染色体无标记随机整合载体pUTTns及其应用的制作方法

专利名称：：染色体无标记随机整合载体pUTTns及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及染色体无标记随机整合载体pUTTns及其应用，是将外源目的基因随机整合到革兰氏阴性细菌的染色体上，再将抗性基因删除，得到不带有外源抗性的工程菌株的系列新载体，包括pUTTnsKm、pUTTnsCm和pUTTnsTet，属于生物工程
技术领域：
。二
背景技术：
：基因工程菌的应用非常广泛，在工业生产、制药、污染降解等方面得到了广泛的研究与应用，构建基因工程菌的方法主要有质粒转移法和基因改造法。由于质粒的不稳定性会导致外源基因和尤其是抗生素抗性基因的迁移，将外源基因构建于质粒载体而获得的基因工程菌的应用越来越受到限制。公众对基因工程微生物的环境释放的生态安全性也表示担忧，许多国家(如美国的EPA、中国转基因安全办等)对基因工程微生物环境释放进行了严格的限制。美国环境保护署花了2年时间评估才批准含有萘代谢质粒(pUTK21)的工程菌株P.fluorescensHK44应用于生物修复的田间试验。表达阿特拉津脱氯酶AtzA重组E.coli被戊二醛灭活后才被批准应用于阿特拉津污染土壤的生物修复。将外源基因整合到受体菌染色体上的常用的方法主要有同源重组和转座子插入等。同源重组必须要有同源序列才能进行整合，对一些遗传背景不明的菌株操作困难。转座子随机插入在通常情况下是抗生素抗性基因被用作正筛选标记，但所获得的目标工程菌株的染色体上同时会被引入抗性标记基因，如VictorDL等开发了一种Tn5衍生的转座子。因此，引入的外源抗性基因需要进行删除来能够进行环境释放。因此，目前迫切需要发展能将外源基因整合到受体菌染色体上且不带入外源抗性基因的整合技术，构建生态安全型的基因工程菌株应用于实践。反向筛选标记(Counter-selectablemarker)是首先利用自杀性载体将目的片段和反向筛选标记基因整合到目标菌株的染色体上(先采用抗生素抗性基因为正筛选标记)，然后将整合子传代培养，再通过一次单交换使抗生素抗性基因从染色体中删除，从而获得无标记的工程菌株。反向筛选标记基因的表达一般会抑制宿主菌的生长或致死，因此在添加诱导物的选择性平板上，只有那些发生了重组将抗性基因和反向筛选标记基因删除的菌株才可以生长，从而被筛选出来。在革兰氏阴性菌中，来自于枯草杆菌的反向筛选标记基因-果聚糖蔗糖酶基因sacB可以将蔗糖转换成大分子的果聚糖，并使其在阴性菌的周质空间大量积聚，从而阻止宿主菌与外界的物质传递与运输，最终导致宿主菌停止生长或死亡。因此，染色体上整合有sacB基因的整合子不能够在蔗糖平板上生长，只有那些发生了重组事件将sacB基因和抗性基因删除的菌株才会在添加了蔗糖的选择性平板上生长。现国际上已经有报道应用sacB基因作为同源重组的反筛选标记。本发明即利用sacB基因作为反向筛选标记，构建出系列染色体无标记随机整合载体pUTTnsKm、pUTTnsCm禾口pUTTnsTet。
发明内容技术问题本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，建立针对革兰氏阴性细菌的染色体随机整合技术体系，并利用同向重复序列(DirectRepeat)之间的重组删除抗性标记基因，使用该载体构建出能够表达外源基因且不带有抗性基因的工程菌株，为实际生产应用提供技术支持。技术方案l.染色体无标记随机整合载体pUTTns，是由以下方法构建而成的分别取含质粒pUTmini-Tn5和pWSMK的大肠杆菌，划线于含50mg/kg卡那霉素100mg/kg氨苄青霉素的LB平板和含50mg/kg卡那霉素的LB平板，37。C培养24h，分别挑单菌入含相应抗生素的LB液体试管，37°C150rpm培养18h，碱裂解法提取质粒pUTmini-Tn5和pWSMK，用限制性内切酶Sacl对质粒pUTmini-Tn5进行单酶切，回收片段；采用PCR扩增的方法从pWSMK中扩增出SacB基因并在其两端引入酶切位点Sacl，酶切酶连将SacB基因整合进pUTmini-Tn5的Sacl酶切位点中，挑选阳性克隆命名为pUTTnSacBs;将pUTTnSacBs用Sphl和Notl双酶切，回收大片段。