抗体抗龋制剂的制作方法
专利名称：抗体抗龋制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种牙科用的制品，具体涉及口腔抗龋的生物制品。
背景技术：
长期以来，国内外以氟化物作为主要的防龋剂，但随着广泛的应用，也暴露出氟化物的一些问题。据有关部门调查表明氟化物在水中即使微量也可能与有机物结合形成三卤甲烷。三卤甲烷是一种具有基因毒性的致癌物；氟化物的长期应用，会产生耐氟菌株，该菌株不仅抗氟，且仍然可以致龋，尤其当它存在于混合菌斑时，致龋能力更强。
鉴于以上存在的问题，各国学者们都致力于寻找新的、更好的，从根本上消除致龋病原体的防龋制剂的研究。国外一些科学家先后发现和证实了变形链球菌是主要的致龋病原体。由此，不少学者从免疫学的角度，针对如何从根本上防龋做了大量的研究，并取得了重大的成果。研究表明，主动免疫和被动免疫防龋均是有效技术。但由于主动免疫疫苗在人体组织内可能产生其它不利于人体的反应，故主动免疫尚未在人类中开展应用。而被动免疫是口腔内直接输入抗变链球菌抗体(免疫球蛋白)，从而达到防龋的目的，避免了主动免疫所存在的问题，因此，成为当今防龋研究的热点。目前，应用于实践中的主要是抗龋牙鸡蛋黄抗体(anti-DC IgY)。抗龋牙IgY可明显地抑制变链菌菌体酶的活性，制备出的抗龋牙IgY效价可达320，且被证明安全无毒；还由于抗龋牙IgY接触致龋菌后便与菌体结合而使致龋菌失活，从而可以达到标本兼治的目的。
然而，尽管抗龋牙IgY可明显地抑制变链菌菌体酶的活性，但仍难达到现在广泛使用的氟化物等化学防龋制剂的直接效果。因此，如何增强应用抗体抑制致龋菌的效果，则是重要的需要研究解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷，提供一种具有非常明显的抑制牙菌斑中的变链菌的生长，还能明显抑制一些重要牙周病原菌的活性，不仅具有很好的防龋作用，而且可以防止其它口腔疾病的抗体抗龋制剂。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为抗体抗龋制剂由用口腔致龋的几种变形链球菌菌株混合培养后经家兔免疫制备的抗血清与水杨酸、薄荷醇、没食子酸中的一种或一种以上的增效剂组成；四种组分组合时以抗体效价640、水杨酸0.138g/ml、薄荷醇0.01g/ml、没食子酸0.047g/ml浓度的溶液为母液，经稀释X倍后混合，各组分的浓度稀释范围为抗血清20～80X；水杨酸10～80X；薄荷醇4～40X；没食子酸1～8X；抗龋制剂的四种组分组合时，抗体效价提高，抗血清的稀释倍数增加，组分的浓度范围扩大。
下面进一步详述本发明通过培养指示菌，观察指示菌菌落状态和生长变化，制备指示菌抗血清，测定指示菌抗血清、水杨酸、薄荷醇和没食子酸对指示菌生长的抑制作用，测定抑菌圈大小和最低抑菌浓度。通过正交试验设计，将指示菌抗血清、水杨酸、薄荷醇及没食子酸按一定浓度一定比例分别进行组合后发现对抑制指示菌生长具有明显的增效作用。
一、抗血清(抗体)的制备1、制备材料1.1、菌种菌种来源从四川大学华西口腔医学院口腔生物医学工程教育部重点实验室购得。
菌种名称及编号变形链球菌(Streptococcus Porteus)S.mulans AHT，S.mulansBHT，S.mulans MT8148。菌种由试验室冻干保存。(以下简称指示菌)。
1.2、培养基固体培养基葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨1％，琼脂1.6％，pH 7.0，121℃灭菌20min。
液体培养基葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨1％，pH 7.0，121℃灭菌20min。
性能测定培养基葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨1％，pH 7.0。在培养液中加入数滴1.6％溴甲酚紫水溶液呈紫色。分装试管约10ml，并将杜氏发酵管倒置于培养液中，121℃灭菌20min。
2、菌种的增殖培养和活性测定2.1、指示菌的培养2.1.1、增殖培养挑取少量冻干的混合指示菌接入液体培养基中，37℃静置培养72小时。当培养液混浊，液面无膜，而振动后有绢丝样的波动物时，接入另一新鲜液体培养基中，接种量20％-30％，继续培养72h。
2.1.2、稀释培养吸取增殖液1ml加入9ml无菌水中，依次稀释至10-6，分别取不同稀释度菌液1ml于培养皿中，然后加入融化并冷却至45℃左右的固体培养基10-15ml，摇匀，待凝固后再加入10ml培养基，摇匀，制成含菌的双层平板，于37℃培养2-5天。
