不动杆菌萘双加氧酶系统及其应用的制作方法
专利名称：不动杆菌萘双加氧酶系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于降解低分子量多环芳烃的萘双加氧酶系统，尤其涉及一种能 降解低分子量多环芳烃的不动杆菌的萘双加氧酶系统，更具体的是涉及一种能降解萘和菲 双加氧酶系统及其在环境污染修复中的应用。
背景技术：
多环芳经(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是指分子中含有两个或 两个以上苯环的碳氢化合物，可分为芳香稠环和非芳香稠环型，环境污染研究中的多环芳 烃一般是指芳香稠环型，其中16种多环芳烃化合物已被美国环保局列入优先控制的污染 物黑名单。多环芳烃大多是石油、煤等化石燃料以及木材、天然气、有机高分子化合物、纸 张、作物秸秆、烟草等含碳氢化合物的物质经不完全燃烧或在还原性气氛中经热分解而生 成的，PAHs环数相对丰度可以反映来自热解或石油类污染，通常4环及4环以上PAHs主要 来源于化石燃料高温燃烧，而2环和3环PAHs则来源于石油类污染。一般而言2-3环的低 分子量PAHs具有显著的急性毒性，而某些高分子量的PAHs则具有潜在的致癌性，有很强的 致畸、致癌、致突变作用。随着煤、石油在工农业生产、交通运输以及生活中被广泛应用，由此而产生的多环 芳烃已成为世界各国共同关注的有机污染物，多环芳烃的积累已经越来越严重地威胁着人 类的健康。多环芳烃化合物(PAHs)由于水溶性差，辛醇_水分配系数高，常被吸附于土壤颗 粒上。因此，该类化合物易于从水中分配到生物体内、沉积层中，土壤就成为PAHs的主要载 体。多环芳烃在环境中不断积累，其半衰期少则2个月、多则几年。多环芳烃进入土壤后，由 土壤表面污染进一步导致下层土壤污染，甚至地下水污染(Environ Sci Technol. ,2004, 15,5878)。治理多环芳烃化合物(PAHs)污染主要有物理修复、化学修复和生物修复。同其 它有机污染物相比，多环芳烃化合物在土壤中比较稳定，利用促使其挥发和降解的物理化 学方法很难去除，国内外正在筛选高效的吸附剂及臭氧化降解途径(Water Res.，1998， 32,1231).。近年来，生物修复技术为PAHs的降解提供了新的途径，生物降解在污染物的 迁移转化直至最终消失的过程中占重要地位。许多细菌、真菌、藻类都有降解PAHs的能 力。在PAHs污染土壤中，经过自然驯化，存在大量的能降解多环芳烃的微生物。但是，由 于微生物种类不同以及多环芳烃较难在环境中降解，所以降解PAHs的途径就有较大的差 另O。研究表明，微生物一般通过2种方式对PAHs进行代谢(1)微生物在生长过程中以 PAHs作为唯一的碳源和能源。适合于土壤中低分子量的3环和3环以下的多环芳烃类化 合物。(2)微生物把PAHs与其他有机质共代谢(或共氧化)。由于来源于土壤中很少有 能直接降解4环及4环以上高分子量的多环芳烃的微生物，所以高分子量的多环芳烃的降 解要依赖共代谢作用和类似物。早在1964年，Davies和Evans在土壤中就分离到能够分 解萘的假单胞菌(Biochem. J.，1964，91，251)。近年来人们对降解多环芳烃的微生物进行了广泛的研究，常见微生物有红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝 杆菌(Mycobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、气单胞菌 属(Aeromonas)、拜叶林克氏菌属(Bei jernckia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、蓝细菌 (Cyanobacteria)、微球菌属(Micrococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)和弧菌属(Vibrio)等 (Biosci. Biotech. Biochem. 2003,67,225)。香港大学的梁佩芝等(生态科学，2003，22，97)研究了红树林厌氧环境对多环芳 烃的降解，指出了厌氧的硫酸盐还原菌在降解多环芳烃方面有其独特的生化优势，并确定 羰基化反应是开始的一个重要步骤。聂麦茜等(环境科学，2001，22，83)从焦化废水污染的污泥中分离出1株优势短 杆菌，该菌株对菲、蒽、芘降解IOh后，菲、蒽、芘浓度从起始40mg/L，分别降至15.2、19.8、 28. Omg/L, Fe3+对这3种多环芳烃的降解有明显的促进作用，在相同实验条件加Fe3+反应 IOh后，反应瓶中菲的浓度降至5. Omg/L,蒽降至9. 8mg/L,芘则降至15. 8mg/L。Dan等(Chemosphere，1999，38，1313)研究发现，好氧条件下萘存在时可使菲的降 解率提高5倍，芘提高2倍，同时发现菲存在时可抑制芘的降解，厌氧条件也有同样结果。 Michiei等(Microbio Ecol，2004，48，209)发现分枝杆菌菌株S65可利用芘、菲和荧蒽，苯 并蒽，当苯并芘或菲作为芘的共代谢底物时，可以提高芘的降解率。张志杰等(水处理技术，2003，29，276)研究了 1株芽孢杆菌对蒽、菲、芘在单基质 及混合基质条件下降解性能的研究，发现在单基质条件下，起初的82h内，该菌株对蒽的降 解转化效果最好，菲最差，反应进行到106h，各PAHs的浓度均接近于O ；在混合基质条件下， 菲的竞争代谢能力最强，芘最小。Robert等在生物反应器中使用白腐真菌处理受多环芳烃处理的土壤，36天后， 包括萘等低分子量的多环芳烃降解率为70%-100% (Environ SciTechnol.，1997，31， 2626)。Jee等用生物反应器修复河道底泥，在搅拌且曝气的条件下，多环芳烃的降解率达到 40% (Water Res.，1998，32，1231)。微生物修复的关键是筛选具有很强分解能力的优势菌。多环芳烃的降解取决于微 生物产生加氧酶的能力。多环芳烃的最初氧化，即苯环加氧是控制PAHs生物降解反应速度 的关键步骤。在过去20年的时间里，对好氧细菌降解多环芳烃的研究主要集中在假单胞 菌的萘降解途径的分析。同植物一样，假单胞菌也是通过羟基化作用分解萘，萘双加氧酶 (naphthalenedioxygenase ND0)系统参与萘的羟基化。目前对该酶的研究结果主要来自恶 臭假单胞菌Pseudomonas putida G7菌株，该菌中萘加氧酶系统含有三个组分铁硫黄素蛋 白还原酶NahAa ；铁氧还蛋白NahAb和加氧酶，加氧酶由大亚基NahAc和小亚基NahAd组成 四聚体，电子从NAD(P)H通过铁硫黄素蛋白还原酶和铁氧还蛋白向加氧酶传送，促进加氧 酶将两个氧原子加到萘的一个苯环上。对很多细菌中的NDO基因结构分析发现，它们多由 上述三个组份构成并且种间具有很高的同源性，说明萘双加氧酶系统普遍存在于自然界(J Bacteriol.，1992，174，7542)。不动杆菌(Acinetobacter)是一群不发酵糖类，氧化酶阴性的革兰阴性杆菌。绝 大多数的种与人的疾病有关。不动杆菌广泛存在于自然界，主要在水体和土壤中，易在潮湿 环境中生存，如浴盆、肥皂盒等处。该菌粘附力极强，易在各类医用材料上粘附，而可能成为 贮菌源。此外，本菌还存在于健康人皮肤(25%)、咽部(7% )，也存在于结膜、唾液、胃肠道及阴道分泌物中。有些研究发现在石油污染区存在不动杆菌，它们可以以菲为惟一碳源和 能源生长。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种降解萘和菲的萘双加氧酶系统，该操纵子源自于 不动杆菌属本发明的另一个目的在于提供一种含有萘双加氧酶系统的表达载体。本发明的又一个目的在于提供一种萘双加氧酶系统及其表达载体，该双加氧酶系 统与表达载体在低分子量多环芳烃降解中的应用。本发明的目的是通过如下技术方案实现的萘双加氧酶系统源自于不动杆菌属，由4个基因组成，其核苷酸序列为SEQ ID No 1所示，在其序列中51-1413核苷酸为双加氧酶α亚基基因；1534-2097核苷酸为双加氧酶 β亚基基因；2164-2429核苷酸为铁氧还蛋白基因；2428-3661核苷酸为铁硫黄素蛋白还原
酶基因。SEQ ID No :1所示的萘双加氧酶系统的获取方法为先将野生菌在含有萘为碳源 的Μ9固体培养基中培养48小时，选择生长良好的菌落；再将选择出来的菌落置于LB液体 培养基中培养24小时以上；之后提取总DNA，采用功能互补法(Microbiology，2007，153， 787)克隆并得到萘双加氧酶系统的四个基因。一种SEQ ID No 1所示的萘双加氧酶系统的具体获取方法为菌种分离从上海化学工业基地取污泥，稀释10-100倍后涂布在以萘为碳源的M9固体培养 基上(15g/L 琼脂，12. 8g/L Na2HP04，3. Og/L KH2P04，0. 5g/L NaCl，0. 5g/L NH4C1,1 μ g/ml 维生素Bl (单独灭菌)，200mg/L萘，pH7. 5)，28°C培养48小时，挑取生长良好的菌株。总DNA提取将分离获得的细菌单株在IOml液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl, IOg/ L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7. 5)中培养24小时，菌体培养液离心5min，得到菌体沉淀。将这 些沉淀在-20°C下冷冻1小时，之后使用TE(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，pH 8.0)溶液清洗一 次。加入浓度为lOmg/mL溶菌酶(Sigma-Aldrich)的无菌水悬浮，在37°C下摇床培养lhr。 加入0. 5M EDTA, 10% (w/v) SDS和浓度为5M的NaCl轻轻振荡混勻。再加入浓度为20mg/ mL蛋白激KCTakara日本)，反应物在37°C下培养lhr。用与培养菌液液体体积相当(1倍 体积)的苯酚氯仿异戊醇(25 24 1)提取DNA。水相用与相当水相体积1/2(0. 5 倍体积)的氯仿异戊醇(24 1)萃取。振荡混勻后离心5min。水相中加入与水相体积 相当(1倍体积)的异戊醇。振荡混勻后离心15min。取沉淀，用70% (ν/ν)酒精冲洗DNA， 干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮。所得总DNA储存于4°C下备用。萘双加氧酶系统获取用0. 02-0. 5u/μ L浓度限制性核酸内切酶Sau3A (大连宝生物工程公司)酶切 提取所得的细菌总DNA，时间20-60分钟，然后0.7% (w/v)琼脂糖凝胶电泳，切下长度为 3-5kb的DNA片段，用胶试剂盒(上海生物工程公司)回收。选择pG251(CN1338515NCBI) 作为表达载体，用限制性核酸内切酶BamHI(大连宝生物工程公司)酶切并进行胶回收。对酶切的载体质粒进行去磷酸化操作，以降低质粒自连，并对碱性磷酸酶进行失活操作后 (Sambrook分子克隆手册1989)，再与外源的DNA片段(即长度为3_5kb的细菌DNA片段) 连接。反应温度16°C，连接时间为10-12h。连接产物用正丁醇沉淀后，用70% (ν/ν)的乙 醇离心洗涤，最后用10μ 1的超纯水溶解，将连接物进行电击转化大肠杆菌DH5 α感受态细 胞，点击参数为电脉冲为2. 5 μ F，电压2. 5kV，电阻200 Ω，电击时间为4. 5. S。复苏后，将 菌液涂布于以萘为碳源的Μ9固体培养基(含有5(^8/!^氨苄青霉素)平板上，371培养 48h，筛选生长良好的菌落。萘双加氧酶系统工程菌种构建以 PNap 1:5，-ATGAACCAGACGGAGACGACCCCGATCAGA-3 ’ 和 PNap2 5 ’ -TCTTTAAGTTCAT TTCTGCTTTCCATCG-3’为扩增引物对萘双加氧酶系统相关的基因进行PCR扩增。使用KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，扩增条件依次为-MV 30秒，68°C 30秒，72°C 600秒，扩增30 个循环。加入2单位rtaq酶(大连宝生物工程公司)，在72°C延伸30分钟。PCR结束后， 1% (w/v)琼脂糖凝胶回收，获得长度为3682bp的SEQ ID No 1序列。SEQ ID No 1序列转入原核生物细胞中一种方式为，将SEQ ID No 1序列直接与表 达载体pBAD/TOPO ThioFusion (Invitrogen)相连，4°C连接2小时。然后将该载体转化感 受态大肠杆菌T0P10 (Invitrogen)。将菌液涂布于含有50 μ g/mL氨苄青霉素的以萘为碳源 的M9固体培养基上，培养后挑取生长良好的菌落。然后将挑取的菌落转入LB液体培养基中，37°C振荡培养12小时。加入菲至终浓 度100 μ g/mL,继续培养7天，培养液中加入二氯甲烷，在振荡摇床中摇至成乳状，以5000r/ min离心lOmin，取下层萃取液，样液过0. 22um微孔滤膜后进行HPLC分析，外标法定量。检 测细菌对多环芳烃的降解效果。本发明技术方案实现的有益效果多环芳烃是一类重要的环境污染有机物，大多数多环芳烃具有显著的毒性，某些 高分子量的多环芳烃则具有潜在的致癌性。随着工业化进程的加快，多环芳烃对环境的污 染显著提高。分离高效降解多环芳烃的菌株，提取总DNA和PCR扩增后得到的SEQ ID No 1的序列及其表达载体可以应用于环境中多环芳烃的降解。本发明所述的术语与其一般概念相同。所述的“核苷酸”和“引物”序列均为5’端至3’端。所述的“生物合成”指利用微生物、植物细胞或组织，以发酵或培养的方式合成目 标产物，如β-胡萝卜素。所述的“生物细胞”指微生物、植物细胞或组织。所述的“微生物”指原核微生物或真核微生物，原核微生物主要为细菌；真核微生 物为真菌或藻类，真菌主要指酵母菌。