采用PCR扩增的方法从pUTTnSacBs中扩出SacB基因的前四百个碱基，命名为SacBq400，两端引入酶切位点SphI和NotI，同时在NotI酶切位点前引入多克隆位点Apal、Ncol、Ndel、AcccIII、EcoO109、PspOMI和BspEI。酶切酶连将SacBq400整合入pUTTnSacBs,转化E.coliDH5aApir，构建成功pUTTnsKm;将pUTTnsKm用MM酶切，将卡那霉素抗性基因从pUTTnsKm中切开，回收大片段；采用PCR扩增法获得氯霉素抗性基因和四环素抗性基因，两端引入MluI限制性内切酶酶切位点，通过酶切酶连，分别连入pUTTnsKm用MluI酶切回收的大片段中，转化E.coliDH5aApir，挑选阳性克隆即分别为pUTTnsCm和pUTTnsTet;pUTTnsKm、pUTTnsCm和pUTTnsTet分别为含卡那霉素、氯霉素和四环素抗性基因的整合载体系列，该载体通过同向序列的设计，可最终将抗性基因删除；pUTTnsKm载体保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其宿主为大肠杆菌EscherichiacoliDH5aApir，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏号为CGMCC3098;载体pUTTnsKm和pUTTnsTet的多酶切位点有八个酶切位点Apal、Ncol、Ndel、AcccIII、EcoO109、PspOMI、BspEI、Notl，载体pUTTnsCm有七个酶切位点Apal、Ndel、AcccIII、EcoO109、PspOMI、BspEI、Notl，在载体抗性基因的两端有Mlul酶切位点可以针对不同的G-细菌置换抗性基因；染色体无标记随机整合载体pUTTns用于构建不带有外源抗性基因的工程菌株，质粒的宿主菌为E.coliDH5aApir，保存于斜面，在LB培养基上划线，37。C培养24h，挑单菌入3mlLB试管，37°C150rpm摇12h，得到带有pUTTns的大肠杆菌，提取质粒即得。使用上述载体的流程为斜面种-获取质粒-酶切酶连进目的基因-三亲结合获得工程菌。2.农药降解基因mpd的基因工程菌KT2440-mpd，构建方法如下1)农药降解基因mpd整合进pUTTnsKm将含pUTTnsKm载体的E.coliDH5aApir在LB培养基中培养至对数后期，提取质粒，用Notl和Ndel双酶切后回收大片段。从有机磷农药降解菌PsedudomonasputidaDLL-l中用PCR的方法扩增获得mpd基因(引物序列正向5'-gggcccatatgctccgtccaatctccgcc-3，；反向5'-gggcccgcggccgctatcacttggggttgac-3，，PCR方法扩增反应体系如下10XTaq聚合酶反应缓冲液5yL，dNTP(20mmol/L)5yL，引物(25pmol/yL)各2yL，Mg2+(25mmol/L)4iiL，菌体DNA(约50ng/iiL)liiL，TaqDNA聚合酶(5U/PL)0.5iiL，加H20至50iiL。反应条件95。C变性5min;94°C30s，55°C30s，72°C1.5min，30个循环；最后72t:延伸20min)，两端引入用Notl和Ndel酶切位点。通过酶切酶连将mpd基因整合到pUTTnsKm的Notl和Ndel酶切位点，获得的载体命名为pUTTnsKm-mpd。