2.1.3、活性测定选择具有透明圈的白色小型菌落，接入性能测定培养基内，然后补充培养基距管口2cm处，密封管口，37℃培养2-3天，观察培养液颜色的变化。当所挑指示菌与同型乳酸发酵时，由于产生乳酸，培养基颜色由紫色变为黄色；若所挑菌株与异型发酵时，不仅培养基颜色发生变化，而且由于产气，在杜氏管内充满气体。
2.1.4、菌体的保存将增殖培养后的菌液经12000r/min离心4min，去上清液，0.9％生理盐水冲洗，菌体放入4℃冰箱保存。
3、制备抗血清3.1、抗原的制备挑取培养好的指示菌与PBS磷酸缓冲液混匀，配制成浓度为1mg/ml的菌悬液，取菌悬液2ml与完全弗氏佐剂混合乳化(菌悬液∶完全弗氏佐剂＝1∶1)，充分混合后备用。
3.2、菌体免疫免疫前从家兔耳静脉采集约3ul血液，作为对照血清。
用指示菌抗原做家兔免疫的注射程序如下表1
3.3、采血注射最后一次后采试血约3ml，当试血效价达到1∶500以上，则可心脏采全血，否则要加强注射1-2次。
3.4、抗血清的分离保存从免疫家兔心脏采集的血液经室温或37℃静置后置于冰箱中过夜，让血清充分析出，必要时经3000r/min离心10min，PBS洗涤2次，按1∶100的比例加入1％的硫柳汞，分装入青霉素瓶，置-20℃保存备用。
3.5、抗血清的效价测定3.5.1、抗血清稀释按表2两倍稀释法稀释抗血清表2稀释方法
3.5.2、抗原稀释将保存的指示菌抗原用生理盐水稀释，使其相当于麦氏比浊管第7管的浓度。
3.5.3、效价测定分别在11支血清管中加入0.5ml指示菌抗原稀释液，抗原与等量的抗血清均匀混合，置37℃水浴锅中孵育2～4小时，按下述判定标准测定效价++++100％凝集(完全凝集，上层变清)+++约75％凝集(绝大部分凝集，上层略浑)++约50％凝集(部分凝集，上层较浑)+约25％凝集(很少部分凝集，上层浑浊)-无凝集(液体浑浊)以出现“++”反应的最大稀释倍数为抗血清的效价。经测定，指示菌抗血清的效价为640。
3.6、抗血清抑制指示菌生长测定3.6.1、最佳菌浓度的筛选挑取指示菌菌体0.5000g，稀释至5ml生理盐水中，浓度为0.1g/ml，备用。取10支干净已灭菌的试管，依次稀释成10、20、40、80、160、320、640、1280、2560、5120倍共11个浓度梯度。培养基灭菌，倒平板，冷却，每皿分别接种不同浓度的指示菌稀释液50ul，各3个重复，37℃温箱培养18h，观察实验结果。
通过比较，以第10管浓度菌液的指示菌菌落分布均匀，密度一致，生长状况良好，最适合做抑菌实验。因此，以该浓度作为抑菌实验浓度，备用。菌浊度测定，配制真菌混悬液，以生理盐水为空白对照，721型分光光度计测定菌浓度，波长530nm，测定第10管菌液吸光度，OD420值为0.33。
3.6.2、抑菌试验采用牛津杯法测定抑菌圈的大小。
将抗血清依次稀释成10、20、40、80、100、200、400、800、1000、1200倍共10个浓度梯度。培养基灭菌，倒平板，冷却，每皿涂布指示菌液50ul，4个重复，吸取200ul抗血清加入至涂布指示菌液的培养皿中，37℃温箱培养18h，结果见表4。
表4抗血清抑菌效果
效价为640的抗血清的20～80X稀释液对指示菌有抑制作用，其中以40X的生理盐水稀释液的抑菌效果最佳。
二、增效剂的配制与抑菌效果测定1、水杨酸水杨酸(salicylic acid)，即邻羟基苯甲酸，是植物的一种次生代谢产物，它广泛存在于植物界，在生物体内除以游离形式和葡萄糖苷形式存在外还可以以水杨酸甲酯的形式释放到空气中。水杨酸具有多种生理调节作用，最典型的生理作用是诱导生物产生系统获得性抗性，是生物产生系统获得性抗性的必需因子。许多实验证明SA是重要的系统获得性抗性(Systemic acquired resistance，SAR)的内源信号分子。
1.1、配制水杨酸，由北京华美生物工程公司购入。称取水杨酸(分析纯)6.9000g，充分研磨成细末，按百分比浓度溶入50％乙醇溶液中，定容至50ml，浓度为1M，作为母液备用。依次稀释10、20、40、80、100、200、400、600、800、1000、1200共11个浓度梯度。
1.2、抑菌效果测定培养基灭菌，倒平板，冷却，每皿涂布指示菌液50ul，4个重复，吸取200ul水杨酸到涂布指示菌液的培养皿中。以50％乙醇作空白对照，4个重复，37℃温箱培养18小时。测定结果见表5。
表5抑菌效果
50％乙醇空白对照，4个重复，均不产生抑菌圈，说明50％乙醇不抑制指示菌的生长，没有抑菌作用，不干扰测定水杨酸对指示菌的作用效果；从表5中可以看出水杨酸在10～80X的50％乙醇稀释度范围有抑菌效果，以10X的抑菌效果最佳。
2、薄荷醇薄荷醇也是植物的一种次生代谢产物，人工为龙脑香科常绿乔木龙脑香(Dryobalanops Arornatica Gaertnerf)树脂的加工品，或菊科植物(Blumea Balsamifera)的提取物，或以樟脑、松节油为原料经化学合成的加工制成品。薄荷醇属挥发性药物，在有机化学中称为莰醇，难溶于水，可溶于含水乙醇中，由两个异戊二烯单位的化合物组成，属于多烯族化合物。薄荷醇是从含挥发油类植物中提取，亦属于醇类。