图1为PCR扩增所得序列为SEQ ID No :1的萘双加氧酶系统电泳图，其中泳道1 为DNA分子量标记(Marker)；泳道2为从不动杆菌中扩增的萘双加氧酶系统；图2工程菌对多环芳烃菲的降解；A，加样前，B培养168小时后。菲相应的色谱峰 为 472nm。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案 而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理 解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范 围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛_奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨 姆布鲁克、E. F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科学出版社，1994)。该书及其后续出版版本是本 领域技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。实施例1菌种分离从上海化学工业基地取污泥，稀释10-100倍后涂布在以萘为碳源的M9固体培养 基上(15g/L 琼脂，12. 8g/L Na2HP04，3. Og/L KH2P04，0. 5g/L NaCl，0. 5g/L NH4C1,1 μ g/ml 维生素Bl (单独灭菌)，200mg/L萘，pH7. 5)，28°C培养48小时，挑取生长良好的菌株。该菌 落呈圆形，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，无色，革兰氏染色反应为阴性的菌株；进一步通 过显微镜筛选无鞭毛，无芽孢的杆状菌株。将获得的菌株稀释104后反复2次在LB固体平 板培养基上纯合。实施例2总DNA的提取将实施例1中分离获得的细菌单株在IOml LB液体培养基(5g/L酵母提取物，5g/ L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中培养16小时后，菌体培养液以6，OOOg速 度离心5min，得到菌体沉淀。这些沉淀先在_20°C下冷冻lhr，之后使用TE缓冲液(IOmM Tris-HCl，ImM EDTA，pH 8. 0)清洗一次，再于 20 μ 1 溶菌酶(Sigma-Aldrich)浓度为 IOmg/ mL的无菌水中悬浮，并于37°C摇床培养lhr。接着加入50 μ 1浓度为0. 5Μ EDTA, 50 μ 1浓度为10% (w/v) SDS和50 μ 1浓度为 5Μ的NaCl并轻轻振荡混勻后，再加入10 μ 1浓度为20mg/mL蛋白激酶K(Takara日本)，于 37°C下培养lhr。之后用与培养菌液液体体积相当(1倍体积)的苯酚氯仿异戊醇 (25 24 1，体积比)提取DNA。水相用与相当水相体积1/2 (0. 5倍体积)的氯仿异 戊醇(24 1，体积比)萃取。振荡混勻后离心5min。水相中加入与水相体积相当(1倍体 积)的异戊醇。振荡混勻后离心15min。取沉淀，用70% (ν/ν)酒精冲洗DNA，干燥，之后在 TE缓冲液中重悬浮。所得总DNA于-20 V下保存。实施例3不动杆菌菌株同源性分析以实施例2抽提的总DNA为模板，利用16s rRNA两端引物进行扩增。扩增的引物 为 16SR1 :5，CAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3，和 16SF :5，TACGGCTACCTTGTTACGACTTC3，。以 KOD Plus (Toyobo日本)为Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 120 秒，扩增30个循环。循环结束后，加入2个单位的rtaq酶(宝生物工程(大连)有限公 司)，72°C延伸300秒，扩增片段长1503bp(如下)。PCR结束后，(w/v)琼脂糖凝胶回 收，取10 μ 1直接与T/A克隆载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4°C连接过夜。
先将该载体转化入DH5 α感受态中。再用ABI Prism Big Dye的ΑΒΙ3700毛细管 自动化测序仪测序，测得的序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，得到 菌株与Acinetobacter属中的许多种菌的16s rRNA有99. 5%的同源性(NCBI)。菌株系统 发育地位上属于不动杆菌属(Acinetobacter)。1 cagagtttga tcctggctca gattgaacgc tggcggcagg cctaacacat gcaagtcgag61 cggatgagtg gagcttgctc catgattcag cggcggacgg gtgagtaatg cctaggaatc121tgcctggtagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcatacgtcctacggg
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1441tcggggggacggttaccacggagtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtagcc
1501gta 实施例4不动杆菌中萘双加氧酶系统的获取 通过功能互补方法获取萘双加氧酶系统相关基因，具体方法如下用不同浓度 (0. 02-0. 5u/ μ L)限制性核酸内切酶Sau3A (大连宝生物工程公司)酶切实施例2提取所得 的不动杆菌总DNA，时间20-60分钟，然后0.7% (w/v)琼脂糖凝胶电泳，切下长度为3_5kb 的DNA片段，用胶试剂盒(上海生物工程公司)回收。选择pG251(CN1338515NCBI)作为表 达载体，用限制性核酸内切酶BamHI (大连宝生物工程公司)酶切并进行胶回收。对酶切的 载体质粒进行去磷酸化操作，以降低质粒自连，并对碱性磷酸酶进行失活操作后(Sambrook 分子克隆手册1989)，再与外源的DNA片段(即长度为3-5kb的不动杆菌DNA片段)连接。 连接前，将回收的部分酶解的细菌基因组DNA片段与pG251载体DNA，用琼脂糖凝胶电泳的方法估计浓度，确保连接反应中外源DNA的浓度至少是载体浓度3-5倍。反应温度16°C，连接时间为10_12h。连接产物用正丁醇沉淀后，用70% (ν/ν)的乙醇离心洗涤，最后用10μ 1 的超纯水溶解，将连接物进行电击转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，点击参数为电脉冲为 2. 5 μ F,电压2. 5kV，电阻200 Ω，电击时间为4. 5. S。复苏后，将菌液涂布于以萘为碳源的Μ9 固体培养基上(15g/L 琼脂，12. 8g/LNa2HP04，3. Og/L KH2P04，0. 5g/L NaCl，0. 5g/L NH4C1, 1 μ g/ml维生素Bl (单独灭菌)，200mg/L萘，ρΗ7· 5)(含有50 μ g/mL氨苄青霉素)平板上， 37°C培养24-48h，筛选生长良好的菌落。利用逐步序列测定方法对筛选获得的重组子全序列进行DNA测序。测序的引物分 别为Pnahl :5，-GATGTTTGATGTTATGGAGCAG-3，Pnah2 :5’ -AGCAGTTCTGCAGGGACATGTAC-3，Pnah3 :5， -GACTATGGATTTGAAATCTAC-3，Pnah4 :5，-CTATCAAGATAGAAGGTGATGAG-3，Pnah5 :5， -CATGGTCAATGAAGGCCGGAGGT-3，测序结果表明重组子全序列为3682bp(SEQ ID No 1)。实施例5不动杆菌中萘双加氧酶系统基因的合成以基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)将不动杆菌中萘双加 氧酶系统(SEQ ID No 1)克隆。设计的引物如下1. EMPII-I Tm = 54,60merGTG，CCA，CCT，GTA，ATT，ACC，CGC，TAT，CCA，CTA，CTT，TAA，AAA, GTG，AGA，AGA， CAA，TGA，ACC，AGA2. EMPI1-2 :Tm = 54,60merTGT, TCC, AAT, TCT, TGC, GGA, CTC, TGA, TCG, GGG, TCG, TCT, CCG, TCT, GGT, TCA, TTG, TCT, TCT, CAC3. EMPI1-3 :Tm = 54,60merGAG, TCC，GCA，AGA，ATT，GGA，ACA，CCA，GGG，AGA，TCG，AGA，CGC，TCT，TCG，ATG， AGC，AGG，CTG，GAC4. EMPII-4 :Tm = 54,60merGGT，ACA，GAT，CCT，CAT, CGG，TAT，GAA，TGC，GCG，GAT，CGA，TGC，GTC，CAG，CCT， GCT，CAT, CGA，AGA5. EMPI1-5 :Tm = 54,60merATA, CCG，ATG，AGG，ATC，TGT，ACC，AGC，TCG，AAC，TGG，AGC，GTG，TGT，TCG，CTC， GGT, CCT, GGC, TCC6. EMP11-6 :Tm = 54,60merATC，GAC，CTG，GTT，TCC，GAA，TGT，GCG，TCT，CCT，GTC，CTA，ACA，GGA，GCC，AGG， ACC，GAG，CGA，ACA7. EMPI1-7 :Tm = 54,60merACA，TTC，GGA，AAC，CAG，GTC，GAT，ACT, TCA，CGA，CCT，ACA，TGG，GTG，ACG，ATC， CTG, TCG, TGG, TCG
8. EMPI1-8 :Tm = 54,60merGGT，TCG，GGA，AGA，CGG，CGA，TCC，TGG，CGT，CTT，TCT，GTC，TCA，CGA，CCA，CGA， CAG，GAT，CGT，CAC9. EMPI1-9 :Tm = 54,60merGGA，TCG，CCG，TCT，TCC，CGA，ACC，AGT，GCC，GCC，ATC，GTG，GCA，TGC，GGA，TCT， GCC, GTT, CGG, ATC10. EMPII-10 :Tm = 54,60merACC，CGT，GGT，CAC，TAC，AAG，TAA，ATG，CCT，TCG，CGT，TTC，CAG，GAT，CCG，AAC， GGC，AGA，TCC，GCA11. EMPII-Il :Tm = 54,60merTTA，CTT，GTA，GTG，ACC，ACG，GGT，GGG，CGT，ACG，ACA，CTG，CTG，GCA，ACC，TTA， TCA，AGG，TGC，CTT12. EMPl 1-12 :Tm = 54,60merATT，CCT，TCT，TGT，CGA，AGC，ATG，CGA，AGG，ATT，CGG，CCT，CGT，AAG，GCA，CCT， TGA, TAA, GGT, TGC13. EMPII-13 :Tm = 54,60merCAT, GCT, TCG, ACA, AGA, AGG, AAT, GGA, GTC, CAC, TGA, AGG, CTC, GAG, TGG, AGA, CCT，ACA，AGG，GTC14. ΕΜΡΙΙ-14 :Tm = 54，60merCAA, GGT, CGA, TGG, CGT, TCT, CGT, CCC, AGT, TGG, CAA, AGA, TCA, GAC, CCT, TGT, AGG，TCT，CCA，CTC15. ΕΜΡΙΙ-15 :Tm = 54，60merACG，AGA，ACG，CCA，TCG，ACC，TTG，ACA，CAT, ACC，TCG，GCG，AGG，CGA，AGT，TCT， ACA，TGG，ACC，ACA16. EMPII-16 :Tm = 54,60merCTG，GAA，TGA，CCT，CAG，TGC，CTG，GCT，CAG，TAC，GGT，CGA，GCA，TGT，GGT，CCA， TGT，AGA，ACT, TCG17. EMPII-17 :Tm = 54,60merCAG，GCA，CTG，AGG，TCA，TTC，CAG，GCA，TCC，AGA，AGT，GGG，TTA，CTC，CCT，GTA， CCT，GGA，AGT，TCG18. EMPI1-18 :Tm = 54,60merTCC，CGG，CAT, GGT，ACA，TGT，CCC，TGC，AGA，ACT, GCT，CTG，CTG，CGA，ACT, TCC， AGG，TAC，AGG，GAG19. EMPI1-19 :Tm = 54,60merGGG，ACA，TGT，ACC，ATG，CCG，GGA，CTA，CAG，CAC，ACT, TCT，CAG，GCA，TCA，TCG， CTG，GTC，AGC，CAG20. EMPI1-20 :Tm = 54,60merCGA，AGT，TCG，GCG，GTG，CGA，GAT，CAG，CCA，ACT, CGA，GCT，CTT，CTG，GCT，GAC， CAG，CGA，TGA，TGC
21. EMPII-21 :Tm = 54,60merATC，TCG，CAC，CGC， CGA，ACT, TCG，GCA，AGC，AGT，ACC，GCG，CAT, CAT, GGG，GTG， GTC，ACG，GAA，GTG22. EMPI1-22 :Tm = 54,60merTCA，TGG，CGA，GCA，TCA，TCT，TGC，GGT，CGC，CGA，TAG, AGA，AGC，CAC，TTC，CGT， GAC，CAC，CCC，ATG23. EMPI1-23 :Tm = 54,60merGCA，AGA，TGA，TGC，TCG，CCA，TGA，TGG，GAC，CGA，AAG，TCA，CCA，GCT，ACT, TGA， CCG，AAG，GCC，GTG24. EMPI1-24 :Tm = 54,60merGCT，CGA，TAC，TGC，CCA，GAC，GCT，CTG，CCG，CCG，TTT，CCG，CCG，CAC，GGC，CTT， CGG，TCA，AGT，AGC25. EMPI1-25 :Tm = 54,60merAGC，GTC，TGG，GCA，GTA，TCG，AGC，GCG，GCA，CGC，AAA, ACA，TGC，TTC，AGC，ACA， TCA, CTG, TCT, TGC26. EMPI1-26 :Tm = 54,60merTTC，GCA，TCG，TGT，TGA，CAC，CTG，GCA，GGA，AGA，AAG，ACG，TAG, GCA，AGA，CAG， TGA, TGT, GCT, GAA27. EMPI1-27 :Tm = 54,60merCAG，GTG，TCA，ACA，CGA，TGC，GAA，CAT, GGC，ATC，CAC，GCG，GGC，CGA，AGG，AGG， TCG, AAG, TGT, GGG28. EMPI1-28 :Tm = 54,60merTGA，TGT，CGG，CTG，GAG, CAT, CCG，TAT，GAC，TGA，CTG，TGA，ATG，CCC，ACA，CTT， CGA, CCT, CCT, TCG29. EMPI1-29 :Tm = 54,60merCGG，ATG，CTC，CAG，CCG，ACA，TCA，AGG，AGG，AGT，TCC，GTC，GTC，AGA，CAC，TAC， GTA，CCT，CCT，CTG30. EMPI1-30 :Tm = 54,60merCCC，AGG，TCT，CGC，CGT，GAT，CCT，GCT，CGA，GTA，CAC，GAA，CGG，CAG，AGG，AGG， TAC，GTA，GTG，TCT31. EMPII-31 :Tm = 54,60merAGG，ATC，ACG，GCG，AGA，CCT，GGG，TCG，AGA，TCC，AGC，ATT，TCC，TGC，GAG, GTC， ATC，AGG，CAC，GTA32. EMPI1-32 :Tm = 54,60merCCC，TTT，GCC，CCA，TCC，TCA，TCT，CAG，CGT，TGA，ATC，GAC，GGG，TAC，GTG，CCT， GAT，GAC，CTC，GCA33. EMPI1-33 :Tm = 54,60merAGA，TGA，GGA，TGG，GGC，AAA, GGG，TTC，ACA，CCG，AAC，CAG，TTC，ACC，CTG，GTC， GTA，CAT, CCA, ACA
