巨大芽孢杆菌及其应用、微生物降解剂及其制备方法和应用的制作方法
巨大芽孢杆菌及其应用、微生物降解剂及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物领域，具体涉及巨大芽孢杆菌及其应用、微生物降解剂及其制备方法和应用，其中巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌TDB-2（ Bacillusmegaterium TDB-2），保藏编号为CCTCC NO：M 2012352，可应用于三唑磷的降解；微生物降解剂以巨大芽孢杆菌TDB-2为活性成分，其制备方法具体包括以下步骤：将巨大芽孢杆菌TDB-2按平板培养法培养至单菌落出现；取单菌落接入种子培养基中培养至对数生长期，得到菌液；将菌液按1～3%接种量接种到生产培养基中培养至对数生长期，分装制得微生物降解剂。本发明的巨大芽孢杆菌TDB-2可以高效降解三唑磷，具有高效、无毒、环保等优势。
CCTCC NO: M 2012352
2012.09.16
【专利说明】巨大芽孢杆菌及其应用、微生物降解剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物【技术领域】，尤其涉及一种巨大芽孢杆菌及其在降解三唑磷中的应用，还涉及以该巨大芽孢杆菌为活性成分的微生物降解剂及其制备方法和在降解三唑磷中的应用。
【背景技术】
[0002]三唑磷是一种广谱的中等毒性有机磷杀虫剂，在我国广泛的应用于粮食、油料和蔬菜的主要虫害的防控。长期大量的使用三唑磷，不但导致农产品中三唑磷残留，从而对人类健康造成潜在危险，而且施用的三唑磷农药，随雨水的冲刷等因素影响，流失到生态环境中，危害非靶标生物，进而影响整个生态环境。然而，基于我国农业生产实际，三唑磷的投入量会继续上升。因此，如何消除三唑磷在生态环境中的残留污染，成为一个非常重要的环境问题。
[0003]三唑磷残留的修复技术中，最具潜力的方法是生物修复，包括植物修复和微生物修复。植物修复技术具有花费较少、对环境安全等优点，但是，由于植物自身特点，需要合适生长条件、生长速率较低，因此，导致其修复效率较低。三唑磷微生物修复领域虽然具有较大的发展前景，但目前存在的技术难题是:降解菌资源筛选相对较少，且一些降解菌资源本身存在安全性问题，限制了三唑磷微生物修复技术的实际应用。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种生产成本低，降解效率高且生产工艺简洁、成本低、无二次污染的巨大芽孢杆菌菌株及其在降解三唑磷中的应用，另外提供以巨大芽孢杆菌为活性成分的微生物降解剂及其制备方法和在降解三唑磷方面的应用，具有降解效率高、无二次污染等优势。
[0005]为解决上述技术问题，本发明提供了一种巨大芽孢杆菌，前述巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌TDB-2 {Bacillus megaterium TDB-2)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2012352。保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月16日，该菌株被命名为巨大芽抱杆菌TDB-2 {BadIlus mega terium TDB-2)。
[0006]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种以前述巨大芽孢杆菌TDB-2为活性成分的微生物降解剂。
[0007]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种前述微生物降解剂的制备方法，包括以下步骤:
51、将巨大芽孢杆菌TDB-2按平板培养法培养至单菌落出现；
52、取前述单菌落接入种子培养基中经振荡培养至对数生长期，得到菌液；
53、将前述菌液按I?3%接种量接种到生产培养基中经振荡培养至对数生长期，分装制得微生物降解剂。
[0008]进一步的，前述微生物降解剂中巨大芽孢杆菌TDB-2的浓度为18?19 cfu/mL,优选为 19 cfu/mL。
[0009]进一步的，前述步骤SI中前述平板培养法采用MSY固体培养基，培养温度为30°C?35°C，振荡速度为100?150 rpm。
