 9的比例配 制；②二级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按2: 8的比例配制；③三级 驯化培养基泰乐菌素药渣与水按3: 7的比例配制；④四级驯化培养基 泰乐菌素药渣与水按4: 6的比例配制；4) 菌种筛选培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成即可 得菌种筛选培养基①初筛分离培养基泰乐菌素药渣200g，琼脂20g，水800ml;②复筛分离培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨20g,葡萄糖20g， 酒石酸泰乐菌素标准品0.04g，水1000ml;③分离纯化培养基蛋白胨10g， 葡萄糖5g,泰乐菌素药渣浸出液1000ml;5) 菌种活化复壮培养基的配制将下述重量或体积的原料混合而成 即可得菌种活化复壮培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml;6) 药渣发酵培养基的配制泰乐菌素药渣700g，麸皮300g， K2HP04 0.15g， FeSO4'7H2O0.15g，水850ml;7) 取上述步骤1)制备的土壤菌悬液15ml，加入到100g上述步骤2) 制备的菌种选育培养基中，搅拌均匀，置32。C恒温摇床中，120r/min下培 养60h;取培养后的菌悬液，按4%的接种量接入到上述步骤3)制备的一 级菌种驯化培养基中，置32。C恒温摇床中，120r/min培养60h。重复该步 骤8次，所用菌种驯化培养基由一级逐级升至四级；8) 取驯化后的培养液3ml，用磷酸盐缓冲溶液梯度稀释为10—、 10— 2......10—1()浓度，然后采用倾注平板法将稀释后菌液接种于初筛分离培养基，混合后倾注倒板，依据菌落形态及其生长周期的不同，依次编号并将 其接入液体复筛培养基，经培养传代后再采用涂布平板法接种到固体复筛 培养基，经再次分离后将其接入液体分离纯化培养基，培养传代后划线接 种到固体分离纯化培养基，并重复该步骤4次后，即可筛选出降解泰乐菌素的菌株；9) 取上述步骤8)降解泰乐菌素的菌株，接入到上述步骤5)制备的 菌种活化复壮培养基中，32°C下，120r/min恒温摇床中培养24h， 4000r/min 离心15min后，悬浮于新的菌种活化复壮培养基中，32°C恒温摇床中 120r/min继续培养10h，即可得到降解泰乐菌素的菌悬液。10) 取降解泰乐菌素的菌悬液7ml，接入到100g药渣发酵培养基中， 搅拌均匀。在32。C下，孵育72h。然后在100。C下烘干，粉碎后即可。经微生物法检测，处理后药渣中未检测到残留泰乐菌素的存在。 上述步骤4)的泰乐菌素药渣浸出液是按照药渣湿重与水的比例为1: 2配制，具体步骤如下-a. 取泰乐菌素药渣100g，加入200ml已灭菌的蒸馏水或去离子水，搅 拌均匀后在室温下浸泡li2 20h;b. 将上述步骤a中浸泡液分装于离心管中，梯度离心30min，弃沉淀；c. 取梯度离心后的上清液，再通过抽滤弃漂浮的杂质即可； 上述步骤7)泰乐菌素降解菌的驯化过程经历了两个阶段，其依次为菌株性状的稳定阶段和菌株对泰乐菌素降解能力的稳定阶段。
权利要求
1.一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，其特征在于该方法包括如下步骤1)土壤菌悬液的制备用四分取样法，称取堆放泰乐菌素药渣附近土样1～10g，置于三角瓶中，加入100～200ml磷酸盐缓冲溶液，摇匀后，置于恒温摇床中，25～35℃下，200r/min振荡20～40min；2)菌种选育培养基的配制将下述重量的原料混合而成即可得菌种选育培养基泰乐菌素药渣200g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，K2HPO40.1g，FeSO4·7H2O 