一种农药降解酶剂及其制备方法
专利名称：一种农药降解酶剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及酶制剂制备工艺的技术领域，具体地说是一种农药降解酶剂及其制备方法。
背景技术：
农药残留导致农业生产环境恶化，威胁食品安全，一直是国内外关注的问题。农药残留的生物降解是目前国内外研究的热点，利用基因工程手段构建农药解毒酶基因工程菌，发酵并表达农药降解酶是是目前解决农药残留问题的有效技术手段，具有安全、高效、无二次污染等特点。农药降解酶的制备工艺直接关系到酶活力的高低，利用基因工程菌制备农药降解 酶的工艺包括种子培养、发酵培养、菌体收集、菌体破碎和粗酶提取等步骤。在种子培养和发酵培养过程中要保持一定的抗生素压力以保持工程菌中的质粒不丢失。在发酵前期要加入诱导物，诱导酶蛋白的表达，诱导物一般为异丙基硫代半乳糖苷。酶蛋白通常存在于细胞内部，所以发酵结束后首先要收集菌体，离心法简单易行且回收率高，是工业化生产首选的收集方法。菌体破碎是粗酶提取的关键工艺，直接关系到酶活性高低和酶液的品质。菌体破碎方法有超声波破碎、真空负压破碎、机械搅拌破碎、低温冻融破碎等方法，其中超声波破碎方法简单且效率较高，适合工业化生产。
发明内容
本发明目的在于提供一种农药降解酶剂及其制备方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种农药降解酶剂，所述农药降解酶剂为，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCC No. 1529的基因工程菌株发酵培养后的菌体破碎的上清液。农药降解酶剂为在LB培养基中培养后的基因工程菌菌液再经发酵培养后的发酵液；即将基因工程菌在含氨苄青霉素的LB液体培养基中37°C，溶氧量20-30%，培养10-15小时，而后按体积比1% -5%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，37°C，溶氧量20-30%，培养2-4小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到22°C -25°C，诱导表达18-22个小时后菌体经过破碎并回溶于原发酵液体积的O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液，离心得到的上清液即为降解酶剂。农药降解酶剂的制备方法，将基因工程菌在含氨苄青霉素的LB液体培养基中370C，溶氧量20-30 %，培养10-15小时，而后按体积比I % _5%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，37 °C，溶氧量20-30 %，培养2-4小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到22°C _25°C，诱导表达18-22个小时后菌体经过破碎并回溶于原发酵液体积的O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液，离心得到的上清液即为降解酶剂。
将上述所得发酵液以5000rpm离心10分钟收集菌体，并加入发酵液体积1/10-1/20的O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶菌体，而后以5000rpm离心10分钟收集菌体，将收集的菌体中加入液氮破碎菌体，待液氮挥发干净后将菌体冷冻干燥，将冻干后的菌体用O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶至原发酵液体积，再以10000-12000Rpm离心10-20分钟收集上清液，即为农药降解酶剂。所述发酵培养为按重量百分比计，蛋白胨2% -3 %、酵母粉2% -3 %、甘油2% -3%, K2HPO4 O. 25%, KH2PO4 O. 016%, NaCl O. 05%, MgSO4 · H2O O. 025%，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的发酵培养基为每毫升发酵培养基中添加50-75 μ g的氨苄青霉素。所述LB液体培养基为按重量百分比计，胰蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠I %，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的LB液体培养基为每毫升LB液体培养基中添加50-75 μ g的氨苄青霉素。所述回溶菌体离心收集菌体，将收集的菌体平铺于铁制或钢制容器中，菌体厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌体，加入液氮的高度高于菌体表面O. 5-lcm，待液氮挥发干净后将菌体真空冷冻干燥，其真空度30pa，冻干温度-50°C，冻干时间8-12h。所述降解酶剂用于降解有机磷农药的残留。