[0010]进一步的，前述步骤S2中前述种子培养基为MSY液体培养基，前述培养温度为30°C?35°C，振荡速度为100?150 rpm。
[0011]进一步的，前述步骤S3中前述生产培养基为MSY液体培养基，前述培养温度为30°C?35°C，振荡速度为100?150 rpm。
[0012]进一步的，前述MSY固体培养基包括0.2g/L的K2HPO4、0.8g/L的KH2PO4、0.2g/L的MgS04、0.lg/L 的 CaSO4.2Η20、0.0033g/L 的 NaMoO4.2Η20、1.5g/L 的酵母膏、3g/L 的 NaCl和15g/L的琼脂；前述MSY液体培养基包括0.2g/L的K2HP04、0.8 g/L的KH2P04、0.2g/L的MgS04、0.lg/L 的 CaSO4.2Η20、0.0033g/L 的 NaMoO4.2Η20、1.5g/L 的酵母膏和 3g/L 的 NaCl。
[0013]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种前述巨大芽孢杆菌在降解三唑磷中的应用。
[0014]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种前述微生物降解剂或前述制备方法制备得到的微生物降解剂在降解三唑磷中的应用。
[0015]上述制备方法的全流程时间一般为5?8天左右，培养结束后，菌体数量可达到2亿个/ml以上。
[0016]与现有技术相比，本发明的优点在于:
(I)本发明的巨大芽孢杆菌TDB-2，具有多种抑制病原物活性物质，是一种抑制多种作物病害、促进作物生长的益生菌，安全、无毒、环保，生产周期短、适用于工业化生产，生产成本低。
[0017](2)本发明的巨大芽孢杆菌TDB-2能够促进作物生长、具有抑制病害以及杀虫活性，可应用于高浓度三唑磷农药的降解，还可用于田间作物的生产，可部分的替代农用化学品投入，在农业生产中粮食、水果、蔬菜等生产中具有广泛的应用价值。
[0018](3)本发明的微生物降解剂，以巨大芽孢杆菌TDB-2为活性成分，可通过简洁快速的生产工艺制备得到，高效、无毒、环保，具有生产周期短、从菌种到制剂仅需要5?8天，使用简便，去除效果好等优点，能够有效用于工业废水和农业生产中三唑磷农药残留的微生物修复。
[0019](4)本发明的微生物降解剂，可以降解高浓度三唑磷农药，因此可应用于含三唑磷农药废水的处理，使用方便、节约劳动成本。
[0020]巨大芽孢杆菌TDB-2 {Bacillus megaterium TDB-2),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2012352。保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月16日，该菌株被命名为巨大芽孢杆菌TDB-2 {Bacillus megaterium TDB-2)。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0022]图1为本发明巨大芽孢杆菌TDB-2菌株的革兰氏染色图。
[0023]图2为实施例3中三唑磷标准样品的气象色谱图。
[0024]图3为实施例3中菌剂降解三唑磷效率及生物量图。
【具体实施方式】
[0025]以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
[0026]以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
[0027]实施例1
一种巨大芽孢杆菌TDB-2 {Bad Ilus mega teri um TDB-2)菌株,保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2012352，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月16日，该菌株被命名为巨大芽孢杆菌TDB-2 {Bacillusmegaterium TDB-2)。
[0028]前述巨大芽孢杆菌TDB-2，具有以下主要特征:
G+，个体形态为杆状，内生芽孢，不膨大，接触酶反应阳性，能液化明胶、水解淀粉，V-P反应阴性，吲哚反应和过氧化氢酶反应阴性，葡萄糖产酸不产气。最适生长温度为30?35°C，最适生长pH值为7?8，16S rDNA序列长度为1442 bp，在Genbank中的登录号为JX393073。