2)三亲结合将mpd基因整合进供体菌KT2440中将供体菌E.coliDH5aApir(pUTTnsKm-mpd)、辅助菌E.coli(pRK600)、受体菌PsedudomonasputidaKT2440分别在LB培养基中培养至对数后期，5000rpm离心回收菌体，用无菌水洗涤l次，浓縮后混合两种菌液于0.25ym微孔滤膜上，置于不含抗生素的LB培养基上3(TC培养，24h后用无菌水洗下菌体，直接涂布于含100yg/mL氨苄青霉素、50iig/mL卡那霉素和100iig/mL氯霉素的LB平板上，48h后挑选长出的单菌落即获得接合子；3)获得发生同向重复序列发生交换不带外源抗性的工程菌将获得的接合子在10%(w/v)蔗糖的LB培养基中培养过夜，涂布于蔗糖平板，挑取单菌落，同时点接SLB平板(加10%蔗糖、100mg/kg甲基对硫磷)和KLB平板(50mg/kg卡那霉素)，挑选能在SLB平板上生长(且能产生水解圈)，而不能在KLB平板生长的菌落即为成功构建的不含外源抗性基因的工程菌KT2440-mpd。上述染色体无标记随机整合载体pUTTns的应用，包括选取野生菌株Paracoccussp丄3和Sphingomonassp.BHC-A，利用权利要求5所述方法，将mpd基因导入这两株野生型菌株，获得野生型菌株工程菌Paracoccussp丄3-mpd禾口Sphingomonassp.BHC-A-mpd。有益效果本发明提供了一种用于构建不带有外源抗性基因工程菌株的载体pUTTns，实验室功能验证表明，该载体能够非常方便的构建不带有外源抗性基因且能够降解多种农药的工程菌株。本发明载体具有使用范围广(大部分革兰氏阴性细菌)、能多次整合外源基因、操作简单方便(含多克隆位点便于外源基因和抗性基因的替换操作)、周期短等优点，所构建工程菌株遗传稳定、生态安全性高。本发明为生态安全型基因工程菌构建提供了一种新的方法和技术平台、具有重要的研究意义和实际应用价值。四图l载体构建路线图图2载体工作原理图图；3Paracoccussp丄:3-mpd和Paracoccussp丄3的生长曲线图4Sphingomonassp.BHC-A-mpd和Sphingomonassp.BHC-A的生长曲线图5KT2440-mpd和KT2440的生长曲线图6mpd基因在工程菌株PseudomonasputidaKT2440-mpd、Paracoccussp丄3-mpd禾口Sphingomonassp.BHC-A-mpd中的表达pUTTnsKm载体于2009年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其宿主为大肠杆菌EscherichiacoliDH5aApir，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏号为CGMCC3098。载体pUTTnsCm、pUTTnsTet和pUTTnsKm类似，只是抗性基因卡那霉素被分别替换为氯霉素和四环素抗性基因，是为了针对不同受体菌抗性选择的需要。五具体实施方式-以有机磷农药水解酶基因mpd为例1染色体无标记随机整合载体pUTTns的构建取分另ll含质茅立pUTmini-Tn5(M.Herrero，VdeLorenzo,K.N.Timmis.Transposonvectorscontainingnon-antibioticresistanceselectionmarkersforcloningandstablechromosomalinsertionofforeigngenesingram-negativebacteria.J.Bacteriol.1990，172:6557-6567.)和质粒pWSMK(J.Jiang，R.Zhang，Z.Cui，J.He，L.GuandS丄i.Parameterscontrollingthegene-targetingfrequencyattheSphingomonasspeciesrrnsiteandexpressionofthemethylparathionhydrolasegene.JoumalofAppliedMicrobiology,2007，1578-1585)的大肠杆菌，分别划线与含有卡那霉素(50mg/kg)、氨苄青霉素(100mg/kg)的LB平板和只含有卡那霉素(50mg/kg)的LB平板上，37t:培养24h，分别挑单菌入同样含有相应抗生素的LB液体试管，37°C150rpm培养18h。