34. EMPI1-34 :Tm = 54,60mer
GTG，GAG, AGA，GTC，CAC，GAG, CAG，CTT，CTT，CGC，TGT，ACA，CGT，TGT，TGG，ATG， TAC，GAC，CAG，GGT35. EMPI1-35 :Tm = 54,60merCTG，CTC，GTG，GAC，TCT，CTC，CAC，ATG，GGC，CGA，AAA, TCA，TCA，CCT，CGC，CAG， ACT, GGG，AAG，CAT36. EMPI1-36 :Tm = 54,60merGTT，TCC，CTA，GCT，GTC，GTT，AGG，TTT，AAG，GCG，TCG，CCT，TGA，ATG，CTT，CCC， AGT, CTG, GCG, AGG37. EMPI1-37 :Tm = 54,60merCCT，AAC，GAC，AGC，TAG, GGA，AAC，ATC，GTG，GCA，CCA，GTT，AGA，ATA，CGC，ATT， TGA，TTC，ATA，ATT38. EMPI1-38 :Tm = 54,60merCGT，GTA，GAT，TTC，AAA, TCC，ATA，GTC，CAC，CGC，ATC，CAA，TTA，AAT，TAT，GAA， TCA，AAT，GCG，TAT39. EMPI1-39 :Tm = 54,60merTAT，GGA，TTT，GAA，ATC，TAC，ACG，GCC，TGA，TTA，CGA，TTT，TAA，AAA, GGA，GTG， ACC，ATG，ATC，GAC40. EMPI1-40 :Tm = 54,60merTGC，AGG，CTT，GCG，AAC，GAA，GAG, GTC，TGG，TCT，GTC，GAC，TGA，GTC，GAT，CAT, GGT, CAC, TCC, TTT41. EMPII-41 :Tm = 54,60merCTC, TTC, GTT, CGC, AAG, CCT, GCA, CCG, GTA, CCA, CTT, CAA, CTG, CAA, AAT, CAA, ATT，GGG，CAG，TGC42. EMPI1-42 :Tm = 54,60merGAA, GCG, GCG, ATA, ATT, GAG, AAG, GTT, AGC, TTC, CCA, GTA, GTA, GCA, CTG, CCC, AAT，TTG，ATT，TTG43. EMPI1-43 :Tm = 54,60merCTT, CTC, AAT, TAT, CGC, CGC, TTC, GAT, GAA, TGC, TTC, GCA, CTA, TTT, GCC, AAG, GAC，ATC，CAC，TAC44. EMPI1-44 :Tm = 54,60merTGA，ATG，ACG，CAA，GAT，TCC，TGT，GCT，GCG，GAG, AGG，GAT，GAA，GTA，GTG，GAT， GTC，CTT，GGC，AAA45. EMPI1-45 :Tm = 54,60merACA，GGA，ATC，TTG，CGT，CAT, TCA，CGC，CTC，GAA，TAT，TCG，GCC，TCG，CGA，GAT， TAT，CCA，CAT, CTC46. EMPI1-46 :Tm = 54,60merCTT，ACG，CGG，ACG，TCC，TTT，CAT, CAT, TGT，GGC，GTG，ATC，ATC，GAG, ATG，TGG， ATA，ATC，TCG，CGA
47. EMPI1-47 :Tm = 54,60merATG，AAA, GGA，CGT，CCG，CGT，AAG，ACT, ACT, CCT，GAC，GTA，AGT，CGC，TCC，GAG, ATT，CCT，GCG，TCA48. EMPI1-48 :Tm = 54,60merGGG，AAT，GAT，GAT，GAC，ATT，GCG，CAC，AGT，ATG，TGT，TGT，TGT，TGA，CGC，AGG， AAT, CTC, GGA, GCG49. EMPI1-49 :Tm = 54,60mer CGC，AAT，GTC，ATC，ATC，ATT，CCC，ACA，GCA，GTA，CAA，GGA，GAA，AAC，GAA，ATC， TCC, AGG, ACC, TTC50. EMPI1-50 :Tm = 54,60merGAT，ATG，AGG，TTG，TCC，TTC，CGA，GCC，ATT，GCG，GTA，CAC，GAT，GAA，GGT，CCT， GGA，GAT，TTC，GTT51. EMPII-51 :Tm = 54,60merTCG，GAA，GGA，CAA，CCT，CAT, ATC，TGT，GCT，GGA，GAG, CGT，CGC，GAC，AGA，TTG， CGT，CGT，ACC，AAG52. EMPI1-52 :Tm = 54,60merCAG，GAT，TGT，CCG，ATT，GAC，TAT，CTC，GCA，TCC，AGC，TTG，ACC，CTT，GGT，ACG， ACG，CAA，TCT，GTC53. EMPI1-53 :Tm = 54,60merATA，GTC，AAT，CGG，ACA，ATC，CTG，CTG，GAC，CAA，AGC，ACC，ATC，CTA，GGC，AAT， CAC，CTC，AGT，TGC54. EMPI1-54 :Tm = 54,60merGCA，GCA，TAT，ACG，TCC，AGG，TCA，TGA，CAT, CTC，CTA，GAA，GTA，GCA，ACT, GAG, GTG，ATT，GCC，TAG55. EMPI1-55 :Tm = 54,60merTGA，CCT，GGA，CGT，ATA，TGC，TGC，GGC，AAA, GGG，ATT，TGC，CAC，CTG，GTG，AAA, TGC，AAC，GCT，ATG56. EMPI1-56 :Tm = 54,60merCGT，CGA，CGT，TAC，AGA，CCA，TCA，CGG，GTT，CTG，ATC，CAC，CGT，CAT, AGC，GTT， GCA, TTT, CAC, CAG57. EMPI1-57 :Tm = 54,60merTGA，TGG，TCT，GTA，ACG，TCG，ACG，GTG，AGT，TTT，CCG，CAG，TTC，AGG，ACA，CCT， GCA, CGC, ACG, GGG58. EMPI1-58 :Tm = 54,60merCGA，CAT, CAC，CAT, CAA，GGT，ATC，CCT，CTG，GTA，GTG，CCC，AAT，CCC，CGT，GCG， TGC，AGG，TGT，CCT59. EMPI1-59 :Tm = 54,60merGAT，ACC，TTG，ATG，GTG，ATG，TCG，TCG，AGT，GTA，CGT，TGC，ACT, TCG，GCA，AGT， TCT，GTG，TGC，GAA
60. EMPI1-60 :Tm = 54,60merTGA，TAG, GTT，TAC，ATG，CAG，GCA，ACG，CTT，TCA，CTT，TCG，CAG，TTC，GCA，CAC， AGA，ACT, TGC，CGA61. EMP11-61 :Tm = 54,60merTGC, CTG, CAT, GTA, AAC, CTA, TCA, AGG, TCT, ATC, CTA, TCA, AGA, TAG, AAG, GTG, ATG, AGG, TAC, ACG62. EMPI1-62 :Tm = 54,60merTGG, TTT, GCC, ATC, ATT, TGA, GTT, CCC, CAC, TGT, CAG, GAT, CAA, CGT, GTA, CCT, CAT, CAC，CTT，CTA63. EMPI1-63 :Tm = 54,60merAAC, TCA, AAT, GAT, GGC, AAA, CCA, GGT, AGC, GAT, GAT, CTG, TGA, TGG, GGT, AGC, GGG，CTT，TAC，GAC64. EMPI1-64 :Tm = 54,60merAAT, CGC, CCA, TCT, TAT, CCC, TCG, GCG, CGT, AGG, GCC, TGG, GCA, GTC, GTA, AAG, CCC，GCT，ACC，CCA65. EMPI1-65 :Tm = 54,60merCGA, GGG, ATA, AGA, TGG, GCG, ATT, CTT, CCT, GAT, GGG, TGA, TGA, GCA, TCA, ACT, GCC，GTA，GGA，GCG66. EMPI1-66 :Tm = 54,60merTCC，AAG，CTC，CCA，TCC，GGG，ACG，GCC，TTT，GAG, AAC，GAG, GGG，CGC，TCC，TAC， GGC，AGT，TGA，TGC67. EMPI1-67 :Tm = 54,60merCGT, CCC, GGA, TGG, GAG, CTT, GGA, GCA, CCC, TCC, AAG, CCT, CGC, CGA, CGC, CGA, GTG，CTA，GAG, GGA68. EMPI1-68 :Tm = 54,60merTCG，GTA，ACA，TCA，GAA，CCT，GTG，AGC，ATC，TCG，ATG，TTG，GGT，TCC，CTC，TAG, CAC，TCG，GCG，TCG69. EMPI1-69 :Tm = 54,60merCAC，AGG，TTC，TGA，TGT，TAC，CGA，GCT，CGA，CAC，GCA，CAA，AAA, CAT, GGT，CAC， TTT，GAA，AGA，AGG70. EMPI1-70 :Tm = 54,60merCCC，GTA，GCC，ATT，ACC，ATT，GCC，TCC，GCA，GAA，ATA，GTC，CTC，CCT，TCT，TTC， AAA, GTG，ACC，ATG71. EMP11-71 :Tm = 54,60merGGC，AAT，GGT，AAT，GGC，TAC，GGG，CAG，TGG，AGG，CCG，GAT，TTT，TTC，TTT，GCC， GGG，GAG, TCA，TTT72. EMPI1-72 :Tm = 54,60merTGG，ACA，TCC， GCA，TTA，GTG，CGA，AAC，GTG，ACC，ACT, CCT，GGG，AAA, TGA，CTC， CCC，GGC，AAA, GAA
73. EMPI1-73 :Tm = 54,60merTCG，CAC，TAA，TGC，GGA，TGT，CCA，TTT，CTT，ACG，GGA，TAG, CTG，AAC，TCC，GAA， AAC，ACG，GTT，CCT74. EMPI1-74 :Tm = 54,60merGTT，GCA，ACG，TCA，CAG，CCG，ATG，AAC，CCA，GCG，CTT，ACC，ATA，AGG，AAC，CGT， GTT，TTC，GGA，GTT75. EMPI1-75 :Tm = 54,60mer
CAT, CGG，CTG，TGA，CGT，TGC，AAC，CAC，TGC，CCG，TAA，CCT，CGG，TCT，TTC，AGT， CGC, GAA, CCT, TGA76. EMPI1-76 :Tm = 54,60merCGC，CGC，CCA，AGG，ACT, CGA，ACC，AAA, AGG，TCA，TCG，CCG，GCC，TCA，AGG，TTC， GCG，ACT, GAA，AGA77. EMPI1-77 :Tm = 54,60merGGT，TCG，AGT，CCT，TGG，GCG，GCG，TAT，TGG，CGC，TGG，GCT，ACG，TGG，GTT，CTT， TAC，GGA，CCA，AGG78. EMPI1-78 :Tm = 54,60merGAT，AAA, CGT，GAG, ACG，CCT，GTA，TTC，AGA，TCG，ACG，TGA，ACA，CCT，TGG，TCC， GTA，AAG，AAC，CCA79. EMPI1-79 :Tm = 54,60merTAC，AGG，CGT，CTC，ACG，TTT，ATC，AGG，GGA，GGG，TCA，GCT，GGA，AAA, AGT，CAT, GGT，CAA，TGA，AGG80. EMPI1-80 :Tm = 54,60merCCC，ACG，CAA，ATG，AGG，GCG，TTA，CCA，GGA，ATA，AAC，CTC，CGG，CCT，TCA，TTG， ACC，ATG，ACT, TTT81. EMP11-81 :Tm = 54,60merTAA，CGC，CCT，CAT, TTG，CGT，GGG，GGC，AGA，CCC，AGC，GGA，CCA，CCT，GGC，ACG， CCA, TGC, CGG, TTC82. EMPI1-82 :Tm = 54,60merGCG，CCA，CTT，TGG，TCA，ACC，ACA，ACC，CCC，CGA，TCC，CAT, TCG，GAA，CCG，GCA， TGG, CGT, GCC, AGG83. EMPI1-83 :Tm = 54,60merTGT，GGT，TGA，CCA，AAG，TGG，CGC，CAC，CTC，GGC，AAA, AGG，CGT，ATT，CGC，GGT， CGG，GGA，TGT，GGC84. EMPI1-84 :Tm = 54,60merTCA，AGG，GAG, CGC，TTA，CCC，CCA，GAT，TGG，AGG，GGC，CAG，GTC，GCC，ACA，TCC， CCG，ACC，GCG，AAT85. EMPI1-85 :Tm = 54,60merTGG，GGG，TAA，GCG，CTC，CCT，TGA，AAG，TTA，TAT，TAA，AGC，TCA，ACG，GCA，GGC， CAC，TGC，GGT，CGC