[0029]参见图1，从图1中可知巨大芽孢杆菌TDB-2的个体形态为杆状，内生芽孢，不膨大，被革兰氏染色液染成紫色，为革兰氏阳性菌。
[0030]实施例1的巨大芽孢杆菌是通过以下方法筛选得到:
(1)取采自湖南省的农田灌溉沟渠中底泥，放入MSY液体培养基(MSY液体培养基组分:0.2g/L K2HPO4,0.8g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033g/L NaMoO4.2Η20，0.005g/L，酵母膏和3g/L NaCl，pH 7.1)，在35±2°C，转速为120 rpm条件下振荡培养至菌液浑浊(培养时间一般为16?24 h，本实施例的培养时间为20 h)；
(2)取步骤(I)制备得到的菌液200μ L，然后涂布到MSY固体培养基中(MSY固体培养基成分:0.2g/L K2HPO4, 0.8g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033g/LNaMoO4.2H20,1.5g/L 酵母膏，3g/L NaCl，15g/L 琼脂，pH 值为 7.1)，在 35±2°C下倒置培养至菌落出现；
(3 )挑取菌落形态不同的菌，分别接种到含MSY液体培养基中，筛选得到巨大芽孢杆菌TDB-2。
[0031]实施例1中，MSY固体培养基的pH值在7.0?7.2之间均能达到相同或相似的技术效果。
[0032]实施例2
一种微生物降解剂，包括实施例1的巨大芽孢杆菌TDB-2和辅料。
[0033]微生物降解剂中巨大芽孢杆菌TDB-2的浓度一般为18?19 cfu/mL,本实施例中巨大芽孢杆菌TDB-2的浓度为19 cfu/mL,辅料为水或其他微生物降解剂中常用的辅料。
[0034]实施例2的微生物降解剂采用以下方法制备得到:
S1、将巨大芽孢杆菌TDB-2接种于MSY固体培养基(MSY固体培养基成分:0.2g/LK2HPO4,0.8g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033g/L NaMoO4.2H20,1.5g/L酵母膏，3g/L NaCl，15g/L琼脂，pH值为7.1)，按平板培养法在30°C?35°C培养至单菌落出现。
[0035]S2、取前述单菌落接入150 mL的MSY液体培养基(MSY液体培养基组分:0.2g/L K2HPO4,0.8 g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033 g/L NaMoO4.2H20,0.005g/L，酵母膏和3g/L NaCl，pH 7.1)中以30°C?35°C振荡培养至对数生长期，得到菌液；振荡速度为150 rpm。
[0036]S3、将前述菌液按I %接种量(接种量在I?3%范围内均能达到相同或相似的技术效果)接种到5 L的MSY液体培养基(MSY液体培养基组分:0.2g/L K2HPO4,0.8 g/LKH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033g/L NaMoO4.2Η20，0.005g/L,酵母膏和3g/L NaCl，pH 7.1)中以30°C?35°C振荡培养至对数生长期，振荡速度为150 rpm，分装制得微生物降解剂。
[0037]上述制备方法的全流程时间一般为5?8天左右，培养结束后，菌体数量可达到2亿个/ml以上。
[0038]实施例2仅为本发明的优选实施方式，在本发明中，振荡速度在100?150 rpm均可实施，MSY固体培养基的pH值在7.0?7.2之间，MSY液体培养基的pH值在7.0?7.2之间，均能达到相同或相似的技术效果。
[0039]实施例3:巨大芽孢杆菌TDB-2在降解三唑磷中的应用。
[0040](I)将巨大芽孢杆菌TDB-2在MSY液体培养基中培养成菌液，菌液中巨大芽孢杆菌TDB-2 的浓度为 19 cfu/mL ；
(2)将含有三唑磷的废水添加到MSY液体培养基中混匀得到混合溶液，其中三唑磷的浓度为50 mg/L。将步骤(I)中制备得到的菌液按1% (v/v)接种到混合溶液中，以30°C?35°C进行振荡培养(振荡速度为150 rpm，在实际应用过程中，振荡速度为100?150 rpm均可实施)9小时，每隔I小时取样，用气象色谱法(Agilent 6890N)测定三唑磷含量。
[0041]测定前用已知浓度的三唑磷标准样品定性定量，以不加巨大芽孢杆菌TDB-2的实验培养基为对照(相当于三唑磷未处理，浓度不变)。所有处理重复三次。