碱裂解法提取质粒pUTmini-Tn5和pWSMK，用限制性内切酶SacI对质粒pUTmini-Tn5进行单酶切，回收片段(7055bp)。采用PCR扩增的方法从pWSMK中扩出sacB基因(引物序列正向5'-gagctccttcccaaccttaccagag-3';反向5'-gagctctagttctttaggcccgtag-3'，PCR方法扩增反应体系如下lOXTaq聚合酶反应缓冲液5iiL，dNTP(20mmol/L)5iiL，引物(25pmol/yL)各2iiL，Mg2+(25mmol/L)4iiL，菌体DNA(约50ng/yL)lyL，TaqDNA聚合酶(5U/PL)0.5uL，力BH20至50iiL。反应条件95t:变性5min;94°C30s，58°C30s，72°C1.5min，30个循环；最后72t:延伸20min)。引物两端引入酶切位点sacl，酶切酶连将sacB基因整合进pUTmini-Tn5酶切回收的大片段中，挑选阳性克隆命名为pUTTnSacBs。将pUTTnSacBs用Sphl和Notl双酶切，回收大片段，采用PCR扩增的方法从pUTTnSacBs中扩出SacB基因的前四百个碱基SacBq400(引物序列正向5'-catagcggccgctccggacatatgccatgggccctcggtatgattgagctaaac-3';反向5'-cctgcagggcatgcgacaacagatgttttcttgcctttg-3'。PCR方法扩增反应体系如下10XTaq聚合酶反应缓冲液5yL，dNTP(20mmol/L)5iiL，引物(25pmo1/PL)各2iiL，Mg2+(25mmol/L)4iiL，菌体DNA(约50ng/yL)lyL，TaqDNA聚合酶(5U/yL)0.5iiL，力BH2O至50iiL。反应条件95°C变性5min;94°C30s，56°C30s，72°Clmin，30个循环；最后72"C延伸10min。引物两端引入酶切位点Sphl和Notl，同时在Notl酶切位点前引入多酶切位点，Sphl和Notl进行双酶切后用T4连接酶进行酶连将SacBq400整合进大片段构建成功pUTTnsKm。将pUTTnsKm用MM酶切位点将卡那霉素基因与pUTTnsKm切开，回收大片段，采用PCR扩增法从质粒pNW33N(来源于BGSC)和pBBRlMCS-3(Kovachetal.，Biotechniques，1994，5:800-802)获得氯霉素基因和四环素基因(四环素抗性基因引物正向5'-acgcgtgacgtcattgattggctccaattc-3'，反向5'-acgcgtactagtgaattctcatgtttgacagc-3';氯霉素抗性基因引物正向5，-acgcgtgacgtcttataaaagccagtcattaggc-3，，反向acgcgtactagtaccttgatgacacagaagaag。PCR方法扩增反应体系如下10XTaq聚合酶反应缓冲液5yL，dNTP(20mmol/L)5iiL，引物(25pmo1/iiL)各2iiL，Mg2+(25mmol/L)4iiL，菌体DNA(约50ng/yL)lyL，TaqDNA聚合酶(5U/yL)0.5iiL，加H2O至50iiL。反应条件95。C变性5min;94°C30s，58°C30s，72°Clmin，30个循环；最后72。C延伸10min。两端引入Mlul限制性内切酶酶切位点，通过酶切酶连分别连入刚刚回收的大片段挑选阳性克隆即分别为pUTTnsCm和pUTTnsTet，可以根据酶切位点针对不同的革兰氏阴性细菌置换抗性基因而构建出一系列的载体。pUTTnsKm和pUTTnsTet的多酶切位点有八个酶切位点Apal、Ncol、Ndel、AcccIII、EcoO109、PspOMI、BspEI、Notl。