本发明所具有的优点为1.本发明制备的农药降解酶剂能够降解有机磷农药残留，可以去除水果、蔬菜表面农药残留，保障食品安全。2.本发明制备的农药降解酶剂酶活力高，作用迅速。3.本发明制备的农药降解酶剂酶活力稳定。不易失活。4.本发明制备的农药降解酶剂安全高效，无毒副作用。
具体实施例方式实施例1将保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCCNo. 1529的基因工程菌株接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，培养温度37°C，溶氧量20%，培养时间10个小时。LB液体培养基为按重量百分比计，胰蛋白胨I %、酵母粉0.5%、氯化钠I %，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的LB液体培养基为每毫升LB液体培养基中添加50 μ g的氨苄青霉素。所述基因工程菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 1529，另参见申请号200510086957. 3中的相关记载。而后按体积比1%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，在370C，溶氧量20%，培养2小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到25°C，诱导表达20个小时后将发酵液以5000rpm离心10分钟收集菌体，并加入1/10发酵液体积的O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液(称取Na2HPO4 · 2H20 10. 86g，NaH2PO4 · H2O 5. 38g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。上述缓冲液的pH值应使用酸度计加以校正。)回溶菌体，5000rpm离心10分钟重新收集菌体，将收集的菌体平铺于铁制或钢制容器中，菌体厚度0.1cm,向容器中加入液氮破碎菌体，液氮的高度高于菌体表面0. 5cm，待液氮挥发干净后将菌体置于真空冷冻干燥机冷冻干燥，其中真空冷冻干燥真空度30pa，冻干温度_50°C，冻干时间12h，将冻干后的菌体用0. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶至原发酵液体积，IOOOORpm离心20分钟收集上清液，即为农药降解酶剂。发酵培养为按重量百分比计，蛋白胨2%、酵母粉2%、甘油2%、K2HPO4 O. 25%,KH2PO4 O. 016%, NaCl O. 05%, MgSO4 · H2O O. 025%，蒸馏水，121°C灭菌 20 分钟；含氨苄青霉素的发酵培养基为每毫升发酵培养基中添加50 μ g的氨苄青霉素。检测上述制备所得农药降解酶的酶活力吸取980 μ I O. lmol/L pH7. O的磷酸盐缓冲液，10 μ I 10mg/mL的对硫磷溶液(称取对硫磷标准品IOOmg,用乙醇溶解并定容至IOmL)，充分混匀，加入10 μ I上述农药降解酶剂，30°C反应I分钟，用20 μ I 6mol/L的HCl终止反应，吸取O. 5ml加入4. 5mL O. 05mol/L ρΗΙΟ. O的NaOH-甘氨酸缓冲液(甘氨酸3. 78g，氢氧化钠1. 28g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。上述缓冲液的pH值应使用酸度计加以校正。)充分混匀，于410nm波长下测定产物对硝基苯酚的吸光度，通过标准曲线，计算酶活力。酶活力单位(U)定义为在30°C，pH 7. O的条件下，I分钟降解I μ g甲基对硫磷所需要的酶量定义为一个酶活力单位U。测定上述制备的农药降解酶酶活力为10546U/mL，能够降解有机磷农药残留。 实施例2将基因工程菌接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，培养温度37°C，溶氧量20%，培养时间10个小时。LB液体培养基为按重量百分比计，胰蛋白胨I %、酵母粉0.5%、氯化钠1%，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的LB液体培养基为每毫升LB液体培养基中添加50的氨苄青霉素。而后按体积比1%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，在370C，溶氧量25%，培养3小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到25°C，诱导表达22个小时后将发酵液以5000rpm离心10分钟收集菌体，并加入1/10发酵液体积的O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液(称取Na2HPO4 · 2H20 10. 86g，NaH2PO4 · H2O 5. 38g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。