[0042]参见图2，其中三唑磷在色相色谱峰图中的特异保留时间为21.01 min，峰面积为对应标准样品的浓度对应的峰面积；根据样品的色相色谱峰图中出峰的保留时间定性三唑磷，峰面积与标准样品峰面积的比值，乘以标准样品的浓度，即可换算得到的样品中的三唑磷的浓度。
[0043]参见图3，按照气相色谱法检测出混合液中三唑磷的含量，降解效率随降解时间逐渐升高，当降解时间达到9 h，巨大芽孢杆菌TDB-2对50 mg/L的三唑磷降解效率为69.71%。
[0044]实施例4:微生物降解剂在降解三唑磷中的应用。
[0045]采用实施例2的微生物降解剂对含三唑磷的废水进行处理:
将含有三唑磷的废水添加到MSY液体培养基中混匀得到混合溶液，其中三唑磷的浓度为50 mg/L。将微生物降解剂按1% (v/v)接种到混合溶液中，以30°C?35°C进行振荡培养(振荡速度为150 rpm，在实际的应用过程中，振荡速度为100?150 rpm均能实施)9小时，用气象色谱法(Agilent 6890N)测定三唑磷含量。
[0046]测定前用已知浓度的三唑磷标准样品定性定量，以不加巨大芽孢杆菌TDB-2的实验培养基为对照(相当于三唑磷未处理，浓度不变)。所有处理重复三次。
[0047]微生物降解剂对三唑磷的降解效率为55.62%。
[0048]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
【权利要求】
1.一种巨大芽孢杆菌，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌TDB-2(.Bacillus megaterium TDB-2)，保藏编号为 CCTCC NO:M 2012352。
2.一种以权利要求1所述巨大芽孢杆菌TDB-2为活性成分的微生物降解剂。
3.—种权利要求2所述微生物降解剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 51、将巨大芽孢杆菌TDB-2按平板培养法培养至单菌落出现； 52、取所述单菌落接入种子培养基中振荡培养至对数生长期，得到菌液； 53、将所述菌液按1?3%接种量接种到生产培养基中振荡培养至对数生长期，分装制得微生物降解剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中所述平板培养法采用MSY固体培养基，所述培养温度为30°C?35°C，所述MSY固体培养基包括0.2g/L的Κ2ΗΡ04、0.8g/L 的 ΚΗ2Ρ04、0.2g/L 的 MgS04、0.lg/L 的 CaS04.2Η20、0.0033g/L 的 NaMo04.2Η20、1.5g/L的酵母膏、3g/L的NaCl和15g/L的琼脂。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中所述种子培养基为MSY液体培养基，所述培养温度为30°C?35°C，振荡速度为100?150 rpm。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中所述生产培养基为MSY液体培养基，所述培养温度为30°C?35°C，振荡速度为100?150 rpm。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述MSY液体培养基包括0.2g/L 的 Κ2ΗΡ04、0.8 g/L 的 ΚΗ2Ρ04、0.2g/L 的 MgS04、0.lg/L 的 CaS04.2Η20、0.0033g/L 的NaMo04.Η20、1.5g/L 的酵母膏和 3g/L 的 NaCl。
8.根据权利要求3至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述微生物降解剂中巨大芽孢杆菌TDB-2的浓度为108?109 cfu/mL。
9.一种权利要求1所述巨大芽孢杆菌在降解三唑磷中的应用。
10.一种权利要求2所述的微生物降解剂或权利要求3至8中任一项所述制备方法制备得到的微生物降解剂在降解三唑磷中的应用。
【文档编号】A62D101/28GK104293708SQ201410506986
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】张松柏, 刘勇, 张德咏, 罗香文, 谭新球, 彭静, 成飞雪, 程菊娥 申请人:湖南省植物保护研究所