pUTTnsCm有七个酶切位点Apal、Ndel、AcccIII、EcoO109、PspOMI、BspEI、Notl，在载体抗性基因的两端有Mlul酶切位点可以针对不同的G-细菌置换抗性基因。本发明提供一系列染色体无标记随机整合载体pUTTnsKm、pUTTnsCm、pUTTnsTet,用于构建不带有外源抗性基因的工程菌株，质粒的宿主菌为E.coliDH5aApir(J.C.P.Yin，M.P.Krebs.W.S.Reznikoff.l988.EffectofdammethylationonTn5transposition丄Mol.Bio1.199:35-45.)，保存于斜面，在LB培养基上划线，37。C培养24h，挑单菌入3mlLB试管，37°C150rpm摇12h，得到带有pUTTns的大肠杆菌，提取质粒即得。使用上述载体的流程为斜面种-获取质粒-酶切酶连进目的基因-三亲结合获得工程菌。2将农药降解基因mpd整合进多酶切位点由于我们所选择的受体菌PseudomonasputidaKT2440没有卡那霉素抗性(顾立锋等，多功能降解菌PseudomonasputidaKT2440-DOP的构建与降解特性研究，微生物学报，2006:763-766)，我们选择卡那霉素抗性标记基因的载体pUTTnsKm，LB培养基中培养至对数后期，提取质粒，用Notl和Ndel双酶切后回收大片段，从有机磷农药降解菌PseudomonasputidaDLL-1(刘智，孙建春，李顺鹏.甲基对硫磷降解菌DLL-1的分离、鉴定及降解性研究.应用与环境生物学报，1999，147-151)中用PCR的方法扩增获得mpd基因(蒋建东，顾立锋，孙纪全，代先祝，文阳，李顺鹏.同源重组法构建多功能农药降解基因工程菌研究.生物工程学报，2005，21(6):884-891.)，两端引入用Notl和Ndel酶切位点，在通过酶切酶连将基因整合进pUTTnsKm，载体命名为pUTTnsKm-mpd。2.2三亲结合将mpd基因整合进供体菌KT2440中由于pUTTnsKm-mpd载体不能在KT2440中自主复制，因此转入受体菌细胞内的载体只有整合到染色体上才能随着染色体的复制而存在。载体上含有卡那霉素抗性基因，受体菌为氯霉素抗性，因此，在氯霉素、卡那霉素和氨苄青霉素三抗平板上长出来的菌株则为所需发生插入的工程菌。将含pUTTnsKm-mpd的供体菌E.coliDH5aApir、辅助菌E.colipRK600(MillerS.A.，DykesD.D.，PoleskyH.R.1988.AsimplesaltingoutprocedureforextractingDNAfromhumannucleatedcells.NucleicAcidsRes，16:1215)、受体菌PsedudomonasputidaKT2440分别在LB培养基中培养至对数后期，5000rpm离心回收菌体，用无菌水洗涤l次，浓縮后混合两种菌液于0.25ym微孔滤膜上，置于不含抗生素的LB培养基上3(TC培养，24h后用无菌水洗下菌体，直接涂布于含100yg/mL氨苄青霉素、50iig/mL卡那霉素和100iig/mL氯霉素的LB平板上，48h后挑选长出的单菌落并能在甲基对硫磷平板上产生水解圈的即为接合子；2.3获得发生同向重复序列发生交换不带外源抗性的工程菌将获得的接合子在10%(w/v)蔗糖的LB培养基中培养过夜，涂布于蔗糖平板，挑取单菌落，同时点接SLB平板(加10%蔗糖、100mg/kg甲基对硫磷)和KLB平板(50mg/kg卡那霉素)，挑选能在SLB平板上生长(且能产生水解圈)，而不能在KLB平板生长的菌落即为成功构建的不含外源抗性基因的工程菌KT2440-mpd(丢失sacB基因和抗性等载体序列)。2.4工程菌KT2440-mpd的生长情况按3%的接种量将培养8h且OD值一致的KT2440-mpd和KT2440种子液分别接入含有200mlLB液体培养基500ml三角瓶中，置于3(TC、160r/min摇床培养。每隔2h取样3ml，测定OD600nm值，结果表明工程菌与野生菌株生长没有差异。