牟氏的体外抗菌试验表明薄荷醇可抑制或杀灭金黄色葡萄球菌、乙型溶菌性链球菌、绿色链球菌、大肠杆菌等5种常见细菌，其最低抑菌浓度(MIC)为1.0％-2.0％，最低杀菌浓度(MFC)为1.5％-2.0％，为接触抑菌。其主要成分龙脑与异龙脑的抗菌效果一致，两组分间既无拮抗也无协同作用。研究发现其最低杀菌浓度(MFC)为10％。日前薄荷醇在临床上的应用极为广泛，特别是在心脑血管疾病中的应用尤引人关注。
2.1、配制薄荷醇，(龙脑59.9％，异龙脑37.5％)，由北京华美生物工程公司购入。称取薄荷醇(分析纯)1.0000g，充分研磨成细末，按百分比浓度溶入45％乙醇溶液中，定容至100ml，作为母液备用。用45％乙醇依次稀释成0、2、4、8、10、20、40、80、160、320、640共11个浓度梯度。
2.2、抑菌效果测定培养基灭菌，倒平板，冷却，每皿涂布指示菌液50ul，4个重复，移取200ul薄荷醇液入培养皿中。45％乙醇作空白对照，4个重复，37℃温箱培养18小时。测定结果见表6。
表6抑菌效果
45％乙醇空白对照，4个重复均不产生抑菌圈，说明45％乙醇不抑制指示菌的生长，没有抑菌作用，不干扰测定薄荷醇对指示菌的作用效果。表6的测定结果说明薄荷醇在4～40X的45％乙醇稀释度范围有抑菌效果，以8X的抑菌效果最佳。
3、没食子酸没食子酸(Gallic acid)可以从五倍子、刺云实豆荚等植物中提取而得。没食子酸对蛋白质有沉淀作用，与皮肤、粘膜的溃疡面接触后，其组织蛋白质即被凝固，造成一层被膜而呈收敛作用；腺细胞的蛋白质被凝固引起分泌，产生粘膜干燥，神经末梢蛋白质的沉淀，可呈微弱的局部麻醉现象。没食子酸可与若干金属、生物碱甙类形成不溶解化合物，因而用作解毒剂。没食子对小肠有收敛作用，可减轻肠道炎症，制止腹泻。此外，对金黄色葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、伤寒、副伤寒、痢疾、炭疽、白喉、绿脓杆菌均有抑制作用。
3.1、配制没食子酸，由北京华美生物工程公司购入。称取没食子酸4.7035g，按百分比浓度溶入蒸馏水中，定容至100ml，浓度为0.25M，作为母液备用。依次稀释0、2、4、8、10、20、40、60、80、100共10个浓度梯发。
3.2、抑菌效果测定培养基灭菌，倒平板，冷却，每皿涂布指示菌液50ul，3个重复，吸取200ul没食子酸液至涂布指示菌的培养皿中，37℃温箱培养18小时。测定结果见表7。
表7、抑菌效果
从表7的测定结果看出，母液及2～8X的稀释液均有抑菌效果。
三、抗血清与增效剂不同组合的增效测定1、正交试验考察的因素及水平为探讨抗血清与水杨酸、薄荷醇、没食子酸不同组合是否具有增效作用，以抑菌圈的大小为评价指标，进行正交试验。考察不同浓度的水杨酸、薄荷醇、没食子酸和抗血清4种主要因素对抑制指示菌生长的抑菌圈大小的影响，试验通过四因素、四水平组合正交实验选择抑制指示菌生长的浓度组合。
表8正交试验考察的因素及水平
以上母液的浓度为血清效价640，水扬酸0.138g/ml，薄荷醇0.01g/ml，没食子酸0.047g/ml。”X”为稀释倍数。
2、正交试验方法与结果以血清20-80X，薄荷醇4-40X，水扬酸10-80X，没食子酸1-8X，为区间，每个物质分别选用四个以上浓度进行组合进行正交实验。
按照上列的组合逐个依次配制，分别吸取每种物质1ml混合于大试管中，充分混匀，移取混合液1ml到eppendorf管中，以测定各组合、各浓度的抑菌效果。
培养基灭菌，倒平板，冷却，每皿涂乳布指示菌液50ul.依次从eppendorf管中吸取已配制好的混合液200ul放置到牛津杯中，每处理三个重复，37℃培养18h后，观察不同因素水平组合的抑菌效果(见表9)。
表9.1.一种增效剂与抗血清正交试验结果(三重复平均值)
表9.2.一种增效剂与抗血清正交试验结果(三重复平均值)
表9.3.一种增效剂与抗血清正交试验结果(三重复平均值)
表9.4.二种增效剂与抗血清交试验结果(三重复平均值)
表9.5.二种增效剂与抗血清正交试验结果(三重复平均值)
表9.6.二种增效剂与抗血清正交试验结果(三重复平均值)
表9.7.三种增效剂与抗血清正交试验结果(三重复平均值)
以上”X”为每种物质的母液稀释倍数。