0.2g，水800ml；3)菌种驯化培养基的配制将下述原料按重量比混合而成即可得菌种驯化培养基①一级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按1∶9的比例配制；②二级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按2∶8的比例配制；③三级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按3∶7的比例配制；④四级驯化培养基泰乐菌素药渣与水按4∶6的比例配制；4)菌种筛选培养基的配制将下述重量的原料混合而成即可得菌种筛选培养基①初筛分离培养基泰乐菌素药渣200g，琼脂20g，水800ml；②复筛分离培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，酒石酸泰乐菌素标准品0.04g，水1000ml；③分离纯化培养基蛋白胨10g，葡萄糖5g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml；5)菌种活化复壮培养基的配制将下述重量的原料混合而成即可得菌种活化复壮培养基酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，泰乐菌素药渣浸出液1000ml；6)药渣发酵培养基的配制将下述重量的原料混合而成即可得药渣发酵培养基泰乐菌素药渣700～900g，麸皮300～100g，K2HPO40.1～0.2g，FeSO4·7H2O 0.1～0.2g，水800～900ml；7)取上述步骤1)制备的土壤菌悬液10～20ml，加入到100～200g上述步骤2)制备的菌种选育培养基中，搅拌均匀，置25～35℃恒温摇床中，120r/min下培养60～72h；取培养后的菌悬液，按2～5％的接种量接入到上述步骤3)制备的一级菌种驯化培养基中，置25～35℃恒温摇床中，120r/min培养60～72h，重复该步骤5～10次，所用菌种驯化培养基由一级逐级升至四级；8)取驯化后的培养液1～3ml，用磷酸盐缓冲溶液梯度稀释为10-1、10-2……10-10浓度，然后采用倾注平板法将稀释后菌液接种于初筛分离培养基，混合后倾注倒板，依据菌落形态及其生长周期的不同，依次编号并将其接入液体复筛培养基，经培养传代后再采用涂布平板法接种到固体复筛培养基，经再次分离后将其接入液体分离纯化培养基，培养传代后划线接种到固体分离纯化培养基，并重复该步骤3～4次后，完成菌种的分离纯化，即可筛选出降解泰乐菌素的菌株；9)取上述步骤8)降解泰乐菌素的菌株，接入到上述步骤5)制备的菌种活化复壮培养基中，置25～35℃恒温摇床中，120r/min下培养20～30h，4000r/min离心15min后，悬浮于新的菌种活化复壮培养基中，25～35℃恒温摇床中120r/min继续培养8～14h，即可得到泰乐菌素降解菌悬液；10)取上述步骤6)制备的药渣发酵培养基100～200g，接入上述步骤9)制备的泰乐菌素降解菌悬液2～10ml，搅拌均匀，25～35℃发酵60～120h，然后在60～100℃下烘干，粉碎后即可。
2. 如权利要求1所述的一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，其特 征在于所述步骤4)的泰乐菌素药渣浸出液是按照药渣湿重与水的比例为1: 2配制，具体步骤如下a. 取泰乐菌素药渣100g,加入200ml已灭菌的蒸馏水或去离子水，搅 拌均匀后在室温下浸泡12 20h; 'b. 将上述步骤a中浸泡液分装于离心管中，梯度离心30min，弃沉淀;c. 取梯度离心后的上清液，再通过抽滤弃漂浮的杂质即可。
3. 如权利要求1所^E的一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，其特 征在于所述步骤7)泰乐菌素降解菌的驯化过程经历了两个阶段，其依 次为菌株性状的稳定阶段和菌株对泰乐菌素降解能力的稳定阶段。
全文摘要
本发明涉及一种降解药渣中残留泰乐菌素的方法，尤其是涉及一种利用微生物降解药渣中残留泰乐菌素的方法，主要包括土壤菌悬液的制备、菌种选育培养基的配制、菌种驯化培养基的配制、菌种筛选培养基的配制、菌种活化复壮培养基的配制、药渣发酵培养基的配制、降解菌株的筛选等步骤；本发明提供一种通过筛选，培育出能够降解药渣中残留泰乐菌素的复合菌，然后再从复合菌中分离、纯化得到降解泰乐菌素的菌株，配制相应的药渣培养基，接入降解菌发酵降解药渣中残留的泰乐菌素。
文档编号A62D101/20GK101259313SQ20081009339
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月16日 优先权日2008年4月16日
发明者刘宁普, 张作义, 丽 谢, 马玉龙 申请人:宁夏大学
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