2.5工程菌KT2440-mpd在液体中对农药甲基对硫磷的降解及生长特性在甲基对硫磷浓度为100mg/L的基础盐培养基中，以3%的接种量接入用O.lmol/L的PBS缓冲液洗涤2次的KT2440-mpd种子液(A600《2.00)，于30°C、180r/min摇床培养。每2h取样，测定甲基对硫磷的含量。菌株KT2440-mpd对甲基对硫磷有着很好的降解率。3载体在其他野生菌株中的应用选取野生菌株Paracoccussp丄3(王堃等，乐果降解菌L3的分离、鉴定及降解性能，中国环境科学)和Sphingomonassp.BHC-A(马爱芝等，六六六(HCH)降解菌Sphingomonassp.BHC-A的分离与降解特性的研究，微生物学报)为例，菌株为本实验室对外提供，利用以上方法，成功的将mpd基因导入这两株野生型菌株，基因能够很好的f寻至Ll表达，获f寻王禾呈菌Paracoccussp丄3-mpd禾口Sphingomonassp.BHC-A-mpd。4外源基因对野生型菌株生长的影响在18个lL的三角瓶中加入300mL的LB培养基，12rC灭菌30分钟，分别以2X的接种量接入KT2440-mpd、Paracoccussp丄3-mpd、Sphingomonassp.BHC-A-mpd和野生菌株KT2440、Paracoccussp丄3、Sphingomonassp.BHC-A，置于30。C、180rpm摇床振荡培养，按不同的培养时间，每隔2h用无菌移液管取样3mL，立即放入4t:冰箱储存，最后一同在600nm波长处测定OD值。用未接种的细菌培养基作空白对照，从最早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用细菌培养基适当稀释后，使其光密度在O.l0.8之间(在测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)，每个处理三次重复。测定结果表明，外源基因对工程菌株的生长没有影响。权利要求染色体无标记随机整合载体pUTTns，其特征在于，由以下方法构建而成的分别取含质粒pUTmini-Tn5和pWSMK的大肠杆菌，划线于含50mg/kg卡那霉素、100mg/kg氨苄青霉素的LB平板和含50mg/kg卡那霉素的LB平板，37℃培养24h，分别挑单菌入含相应抗生素的LB液体试管，37℃150rpm培养18h，碱裂解法提取质粒pUTmini-Tn5和pWSMK，用限制性内切酶SacI对质粒pUTmini-Tn5进行单酶切，回收片段；采用PCR扩增的方法从pWSMK中扩增出SacB基因并在其两端引入酶切位点SacI，酶切酶连将SacB基因整合进pUTmini-Tn5的SacI酶切位点中，挑选阳性克隆命名为pUTTnSacBs；将pUTTnSacBs用SphI和NotI双酶切，回收大片段，采用PCR扩增的方法从pUTTnSacBs中扩出SacB基因的前四百个碱基，命名为SacBq400，两端引入酶切位点SphI和NotI，同时在NotI酶切位点前引入多克隆位点ApaI、NcoI、NdeI、AcccIII、EcoO109、PspOMI和BspEI，酶切酶连将SacBq400整合入pUTTnSacBs，转化E.coliDH5αλpir，即为构建成功pUTTnsKm；将pUTTnsKm用MluI酶切，将卡那霉素抗性基因从pUTTnsKm中切开，回收大片段，采用PCR扩增法获得氯霉素抗性基因和四环素抗性基因，两端引入MluI限制性内切酶酶切位点，通过酶切酶连，分别连入pUTTnsKm用MluI酶切回收的大片段中，转化E.coliDH5αλpir，挑选阳性克隆即分别为pUTTnsCm和pUTTnsTet；pUTTnsKm、pUTTnsCm和pUTTnsTet分别为含卡那霉素、氯霉素和四环素抗性基因的整合载体系列，该载体通过同向序列的设计，可最终将抗性基因删除；pUTTnsKm载体保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其宿主为大肠杆菌EscherichiacoliDH5αλpir，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏号为CGMCC3098。