3、增效结果分析从表9.1～9.7可看出3.1使用一种增效剂的抗血清其抑菌圈最高最低值的平均值分别比单一抗血清的最高值11.76高3.12和5.79[见表9.1、9.2、9.3，血清加入水扬酸(9.98+19.79)/2＝14.88；血清加入没食子酸(11.67+23.43)/2＝17.55]；总平均值(血清加入水扬酸12.98，血清加入没食子酸16.88，血清加入薄荷醇11.12)以及抗血清加入薄荷醇的最高最低平均值(9.95+12.51)/2＝11.23均高于抗血清的20X，40X，80X三种浓度的平均值9.74(见表6)；使用一种增效剂的抗血清的最低值9.95高于单独使用抗血清的最低值9.34。
3.2、使用二种增效剂的抗血清其抑菌圈最高最低值的平均值比单独使用抗血清的抑菌圈最大值11.76分别高2.30，3.24，3.51[见表9.4、9.5、9.6血清加入薄荷醇和水扬酸(8.11+20.01)/2＝14.06，血清加入没食子酸和薄荷醇(10.11+19.89)/2＝15.00，血清加入没食子酸和水扬酸(11.67+18.88)/2＝15.27]；总平均值比单独使用血清的最高值11.76分别高0.53，1.87，3.96(血清加入水扬酸和薄荷醇12.29，血清加入没食子酸和薄荷醇13.63，血清加入没食子酸和水扬酸15.72)。
3.3、使用三种增效剂的抗血清其抑菌圈最高最低值的平均值比单独使用血清的抑菌圈最大值11.76高5.40[见表9.7血清加水扬酸加没食子酸加薄荷醇(10.78+23.54)/2＝17.16]；总平均值比单独使用抗血清的最高值11.76高4.03(血清加水扬酸加没食子酸加薄荷醇15.79)；四种物质的最低值10.78高于单独使用抗血清的最低值9.34。
上述结果说明一种或一种以上的增效剂加入抗血清中的增效作用明显。当抗体效价提高，抗血清的稀释范围扩大。
四川大学华西口腔医学院口腔医学工程教育重点实验室对抗体抗龋制剂进行抗菌活性检测，检测采用NCCLs推荐的厌氧菌药物敏感试验肉湯稀释法，测定抗体抗龋制剂对口腔最常见和最主要的致龋菌变形链球菌和粘性放线菌，以及重要牙周病原菌牙龈卟啉单细胞菌的抗菌活性，结果显示检品对三种实验菌株均有明显的抗菌活性。
表10检品对三株实验菌的MIC和MBC(g/L)
以上结果表明，抗体抗龋制剂具有非常明显的抑制牙菌斑中的变链菌的生长，还能明显抑制一些重要牙周病原菌的活性，不仅具有很好的防龋作用，而且可以防止其它口腔疾病。
根据湖南省疾病控制中心对“抗体抗龋制剂”产品进行急毒性试验结果表明，对昆明种雌雄小鼠的急性经口LD50大于20000mg/Kg·bw，属实际无毒物；24小时、48小时、72小时对白色家兔的急性眼刺激性反应结果为角膜、红膜、结膜充血和结膜水肿积分均值均为0，属无刺激性。
因此抗体抗龋制剂可用于生产防治龋齿的口腔药物，儿童防龋的口腔疫苗，还可用于口腔保健产品以及添加至人们日常用品如牙膏、嗽口液、口香糖等中用于防龋及防口腔疾病。
具体实施例方式用4X没食子酸加入到80X血清中，用蒸馏水稀释600-800倍后加入牙膏中制成牙膏，或制成漱口液等可以有效地防止龋病及牙周炎。
用10X水扬酸及20X薄荷醇混合制成增效剂加入到80X血清中，用蒸馏水稀释500倍后可制成专用的抗龋喷剂保健用品，可专门用于儿童抗龋牙保健。
用2X没食子酸、10X水扬酸与8X薄荷醇混合制成增效剂加入到80X血清中，用蒸馏水稀释200倍可制成防龋口腔药品喷剂。制成的药品喷于口腔患处不仅能有效地防止龋病，而且还对牙周炎有较好的治疗作用。
权利要求
1.一种抗体抗龋制剂，其特征在于抗龋制剂由用口腔致龋的几种变形链球菌菌株混合培养后经家兔免疫制备的抗血清与水杨酸、薄荷醇、没食子酸中的一种或一种以上的增效剂组成。
2.按权利要求1所述的抗体抗龋制剂，其特征在于抗龋制剂的四种组分组合时以抗体效价640、水杨酸0.138g/ml、薄荷醇0.01g/ml、没食子酸0.047g/ml浓度的溶液为母液，经稀释X倍后混合，各组分的浓度稀释范围为抗血清20～80X水杨酸10～80X薄荷醇4～40X没食子酸 1～8X。
3.按权利要求2所述的抗体抗龋制剂，其特征在于抗龋制剂的四种组分组合时，抗体效价提高，抗血清的稀释倍数增加，组分的浓度范围扩大。
全文摘要
本发明涉及用于口腔抗龋的生物制品。本发明由用口腔致龋的几种变形链球菌菌株混合培养后经家兔免疫制备的抗血清与水杨酸、薄荷醇、没食子酸中的一种或一种以上增效剂组成，各组分的母液经稀释后组合的浓度稀释范围为抗血清20～80X、水杨酸10～80X、薄荷醇4～40X、没食子酸1～8X；本发明的各种组合的抑菌效果均高于单一抗血清；经检测，抗体抗龋制剂对口腔最常见和最主要的致龋菌均有明显的抗菌活性，而且无毒性，无刺激性，因而可用于生产防治龋齿的口腔药物，口腔疫苗以及添加到日常生活用品如牙膏、漱口液、口香糖中防龋及预防其他口腔疾病。
文档编号A61P1/00GK1660422SQ200410047128
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月31日 优先权日2004年12月31日
发明者邱德文, 沈建奇, 粟铸 申请人:长沙德文生物科技开发有限公司
