一种有机磷降解酶制剂及其制备方法

专利名称：：一种有机磷降解酶制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及微生物技术，具体的说是一种用于降解蔬菜水果上残留的有机磷降解酶制剂及其制备方法。
背景技术：
：有机磷农药是农药中的主要类别，在农业生产中起了重要作用。但其杀伤非目标生物及污染环境的问题同样不能忽视。残留在蔬菜、水果等食品中的低剂量有机磷对人可产生慢性毒性，诱发多发性神经病、中风等。此外，有些有机磷对蜜蜂、鱼类有很高的毒性。有机磷农药的残留毒性问题越来越受到人们的关注。有机磷在环境中的降解，主要有目前光化学降解、化学降解、微生物降解3种形式。目前利用微生物以及其代谢产物对有机磷进行降解是逐渐被采用。有机磷通常含有三个磷酯键，一个磷酸酯键被水解将大大降低其毒性。有机磷农药降解酶可降解有机磷农药分子，破坏有机磷的磷酸键而使其脱毒。由于各种有机磷农药都有类似的结构，只是取代基不同，所以一种有机磷农药降解酶往往能降解多种有机磷农药。
发明内容本发明的目的是提供一种工艺简单的有机磷降解酶制剂及其制备方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为有机磷降解酶制剂甲基杆菌经发酵后即得有机磷降解酶制剂。所述有机磷降解酶制剂还包括N-油酰基多縮氨基酸钠、碳酸氢钠和羧甲基纤维素钠，按重量份数计为按重量份数计为5-20份有机磷降解酶制剂、2-8份N-油酰基多縮氨基酸钠、18-50份碳酸氢钠和O.5-l份羧甲基纤维素钠。所述甲基杆菌经发酵过程为首先按体积百分比5-10X甲基杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基于30-35t:，振荡培养48-60h，待用；而后按体积百分比5_8%的接种量将上述培养的菌种种子罐培养以25-3(TC、发酵时间48-60小时，待用；最后将发酵液离心后沉淀中加入1/30-1/40发酵液的EDTA和1/10-1/15发酵液体积的蔗糖溶液于30-60min冰浴，再离心沉淀中加入1/30-1/40发酵液体积的冰水再在30-60min冰浴，再次离心沉淀加入硫酸铵至饱和度为100%，待盐析过夜；离心，沉淀即为所得。有机磷降解酶制剂的制备方法首先按体积百分比5_10%甲基杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基于30-35t:，振荡培养48-60h，待用；而后按体积百分比5_8%的接种量将上述培养的菌种种子罐培养以25-3(TC、发酵时间48-60小时，待用；最后将发酵液离心后沉淀中加入1/30-1/40发酵液的EDTA和1/10-1/15发酵液体积的蔗糖溶液于30-60min冰浴，再离心沉淀中加入1/30-1/40发酵液体积的冰水再在30-60min冰浴，再次离心沉淀加入硫酸铵至饱和度为100%，待盐析过夜；离心，沉淀即为有机磷降解酶制剂，将上述混匀后。所述有机磷降解酶制剂冷冻干燥，粉碎并加水混合均匀，在造粒机中于15_35°C，制作成20-40目的颗粒。所述有机磷降解酶制剂还包括N-油酰基多縮氨基酸钠、碳酸氢钠和羧甲基纤维素钠，按重量份数计为按重量份数计为5-20份有机磷降解酶制剂、2-8份N-油酰基多縮氨基酸钠、18-50份碳酸氢钠和0.5-1份羧甲基纤维素钠，按上述混匀后在压片机中压片，压成厚度1.0-1.5cm，直径1.0-1.5cm，重量2.0-4.0g的片剂，得到有机磷类农药降解剂泡腾片。所述离心均在4。C下，以6000-8000r/min，离心30-40min。所述种子罐培养时罐压0.02-0.05MPa、通气量1:1.0-1.5v/v/min、搅拌速度300转/分钟。本发明的优点在于1.本发明制剂对有机磷类农药具有广谱性降解，能够降解敌敌畏、辛硫磷、甲胺磷、对硫磷等。2.本发明制剂与通常采用清水、洗涤剂浸泡或是清洗相比，效果更佳，对蔬果上残留的有机磷类农药能降解75%以上。具体实施方式实施例11)种子液发酵牛肉膏蛋白胨培养基，灭菌后以体积百分比10%的接种量接入甲基杆菌，30°C，180r/min培养60h。2)发酵罐发酵按体积百分比8%的接种量将种子液移入种子罐，进行发酵培养，条件为罐温3(TC、罐压0.05MPa、通气量1:1.5v/v/min、搅拌速度300转/分钟、发酵时间60小时。