2.根据权利要求1所述的载体pUTTns，其特征在是pUTTnsKm和pUTTnsTet的多克隆位点含八个酶切位点Apal、Ncol、Ndel、AcccIII、EcoO109、PspOMI、BspEI、Notl，载体pUTTnsCm的多克隆位点含七个酶切位点ApaI、Ndel、AcccIII、EcoO109、PspOMI、BspEI、Notl，在载体抗性基因的两端有Mlul酶切位点可以针对不同的G—细菌进行抗性基因的置换；3.根据权利要求1或2所述的载体pUTTns，其特征在是载体pUTTns的宿主菌为原核生物大肠杆菌E.coliDH5aApir，分别为E.coliDH5a入pir-pUTTnsCm、E.coliDH5a入pir-pUTTnsTet禾口E.coliDH5a入pir-pUTTnsKm;4.权利要求1-3之一所述染色体无标记随机整合载体pUTTns的应用；5.农药降解基因工程菌株KT2440-mpd，其特征在于，构建方法如下1)外源降解基因mpd整合进pUTTnsKm将权利要求l所述pUTTnsKm载体在LB培养基中培养至对数后期，提取质粒，用Notl和Ndel双酶切后回收大片段，从有机磷农药降解菌PsedudomonasputidaDLL-1中用PCR的方法扩增获得mpd基因，两端引入用Notl和Ndel酶切位点，在通过酶切酶连将mpd基因整合进pUTTnsKm,获得的载体命名为pUTTnsKm-mpd;2)三亲结合将mpd基因整合进供体菌KT2440中将含pUTTnsKm-mpd的供体菌E.coliDH5aApir、辅助菌E.colipRK600、受体菌PsedudomonasputidaKT2440分别在LB培养基中培养至对数后期，5000rpm离心回收菌体，用无菌水洗涤l次，浓縮后混合两种菌液于0.22ym微孔滤膜上，置于不含抗生素的LB培养基上3(TC培养，24h后用无菌水洗下菌体，直接涂布于含100yg/mL氨苄青霉素、50iig/mL卡那霉素和100iig/mL氯霉素的LB平板上，48h后挑选长出的单菌落即获得接合子；3)筛选发生同向重复序列发生交换的不带外源抗性的工程菌株将获得的接合子在含10X蔗糖的LB培养基中培养过夜，涂布于蔗糖平板，挑取单菌落，同时接种含10%蔗糖、100mg/kg甲基对硫磷平板SLB和加50mg/kg卡那霉素的平板KLB，挑选能在SLB平板上生长且产生黄色水解圈而不能在KLB平板生长的菌落，即为成功构建的不含外源抗性基因的工程菌KT2440-mpd;6.权利要求5所述基因工程菌KT2440-mpd在野生菌株中的应用，包括选取野生型菌株Paracoccussp丄3和Sphingomonassp.BHC-A，利用权利要求5所述方法，将mpd基因整合到这两株野生型菌株的染色体上，获得工程菌Paracoccussp丄3-mpd禾口Sphingomonassp.BHC-A-mpd;全文摘要本发明涉及染色体无标记随机整合载体pUTTns及其应用，属于生物工程
技术领域：
。pUTTnsKm、pUTTnsCm和pUTTnsTet分别为含卡那霉素、氯霉素和四环素抗性基因的载体。该系列载体可通过转座子Mini-Tn5将外源基因随机整合到G-细菌染色体上，先通过抗性基因筛选整合子，再通过同向重复序列之间的重组将抗性基因删除，用反筛选标记基因sacB将抗性基因删除的重组子筛选出来，构建出无外源抗性基因标记的工程菌株。本发明载体具有使用范围广、能多次整合外源基因、操作简单方便等优点，所构建工程菌株遗传稳定、不含外源抗性基因、生态安全性高，为生态安全型基因工程菌构建提供了新的方法和技术平台。文档编号A62D3/00GK101691581SQ20091003369公开日2010年4月7日申请日期2009年6月25日优先权日2009年6月25日发明者李荣,李顺鹏,蒋建东申请人:南京农业大学