技术领域：
本发明涉及一种牙科用的制品，具体涉及口腔抗龋的生物制品。
背景技术：
长期以来，国内外以氟化物作为主要的防龋剂，但随着广泛的应用，也暴露出氟化物的一些问题。据有关部门调查表明氟化物在水中即使微量也可能与有机物结合形成三卤甲烷。三卤甲烷是一种具有基因毒性的致癌物；氟化物的长期应用，会产生耐氟菌株，该菌株不仅抗氟，且仍然可以致龋，尤其当它存在于混合菌斑时，致龋能力更强。
鉴于以上存在的问题，各国学者们都致力于寻找新的、更好的，从根本上消除致龋病原体的防龋制剂的研究。国外一些科学家先后发现和证实了变形链球菌是主要的致龋病原体。由此，不少学者从免疫学的角度，针对如何从根本上防龋做了大量的研究，并取得了重大的成果。研究表明，主动免疫和被动免疫防龋均是有效技术。但由于主动免疫疫苗在人体组织内可能产生其它不利于人体的反应，故主动免疫尚未在人类中开展应用。而被动免疫是口腔内直接输入抗变链球菌抗体(免疫球蛋白)，从而达到防龋的目的，避免了主动免疫所存在的问题，因此，成为当今防龋研究的热点。目前，应用于实践中的主要是抗龋牙鸡蛋黄抗体(anti-DC IgY)。抗龋牙IgY可明显地抑制变链菌菌体酶的活性，制备出的抗龋牙IgY效价可达320，且被证明安全无毒；还由于抗龋牙IgY接触致龋菌后便与菌体结合而使致龋菌失活，从而可以达到标本兼治的目的。
然而，尽管抗龋牙IgY可明显地抑制变链菌菌体酶的活性，但仍难达到现在广泛使用的氟化物等化学防龋制剂的直接效果。因此，如何增强应用抗体抑制致龋菌的效果，则是重要的需要研究解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷，提供一种具有非常明显的抑制牙菌斑中的变链菌的生长，还能明显抑制一些重要牙周病原菌的活性，不仅具有很好的防龋作用，而且可以防止其它口腔疾病的抗体抗龋制剂。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为抗体抗龋制剂由用口腔致龋的几种变形链球菌菌株混合培养后经家兔免疫制备的抗血清与水杨酸、薄荷醇、没食子酸中的一种或一种以上的增效剂组成；四种组分组合时以抗体效价640、水杨酸0.138g/ml、薄荷醇0.01g/ml、没食子酸0.047g/ml浓度的溶液为母液，经稀释X倍后混合，各组分的浓度稀释范围为抗血清20～80X；水杨酸10～80X；薄荷醇4～40X；没食子酸1～8X；抗龋制剂的四种组分组合时，抗体效价提高，抗血清的稀释倍数增加，组分的浓度范围扩大。
下面进一步详述本发明通过培养指示菌，观察指示菌菌落状态和生长变化，制备指示菌抗血清，测定指示菌抗血清、水杨酸、薄荷醇和没食子酸对指示菌生长的抑制作用，测定抑菌圈大小和最低抑菌浓度。通过正交试验设计，将指示菌抗血清、水杨酸、薄荷醇及没食子酸按一定浓度一定比例分别进行组合后发现对抑制指示菌生长具有明显的增效作用。
一、抗血清(抗体)的制备1、制备材料1.1、菌种菌种来源从四川大学华西口腔医学院口腔生物医学工程教育部重点实验室购得。
菌种名称及编号变形链球菌(Streptococcus Porteus)S.mulans AHT，S.mulansBHT，S.mulans MT8148。菌种由试验室冻干保存。(以下简称指示菌)。
1.2、培养基固体培养基葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨1％，琼脂1.6％，pH 7.0，121℃灭菌20min。
液体培养基葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨1％，pH 7.0，121℃灭菌20min。
性能测定培养基葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨1％，pH 7.0。在培养液中加入数滴1.6％溴甲酚紫水溶液呈紫色。分装试管约10ml，并将杜氏发酵管倒置于培养液中，121℃灭菌20min。
2、菌种的增殖培养和活性测定2.1、指示菌的培养2.1.1、增殖培养挑取少量冻干的混合指示菌接入液体培养基中，37℃静置培养72小时。当培养液混浊，液面无膜，而振动后有绢丝样的波动物时，接入另一新鲜液体培养基中，接种量20％-30％，继续培养72h。
2.1.2、稀释培养吸取增殖液1ml加入9ml无菌水中，依次稀释至10-6，分别取不同稀释度菌液1ml于培养皿中，然后加入融化并冷却至45℃左右的固体培养基10-15ml，摇匀，待凝固后再加入10ml培养基，摇匀，制成含菌的双层平板，于37℃培养2-5天。
2.1.3、活性测定选择具有透明圈的白色小型菌落，接入性能测定培养基内，然后补充培养基距管口2cm处，密封管口，37℃培养2-3天，观察培养液颜色的变化。当所挑指示菌与同型乳酸发酵时，由于产生乳酸，培养基颜色由紫色变为黄色；若所挑菌株与异型发酵时，不仅培养基颜色发生变化，而且由于产气，在杜氏管内充满气体。