86. EMPI1-86 :Tm = 54,60merAAT，TGG，GGT，GCT，GAT，ACT, TCT，TTC，CCC，AGG，ATA，GCA，TTA，GCG，ACC，GCA， GTG, GCC, TGC, CGT87. EMPI1-87 :Tm = 54,60merAGA，AGT，ATC，AGC，ACC，CCA，ATT，GCC，CGT，TTC，ATG，TAC，AGA，CAT, AGC，AGG， CCA，TCG，GAT，TCA88. EMPI1-88 :Tm = 54,60merAAT，ACA，TAT，TCC，CCG，GGT，CCT，TCA，ATT，TCA，CCC，TCC，ACT, TGA，ATC，CGA， TGG，CCT，GCT，ATG89. EMPI1-89 :Tm = 54,60merAGG，ACC，CGG，GGA，ATA，TGT，ATT，GCG，GGG，TAC，TTT，CGG，GAT，TGG，CCC，TGG， TTT，ATT，CTT，TCG90. EMPI1-90 :Tm = 54,60merTCC，ACG，GCT，ACA，ACG，GCC，TGC，ATT，CGT，CCT，TCC，AGT，AGA，CGA，AAG，AAT， AAA, CCA，GGG，CCA91. EMP11-91 :Tm = 54,60merGCA，GGC，CGT，TGT，AGC，CGT，GGA，CGC，CCC，TCG，TGA，TTT，GGC，CCT，CGC，GAA， ACG，ATT，GGT，CGA92. EMPI1-92 :Tm = 54,60merACC，TCT，GCG，TGC，TTC，TCC，GGG，TCA，ATT，ATC，ACG，TGG，GCC，TCG，ACC，AAT， CGT，TTC，GCG，AGG93. EMPI1-93 :Tm = 54,60merCCC，GGA，GAA，GCA，CGC，AGA，GGT，TTC，AAA, AAA, CAT, CCG，AGA，CAT, GGT，CCG， CGC, CAA, CGA, TGG94. EMPI1-94 :Tm = 54，55merTGA，TCT，ACT, TGC，TCT，TTA，AGT，TCA，TTT，CTG，CTT，TCC，ATC，GTT，GGC，GCG， GAC，CAT, G利用PCR进行萘双加氧酶全长扩增，在100 μ 1反应体系中，ΕΜΡΙΙ-2-ΕΜΡΙΙ-93共 92个扩增引物的添加量为2ng，2个外侧引物EMPII-I和EMPII-161添加量为30ng。扩增 条件依次为94°C预热Imin ；94°C 30秒，50°C 30秒，72°C IOmin,共25个循环。扩增所使用 的Taq DNA聚合酶为KODFX taq酶(Toyobo公司，日本)。PCR结束后，用0. 8% (w/v)琼脂糖胶回收，取10 μ 1直接与Τ/Α克隆载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4°C连接过夜。之后高效转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，获 得阳性克隆。实施例6萘双加氧酶系统工程菌种构建以 PNap 1:5，-ATGAACCAGACGGAGACGACCCCGATCAGA-3，和 PNap2 5，-TCTTTAAGTTCAT TTCTGCTTTCCATCG-3’为扩增引物对萘双加氧酶系统相关的基因进行PCR扩增。使用KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，扩增条件依次为-MV 30秒，68°C 30秒，72°C 600秒，扩增30 个循环。加入2单位rtaq酶(大连宝生物工程公司)，在72°C延伸30分钟。PCR结束后，1% (w/v)琼脂糖凝胶回收，获得长度为3620bp的萘双加氧酶基因序列。萘双加氧酶基因转入原核生物细胞中一种方式为，将SEQ ID No 1序列直接与表 达载体pBAD/TOPO ThioFusion (Invitrogen)相连，4°C连接2小时。然后将该载体转化感 受态大肠杆菌TOPlO (Invitrogen)。将菌液涂布于含有50 μ g/mL氨苄青霉素的以萘为碳源 的M9固体培养基上，培养后挑取生长良好的菌落。
实施例7萘双加氧酶系统在大肠杆菌中表达对多环芳烃菲的降解挑取实施例6中生长良好的大肠杆菌菌落于20ml LB液体培养基(5g/L酵母提取 物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，pH7. 5)中，37°C振荡培养12小时。加入20 μ 1 100mg/mL 菲后继续培养168小时。以5，OOOg离心lOmin，取上清液分析菲的降解。取5ml上述制备的样品于25ml玻璃离心管中，加入2g无水硫酸钠，充分混勻；力口 入IOml 二氯甲烷，盖紧后超声萃取lh，离心；以5000r/min离心lOmin，取下层萃取液，重复 三次合并二氯甲烷萃取液，用旋转蒸发仪浓缩至干用乙腈定容至2ml。过0. 22 μ m孔径滤膜 后，HPLC分析。图2可以看出，将含有萘双加氧酶系统的大肠杆菌中接种到含有菲的培养基中， 168小时后，菲的浓度由原来的200 μ g/mL降解为29 μ g/mL，培养液中的浓度仅为原来的 14. 5%。序列表<110>上海市农业科学院<120>不动杆菌萘双加氧酶系统及其应用<130>0911<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>SEQ ID No 1<211>3682<212>DNA<213>萘双加氧酶系统<400>1gtgccacctg taattacccg ctatccacta ctttaaaaag tgagaagaca atgaaccaga 60cggagacgac cccgatcaga gtccgcaaga attggaacac cagggagatc gagacgctct 120tcgatgagca ggctggacgc atcgatccgc gcattcatac cgatgaggat ctgtaccagc 180tcgaactgga gcgtgtgttc gctcggtcct ggctcctgtt aggacaggag acgcacattc 240ggaaaccagg tcgatacttc acgacctaca tgggtgacga tcctgtcgtg gtcgtgagac 300agaaagacgc caggatcgcc gtcttcccga accagtgccg ccatcgtggc atgcggatct 360gccgttcgga tcctggaaac gcgaaggcat ttacttgtag tgaccacggg tgggcgtacg 420acactgctgg caaccttatc aaggtgcctt acgaggccga atccttcgca tgcttcgaca 480agaaggaatg gagtccactg aaggctcgag tggagaccta caagggtctg atctttgcca 540actgggacga gaacgccatc gaccttgaca catacctcgg cgaggcgaag ttctacatgg 600accacatgct cgaccgtact gagccaggca ctgaggtcat tccaggcatc cagaagtggg 660ttactccctg tacctggaag ttcgcagcag agcagttctg cagggacatg taccatgccg 720
ggactacagcacacttctca ggcatcatcg ctggtcagcc agaagagctc gagttggctg780atctcgcaccgccgaacttc ggcaagcagt accgcgcatc atggggtggt cacggaagtg840gcttctctatcggcgaccgc aagatgatgc tcgccatgat gggaccgaaa gtcaccagct900acttgaccga aggccgtgcg gcggaaacgg cggcagagcg tctgggcagt atcgagcgcg960gcacgcaaaa catgcttcag cacatcactg tcttgcctac gtctttcttc ctgccaggtg1020tcaacacgatgcgaacatgg catccacgcg ggccgaagga ggtcgaagtg tgggcattca1080cagtcagtca tacggatgct ccagccgaca tcaaggagga gttccgtcgt cagacactac1140gtacctcctctgccgttcgt gtactcgagc aggatcacgg cgagacctgg gtcgagatcc1200agcatttcctgcgaggtcat caggcacgta cccgtcgatt caacgctgag atgaggatgg1260ggcaaagggttcacaccgaa ccagttcacc ctggtcgtac atccaacaac gtgtacagcg1320aagaagctgctcgtggactc tctccacatg ggccgaaaat catcacctcg ccagactggg1380aagcattcaaggcgacgcct taaacctaac gacagctagg gaaacatcgt ggcaccagtt1440agaatacgcatttgattcat aatttaattg gatgcggtgg actatggatt tgaaatctac1500acggcctgattacgatttta aaaaggagtg accatgatcg actcagtcga cagaccagac1560ctcttcgttcgcaagcctgc accggtacca cttcaactgc aaaatcaaat tgggcagtgc1620tactactgggaagctaacct tctcaattat cgccgcttcg atgaatgctt cgcactattt1680gccaaggacatccactactt catccctctc cgcagcacag gaatcttgcg tcattcacgc1740ctcgaatattcggcctcgcg agattatcca catctcgatg atcacgccac aatgatgaaa1800ggacgtccgcgtaagactac tcctgacgta agtcgctccg agattcctgc gtcaacaaca1860acacatactgtgcgcaatgt catcatcatt cccacagcag tacaaggaga aaacgaaatc1920tccaggaccttcatcgtgta ccgcaatggc tcggaaggac aacctcatat ctgtgctgga1980gagcgtcgcgacagattgcg tcgtaccaag ggtcaagctg gatgcgagat agtcaatcgg2040acaatcctgctggaccaaag caccatccta ggcaatcacc tcagttgcta cttctaggag2100atgtcatgacctggacgtat atgctgcggc aaagggattt gccacctggt gaaatgcaac2160gctatgacggtggatcagaa cccgtgatgg tctgtaacgt cgacggtgag ttttccgcag2220ttcaggacacctgcacgcac ggggattggg cactaccaga gggatacctt gatggtgatg2280tcgtcgagtgtacgttgcac ttcggcaagt tctgtgtgcg aactgcgaaa gtgaaagcgt2340tgcctgcatgtaaacctatc aaggtctatc ctatcaagat agaaggtgat gaggtacacg2400ttgatcctgacagtggggaa ctcaaatgat ggcaaaccag gtagcgatga tctgtgatgg2460ggtagcgggctttacgactg cccaggccct acgcgccgag ggataagatg ggcgattctt2520cctgatgggtgatgagcatc aactgccgta ggagcgcccc tcgttctcaa aggccgtccc2580ggatgggagcttggagcacc ctccaagcct cgccgacgcc gagtgctaga gggaacccaa2640catcgagatgctcacaggtt ctgatgttac cgagctcgac acgcacaaaa acatggtcac2700tttgaaagaagggaggacta tttctgcgga ggcaatggta atggctacgg gcagtggagg2760ccggattttttctttgccgg ggagtcattt cccaggagtg gtcacgtttc gcactaatgc2820ggatgtccatttcttacggg atagctgaac tccgaaaaca cggttcctta tggtaagcgc2880tgggttcatcggctgtgacg ttgcaaccac tgcccgtaac ctcggtcttt cagtcgcgaa2940ccttgaggccggcgatgacc ttttggttcg agtccttggg cggcgtattg gcgctgggct3000acgtgggttctttacggacc aaggtgttca cgtcgatctg aatacaggcg tctcacgttt3060
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一种不动杆菌萘双加氧酶系统，序列为SEQ ID NO 1。
2.根据权利要求1所述的不动杆菌萘双加氧酶系统，在低分子量多环芳烃降解中的应 用，所述的低分子量多环芳烃是指3环或3环以下的多环芳烃化合物。
3.一种包含权利要求1所述的不动杆菌萘双加氧酶系统的表达载体。
4.根据权利要求3所述的不动杆菌萘双加氧酶系统的表达载体，其特征在于所述表达 载体为pBAD/TOPO载体，其通过与SEQ ID Nol序列直接连接形成。
5.根据权利要求4所述的含有不动杆菌萘双加氧酶系统的表达载体，在低分子量多环 芳烃降解中的应用，所述的低分子量多环芳烃是指3环或3环以下的多环芳烃化合物。
全文摘要
一种不动杆菌萘双加氧酶系统，全长3682bp。通过培养、提取总DNA和功能互补法克隆得到的萘双加氧酶系统的序列为SEQ ID No 1。该序列及其表达载体可应用于低分子量多环芳烃的降解。
文档编号A62D3/02GK101955951SQ200910055020
公开日2011年1月26日 申请日期2009年7月17日 优先权日2009年7月17日
发明者付晓燕, 姚泉洪, 孙广东, 彭日荷, 熊爱生, 田永生, 赵伟, 高峰 申请人:上海市农业科学院
技术领域：