上述缓冲液的pH值应使用酸度计加以校正。)回溶菌体，5000rpm离心10分钟重新收集菌体，将收集的菌体平铺于铁制或钢制容器中，菌体厚度0.1cm,向容器中加入液氮破碎菌体，液氮的高度高于菌体表面0. 5cm，待液氮挥发干净后将菌体置于真空冷冻干燥机冷冻干燥，其真空冷冻干燥真空度30pa，冻干温度-50°C，冻干时间10h，将冻干后的菌体用0. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶至原发酵液体积，IOOOORpm离心20分钟收集上清液，即为农药降解酶剂。发酵培养为按重量百分比计，蛋白胨2.5%、酵母粉2.5%、甘油2.5%、K2HPO40. 25%,KH2PO4 0. 016%,NaCl 0. 05%、MgSO4 ·H2O 0. 025%，蒸馏水，121°C灭菌 20 分钟；含氨苄青霉素的发酵培养基为每毫升发酵培养基中添加50 μ g的氨苄青霉素。检测上述制备所得农药降解酶的酶活力吸取980 μ I 0. lmol/L pH7. O的磷酸盐缓冲液，10 μ I 10mg/mL的对硫磷溶液(称取对硫磷标准品IOOmg,用乙醇溶解并定容至IOmL)，充分混匀，加入10 μ I上述农药降解酶剂，30°C反应I分钟，用20 μ I 6mol/L的HCl终止反应，吸取O. 5ml加入4. 5mL O. 05mol/L ρΗΙΟ. O的NaOH-甘氨酸缓冲液(甘氨酸3. 78g，氢氧化钠1. 28g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。上述缓冲液的pH值应使用酸度计加以校正。)，充分混匀，于410nm波长下测定产物对硝基苯酚的吸光度，通过标准曲线，计算酶活力。酶活力单位(U)定义为在30°C，pH 7. O的条件下，I分钟降解I μ g甲基对硫磷所需要的酶量定义为一个酶活力单位U。测定上述制备的农药降解酶酶活力为11250U/mL,能够降解有机磷农药残留。实施例3将基因工程菌菌接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，培养温度37°C，溶氧量20%，培养时间10个小时。LB液体培养基为按重量百分比计，胰蛋白胨I %、酵母粉0.5%、氯化钠I %，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的LB液体培养基为每毫升LB液体培养基中添加50的氨苄青霉素。而后按体积比2%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，在370C，溶氧量30%，培养3小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到22°C，诱导表达20个小时后将发酵液以5000rpm离心10分钟收集菌体，并加入1/20发酵液体积的O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液(称取Na2HPO4 · 2H20 10. 86g，NaH2PO4 · H2O 5. 38g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。上述缓冲液的pH值应使用酸度计加以校正。)回溶菌体，5000rpm离心10分钟重新收集菌体，将收集的菌体平铺于铁制或钢制 容器中，菌体厚度O. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌体，液氮的高度高于菌体表面1cm，待液氮挥发干净后将菌体置于真空冷冻干燥机冷冻干燥，其中真空冷冻干燥真空度30pa，冻干温度-50°C，冻干时间12h)，将冻干后的菌体用O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶至原发酵液体积，IOOOORpm离心20分钟收集上清液，即为农药降解酶剂。发酵培养为按重量百分比计，蛋白胨3%、酵母粉2%、甘油2. 5%、K2HP04 0. 25%,KH2PO4 0. 016%, NaCl 0. 05%, MgSO4 · H2O 0. 025%，蒸馏水，121°C灭菌 20 分钟；含氨苄青霉素的发酵培养基为每毫升发酵培养基中添加75 μ g的氨苄青霉素。检测上述制备所得农药降解酶的酶活力吸取980 μ I 0. lmol/L pH7. O的磷酸盐缓冲液，10 μ I 10mg/mL的对硫磷溶液(称取对硫磷标准品IOOmg,用乙醇溶解并定容至IOmL)，充分混匀，加入10 μ I上述农药降解酶剂，30°C反应I分钟，用20 μ I 6mol/L的HCl终止反应，吸取0. 5ml加入4. 5mL0. 05mol/L ρΗΙΟ. O的NaOH-甘氨酸缓冲液(甘氨酸3. 78g，氢氧化钠1. 28g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。上述缓冲液的pH值应使用酸度计加以校正。)，充分混匀，于410nm波长下测定产物对硝基苯酚的吸光度，通过标准曲线，计算酶活力。酶活力单位(U)定义为在30°C，pH 7. O的条件下，I分钟降解I μ g甲基对硫磷所需要的酶量定义为一个酶活力单位U。测定上述制备的农药降解酶酶活力为11532U/mL，能够降解有机磷农药残留。