【专利摘要】本发明涉及微生物领域，具体涉及巨大芽孢杆菌及其应用、微生物降解剂及其制备方法和应用，其中巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌TDB-2（ Bacillusmegaterium TDB-2），保藏编号为CCTCC NO：M 2012352，可应用于三唑磷的降解；微生物降解剂以巨大芽孢杆菌TDB-2为活性成分，其制备方法具体包括以下步骤：将巨大芽孢杆菌TDB-2按平板培养法培养至单菌落出现；取单菌落接入种子培养基中培养至对数生长期，得到菌液；将菌液按1～3%接种量接种到生产培养基中培养至对数生长期，分装制得微生物降解剂。本发明的巨大芽孢杆菌TDB-2可以高效降解三唑磷，具有高效、无毒、环保等优势。
CCTCC NO: M 2012352
2012.09.16
【专利说明】巨大芽孢杆菌及其应用、微生物降解剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物【技术领域】，尤其涉及一种巨大芽孢杆菌及其在降解三唑磷中的应用，还涉及以该巨大芽孢杆菌为活性成分的微生物降解剂及其制备方法和在降解三唑磷中的应用。
【背景技术】
[0002]三唑磷是一种广谱的中等毒性有机磷杀虫剂，在我国广泛的应用于粮食、油料和蔬菜的主要虫害的防控。长期大量的使用三唑磷，不但导致农产品中三唑磷残留，从而对人类健康造成潜在危险，而且施用的三唑磷农药，随雨水的冲刷等因素影响，流失到生态环境中，危害非靶标生物，进而影响整个生态环境。然而，基于我国农业生产实际，三唑磷的投入量会继续上升。因此，如何消除三唑磷在生态环境中的残留污染，成为一个非常重要的环境问题。
[0003]三唑磷残留的修复技术中，最具潜力的方法是生物修复，包括植物修复和微生物修复。植物修复技术具有花费较少、对环境安全等优点，但是，由于植物自身特点，需要合适生长条件、生长速率较低，因此，导致其修复效率较低。三唑磷微生物修复领域虽然具有较大的发展前景，但目前存在的技术难题是:降解菌资源筛选相对较少，且一些降解菌资源本身存在安全性问题，限制了三唑磷微生物修复技术的实际应用。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种生产成本低，降解效率高且生产工艺简洁、成本低、无二次污染的巨大芽孢杆菌菌株及其在降解三唑磷中的应用，另外提供以巨大芽孢杆菌为活性成分的微生物降解剂及其制备方法和在降解三唑磷方面的应用，具有降解效率高、无二次污染等优势。
[0005]为解决上述技术问题，本发明提供了一种巨大芽孢杆菌，前述巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌TDB-2 {Bacillus megaterium TDB-2)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2012352。保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月16日，该菌株被命名为巨大芽抱杆菌TDB-2 {BadIlus mega terium TDB-2)。
[0006]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种以前述巨大芽孢杆菌TDB-2为活性成分的微生物降解剂。
[0007]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种前述微生物降解剂的制备方法，包括以下步骤:
51、将巨大芽孢杆菌TDB-2按平板培养法培养至单菌落出现；
52、取前述单菌落接入种子培养基中经振荡培养至对数生长期，得到菌液；
53、将前述菌液按I?3%接种量接种到生产培养基中经振荡培养至对数生长期，分装制得微生物降解剂。
[0008]进一步的，前述微生物降解剂中巨大芽孢杆菌TDB-2的浓度为18?19 cfu/mL,优选为 19 cfu/mL。
[0009]进一步的，前述步骤SI中前述平板培养法采用MSY固体培养基，培养温度为30°C?35°C，振荡速度为100?150 rpm。
[0010]进一步的，前述步骤S2中前述种子培养基为MSY液体培养基，前述培养温度为30°C?35°C，振荡速度为100?150 rpm。
[0011]进一步的，前述步骤S3中前述生产培养基为MSY液体培养基，前述培养温度为30°C?35°C，振荡速度为100?150 rpm。