本发明涉及一种用于降解低分子量多环芳烃的萘双加氧酶系统，尤其涉及一种能 降解低分子量多环芳烃的不动杆菌的萘双加氧酶系统，更具体的是涉及一种能降解萘和菲 双加氧酶系统及其在环境污染修复中的应用。
背景技术：
多环芳经(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是指分子中含有两个或 两个以上苯环的碳氢化合物，可分为芳香稠环和非芳香稠环型，环境污染研究中的多环芳 烃一般是指芳香稠环型，其中16种多环芳烃化合物已被美国环保局列入优先控制的污染 物黑名单。多环芳烃大多是石油、煤等化石燃料以及木材、天然气、有机高分子化合物、纸 张、作物秸秆、烟草等含碳氢化合物的物质经不完全燃烧或在还原性气氛中经热分解而生 成的，PAHs环数相对丰度可以反映来自热解或石油类污染，通常4环及4环以上PAHs主要 来源于化石燃料高温燃烧，而2环和3环PAHs则来源于石油类污染。一般而言2-3环的低 分子量PAHs具有显著的急性毒性，而某些高分子量的PAHs则具有潜在的致癌性，有很强的 致畸、致癌、致突变作用。随着煤、石油在工农业生产、交通运输以及生活中被广泛应用，由此而产生的多环 芳烃已成为世界各国共同关注的有机污染物，多环芳烃的积累已经越来越严重地威胁着人 类的健康。多环芳烃化合物(PAHs)由于水溶性差，辛醇_水分配系数高，常被吸附于土壤颗 粒上。因此，该类化合物易于从水中分配到生物体内、沉积层中，土壤就成为PAHs的主要载 体。多环芳烃在环境中不断积累，其半衰期少则2个月、多则几年。多环芳烃进入土壤后，由 土壤表面污染进一步导致下层土壤污染，甚至地下水污染(Environ Sci Technol. ,2004, 15,5878)。治理多环芳烃化合物(PAHs)污染主要有物理修复、化学修复和生物修复。同其 它有机污染物相比，多环芳烃化合物在土壤中比较稳定，利用促使其挥发和降解的物理化 学方法很难去除，国内外正在筛选高效的吸附剂及臭氧化降解途径(Water Res.，1998， 32,1231).。近年来，生物修复技术为PAHs的降解提供了新的途径，生物降解在污染物的 迁移转化直至最终消失的过程中占重要地位。许多细菌、真菌、藻类都有降解PAHs的能 力。在PAHs污染土壤中，经过自然驯化，存在大量的能降解多环芳烃的微生物。但是，由 于微生物种类不同以及多环芳烃较难在环境中降解，所以降解PAHs的途径就有较大的差 另O。研究表明，微生物一般通过2种方式对PAHs进行代谢(1)微生物在生长过程中以 PAHs作为唯一的碳源和能源。适合于土壤中低分子量的3环和3环以下的多环芳烃类化 合物。(2)微生物把PAHs与其他有机质共代谢(或共氧化)。由于来源于土壤中很少有 能直接降解4环及4环以上高分子量的多环芳烃的微生物，所以高分子量的多环芳烃的降 解要依赖共代谢作用和类似物。早在1964年，Davies和Evans在土壤中就分离到能够分 解萘的假单胞菌(Biochem. J.，1964，91，251)。近年来人们对降解多环芳烃的微生物进行了广泛的研究，常见微生物有红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝 杆菌(Mycobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、气单胞菌 属(Aeromonas)、拜叶林克氏菌属(Bei jernckia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、蓝细菌 (Cyanobacteria)、微球菌属(Micrococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)和弧菌属(Vibrio)等 (Biosci. Biotech. Biochem. 2003,67,225)。香港大学的梁佩芝等(生态科学，2003，22，97)研究了红树林厌氧环境对多环芳 烃的降解，指出了厌氧的硫酸盐还原菌在降解多环芳烃方面有其独特的生化优势，并确定 羰基化反应是开始的一个重要步骤。聂麦茜等(环境科学，2001，22，83)从焦化废水污染的污泥中分离出1株优势短 杆菌，该菌株对菲、蒽、芘降解IOh后，菲、蒽、芘浓度从起始40mg/L，分别降至15.2、19.8、 28. Omg/L, Fe3+对这3种多环芳烃的降解有明显的促进作用，在相同实验条件加Fe3+反应 IOh后，反应瓶中菲的浓度降至5. Omg/L,蒽降至9. 8mg/L,芘则降至15. 8mg/L。Dan等(Chemosphere，1999，38，1313)研究发现，好氧条件下萘存在时可使菲的降 解率提高5倍，芘提高2倍，同时发现菲存在时可抑制芘的降解，厌氧条件也有同样结果。 Michiei等(Microbio Ecol，2004，48，209)发现分枝杆菌菌株S65可利用芘、菲和荧蒽，苯 并蒽，当苯并芘或菲作为芘的共代谢底物时，可以提高芘的降解率。张志杰等(水处理技术，2003，29，276)研究了 1株芽孢杆菌对蒽、菲、芘在单基质 及混合基质条件下降解性能的研究，发现在单基质条件下，起初的82h内，该菌株对蒽的降 解转化效果最好，菲最差，反应进行到106h，各PAHs的浓度均接近于O ；在混合基质条件下， 菲的竞争代谢能力最强，芘最小。Robert等在生物反应器中使用白腐真菌处理受多环芳烃处理的土壤，36天后， 包括萘等低分子量的多环芳烃降解率为70%-100% (Environ SciTechnol.，1997，31， 2626)。Jee等用生物反应器修复河道底泥，在搅拌且曝气的条件下，多环芳烃的降解率达到 40% (Water Res.，1998，32，1231)。微生物修复的关键是筛选具有很强分解能力的优势菌。多环芳烃的降解取决于微 生物产生加氧酶的能力。多环芳烃的最初氧化，即苯环加氧是控制PAHs生物降解反应速度 的关键步骤。在过去20年的时间里，对好氧细菌降解多环芳烃的研究主要集中在假单胞 菌的萘降解途径的分析。同植物一样，假单胞菌也是通过羟基化作用分解萘，萘双加氧酶 (naphthalenedioxygenase ND0)系统参与萘的羟基化。目前对该酶的研究结果主要来自恶 臭假单胞菌Pseudomonas putida G7菌株，该菌中萘加氧酶系统含有三个组分铁硫黄素蛋 白还原酶NahAa ；铁氧还蛋白NahAb和加氧酶，加氧酶由大亚基NahAc和小亚基NahAd组成 四聚体，电子从NAD(P)H通过铁硫黄素蛋白还原酶和铁氧还蛋白向加氧酶传送，促进加氧 酶将两个氧原子加到萘的一个苯环上。对很多细菌中的NDO基因结构分析发现，它们多由 上述三个组份构成并且种间具有很高的同源性，说明萘双加氧酶系统普遍存在于自然界(J Bacteriol.，1992，174，7542)。不动杆菌(Acinetobacter)是一群不发酵糖类，氧化酶阴性的革兰阴性杆菌。绝 大多数的种与人的疾病有关。不动杆菌广泛存在于自然界，主要在水体和土壤中，易在潮湿 环境中生存，如浴盆、肥皂盒等处。该菌粘附力极强，易在各类医用材料上粘附，而可能成为 贮菌源。此外，本菌还存在于健康人皮肤(25%)、咽部(7% )，也存在于结膜、唾液、胃肠道及阴道分泌物中。有些研究发现在石油污染区存在不动杆菌，它们可以以菲为惟一碳源和 能源生长。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种降解萘和菲的萘双加氧酶系统，该操纵子源自于 不动杆菌属本发明的另一个目的在于提供一种含有萘双加氧酶系统的表达载体。本发明的又一个目的在于提供一种萘双加氧酶系统及其表达载体，该双加氧酶系 统与表达载体在低分子量多环芳烃降解中的应用。本发明的目的是通过如下技术方案实现的萘双加氧酶系统源自于不动杆菌属，由4个基因组成，其核苷酸序列为SEQ ID No 1所示，在其序列中51-1413核苷酸为双加氧酶α亚基基因；1534-2097核苷酸为双加氧酶 β亚基基因；2164-2429核苷酸为铁氧还蛋白基因；2428-3661核苷酸为铁硫黄素蛋白还原
酶基因。SEQ ID No :1所示的萘双加氧酶系统的获取方法为先将野生菌在含有萘为碳源 的Μ9固体培养基中培养48小时，选择生长良好的菌落；再将选择出来的菌落置于LB液体 培养基中培养24小时以上；之后提取总DNA，采用功能互补法(Microbiology，2007，153， 787)克隆并得到萘双加氧酶系统的四个基因。一种SEQ ID No 1所示的萘双加氧酶系统的具体获取方法为菌种分离从上海化学工业基地取污泥，稀释10-100倍后涂布在以萘为碳源的M9固体培养 基上(15g/L 琼脂，12. 8g/L Na2HP04，3. Og/L KH2P04，0. 5g/L NaCl，0. 5g/L NH4C1,1 μ g/ml 维生素Bl (单独灭菌)，200mg/L萘，pH7. 5)，28°C培养48小时，挑取生长良好的菌株。总DNA提取将分离获得的细菌单株在IOml液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl, IOg/ L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7. 5)中培养24小时，菌体培养液离心5min，得到菌体沉淀。将这 些沉淀在-20°C下冷冻1小时，之后使用TE(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，pH 8.0)溶液清洗一 次。加入浓度为lOmg/mL溶菌酶(Sigma-Aldrich)的无菌水悬浮，在37°C下摇床培养lhr。 加入0. 5M EDTA, 10% (w/v) SDS和浓度为5M的NaCl轻轻振荡混勻。再加入浓度为20mg/ mL蛋白激KCTakara日本)，反应物在37°C下培养lhr。用与培养菌液液体体积相当(1倍 体积)的苯酚氯仿异戊醇(25 24 1)提取DNA。水相用与相当水相体积1/2(0. 5 倍体积)的氯仿异戊醇(24 1)萃取。振荡混勻后离心5min。水相中加入与水相体积 相当(1倍体积)的异戊醇。振荡混勻后离心15min。取沉淀，用70% (ν/ν)酒精冲洗DNA， 干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮。所得总DNA储存于4°C下备用。萘双加氧酶系统获取用0. 02-0. 5u/μ L浓度限制性核酸内切酶Sau3A (大连宝生物工程公司)酶切 提取所得的细菌总DNA，时间20-60分钟，然后0.7% (w/v)琼脂糖凝胶电泳，切下长度为 3-5kb的DNA片段，用胶试剂盒(上海生物工程公司)回收。选择pG251(CN1338515NCBI) 作为表达载体，用限制性核酸内切酶BamHI(大连宝生物工程公司)酶切并进行胶回收。对酶切的载体质粒进行去磷酸化操作，以降低质粒自连，并对碱性磷酸酶进行失活操作后 (Sambrook分子克隆手册1989)，再与外源的DNA片段(即长度为3_5kb的细菌DNA片段) 连接。反应温度16°C，连接时间为10-12h。连接产物用正丁醇沉淀后，用70% (ν/ν)的乙 醇离心洗涤，最后用10μ 1的超纯水溶解，将连接物进行电击转化大肠杆菌DH5 α感受态细 胞，点击参数为电脉冲为2. 5 μ F，电压2. 5kV，电阻200 Ω，电击时间为4. 5. S。复苏后，将 菌液涂布于以萘为碳源的Μ9固体培养基(含有5(^8/!^氨苄青霉素)平板上，371培养 48h，筛选生长良好的菌落。萘双加氧酶系统工程菌种构建以 PNap 1:5，-ATGAACCAGACGGAGACGACCCCGATCAGA-3 ’ 和 PNap2 5 ’ -TCTTTAAGTTCAT TTCTGCTTTCCATCG-3’为扩增引物对萘双加氧酶系统相关的基因进行PCR扩增。使用KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，扩增条件依次为-MV 30秒，68°C 30秒，72°C 600秒，扩增30 个循环。加入2单位rtaq酶(大连宝生物工程公司)，在72°C延伸30分钟。PCR结束后， 1% (w/v)琼脂糖凝胶回收，获得长度为3682bp的SEQ ID No 1序列。SEQ ID No 1序列转入原核生物细胞中一种方式为，将SEQ ID No 1序列直接与表 达载体pBAD/TOPO ThioFusion (Invitrogen)相连，4°C连接2小时。然后将该载体转化感 受态大肠杆菌T0P10 (Invitrogen)。将菌液涂布于含有50 μ g/mL氨苄青霉素的以萘为碳源 的M9固体培养基上，培养后挑取生长良好的菌落。然后将挑取的菌落转入LB液体培养基中，37°C振荡培养12小时。加入菲至终浓 度100 μ g/mL,继续培养7天，培养液中加入二氯甲烷，在振荡摇床中摇至成乳状，以5000r/ min离心lOmin，取下层萃取液，样液过0. 22um微孔滤膜后进行HPLC分析，外标法定量。检 测细菌对多环芳烃的降解效果。本发明技术方案实现的有益效果多环芳烃是一类重要的环境污染有机物，大多数多环芳烃具有显著的毒性，某些 高分子量的多环芳烃则具有潜在的致癌性。随着工业化进程的加快，多环芳烃对环境的污 染显著提高。分离高效降解多环芳烃的菌株，提取总DNA和PCR扩增后得到的SEQ ID No 1的序列及其表达载体可以应用于环境中多环芳烃的降解。本发明所述的术语与其一般概念相同。所述的“核苷酸”和“引物”序列均为5’端至3’端。所述的“生物合成”指利用微生物、植物细胞或组织，以发酵或培养的方式合成目 标产物，如β-胡萝卜素。所述的“生物细胞”指微生物、植物细胞或组织。所述的“微生物”指原核微生物或真核微生物，原核微生物主要为细菌；真核微生 物为真菌或藻类，真菌主要指酵母菌。