2.1.4、菌体的保存将增殖培养后的菌液经12000r/min离心4min，去上清液，0.9％生理盐水冲洗，菌体放入4℃冰箱保存。
3、制备抗血清3.1、抗原的制备挑取培养好的指示菌与PBS磷酸缓冲液混匀，配制成浓度为1mg/ml的菌悬液，取菌悬液2ml与完全弗氏佐剂混合乳化(菌悬液∶完全弗氏佐剂＝1∶1)，充分混合后备用。
3.2、菌体免疫免疫前从家兔耳静脉采集约3ul血液，作为对照血清。
用指示菌抗原做家兔免疫的注射程序如下表1
3.3、采血注射最后一次后采试血约3ml，当试血效价达到1∶500以上，则可心脏采全血，否则要加强注射1-2次。
3.4、抗血清的分离保存从免疫家兔心脏采集的血液经室温或37℃静置后置于冰箱中过夜，让血清充分析出，必要时经3000r/min离心10min，PBS洗涤2次，按1∶100的比例加入1％的硫柳汞，分装入青霉素瓶，置-20℃保存备用。
3.5、抗血清的效价测定3.5.1、抗血清稀释按表2两倍稀释法稀释抗血清表2稀释方法
3.5.2、抗原稀释将保存的指示菌抗原用生理盐水稀释，使其相当于麦氏比浊管第7管的浓度。
3.5.3、效价测定分别在11支血清管中加入0.5ml指示菌抗原稀释液，抗原与等量的抗血清均匀混合，置37℃水浴锅中孵育2～4小时，按下述判定标准测定效价++++100％凝集(完全凝集，上层变清)+++约75％凝集(绝大部分凝集，上层略浑)++约50％凝集(部分凝集，上层较浑)+约25％凝集(很少部分凝集，上层浑浊)-无凝集(液体浑浊)以出现“++”反应的最大稀释倍数为抗血清的效价。经测定，指示菌抗血清的效价为640。
3.6、抗血清抑制指示菌生长测定3.6.1、最佳菌浓度的筛选挑取指示菌菌体0.5000g，稀释至5ml生理盐水中，浓度为0.1g/ml，备用。取10支干净已灭菌的试管，依次稀释成10、20、40、80、160、320、640、1280、2560、5120倍共11个浓度梯度。培养基灭菌，倒平板，冷却，每皿分别接种不同浓度的指示菌稀释液50ul，各3个重复，37℃温箱培养18h，观察实验结果。
通过比较，以第10管浓度菌液的指示菌菌落分布均匀，密度一致，生长状况良好，最适合做抑菌实验。因此，以该浓度作为抑菌实验浓度，备用。菌浊度测定，配制真菌混悬液，以生理盐水为空白对照，721型分光光度计测定菌浓度，波长530nm，测定第10管菌液吸光度，OD420值为0.33。
3.6.2、抑菌试验采用牛津杯法测定抑菌圈的大小。
将抗血清依次稀释成10、20、40、80、100、200、400、800、1000、1200倍共10个浓度梯度。培养基灭菌，倒平板，冷却，每皿涂布指示菌液50ul，4个重复，吸取200ul抗血清加入至涂布指示菌液的培养皿中，37℃温箱培养18h，结果见表4。
表4抗血清抑菌效果
效价为640的抗血清的20～80X稀释液对指示菌有抑制作用，其中以40X的生理盐水稀释液的抑菌效果最佳。
二、增效剂的配制与抑菌效果测定1、水杨酸水杨酸(salicylic acid)，即邻羟基苯甲酸，是植物的一种次生代谢产物，它广泛存在于植物界，在生物体内除以游离形式和葡萄糖苷形式存在外还可以以水杨酸甲酯的形式释放到空气中。水杨酸具有多种生理调节作用，最典型的生理作用是诱导生物产生系统获得性抗性，是生物产生系统获得性抗性的必需因子。许多实验证明SA是重要的系统获得性抗性(Systemic acquired resistance，SAR)的内源信号分子。
1.1、配制水杨酸，由北京华美生物工程公司购入。称取水杨酸(分析纯)6.9000g，充分研磨成细末，按百分比浓度溶入50％乙醇溶液中，定容至50ml，浓度为1M，作为母液备用。依次稀释10、20、40、80、100、200、400、600、800、1000、1200共11个浓度梯度。
1.2、抑菌效果测定培养基灭菌，倒平板，冷却，每皿涂布指示菌液50ul，4个重复，吸取200ul水杨酸到涂布指示菌液的培养皿中。以50％乙醇作空白对照，4个重复，37℃温箱培养18小时。测定结果见表5。
表5抑菌效果
50％乙醇空白对照，4个重复，均不产生抑菌圈，说明50％乙醇不抑制指示菌的生长，没有抑菌作用，不干扰测定水杨酸对指示菌的作用效果；从表5中可以看出水杨酸在10～80X的50％乙醇稀释度范围有抑菌效果，以10X的抑菌效果最佳。
2、薄荷醇薄荷醇也是植物的一种次生代谢产物，人工为龙脑香科常绿乔木龙脑香(Dryobalanops Arornatica Gaertnerf)树脂的加工品，或菊科植物(Blumea Balsamifera)的提取物，或以樟脑、松节油为原料经化学合成的加工制成品。薄荷醇属挥发性药物，在有机化学中称为莰醇，难溶于水，可溶于含水乙醇中，由两个异戊二烯单位的化合物组成，属于多烯族化合物。薄荷醇是从含挥发油类植物中提取，亦属于醇类。