3)将发酵液于4°C，7000r/min.离心30min，弃上清液，在菌泥中加入1/40发酵液体积的pH7.5，0.05mol/L的EDTA和1/15发酵液体积的蔗糖溶液，轻轻摇匀，使菌体充分悬浮，冰浴60min，4°C，7000r/min离心30min，弃高渗液，在菌泥中加入1/40发酵液体积的冰水，轻轻摇匀，冰浴60min，4°C，7000r/min离心30min，得上清液，边搅拌边加碾细的硫酸铵至饱和度为100%，41:盐析过夜；离心，收集蛋白沉淀，即为有机磷降解酶制剂。将上述所得8份重量份数的有机磷降解酶制剂加水混合均匀，在造粒机中，制作成20目的颗粒，待用；而后按重量份数计，20份碳酸氢钠，5份N-油酰基多縮氨基酸钠，O.5份羧甲基纤维素钠碳酸氢钠，混合均匀，在压片机中压片，压成厚度1.Ocm，直径1.2cm，重量3.Og的片剂。将上述待用的有机磷降解酶制剂与上述片剂混合，在压片机中压片，压片温度32t:，压成厚度1.Ocm，直径1.2cm，重量3.Og的片剂，得到有机磷类农药降解酶剂泡腾片。将上述有机磷降解酶制剂与有机磷类农药降解酶剂泡腾片和同样浓度的洗洁清以及清水对油菜上残留的辛硫磷进行降解试验(参见表1)。表1有机磷降解酶剂对油菜上残留的辛硫磷的降解效果<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>实施例2与实施例1不同之处在于1)种子液发酵牛肉膏蛋白胨培养基，灭菌后以体积百分比5%的接种量接入甲基杆菌，35°C，180r/min培养48h。2)发酵罐发酵按体积百分比5%的接种量将种子液移入种子罐，进行发酵培养，条件为罐温25t:、罐压0.02MPa、通气量1:1.Ov/v/min、搅拌速度300转/分钟、发酵时间48小时。3)将发酵液于4°C，6000r/min.离心40min.弃上清液，在菌泥中加入1/30发酵液体积的pH7.5，0.05mol/L的EDTA和1/10发酵液体积的蔗糖溶液，轻轻摇匀，使菌体充分悬浮，冰浴30min，4°C，6000r/min离心40min，弃高渗液，在菌泥中加入1/30发酵液体积的冰水，轻轻摇匀，冰浴30min，4°C，6000r/min离心40min，得上清液，边搅拌边加碾细的硫酸铵至饱和度为100%，41:盐析过夜；离心，收集蛋白沉淀，即为有机磷降解酶制剂。将上述所得5份重量份数的有机磷降解酶制剂加水混合均匀，在造粒机中，于15t:制作成30目的颗粒，待用；而后按重量份数计，50份碳酸氢钠，2份N-油酰基多縮氨基酸钠，1份羧甲基纤维素钠碳酸氢钠，混合均匀，在压片机中压片，压成厚度1.5cm，直径1.5cm，重量2.Og的片剂。将上述待用的有机磷降解酶制剂与上述片剂混合，在压片机中压片，压片温度25t:，压成厚度1.5cm，直径1.5cm，重量2.Og的片剂，得到有机磷类农药降解酶剂泡腾片。将上述有机磷降解酶制剂与有机磷类农药降解酶剂泡腾片和同样浓度的洗洁清以及清水对油菜上残留的辛硫磷进行降解试验(参见表2)。表2有机磷降解酶剂对油菜上残留的辛硫磷的降解效果洗涤剂类型降解效率普通洗洁清33.1%清水15.3%有机磷类农药降解酶剂39.8%有机磷类农药降解酶剂泡腾片78.2%实施例3与实施例1不同之处在于1)种子液发酵牛肉膏蛋白胨培养基，灭菌后以体积百分比5%的接种量接入甲基杆菌，32°C，180r/min培养52h。2)发酵罐发酵按体积百分比5%的接种量将种子液移入种子罐，进行发酵培养，条件为罐温28t:、罐压0.04MPa、通气量1:1.2v/v/min、搅拌速度300转/分钟、发酵时间52小时。3)将发酵液于4°C，8000r/min.离心35min.弃上清液，在菌泥中加入1/30发酵液体积的pH7.5，0.05mol/L的EDTA和1/10发酵液体积的蔗糖溶液，轻轻摇匀，使菌体充分悬浮，冰浴50min，4°C，8000r/min离心35min，弃高渗液，在菌泥中加入1/30发酵液体积的冰水，轻轻摇匀，冰浴50min，4°C，8000r/min离心35min，得上清液，边搅拌边加碾细的硫酸铵至饱和度为100%，41:盐析过夜；离心，收集蛋白沉淀，即为有机磷降解酶制剂。将15份重量份数的有机磷降解酶制剂加水混合均匀，在造粒机中，制作成35目的5颗粒，待用。