图1为PCR扩增所得序列为SEQ ID No :1的萘双加氧酶系统电泳图，其中泳道1 为DNA分子量标记(Marker)；泳道2为从不动杆菌中扩增的萘双加氧酶系统；图2工程菌对多环芳烃菲的降解；A，加样前，B培养168小时后。菲相应的色谱峰 为 472nm。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案 而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理 解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范 围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛_奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨 姆布鲁克、E. F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科学出版社，1994)。该书及其后续出版版本是本 领域技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。实施例1菌种分离从上海化学工业基地取污泥，稀释10-100倍后涂布在以萘为碳源的M9固体培养 基上(15g/L 琼脂，12. 8g/L Na2HP04，3. Og/L KH2P04，0. 5g/L NaCl，0. 5g/L NH4C1,1 μ g/ml 维生素Bl (单独灭菌)，200mg/L萘，pH7. 5)，28°C培养48小时，挑取生长良好的菌株。该菌 落呈圆形，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，无色，革兰氏染色反应为阴性的菌株；进一步通 过显微镜筛选无鞭毛，无芽孢的杆状菌株。将获得的菌株稀释104后反复2次在LB固体平 板培养基上纯合。实施例2总DNA的提取将实施例1中分离获得的细菌单株在IOml LB液体培养基(5g/L酵母提取物，5g/ L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中培养16小时后，菌体培养液以6，OOOg速 度离心5min，得到菌体沉淀。这些沉淀先在_20°C下冷冻lhr，之后使用TE缓冲液(IOmM Tris-HCl，ImM EDTA，pH 8. 0)清洗一次，再于 20 μ 1 溶菌酶(Sigma-Aldrich)浓度为 IOmg/ mL的无菌水中悬浮，并于37°C摇床培养lhr。接着加入50 μ 1浓度为0. 5Μ EDTA, 50 μ 1浓度为10% (w/v) SDS和50 μ 1浓度为 5Μ的NaCl并轻轻振荡混勻后，再加入10 μ 1浓度为20mg/mL蛋白激酶K(Takara日本)，于 37°C下培养lhr。之后用与培养菌液液体体积相当(1倍体积)的苯酚氯仿异戊醇 (25 24 1，体积比)提取DNA。水相用与相当水相体积1/2 (0. 5倍体积)的氯仿异 戊醇(24 1，体积比)萃取。振荡混勻后离心5min。水相中加入与水相体积相当(1倍体 积)的异戊醇。振荡混勻后离心15min。取沉淀，用70% (ν/ν)酒精冲洗DNA，干燥，之后在 TE缓冲液中重悬浮。所得总DNA于-20 V下保存。实施例3不动杆菌菌株同源性分析以实施例2抽提的总DNA为模板，利用16s rRNA两端引物进行扩增。扩增的引物 为 16SR1 :5，CAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3，和 16SF :5，TACGGCTACCTTGTTACGACTTC3，。以 KOD Plus (Toyobo日本)为Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 120 秒，扩增30个循环。循环结束后，加入2个单位的rtaq酶(宝生物工程(大连)有限公 司)，72°C延伸300秒，扩增片段长1503bp(如下)。PCR结束后，(w/v)琼脂糖凝胶回 收，取10 μ 1直接与T/A克隆载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4°C连接过夜。
先将该载体转化入DH5 α感受态中。再用ABI Prism Big Dye的ΑΒΙ3700毛细管 自动化测序仪测序，测得的序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，得到 菌株与Acinetobacter属中的许多种菌的16s rRNA有99. 5%的同源性(NCBI)。菌株系统 发育地位上属于不动杆菌属(Acinetobacter)。1 cagagtttga tcctggctca gattgaacgc tggcggcagg cctaacacat gcaagtcgag61 cggatgagtg gagcttgctc catgattcag cggcggacgg gtgagtaatg cctaggaatc121tgcctggtagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcatacgtcctacggg
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1381tgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgctccagaagtagctagtctaacct
1441tcggggggacggttaccacggagtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtagcc
1501gta 实施例4不动杆菌中萘双加氧酶系统的获取 通过功能互补方法获取萘双加氧酶系统相关基因，具体方法如下用不同浓度 (0. 02-0. 5u/ μ L)限制性核酸内切酶Sau3A (大连宝生物工程公司)酶切实施例2提取所得 的不动杆菌总DNA，时间20-60分钟，然后0.7% (w/v)琼脂糖凝胶电泳，切下长度为3_5kb 的DNA片段，用胶试剂盒(上海生物工程公司)回收。选择pG251(CN1338515NCBI)作为表 达载体，用限制性核酸内切酶BamHI (大连宝生物工程公司)酶切并进行胶回收。对酶切的 载体质粒进行去磷酸化操作，以降低质粒自连，并对碱性磷酸酶进行失活操作后(Sambrook 分子克隆手册1989)，再与外源的DNA片段(即长度为3-5kb的不动杆菌DNA片段)连接。 连接前，将回收的部分酶解的细菌基因组DNA片段与pG251载体DNA，用琼脂糖凝胶电泳的方法估计浓度，确保连接反应中外源DNA的浓度至少是载体浓度3-5倍。反应温度16°C，连接时间为10_12h。连接产物用正丁醇沉淀后，用70% (ν/ν)的乙醇离心洗涤，最后用10μ 1 的超纯水溶解，将连接物进行电击转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，点击参数为电脉冲为 2. 5 μ F,电压2. 5kV，电阻200 Ω，电击时间为4. 5. S。复苏后，将菌液涂布于以萘为碳源的Μ9 固体培养基上(15g/L 琼脂，12. 8g/LNa2HP04，3. Og/L KH2P04，0. 5g/L NaCl，0. 5g/L NH4C1, 1 μ g/ml维生素Bl (单独灭菌)，200mg/L萘，ρΗ7· 5)(含有50 μ g/mL氨苄青霉素)平板上， 37°C培养24-48h，筛选生长良好的菌落。利用逐步序列测定方法对筛选获得的重组子全序列进行DNA测序。测序的引物分 别为Pnahl :5，-GATGTTTGATGTTATGGAGCAG-3，Pnah2 :5’ -AGCAGTTCTGCAGGGACATGTAC-3，Pnah3 :5， -GACTATGGATTTGAAATCTAC-3，Pnah4 :5，-CTATCAAGATAGAAGGTGATGAG-3，Pnah5 :5， -CATGGTCAATGAAGGCCGGAGGT-3，测序结果表明重组子全序列为3682bp(SEQ ID No 1)。实施例5不动杆菌中萘双加氧酶系统基因的合成以基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)将不动杆菌中萘双加 氧酶系统(SEQ ID No 1)克隆。设计的引物如下1. EMPII-I Tm = 54,60merGTG，CCA，CCT，GTA，ATT，ACC，CGC，TAT，CCA，CTA，CTT，TAA，AAA, GTG，AGA，AGA， CAA，TGA，ACC，AGA2. EMPI1-2 :Tm = 54,60merTGT, TCC, AAT, TCT, TGC, GGA, CTC, TGA, TCG, GGG, TCG, TCT, CCG, TCT, GGT, TCA, TTG, TCT, TCT, CAC3. EMPI1-3 :Tm = 54,60merGAG, TCC，GCA，AGA，ATT，GGA，ACA，CCA，GGG，AGA，TCG，AGA，CGC，TCT，TCG，ATG， AGC，AGG，CTG，GAC4. EMPII-4 :Tm = 54,60merGGT，ACA，GAT，CCT，CAT, CGG，TAT，GAA，TGC，GCG，GAT，CGA，TGC，GTC，CAG，CCT， GCT，CAT, CGA，AGA5. EMPI1-5 :Tm = 54,60merATA, CCG，ATG，AGG，ATC，TGT，ACC，AGC，TCG，AAC，TGG，AGC，GTG，TGT，TCG，CTC， GGT, CCT, GGC, TCC6. EMP11-6 :Tm = 54,60merATC，GAC，CTG，GTT，TCC，GAA，TGT，GCG，TCT，CCT，GTC，CTA，ACA，GGA，GCC，AGG， ACC，GAG，CGA，ACA7. EMPI1-7 :Tm = 54,60merACA，TTC，GGA，AAC，CAG，GTC，GAT，ACT, TCA，CGA，CCT，ACA，TGG，GTG，ACG，ATC， CTG, TCG, TGG, TCG
8. EMPI1-8 :Tm = 54,60merGGT，TCG，GGA，AGA，CGG，CGA，TCC，TGG，CGT，CTT，TCT，GTC，TCA，CGA，CCA，CGA， CAG，GAT，CGT，CAC9. EMPI1-9 :Tm = 54,60merGGA，TCG，CCG，TCT，TCC，CGA，ACC，AGT，GCC，GCC，ATC，GTG，GCA，TGC，GGA，TCT， GCC, GTT, CGG, ATC10. EMPII-10 :Tm = 54,60merACC，CGT，GGT，CAC，TAC，AAG，TAA，ATG，CCT，TCG，CGT，TTC，CAG，GAT，CCG，AAC， GGC，AGA，TCC，GCA11. EMPII-Il :Tm = 54,60merTTA，CTT，GTA，GTG，ACC，ACG，GGT，GGG，CGT，ACG，ACA，CTG，CTG，GCA，ACC，TTA， TCA，AGG，TGC，CTT12. EMPl 1-12 :Tm = 54,60merATT，CCT，TCT，TGT，CGA，AGC，ATG，CGA，AGG，ATT，CGG，CCT，CGT，AAG，GCA，CCT， TGA, TAA, GGT, TGC13. EMPII-13 :Tm = 54,60merCAT, GCT, TCG, ACA, AGA, AGG, AAT, GGA, GTC, CAC, TGA, AGG, CTC, GAG, TGG, AGA, CCT，ACA，AGG，GTC14. ΕΜΡΙΙ-14 :Tm = 54，60merCAA, GGT, CGA, TGG, CGT, TCT, CGT, CCC, AGT, TGG, CAA, AGA, TCA, GAC, CCT, TGT, AGG，TCT，CCA，CTC15. ΕΜΡΙΙ-15 :Tm = 54，60merACG，AGA，ACG，CCA，TCG，ACC，TTG，ACA，CAT, ACC，TCG，GCG，AGG，CGA，AGT，TCT， ACA，TGG，ACC，ACA16. EMPII-16 :Tm = 54,60merCTG，GAA，TGA，CCT，CAG，TGC，CTG，GCT，CAG，TAC，GGT，CGA，GCA，TGT，GGT，CCA， TGT，AGA，ACT, TCG17. EMPII-17 :Tm = 54,60merCAG，GCA，CTG，AGG，TCA，TTC，CAG，GCA，TCC，AGA，AGT，GGG，TTA，CTC，CCT，GTA， CCT，GGA，AGT，TCG18. EMPI1-18 :Tm = 54,60merTCC，CGG，CAT, GGT，ACA，TGT，CCC，TGC，AGA，ACT, GCT，CTG，CTG，CGA，ACT, TCC， AGG，TAC，AGG，GAG19. EMPI1-19 :Tm = 54,60merGGG，ACA，TGT，ACC，ATG，CCG，GGA，CTA，CAG，CAC，ACT, TCT，CAG，GCA，TCA，TCG， CTG，GTC，AGC，CAG20. EMPI1-20 :Tm = 54,60merCGA，AGT，TCG，GCG，GTG，CGA，GAT，CAG，CCA，ACT, CGA，GCT，CTT，CTG，GCT，GAC， CAG，CGA，TGA，TGC
21. EMPII-21 :Tm = 54,60merATC，TCG，CAC，CGC， CGA，ACT, TCG，GCA，AGC，AGT，ACC，GCG，CAT, CAT, GGG，GTG， GTC，ACG，GAA，GTG22. EMPI1-22 :Tm = 54,60merTCA，TGG，CGA，GCA，TCA，TCT，TGC，GGT，CGC，CGA，TAG, AGA，AGC，CAC，TTC，CGT， GAC，CAC，CCC，ATG23. EMPI1-23 :Tm = 54,60merGCA，AGA，TGA，TGC，TCG，CCA，TGA，TGG，GAC，CGA，AAG，TCA，CCA，GCT，ACT, TGA， CCG，AAG，GCC，GTG24. EMPI1-24 :Tm = 54,60merGCT，CGA，TAC，TGC，CCA，GAC，GCT，CTG，CCG，CCG，TTT，CCG，CCG，CAC，GGC，CTT， CGG，TCA，AGT，AGC25. EMPI1-25 :Tm = 54,60merAGC，GTC，TGG，GCA，GTA，TCG，AGC，GCG，GCA，CGC，AAA, ACA，TGC，TTC，AGC，ACA， TCA, CTG, TCT, TGC26. EMPI1-26 :Tm = 54,60merTTC，GCA，TCG，TGT，TGA，CAC，CTG，GCA，GGA，AGA，AAG，ACG，TAG, GCA，AGA，CAG， TGA, TGT, GCT, GAA27. EMPI1-27 :Tm = 54,60merCAG，GTG，TCA，ACA，CGA，TGC，GAA，CAT, GGC，ATC，CAC，GCG，GGC，CGA，AGG，AGG， TCG, AAG, TGT, GGG28. EMPI1-28 :Tm = 54,60merTGA，TGT，CGG，CTG，GAG, CAT, CCG，TAT，GAC，TGA，CTG，TGA，ATG，CCC，ACA，CTT， CGA, CCT, CCT, TCG29. EMPI1-29 :Tm = 54,60merCGG，ATG，CTC，CAG，CCG，ACA，TCA，AGG，AGG，AGT，TCC，GTC，GTC，AGA，CAC，TAC， GTA，CCT，CCT，CTG30. EMPI1-30 :Tm = 54,60merCCC，AGG，TCT，CGC，CGT，GAT，CCT，GCT，CGA，GTA，CAC，GAA，CGG，CAG，AGG，AGG， TAC，GTA，GTG，TCT31. EMPII-31 :Tm = 54,60merAGG，ATC，ACG，GCG，AGA，CCT，GGG，TCG，AGA，TCC，AGC，ATT，TCC，TGC，GAG, GTC， ATC，AGG，CAC，GTA32. EMPI1-32 :Tm = 54,60merCCC，TTT，GCC，CCA，TCC，TCA，TCT，CAG，CGT，TGA，ATC，GAC，GGG，TAC，GTG，CCT， GAT，GAC，CTC，GCA33. EMPI1-33 :Tm = 54,60merAGA，TGA，GGA，TGG，GGC，AAA, GGG，TTC，ACA，CCG，AAC，CAG，TTC，ACC，CTG，GTC， GTA，CAT, CCA, ACA