牟氏的体外抗菌试验表明薄荷醇可抑制或杀灭金黄色葡萄球菌、乙型溶菌性链球菌、绿色链球菌、大肠杆菌等5种常见细菌，其最低抑菌浓度(MIC)为1.0％-2.0％，最低杀菌浓度(MFC)为1.5％-2.0％，为接触抑菌。其主要成分龙脑与异龙脑的抗菌效果一致，两组分间既无拮抗也无协同作用。研究发现其最低杀菌浓度(MFC)为10％。日前薄荷醇在临床上的应用极为广泛，特别是在心脑血管疾病中的应用尤引人关注。
2.1、配制薄荷醇，(龙脑59.9％，异龙脑37.5％)，由北京华美生物工程公司购入。称取薄荷醇(分析纯)1.0000g，充分研磨成细末，按百分比浓度溶入45％乙醇溶液中，定容至100ml，作为母液备用。用45％乙醇依次稀释成0、2、4、8、10、20、40、80、160、320、640共11个浓度梯度。
2.2、抑菌效果测定培养基灭菌，倒平板，冷却，每皿涂布指示菌液50ul，4个重复，移取200ul薄荷醇液入培养皿中。45％乙醇作空白对照，4个重复，37℃温箱培养18小时。测定结果见表6。
表6抑菌效果
45％乙醇空白对照，4个重复均不产生抑菌圈，说明45％乙醇不抑制指示菌的生长，没有抑菌作用，不干扰测定薄荷醇对指示菌的作用效果。表6的测定结果说明薄荷醇在4～40X的45％乙醇稀释度范围有抑菌效果，以8X的抑菌效果最佳。
3、没食子酸没食子酸(Gallic acid)可以从五倍子、刺云实豆荚等植物中提取而得。没食子酸对蛋白质有沉淀作用，与皮肤、粘膜的溃疡面接触后，其组织蛋白质即被凝固，造成一层被膜而呈收敛作用；腺细胞的蛋白质被凝固引起分泌，产生粘膜干燥，神经末梢蛋白质的沉淀，可呈微弱的局部麻醉现象。没食子酸可与若干金属、生物碱甙类形成不溶解化合物，因而用作解毒剂。没食子对小肠有收敛作用，可减轻肠道炎症，制止腹泻。此外，对金黄色葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、伤寒、副伤寒、痢疾、炭疽、白喉、绿脓杆菌均有抑制作用。
3.1、配制没食子酸，由北京华美生物工程公司购入。称取没食子酸4.7035g，按百分比浓度溶入蒸馏水中，定容至100ml，浓度为0.25M，作为母液备用。依次稀释0、2、4、8、10、20、40、60、80、100共10个浓度梯发。
3.2、抑菌效果测定培养基灭菌，倒平板，冷却，每皿涂布指示菌液50ul，3个重复，吸取200ul没食子酸液至涂布指示菌的培养皿中，37℃温箱培养18小时。测定结果见表7。
表7、抑菌效果
从表7的测定结果看出，母液及2～8X的稀释液均有抑菌效果。
三、抗血清与增效剂不同组合的增效测定1、正交试验考察的因素及水平为探讨抗血清与水杨酸、薄荷醇、没食子酸不同组合是否具有增效作用，以抑菌圈的大小为评价指标，进行正交试验。考察不同浓度的水杨酸、薄荷醇、没食子酸和抗血清4种主要因素对抑制指示菌生长的抑菌圈大小的影响，试验通过四因素、四水平组合正交实验选择抑制指示菌生长的浓度组合。
表8正交试验考察的因素及水平
以上母液的浓度为血清效价640，水扬酸0.138g/ml，薄荷醇0.01g/ml，没食子酸0.047g/ml。”X”为稀释倍数。
2、正交试验方法与结果以血清20-80X，薄荷醇4-40X，水扬酸10-80X，没食子酸1-8X，为区间，每个物质分别选用四个以上浓度进行组合进行正交实验。
按照上列的组合逐个依次配制，分别吸取每种物质1ml混合于大试管中，充分混匀，移取混合液1ml到eppendorf管中，以测定各组合、各浓度的抑菌效果。
培养基灭菌，倒平板，冷却，每皿涂乳布指示菌液50ul.依次从eppendorf管中吸取已配制好的混合液200ul放置到牛津杯中，每处理三个重复，37℃培养18h后，观察不同因素水平组合的抑菌效果(见表9)。
表9.1.一种增效剂与抗血清正交试验结果(三重复平均值)
表9.2.一种增效剂与抗血清正交试验结果(三重复平均值)
表9.3.一种增效剂与抗血清正交试验结果(三重复平均值)
表9.4.二种增效剂与抗血清交试验结果(三重复平均值)
表9.5.二种增效剂与抗血清正交试验结果(三重复平均值)
表9.6.二种增效剂与抗血清正交试验结果(三重复平均值)
表9.7.三种增效剂与抗血清正交试验结果(三重复平均值)
以上”X”为每种物质的母液稀释倍数。
3、增效结果分析从表9.1～9.7可看出3.1使用一种增效剂的抗血清其抑菌圈最高最低值的平均值分别比单一抗血清的最高值11.76高3.12和5.79[见表9.1、9.2、9.3，血清加入水扬酸(9.98+19.79)/2＝14.88；血清加入没食子酸(11.67+23.43)/2＝17.55]；总平均值(血清加入水扬酸12.98，血清加入没食子酸16.88，血清加入薄荷醇11.12)以及抗血清加入薄荷醇的最高最低平均值(9.95+12.51)/2＝11.23均高于抗血清的20X，40X，80X三种浓度的平均值9.74(见表6)；使用一种增效剂的抗血清的最低值9.95高于单独使用抗血清的最低值9.34。