[0012]进一步的，前述MSY固体培养基包括0.2g/L的K2HPO4、0.8g/L的KH2PO4、0.2g/L的MgS04、0.lg/L 的 CaSO4.2Η20、0.0033g/L 的 NaMoO4.2Η20、1.5g/L 的酵母膏、3g/L 的 NaCl和15g/L的琼脂；前述MSY液体培养基包括0.2g/L的K2HP04、0.8 g/L的KH2P04、0.2g/L的MgS04、0.lg/L 的 CaSO4.2Η20、0.0033g/L 的 NaMoO4.2Η20、1.5g/L 的酵母膏和 3g/L 的 NaCl。
[0013]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种前述巨大芽孢杆菌在降解三唑磷中的应用。
[0014]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种前述微生物降解剂或前述制备方法制备得到的微生物降解剂在降解三唑磷中的应用。
[0015]上述制备方法的全流程时间一般为5?8天左右，培养结束后，菌体数量可达到2亿个/ml以上。
[0016]与现有技术相比，本发明的优点在于:
(I)本发明的巨大芽孢杆菌TDB-2，具有多种抑制病原物活性物质，是一种抑制多种作物病害、促进作物生长的益生菌，安全、无毒、环保，生产周期短、适用于工业化生产，生产成本低。
[0017](2)本发明的巨大芽孢杆菌TDB-2能够促进作物生长、具有抑制病害以及杀虫活性，可应用于高浓度三唑磷农药的降解，还可用于田间作物的生产，可部分的替代农用化学品投入，在农业生产中粮食、水果、蔬菜等生产中具有广泛的应用价值。
[0018](3)本发明的微生物降解剂，以巨大芽孢杆菌TDB-2为活性成分，可通过简洁快速的生产工艺制备得到，高效、无毒、环保，具有生产周期短、从菌种到制剂仅需要5?8天，使用简便，去除效果好等优点，能够有效用于工业废水和农业生产中三唑磷农药残留的微生物修复。
[0019](4)本发明的微生物降解剂，可以降解高浓度三唑磷农药，因此可应用于含三唑磷农药废水的处理，使用方便、节约劳动成本。
[0020]巨大芽孢杆菌TDB-2 {Bacillus megaterium TDB-2),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2012352。保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月16日，该菌株被命名为巨大芽孢杆菌TDB-2 {Bacillus megaterium TDB-2)。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0022]图1为本发明巨大芽孢杆菌TDB-2菌株的革兰氏染色图。
[0023]图2为实施例3中三唑磷标准样品的气象色谱图。
[0024]图3为实施例3中菌剂降解三唑磷效率及生物量图。
【具体实施方式】
[0025]以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
[0026]以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
[0027]实施例1
一种巨大芽孢杆菌TDB-2 {Bad Ilus mega teri um TDB-2)菌株,保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2012352，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月16日，该菌株被命名为巨大芽孢杆菌TDB-2 {Bacillusmegaterium TDB-2)。
[0028]前述巨大芽孢杆菌TDB-2，具有以下主要特征:
G+，个体形态为杆状，内生芽孢，不膨大，接触酶反应阳性，能液化明胶、水解淀粉，V-P反应阴性，吲哚反应和过氧化氢酶反应阴性，葡萄糖产酸不产气。最适生长温度为30?35°C，最适生长pH值为7?8，16S rDNA序列长度为1442 bp，在Genbank中的登录号为JX393073。
[0029]参见图1，从图1中可知巨大芽孢杆菌TDB-2的个体形态为杆状，内生芽孢，不膨大，被革兰氏染色液染成紫色，为革兰氏阳性菌。
[0030]实施例1的巨大芽孢杆菌是通过以下方法筛选得到:
(1)取采自湖南省的农田灌溉沟渠中底泥，放入MSY液体培养基(MSY液体培养基组分:0.2g/L K2HPO4,0.8g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033g/L NaMoO4.2Η20，0.005g/L，酵母膏和3g/L NaCl，pH 7.1)，在35±2°C，转速为120 rpm条件下振荡培养至菌液浑浊(培养时间一般为16?24 h，本实施例的培养时间为20 h)；
(2)取步骤(I)制备得到的菌液200μ L，然后涂布到MSY固体培养基中(MSY固体培养基成分:0.2g/L K2HPO4, 0.8g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033g/LNaMoO4.2H20,1.5g/L 酵母膏，3g/L NaCl，15g/L 琼脂，pH 值为 7.1)，在 35±2°C下倒置培养至菌落出现；
(3 )挑取菌落形态不同的菌，分别接种到含MSY液体培养基中，筛选得到巨大芽孢杆菌TDB-2。
[0031]实施例1中，MSY固体培养基的pH值在7.0?7.2之间均能达到相同或相似的技术效果。
[0032]实施例2
一种微生物降解剂，包括实施例1的巨大芽孢杆菌TDB-2和辅料。
[0033]微生物降解剂中巨大芽孢杆菌TDB-2的浓度一般为18?19 cfu/mL,本实施例中巨大芽孢杆菌TDB-2的浓度为19 cfu/mL,辅料为水或其他微生物降解剂中常用的辅料。
[0034]实施例2的微生物降解剂采用以下方法制备得到:
S1、将巨大芽孢杆菌TDB-2接种于MSY固体培养基(MSY固体培养基成分:0.2g/LK2HPO4,0.8g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033g/L NaMoO4.2H20,1.5g/L酵母膏，3g/L NaCl，15g/L琼脂，pH值为7.1)，按平板培养法在30°C?35°C培养至单菌落出现。
[0035]S2、取前述单菌落接入150 mL的MSY液体培养基(MSY液体培养基组分:0.2g/L K2HPO4,0.8 g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033 g/L NaMoO4.2H20,0.005g/L，酵母膏和3g/L NaCl，pH 7.1)中以30°C?35°C振荡培养至对数生长期，得到菌液；振荡速度为150 rpm。
[0036]S3、将前述菌液按I %接种量(接种量在I?3%范围内均能达到相同或相似的技术效果)接种到5 L的MSY液体培养基(MSY液体培养基组分:0.2g/L K2HPO4,0.8 g/LKH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033g/L NaMoO4.2Η20，0.005g/L,酵母膏和3g/L NaCl，pH 7.1)中以30°C?35°C振荡培养至对数生长期，振荡速度为150 rpm，分装制得微生物降解剂。
[0037]上述制备方法的全流程时间一般为5?8天左右，培养结束后，菌体数量可达到2亿个/ml以上。
[0038]实施例2仅为本发明的优选实施方式，在本发明中，振荡速度在100?150 rpm均可实施，MSY固体培养基的pH值在7.0?7.2之间，MSY液体培养基的pH值在7.0?7.2之间，均能达到相同或相似的技术效果。
[0039]实施例3:巨大芽孢杆菌TDB-2在降解三唑磷中的应用。
[0040](I)将巨大芽孢杆菌TDB-2在MSY液体培养基中培养成菌液，菌液中巨大芽孢杆菌TDB-2 的浓度为 19 cfu/mL ；
(2)将含有三唑磷的废水添加到MSY液体培养基中混匀得到混合溶液，其中三唑磷的浓度为50 mg/L。将步骤(I)中制备得到的菌液按1% (v/v)接种到混合溶液中，以30°C?35°C进行振荡培养(振荡速度为150 rpm，在实际应用过程中，振荡速度为100?150 rpm均可实施)9小时，每隔I小时取样，用气象色谱法(Agilent 6890N)测定三唑磷含量。
[0041]测定前用已知浓度的三唑磷标准样品定性定量，以不加巨大芽孢杆菌TDB-2的实验培养基为对照(相当于三唑磷未处理，浓度不变)。所有处理重复三次。