34. EMPI1-34 :Tm = 54,60mer
GTG，GAG, AGA，GTC，CAC，GAG, CAG，CTT，CTT，CGC，TGT，ACA，CGT，TGT，TGG，ATG， TAC，GAC，CAG，GGT35. EMPI1-35 :Tm = 54,60merCTG，CTC，GTG，GAC，TCT，CTC，CAC，ATG，GGC，CGA，AAA, TCA，TCA，CCT，CGC，CAG， ACT, GGG，AAG，CAT36. EMPI1-36 :Tm = 54,60merGTT，TCC，CTA，GCT，GTC，GTT，AGG，TTT，AAG，GCG，TCG，CCT，TGA，ATG，CTT，CCC， AGT, CTG, GCG, AGG37. EMPI1-37 :Tm = 54,60merCCT，AAC，GAC，AGC，TAG, GGA，AAC，ATC，GTG，GCA，CCA，GTT，AGA，ATA，CGC，ATT， TGA，TTC，ATA，ATT38. EMPI1-38 :Tm = 54,60merCGT，GTA，GAT，TTC，AAA, TCC，ATA，GTC，CAC，CGC，ATC，CAA，TTA，AAT，TAT，GAA， TCA，AAT，GCG，TAT39. EMPI1-39 :Tm = 54,60merTAT，GGA，TTT，GAA，ATC，TAC，ACG，GCC，TGA，TTA，CGA，TTT，TAA，AAA, GGA，GTG， ACC，ATG，ATC，GAC40. EMPI1-40 :Tm = 54,60merTGC，AGG，CTT，GCG，AAC，GAA，GAG, GTC，TGG，TCT，GTC，GAC，TGA，GTC，GAT，CAT, GGT, CAC, TCC, TTT41. EMPII-41 :Tm = 54,60merCTC, TTC, GTT, CGC, AAG, CCT, GCA, CCG, GTA, CCA, CTT, CAA, CTG, CAA, AAT, CAA, ATT，GGG，CAG，TGC42. EMPI1-42 :Tm = 54,60merGAA, GCG, GCG, ATA, ATT, GAG, AAG, GTT, AGC, TTC, CCA, GTA, GTA, GCA, CTG, CCC, AAT，TTG，ATT，TTG43. EMPI1-43 :Tm = 54,60merCTT, CTC, AAT, TAT, CGC, CGC, TTC, GAT, GAA, TGC, TTC, GCA, CTA, TTT, GCC, AAG, GAC，ATC，CAC，TAC44. EMPI1-44 :Tm = 54,60merTGA，ATG，ACG，CAA，GAT，TCC，TGT，GCT，GCG，GAG, AGG，GAT，GAA，GTA，GTG，GAT， GTC，CTT，GGC，AAA45. EMPI1-45 :Tm = 54,60merACA，GGA，ATC，TTG，CGT，CAT, TCA，CGC，CTC，GAA，TAT，TCG，GCC，TCG，CGA，GAT， TAT，CCA，CAT, CTC46. EMPI1-46 :Tm = 54,60merCTT，ACG，CGG，ACG，TCC，TTT，CAT, CAT, TGT，GGC，GTG，ATC，ATC，GAG, ATG，TGG， ATA，ATC，TCG，CGA
47. EMPI1-47 :Tm = 54,60merATG，AAA, GGA，CGT，CCG，CGT，AAG，ACT, ACT, CCT，GAC，GTA，AGT，CGC，TCC，GAG, ATT，CCT，GCG，TCA48. EMPI1-48 :Tm = 54,60merGGG，AAT，GAT，GAT，GAC，ATT，GCG，CAC，AGT，ATG，TGT，TGT，TGT，TGA，CGC，AGG， AAT, CTC, GGA, GCG49. EMPI1-49 :Tm = 54,60mer CGC，AAT，GTC，ATC，ATC，ATT，CCC，ACA，GCA，GTA，CAA，GGA，GAA，AAC，GAA，ATC， TCC, AGG, ACC, TTC50. EMPI1-50 :Tm = 54,60merGAT，ATG，AGG，TTG，TCC，TTC，CGA，GCC，ATT，GCG，GTA，CAC，GAT，GAA，GGT，CCT， GGA，GAT，TTC，GTT51. EMPII-51 :Tm = 54,60merTCG，GAA，GGA，CAA，CCT，CAT, ATC，TGT，GCT，GGA，GAG, CGT，CGC，GAC，AGA，TTG， CGT，CGT，ACC，AAG52. EMPI1-52 :Tm = 54,60merCAG，GAT，TGT，CCG，ATT，GAC，TAT，CTC，GCA，TCC，AGC，TTG，ACC，CTT，GGT，ACG， ACG，CAA，TCT，GTC53. EMPI1-53 :Tm = 54,60merATA，GTC，AAT，CGG，ACA，ATC，CTG，CTG，GAC，CAA，AGC，ACC，ATC，CTA，GGC，AAT， CAC，CTC，AGT，TGC54. EMPI1-54 :Tm = 54,60merGCA，GCA，TAT，ACG，TCC，AGG，TCA，TGA，CAT, CTC，CTA，GAA，GTA，GCA，ACT, GAG, GTG，ATT，GCC，TAG55. EMPI1-55 :Tm = 54,60merTGA，CCT，GGA，CGT，ATA，TGC，TGC，GGC，AAA, GGG，ATT，TGC，CAC，CTG，GTG，AAA, TGC，AAC，GCT，ATG56. EMPI1-56 :Tm = 54,60merCGT，CGA，CGT，TAC，AGA，CCA，TCA，CGG，GTT，CTG，ATC，CAC，CGT，CAT, AGC，GTT， GCA, TTT, CAC, CAG57. EMPI1-57 :Tm = 54,60merTGA，TGG，TCT，GTA，ACG，TCG，ACG，GTG，AGT，TTT，CCG，CAG，TTC，AGG，ACA，CCT， GCA, CGC, ACG, GGG58. EMPI1-58 :Tm = 54,60merCGA，CAT, CAC，CAT, CAA，GGT，ATC，CCT，CTG，GTA，GTG，CCC，AAT，CCC，CGT，GCG， TGC，AGG，TGT，CCT59. EMPI1-59 :Tm = 54,60merGAT，ACC，TTG，ATG，GTG，ATG，TCG，TCG，AGT，GTA，CGT，TGC，ACT, TCG，GCA，AGT， TCT，GTG，TGC，GAA
60. EMPI1-60 :Tm = 54,60merTGA，TAG, GTT，TAC，ATG，CAG，GCA，ACG，CTT，TCA，CTT，TCG，CAG，TTC，GCA，CAC， AGA，ACT, TGC，CGA61. EMP11-61 :Tm = 54,60merTGC, CTG, CAT, GTA, AAC, CTA, TCA, AGG, TCT, ATC, CTA, TCA, AGA, TAG, AAG, GTG, ATG, AGG, TAC, ACG62. EMPI1-62 :Tm = 54,60merTGG, TTT, GCC, ATC, ATT, TGA, GTT, CCC, CAC, TGT, CAG, GAT, CAA, CGT, GTA, CCT, CAT, CAC，CTT，CTA63. EMPI1-63 :Tm = 54,60merAAC, TCA, AAT, GAT, GGC, AAA, CCA, GGT, AGC, GAT, GAT, CTG, TGA, TGG, GGT, AGC, GGG，CTT，TAC，GAC64. EMPI1-64 :Tm = 54,60merAAT, CGC, CCA, TCT, TAT, CCC, TCG, GCG, CGT, AGG, GCC, TGG, GCA, GTC, GTA, AAG, CCC，GCT，ACC，CCA65. EMPI1-65 :Tm = 54,60merCGA, GGG, ATA, AGA, TGG, GCG, ATT, CTT, CCT, GAT, GGG, TGA, TGA, GCA, TCA, ACT, GCC，GTA，GGA，GCG66. EMPI1-66 :Tm = 54,60merTCC，AAG，CTC，CCA，TCC，GGG，ACG，GCC，TTT，GAG, AAC，GAG, GGG，CGC，TCC，TAC， GGC，AGT，TGA，TGC67. EMPI1-67 :Tm = 54,60merCGT, CCC, GGA, TGG, GAG, CTT, GGA, GCA, CCC, TCC, AAG, CCT, CGC, CGA, CGC, CGA, GTG，CTA，GAG, GGA68. EMPI1-68 :Tm = 54,60merTCG，GTA，ACA，TCA，GAA，CCT，GTG，AGC，ATC，TCG，ATG，TTG，GGT，TCC，CTC，TAG, CAC，TCG，GCG，TCG69. EMPI1-69 :Tm = 54,60merCAC，AGG，TTC，TGA，TGT，TAC，CGA，GCT，CGA，CAC，GCA，CAA，AAA, CAT, GGT，CAC， TTT，GAA，AGA，AGG70. EMPI1-70 :Tm = 54,60merCCC，GTA，GCC，ATT，ACC，ATT，GCC，TCC，GCA，GAA，ATA，GTC，CTC，CCT，TCT，TTC， AAA, GTG，ACC，ATG71. EMP11-71 :Tm = 54,60merGGC，AAT，GGT，AAT，GGC，TAC，GGG，CAG，TGG，AGG，CCG，GAT，TTT，TTC，TTT，GCC， GGG，GAG, TCA，TTT72. EMPI1-72 :Tm = 54,60merTGG，ACA，TCC， GCA，TTA，GTG，CGA，AAC，GTG，ACC，ACT, CCT，GGG，AAA, TGA，CTC， CCC，GGC，AAA, GAA
73. EMPI1-73 :Tm = 54,60merTCG，CAC，TAA，TGC，GGA，TGT，CCA，TTT，CTT，ACG，GGA，TAG, CTG，AAC，TCC，GAA， AAC，ACG，GTT，CCT74. EMPI1-74 :Tm = 54,60merGTT，GCA，ACG，TCA，CAG，CCG，ATG，AAC，CCA，GCG，CTT，ACC，ATA，AGG，AAC，CGT， GTT，TTC，GGA，GTT75. EMPI1-75 :Tm = 54,60mer
CAT, CGG，CTG，TGA，CGT，TGC，AAC，CAC，TGC，CCG，TAA，CCT，CGG，TCT，TTC，AGT， CGC, GAA, CCT, TGA76. EMPI1-76 :Tm = 54,60merCGC，CGC，CCA，AGG，ACT, CGA，ACC，AAA, AGG，TCA，TCG，CCG，GCC，TCA，AGG，TTC， GCG，ACT, GAA，AGA77. EMPI1-77 :Tm = 54,60merGGT，TCG，AGT，CCT，TGG，GCG，GCG，TAT，TGG，CGC，TGG，GCT，ACG，TGG，GTT，CTT， TAC，GGA，CCA，AGG78. EMPI1-78 :Tm = 54,60merGAT，AAA, CGT，GAG, ACG，CCT，GTA，TTC，AGA，TCG，ACG，TGA，ACA，CCT，TGG，TCC， GTA，AAG，AAC，CCA79. EMPI1-79 :Tm = 54,60merTAC，AGG，CGT，CTC，ACG，TTT，ATC，AGG，GGA，GGG，TCA，GCT，GGA，AAA, AGT，CAT, GGT，CAA，TGA，AGG80. EMPI1-80 :Tm = 54,60merCCC，ACG，CAA，ATG，AGG，GCG，TTA，CCA，GGA，ATA，AAC，CTC，CGG，CCT，TCA，TTG， ACC，ATG，ACT, TTT81. EMP11-81 :Tm = 54,60merTAA，CGC，CCT，CAT, TTG，CGT，GGG，GGC，AGA，CCC，AGC，GGA，CCA，CCT，GGC，ACG， CCA, TGC, CGG, TTC82. EMPI1-82 :Tm = 54,60merGCG，CCA，CTT，TGG，TCA，ACC，ACA，ACC，CCC，CGA，TCC，CAT, TCG，GAA，CCG，GCA， TGG, CGT, GCC, AGG83. EMPI1-83 :Tm = 54,60merTGT，GGT，TGA，CCA，AAG，TGG，CGC，CAC，CTC，GGC，AAA, AGG，CGT，ATT，CGC，GGT， CGG，GGA，TGT，GGC84. EMPI1-84 :Tm = 54,60merTCA，AGG，GAG, CGC，TTA，CCC，CCA，GAT，TGG，AGG，GGC，CAG，GTC，GCC，ACA，TCC， CCG，ACC，GCG，AAT85. EMPI1-85 :Tm = 54,60merTGG，GGG，TAA，GCG，CTC，CCT，TGA，AAG，TTA，TAT，TAA，AGC，TCA，ACG，GCA，GGC， CAC，TGC，GGT，CGC