3.2、使用二种增效剂的抗血清其抑菌圈最高最低值的平均值比单独使用抗血清的抑菌圈最大值11.76分别高2.30，3.24，3.51[见表9.4、9.5、9.6血清加入薄荷醇和水扬酸(8.11+20.01)/2＝14.06，血清加入没食子酸和薄荷醇(10.11+19.89)/2＝15.00，血清加入没食子酸和水扬酸(11.67+18.88)/2＝15.27]；总平均值比单独使用血清的最高值11.76分别高0.53，1.87，3.96(血清加入水扬酸和薄荷醇12.29，血清加入没食子酸和薄荷醇13.63，血清加入没食子酸和水扬酸15.72)。
3.3、使用三种增效剂的抗血清其抑菌圈最高最低值的平均值比单独使用血清的抑菌圈最大值11.76高5.40[见表9.7血清加水扬酸加没食子酸加薄荷醇(10.78+23.54)/2＝17.16]；总平均值比单独使用抗血清的最高值11.76高4.03(血清加水扬酸加没食子酸加薄荷醇15.79)；四种物质的最低值10.78高于单独使用抗血清的最低值9.34。
上述结果说明一种或一种以上的增效剂加入抗血清中的增效作用明显。当抗体效价提高，抗血清的稀释范围扩大。
四川大学华西口腔医学院口腔医学工程教育重点实验室对抗体抗龋制剂进行抗菌活性检测，检测采用NCCLs推荐的厌氧菌药物敏感试验肉湯稀释法，测定抗体抗龋制剂对口腔最常见和最主要的致龋菌变形链球菌和粘性放线菌，以及重要牙周病原菌牙龈卟啉单细胞菌的抗菌活性，结果显示检品对三种实验菌株均有明显的抗菌活性。
表10检品对三株实验菌的MIC和MBC(g/L)
以上结果表明，抗体抗龋制剂具有非常明显的抑制牙菌斑中的变链菌的生长，还能明显抑制一些重要牙周病原菌的活性，不仅具有很好的防龋作用，而且可以防止其它口腔疾病。
根据湖南省疾病控制中心对“抗体抗龋制剂”产品进行急毒性试验结果表明，对昆明种雌雄小鼠的急性经口LD50大于20000mg/Kg·bw，属实际无毒物；24小时、48小时、72小时对白色家兔的急性眼刺激性反应结果为角膜、红膜、结膜充血和结膜水肿积分均值均为0，属无刺激性。
因此抗体抗龋制剂可用于生产防治龋齿的口腔药物，儿童防龋的口腔疫苗，还可用于口腔保健产品以及添加至人们日常用品如牙膏、嗽口液、口香糖等中用于防龋及防口腔疾病。
具体实施例方式用4X没食子酸加入到80X血清中，用蒸馏水稀释600-800倍后加入牙膏中制成牙膏，或制成漱口液等可以有效地防止龋病及牙周炎。
用10X水扬酸及20X薄荷醇混合制成增效剂加入到80X血清中，用蒸馏水稀释500倍后可制成专用的抗龋喷剂保健用品，可专门用于儿童抗龋牙保健。
用2X没食子酸、10X水扬酸与8X薄荷醇混合制成增效剂加入到80X血清中，用蒸馏水稀释200倍可制成防龋口腔药品喷剂。制成的药品喷于口腔患处不仅能有效地防止龋病，而且还对牙周炎有较好的治疗作用。
权利要求
1.一种抗体抗龋制剂，其特征在于抗龋制剂由用口腔致龋的几种变形链球菌菌株混合培养后经家兔免疫制备的抗血清与水杨酸、薄荷醇、没食子酸中的一种或一种以上的增效剂组成。
2.按权利要求1所述的抗体抗龋制剂，其特征在于抗龋制剂的四种组分组合时以抗体效价640、水杨酸0.138g/ml、薄荷醇0.01g/ml、没食子酸0.047g/ml浓度的溶液为母液，经稀释X倍后混合，各组分的浓度稀释范围为抗血清20～80X水杨酸10～80X薄荷醇4～40X没食子酸 1～8X。
3.按权利要求2所述的抗体抗龋制剂，其特征在于抗龋制剂的四种组分组合时，抗体效价提高，抗血清的稀释倍数增加，组分的浓度范围扩大。
全文摘要
本发明涉及用于口腔抗龋的生物制品。本发明由用口腔致龋的几种变形链球菌菌株混合培养后经家兔免疫制备的抗血清与水杨酸、薄荷醇、没食子酸中的一种或一种以上增效剂组成，各组分的母液经稀释后组合的浓度稀释范围为抗血清20～80X、水杨酸10～80X、薄荷醇4～40X、没食子酸1～8X；本发明的各种组合的抑菌效果均高于单一抗血清；经检测，抗体抗龋制剂对口腔最常见和最主要的致龋菌均有明显的抗菌活性，而且无毒性，无刺激性，因而可用于生产防治龋齿的口腔药物，口腔疫苗以及添加到日常生活用品如牙膏、漱口液、口香糖中防龋及预防其他口腔疾病。
文档编号A61P1/00GK1660422SQ200410047128
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月31日 优先权日2004年12月31日
发明者邱德文, 沈建奇, 粟铸 申请人:长沙德文生物科技开发有限公司
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