权利要求
1.一种农药降解酶剂，其特征在于所述农药降解酶剂为，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCC No. 1529的基因工程菌株发酵培养后的菌体破碎的上清液。
2.按权利要求1所述的农药降解酶剂，其特征在于农药降解酶剂为在LB培养基中培养后的基因工程菌菌液再经发酵培养后的发酵液；即将基因工程菌在含氨苄青霉素的LB液体培养基中37°C，溶氧量20-30%，培养10-15小时，而后按体积比1% _5%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，37 °C，溶氧量20-30 %，培养2-4小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到22°C _25°C，诱导表达18-22个小时后菌体经过破碎并回溶于原发酵液体积的O. lmol/L pH7. O的磷酸盐缓冲液，离心得到的上清液即为降解酶剂。
3.—种权利要求1所述的农药降解酶剂的制备方法，其特征在于将基因工程菌在含氨苄青霉素的LB液体培养基中37 °C，溶氧量20-30 %，培养I O-15小时，而后按体积比1% -5%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，37°C，溶氧量20-30%，培养2-4小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到220C -25°C，诱导表达18-22个小时后菌体经过破碎并回溶于原发酵液体积的O. lmol/LpH7. O的磷酸盐缓冲液，离心得到的上清液即为降解酶剂。
4.按权利要求4所述的农药降解酶剂的制备方法，其特征在于将上述所得发酵液以5000rpm离心10分钟收集菌体，并加入发酵液体积1/10-1/20的O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶菌体，而后以5000rpm离心10分钟收集菌体，将收集的菌体中加入液氮破碎菌体，待液氮挥发干净后将菌体冷冻干燥，将冻干后的菌体用O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶至原发酵液体积，再以10000-12000Rpm离心10-20分钟收集上清液，即为农药降解酶剂。
5.按权利要求4所述的农药降解酶剂的制备方法，其特征在于所述发酵培养为按重量百分比计，蛋白胨2% -3%、酵母粉2% -3%、甘油2% -3%、K2HPO4 O. 25%, KH2PO4O.016%, NaCl O. 05%, MgSO4 · H2O O. 025%，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的发酵培养基为每毫升发酵培养基中添加50-75 μ g的氨苄青霉素。
6.按权利要求4所述的农药降解酶剂的制备方法，其特征在于所述LB液体培养基为按重量百分比计，胰蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠1%，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的LB液体培养基为每毫升LB液体培养基中添加50-75 μ g的氨苄青霉素。
7.按权利要求4所述的农药降解酶剂的制备方法，其特征在于所述回溶菌体离心收集菌体，将收集的菌体平铺于铁制或钢制容器中，菌体厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌体，加入液氮的高度高于菌体表面O. 5-lcm，待液氮挥发干净后将菌体真空冷冻干燥，其真空度30pa，冻干温度_50°C，冻干时间8-12h。
8.按权利要求4所述的农药降解酶剂的制备方法，其特征在于所述降解酶剂用于降解有机磷农药的残留。
全文摘要
本发明涉及酶剂制备工艺的技术领域，具体地说是一种农药降解酶剂及其制备方法。所述所述农药降解酶剂为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.1529的基因工程菌株发酵培养后的菌体破碎的上清液。本发明制备的农药降解酶剂能够降解有机磷农药残留，可以去除水果、蔬菜表面农药残留，保障食品安全。
文档编号A62D101/26GK102994462SQ20111043107
公开日2013年3月27日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者谢建飞, 石元亮, 卢宗云, 张惠文, 李鹏程, 邢云鹏, 李敏 申请人:辽宁中科生物工程有限公司
技术领域：
本发明涉及酶制剂制备工艺的技术领域，具体地说是一种农药降解酶剂及其制备方法。
背景技术：