86. EMPI1-86 :Tm = 54,60merAAT，TGG，GGT，GCT，GAT，ACT, TCT，TTC，CCC，AGG，ATA，GCA，TTA，GCG，ACC，GCA， GTG, GCC, TGC, CGT87. EMPI1-87 :Tm = 54,60merAGA，AGT，ATC，AGC，ACC，CCA，ATT，GCC，CGT，TTC，ATG，TAC，AGA，CAT, AGC，AGG， CCA，TCG，GAT，TCA88. EMPI1-88 :Tm = 54,60merAAT，ACA，TAT，TCC，CCG，GGT，CCT，TCA，ATT，TCA，CCC，TCC，ACT, TGA，ATC，CGA， TGG，CCT，GCT，ATG89. EMPI1-89 :Tm = 54,60merAGG，ACC，CGG，GGA，ATA，TGT，ATT，GCG，GGG，TAC，TTT，CGG，GAT，TGG，CCC，TGG， TTT，ATT，CTT，TCG90. EMPI1-90 :Tm = 54,60merTCC，ACG，GCT，ACA，ACG，GCC，TGC，ATT，CGT，CCT，TCC，AGT，AGA，CGA，AAG，AAT， AAA, CCA，GGG，CCA91. EMP11-91 :Tm = 54,60merGCA，GGC，CGT，TGT，AGC，CGT，GGA，CGC，CCC，TCG，TGA，TTT，GGC，CCT，CGC，GAA， ACG，ATT，GGT，CGA92. EMPI1-92 :Tm = 54,60merACC，TCT，GCG，TGC，TTC，TCC，GGG，TCA，ATT，ATC，ACG，TGG，GCC，TCG，ACC，AAT， CGT，TTC，GCG，AGG93. EMPI1-93 :Tm = 54,60merCCC，GGA，GAA，GCA，CGC，AGA，GGT，TTC，AAA, AAA, CAT, CCG，AGA，CAT, GGT，CCG， CGC, CAA, CGA, TGG94. EMPI1-94 :Tm = 54，55merTGA，TCT，ACT, TGC，TCT，TTA，AGT，TCA，TTT，CTG，CTT，TCC，ATC，GTT，GGC，GCG， GAC，CAT, G利用PCR进行萘双加氧酶全长扩增，在100 μ 1反应体系中，ΕΜΡΙΙ-2-ΕΜΡΙΙ-93共 92个扩增引物的添加量为2ng，2个外侧引物EMPII-I和EMPII-161添加量为30ng。扩增 条件依次为94°C预热Imin ；94°C 30秒，50°C 30秒，72°C IOmin,共25个循环。扩增所使用 的Taq DNA聚合酶为KODFX taq酶(Toyobo公司，日本)。PCR结束后，用0. 8% (w/v)琼脂糖胶回收，取10 μ 1直接与Τ/Α克隆载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4°C连接过夜。之后高效转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，获 得阳性克隆。实施例6萘双加氧酶系统工程菌种构建以 PNap 1:5，-ATGAACCAGACGGAGACGACCCCGATCAGA-3，和 PNap2 5，-TCTTTAAGTTCAT TTCTGCTTTCCATCG-3’为扩增引物对萘双加氧酶系统相关的基因进行PCR扩增。使用KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，扩增条件依次为-MV 30秒，68°C 30秒，72°C 600秒，扩增30 个循环。加入2单位rtaq酶(大连宝生物工程公司)，在72°C延伸30分钟。PCR结束后，1% (w/v)琼脂糖凝胶回收，获得长度为3620bp的萘双加氧酶基因序列。萘双加氧酶基因转入原核生物细胞中一种方式为，将SEQ ID No 1序列直接与表 达载体pBAD/TOPO ThioFusion (Invitrogen)相连，4°C连接2小时。然后将该载体转化感 受态大肠杆菌TOPlO (Invitrogen)。将菌液涂布于含有50 μ g/mL氨苄青霉素的以萘为碳源 的M9固体培养基上，培养后挑取生长良好的菌落。
实施例7萘双加氧酶系统在大肠杆菌中表达对多环芳烃菲的降解挑取实施例6中生长良好的大肠杆菌菌落于20ml LB液体培养基(5g/L酵母提取 物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，pH7. 5)中，37°C振荡培养12小时。加入20 μ 1 100mg/mL 菲后继续培养168小时。以5，OOOg离心lOmin，取上清液分析菲的降解。取5ml上述制备的样品于25ml玻璃离心管中，加入2g无水硫酸钠，充分混勻；力口 入IOml 二氯甲烷，盖紧后超声萃取lh，离心；以5000r/min离心lOmin，取下层萃取液，重复 三次合并二氯甲烷萃取液，用旋转蒸发仪浓缩至干用乙腈定容至2ml。过0. 22 μ m孔径滤膜 后，HPLC分析。图2可以看出，将含有萘双加氧酶系统的大肠杆菌中接种到含有菲的培养基中， 168小时后，菲的浓度由原来的200 μ g/mL降解为29 μ g/mL，培养液中的浓度仅为原来的 14. 5%。序列表<110>上海市农业科学院<120>不动杆菌萘双加氧酶系统及其应用<130>0911<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>SEQ ID No 1<211>3682<212>DNA<213>萘双加氧酶系统<400>1gtgccacctg taattacccg ctatccacta ctttaaaaag tgagaagaca atgaaccaga 60cggagacgac cccgatcaga gtccgcaaga attggaacac cagggagatc gagacgctct 120tcgatgagca ggctggacgc atcgatccgc gcattcatac cgatgaggat ctgtaccagc 180tcgaactgga gcgtgtgttc gctcggtcct ggctcctgtt aggacaggag acgcacattc 240ggaaaccagg tcgatacttc acgacctaca tgggtgacga tcctgtcgtg gtcgtgagac 300agaaagacgc caggatcgcc gtcttcccga accagtgccg ccatcgtggc atgcggatct 360gccgttcgga tcctggaaac gcgaaggcat ttacttgtag tgaccacggg tgggcgtacg 420acactgctgg caaccttatc aaggtgcctt acgaggccga atccttcgca tgcttcgaca 480agaaggaatg gagtccactg aaggctcgag tggagaccta caagggtctg atctttgcca 540actgggacga gaacgccatc gaccttgaca catacctcgg cgaggcgaag ttctacatgg 600accacatgct cgaccgtact gagccaggca ctgaggtcat tccaggcatc cagaagtggg 660ttactccctg tacctggaag ttcgcagcag agcagttctg cagggacatg taccatgccg 720
ggactacagcacacttctca ggcatcatcg ctggtcagcc agaagagctc gagttggctg780atctcgcaccgccgaacttc ggcaagcagt accgcgcatc atggggtggt cacggaagtg840gcttctctatcggcgaccgc aagatgatgc tcgccatgat gggaccgaaa gtcaccagct900acttgaccga aggccgtgcg gcggaaacgg cggcagagcg tctgggcagt atcgagcgcg960gcacgcaaaa catgcttcag cacatcactg tcttgcctac gtctttcttc ctgccaggtg1020tcaacacgatgcgaacatgg catccacgcg ggccgaagga ggtcgaagtg tgggcattca1080cagtcagtca tacggatgct ccagccgaca tcaaggagga gttccgtcgt cagacactac1140gtacctcctctgccgttcgt gtactcgagc aggatcacgg cgagacctgg gtcgagatcc1200agcatttcctgcgaggtcat caggcacgta cccgtcgatt caacgctgag atgaggatgg1260ggcaaagggttcacaccgaa ccagttcacc ctggtcgtac atccaacaac gtgtacagcg1320aagaagctgctcgtggactc tctccacatg ggccgaaaat catcacctcg ccagactggg1380aagcattcaaggcgacgcct taaacctaac gacagctagg gaaacatcgt ggcaccagtt1440agaatacgcatttgattcat aatttaattg gatgcggtgg actatggatt tgaaatctac1500acggcctgattacgatttta aaaaggagtg accatgatcg actcagtcga cagaccagac1560ctcttcgttcgcaagcctgc accggtacca cttcaactgc aaaatcaaat tgggcagtgc1620tactactgggaagctaacct tctcaattat cgccgcttcg atgaatgctt cgcactattt1680gccaaggacatccactactt catccctctc cgcagcacag gaatcttgcg tcattcacgc1740ctcgaatattcggcctcgcg agattatcca catctcgatg atcacgccac aatgatgaaa1800ggacgtccgcgtaagactac tcctgacgta agtcgctccg agattcctgc gtcaacaaca1860acacatactgtgcgcaatgt catcatcatt cccacagcag tacaaggaga aaacgaaatc1920tccaggaccttcatcgtgta ccgcaatggc tcggaaggac aacctcatat ctgtgctgga1980gagcgtcgcgacagattgcg tcgtaccaag ggtcaagctg gatgcgagat agtcaatcgg2040acaatcctgctggaccaaag caccatccta ggcaatcacc tcagttgcta cttctaggag2100atgtcatgacctggacgtat atgctgcggc aaagggattt gccacctggt gaaatgcaac2160gctatgacggtggatcagaa cccgtgatgg tctgtaacgt cgacggtgag ttttccgcag2220ttcaggacacctgcacgcac ggggattggg cactaccaga gggatacctt gatggtgatg2280tcgtcgagtgtacgttgcac ttcggcaagt tctgtgtgcg aactgcgaaa gtgaaagcgt2340tgcctgcatgtaaacctatc aaggtctatc ctatcaagat agaaggtgat gaggtacacg2400ttgatcctgacagtggggaa ctcaaatgat ggcaaaccag gtagcgatga tctgtgatgg2460ggtagcgggctttacgactg cccaggccct acgcgccgag ggataagatg ggcgattctt2520cctgatgggtgatgagcatc aactgccgta ggagcgcccc tcgttctcaa aggccgtccc2580ggatgggagcttggagcacc ctccaagcct cgccgacgcc gagtgctaga gggaacccaa2640catcgagatgctcacaggtt ctgatgttac cgagctcgac acgcacaaaa acatggtcac2700tttgaaagaagggaggacta tttctgcgga ggcaatggta atggctacgg gcagtggagg2760ccggattttttctttgccgg ggagtcattt cccaggagtg gtcacgtttc gcactaatgc2820ggatgtccatttcttacggg atagctgaac tccgaaaaca cggttcctta tggtaagcgc2880tgggttcatcggctgtgacg ttgcaaccac tgcccgtaac ctcggtcttt cagtcgcgaa2940ccttgaggccggcgatgacc ttttggttcg agtccttggg cggcgtattg gcgctgggct3000acgtgggttctttacggacc aaggtgttca cgtcgatctg aatacaggcg tctcacgttt3060
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一种不动杆菌萘双加氧酶系统，序列为SEQ ID NO 1。
2.根据权利要求1所述的不动杆菌萘双加氧酶系统，在低分子量多环芳烃降解中的应 用，所述的低分子量多环芳烃是指3环或3环以下的多环芳烃化合物。
3.一种包含权利要求1所述的不动杆菌萘双加氧酶系统的表达载体。
4.根据权利要求3所述的不动杆菌萘双加氧酶系统的表达载体，其特征在于所述表达 载体为pBAD/TOPO载体，其通过与SEQ ID Nol序列直接连接形成。
5.根据权利要求4所述的含有不动杆菌萘双加氧酶系统的表达载体，在低分子量多环 芳烃降解中的应用，所述的低分子量多环芳烃是指3环或3环以下的多环芳烃化合物。
全文摘要
一种不动杆菌萘双加氧酶系统，全长3682bp。通过培养、提取总DNA和功能互补法克隆得到的萘双加氧酶系统的序列为SEQ ID No 1。该序列及其表达载体可应用于低分子量多环芳烃的降解。
文档编号A62D3/02GK101955951SQ200910055020
公开日2011年1月26日 申请日期2009年7月17日 优先权日2009年7月17日
发明者付晓燕, 姚泉洪, 孙广东, 彭日荷, 熊爱生, 田永生, 赵伟, 高峰 申请人:上海市农业科学院
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