[0042]参见图2，其中三唑磷在色相色谱峰图中的特异保留时间为21.01 min，峰面积为对应标准样品的浓度对应的峰面积；根据样品的色相色谱峰图中出峰的保留时间定性三唑磷，峰面积与标准样品峰面积的比值，乘以标准样品的浓度，即可换算得到的样品中的三唑磷的浓度。
[0043]参见图3，按照气相色谱法检测出混合液中三唑磷的含量，降解效率随降解时间逐渐升高，当降解时间达到9 h，巨大芽孢杆菌TDB-2对50 mg/L的三唑磷降解效率为69.71%。
[0044]实施例4:微生物降解剂在降解三唑磷中的应用。
[0045]采用实施例2的微生物降解剂对含三唑磷的废水进行处理:
将含有三唑磷的废水添加到MSY液体培养基中混匀得到混合溶液，其中三唑磷的浓度为50 mg/L。将微生物降解剂按1% (v/v)接种到混合溶液中，以30°C?35°C进行振荡培养(振荡速度为150 rpm，在实际的应用过程中，振荡速度为100?150 rpm均能实施)9小时，用气象色谱法(Agilent 6890N)测定三唑磷含量。
[0046]测定前用已知浓度的三唑磷标准样品定性定量，以不加巨大芽孢杆菌TDB-2的实验培养基为对照(相当于三唑磷未处理，浓度不变)。所有处理重复三次。
[0047]微生物降解剂对三唑磷的降解效率为55.62%。
[0048]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
【权利要求】
1.一种巨大芽孢杆菌，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌TDB-2(.Bacillus megaterium TDB-2)，保藏编号为 CCTCC NO:M 2012352。
2.一种以权利要求1所述巨大芽孢杆菌TDB-2为活性成分的微生物降解剂。
3.—种权利要求2所述微生物降解剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 51、将巨大芽孢杆菌TDB-2按平板培养法培养至单菌落出现； 52、取所述单菌落接入种子培养基中振荡培养至对数生长期，得到菌液； 53、将所述菌液按1?3%接种量接种到生产培养基中振荡培养至对数生长期，分装制得微生物降解剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中所述平板培养法采用MSY固体培养基，所述培养温度为30°C?35°C，所述MSY固体培养基包括0.2g/L的Κ2ΗΡ04、0.8g/L 的 ΚΗ2Ρ04、0.2g/L 的 MgS04、0.lg/L 的 CaS04.2Η20、0.0033g/L 的 NaMo04.2Η20、1.5g/L的酵母膏、3g/L的NaCl和15g/L的琼脂。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中所述种子培养基为MSY液体培养基，所述培养温度为30°C?35°C，振荡速度为100?150 rpm。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中所述生产培养基为MSY液体培养基，所述培养温度为30°C?35°C，振荡速度为100?150 rpm。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述MSY液体培养基包括0.2g/L 的 Κ2ΗΡ04、0.8 g/L 的 ΚΗ2Ρ04、0.2g/L 的 MgS04、0.lg/L 的 CaS04.2Η20、0.0033g/L 的NaMo04.Η20、1.5g/L 的酵母膏和 3g/L 的 NaCl。
8.根据权利要求3至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述微生物降解剂中巨大芽孢杆菌TDB-2的浓度为108?109 cfu/mL。
9.一种权利要求1所述巨大芽孢杆菌在降解三唑磷中的应用。
10.一种权利要求2所述的微生物降解剂或权利要求3至8中任一项所述制备方法制备得到的微生物降解剂在降解三唑磷中的应用。
【文档编号】A62D101/28GK104293708SQ201410506986
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】张松柏, 刘勇, 张德咏, 罗香文, 谭新球, 彭静, 成飞雪, 程菊娥 申请人:湖南省植物保护研究所
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