农药残留导致农业生产环境恶化，威胁食品安全，一直是国内外关注的问题。农药残留的生物降解是目前国内外研究的热点，利用基因工程手段构建农药解毒酶基因工程菌，发酵并表达农药降解酶是是目前解决农药残留问题的有效技术手段，具有安全、高效、无二次污染等特点。农药降解酶的制备工艺直接关系到酶活力的高低，利用基因工程菌制备农药降解 酶的工艺包括种子培养、发酵培养、菌体收集、菌体破碎和粗酶提取等步骤。在种子培养和发酵培养过程中要保持一定的抗生素压力以保持工程菌中的质粒不丢失。在发酵前期要加入诱导物，诱导酶蛋白的表达，诱导物一般为异丙基硫代半乳糖苷。酶蛋白通常存在于细胞内部，所以发酵结束后首先要收集菌体，离心法简单易行且回收率高，是工业化生产首选的收集方法。菌体破碎是粗酶提取的关键工艺，直接关系到酶活性高低和酶液的品质。菌体破碎方法有超声波破碎、真空负压破碎、机械搅拌破碎、低温冻融破碎等方法，其中超声波破碎方法简单且效率较高，适合工业化生产。
发明内容
本发明目的在于提供一种农药降解酶剂及其制备方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种农药降解酶剂，所述农药降解酶剂为，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCC No. 1529的基因工程菌株发酵培养后的菌体破碎的上清液。农药降解酶剂为在LB培养基中培养后的基因工程菌菌液再经发酵培养后的发酵液；即将基因工程菌在含氨苄青霉素的LB液体培养基中37°C，溶氧量20-30%，培养10-15小时，而后按体积比1% -5%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，37°C，溶氧量20-30%，培养2-4小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到22°C -25°C，诱导表达18-22个小时后菌体经过破碎并回溶于原发酵液体积的O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液，离心得到的上清液即为降解酶剂。农药降解酶剂的制备方法，将基因工程菌在含氨苄青霉素的LB液体培养基中370C，溶氧量20-30 %，培养10-15小时，而后按体积比I % _5%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，37 °C，溶氧量20-30 %，培养2-4小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到22°C _25°C，诱导表达18-22个小时后菌体经过破碎并回溶于原发酵液体积的O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液，离心得到的上清液即为降解酶剂。
将上述所得发酵液以5000rpm离心10分钟收集菌体，并加入发酵液体积1/10-1/20的O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶菌体，而后以5000rpm离心10分钟收集菌体，将收集的菌体中加入液氮破碎菌体，待液氮挥发干净后将菌体冷冻干燥，将冻干后的菌体用O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶至原发酵液体积，再以10000-12000Rpm离心10-20分钟收集上清液，即为农药降解酶剂。所述发酵培养为按重量百分比计，蛋白胨2% -3 %、酵母粉2% -3 %、甘油2% -3%, K2HPO4 O. 25%, KH2PO4 O. 016%, NaCl O. 05%, MgSO4 · H2O O. 025%，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的发酵培养基为每毫升发酵培养基中添加50-75 μ g的氨苄青霉素。所述LB液体培养基为按重量百分比计，胰蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠I %，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的LB液体培养基为每毫升LB液体培养基中添加50-75 μ g的氨苄青霉素。所述回溶菌体离心收集菌体，将收集的菌体平铺于铁制或钢制容器中，菌体厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌体，加入液氮的高度高于菌体表面O. 5-lcm，待液氮挥发干净后将菌体真空冷冻干燥，其真空度30pa，冻干温度-50°C，冻干时间8-12h。所述降解酶剂用于降解有机磷农药的残留。
本发明所具有的优点为1.本发明制备的农药降解酶剂能够降解有机磷农药残留，可以去除水果、蔬菜表面农药残留，保障食品安全。2.本发明制备的农药降解酶剂酶活力高，作用迅速。3.本发明制备的农药降解酶剂酶活力稳定。不易失活。4.本发明制备的农药降解酶剂安全高效，无毒副作用。