而后按重量份数计，20份碳酸氢钠，5份N-油酰基多縮氨基酸钠和1.0份羧甲基纤维素钠碳酸氢钠，混合均匀，在压片机中压片，压成厚度1.2cm，直径1.4cm，重量3.Og的片剂。将上述待用的有机磷降解酶制剂与上述片剂混合，在压片机中压片，压片温度32t:，压成厚度1.2cm，直径1.4cm，重量4.Og的片剂，得到蔬果专用有机磷类农药降解剂泡腾片。将上述有机磷类农药降解酶剂泡腾片和同样浓度的洗洁清以及清水对油菜上残留的敌敌畏进行降解试验(参见表3)。表3有机磷降解酶剂对油菜上残留的敌敌畏的降解效果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求一种有机磷降解酶制剂，其特征在于甲基杆菌经发酵后即得有机磷降解酶制剂。2.按权利要求1所述的有机磷降解酶制剂，其特征在于所述有机磷降解酶制剂还包括N-油酰基多縮氨基酸钠、碳酸氢钠和羧甲基纤维素钠，按重量份数计为5-20份有机磷降解酶制剂、2-8份N-油酰基多縮氨基酸钠、18-50份碳酸氢钠和0.5-1份羧甲基纤维素钠。3.按权利要求1或2所述的有机磷降解酶制剂，其特征在于所述甲基杆菌经发酵过程为首先按体积百分比5-10%甲基杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基于30-351:，振荡培养48-60h，待用；而后按体积百分比5-8%的接种量将上述培养的菌种种子罐培养以25-30°C、发酵时间48-60小时，待用；最后将发酵液离心后沉淀中加入1/30-1/40发酵液的EDTA和1/10-1/15发酵液体积的蔗糖溶液于30-60min冰浴，再离心沉淀中加入1/30-1/40发酵液体积的冰水再在30-60min冰浴，再次离心沉淀加入硫酸铵至饱和度为100%，待盐析过夜；离心，沉淀即为所得。4.一种按权利要求1所述的有机磷降解酶制剂的制备方法，其特征在于首先按体积百分比5-10X甲基杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基于30-35t:，振荡培养48-60h，待用；而后按体积百分比5-8%的接种量将上述培养的菌种种子罐培养以25-3(TC、发酵时间48-60小时，待用；最后将发酵液离心后沉淀中加入1/30-1/40发酵液的EDTA和1/10-1/15发酵液体积的蔗糖溶液于30-60min冰浴，再离心沉淀中加入1/30-1/40发酵液体积的冰水再在30-60min冰浴，再次离心沉淀加入硫酸铵至饱和度为100%，待盐析过夜；离心，沉淀即为有机磷降解酶制剂。5.按权利要求4所述的有机磷降解酶制剂的制备方法，其特征在于所述有机磷降解酶制剂冷冻干燥，粉碎并加水混合均匀，在造粒机中于15-35t:，制作成20-40目的颗粒。6.按权利要求4所述的有机磷降解酶制剂的制备方法，其特征在于所述有机磷降解酶制剂还包括N-油酰基多縮氨基酸钠、碳酸氢钠和羧甲基纤维素钠，按重量份数计为按重量份数计为5-20份有机磷降解酶制剂、2-8份N-油酰基多縮氨基酸钠、18-50份碳酸氢钠和0.5-1份羧甲基纤维素钠，按上述混匀后在压片机中压片，压成厚度1.0-1.5cm，直径1.0-1.5cm，重量2.0-4.Og的片剂，得到有机磷类农药降解剂泡腾片。7.按权利要求4所述的有机磷降解酶制剂的制备方法，其特征在于所述离心均在4t:下，以6000-8000r/min，离心30-40min。8.按权利要求4所述的有机磷降解酶制剂的制备方法，其特征在于所述种子罐培养时罐压0.02-0.05MPa、通气量1:1.0-1.5v/v/min、搅拌速度300转/分钟。全文摘要本发明涉及微生物技术，具体地说是一种用于降解蔬菜水果上残留的有机磷降解酶制剂及其制备方法。具体为甲基杆菌经发酵后即得有机磷降解酶制剂。制备过程为接入菌种发酵后，离心收集菌体，破碎菌体，即为所得。本发明的有机磷类农药降解酶制剂可以降解蔬菜、水果上残留的有机磷类农药。文档编号A62D3/02GK101732819SQ200810228798公开日2010年6月16日申请日期2008年11月14日优先权日2008年11月14日发明者张惠文,李旭,苏振成,蔡颖慧申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所