具体实施例方式实施例1将保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCCNo. 1529的基因工程菌株接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，培养温度37°C，溶氧量20%，培养时间10个小时。LB液体培养基为按重量百分比计，胰蛋白胨I %、酵母粉0.5%、氯化钠I %，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的LB液体培养基为每毫升LB液体培养基中添加50 μ g的氨苄青霉素。所述基因工程菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 1529，另参见申请号200510086957. 3中的相关记载。而后按体积比1%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，在370C，溶氧量20%，培养2小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到25°C，诱导表达20个小时后将发酵液以5000rpm离心10分钟收集菌体，并加入1/10发酵液体积的O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液(称取Na2HPO4 · 2H20 10. 86g，NaH2PO4 · H2O 5. 38g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。上述缓冲液的pH值应使用酸度计加以校正。)回溶菌体，5000rpm离心10分钟重新收集菌体，将收集的菌体平铺于铁制或钢制容器中，菌体厚度0.1cm,向容器中加入液氮破碎菌体，液氮的高度高于菌体表面0. 5cm，待液氮挥发干净后将菌体置于真空冷冻干燥机冷冻干燥，其中真空冷冻干燥真空度30pa，冻干温度_50°C，冻干时间12h，将冻干后的菌体用0. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶至原发酵液体积，IOOOORpm离心20分钟收集上清液，即为农药降解酶剂。发酵培养为按重量百分比计，蛋白胨2%、酵母粉2%、甘油2%、K2HPO4 O. 25%,KH2PO4 O. 016%, NaCl O. 05%, MgSO4 · H2O O. 025%，蒸馏水，121°C灭菌 20 分钟；含氨苄青霉素的发酵培养基为每毫升发酵培养基中添加50 μ g的氨苄青霉素。检测上述制备所得农药降解酶的酶活力吸取980 μ I O. lmol/L pH7. O的磷酸盐缓冲液，10 μ I 10mg/mL的对硫磷溶液(称取对硫磷标准品IOOmg,用乙醇溶解并定容至IOmL)，充分混匀，加入10 μ I上述农药降解酶剂，30°C反应I分钟，用20 μ I 6mol/L的HCl终止反应，吸取O. 5ml加入4. 5mL O. 05mol/L ρΗΙΟ. O的NaOH-甘氨酸缓冲液(甘氨酸3. 78g，氢氧化钠1. 28g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。上述缓冲液的pH值应使用酸度计加以校正。)充分混匀，于410nm波长下测定产物对硝基苯酚的吸光度，通过标准曲线，计算酶活力。酶活力单位(U)定义为在30°C，pH 7. O的条件下，I分钟降解I μ g甲基对硫磷所需要的酶量定义为一个酶活力单位U。测定上述制备的农药降解酶酶活力为10546U/mL，能够降解有机磷农药残留。 实施例2将基因工程菌接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，培养温度37°C，溶氧量20%，培养时间10个小时。LB液体培养基为按重量百分比计，胰蛋白胨I %、酵母粉0.5%、氯化钠1%，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的LB液体培养基为每毫升LB液体培养基中添加50的氨苄青霉素。而后按体积比1%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，在370C，溶氧量25%，培养3小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到25°C，诱导表达22个小时后将发酵液以5000rpm离心10分钟收集菌体，并加入1/10发酵液体积的O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液(称取Na2HPO4 · 2H20 10. 86g，NaH2PO4 · H2O 5. 38g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。上述缓冲液的pH值应使用酸度计加以校正。)回溶菌体，5000rpm离心10分钟重新收集菌体，将收集的菌体平铺于铁制或钢制容器中，菌体厚度0.1cm,向容器中加入液氮破碎菌体，液氮的高度高于菌体表面0. 5cm，待液氮挥发干净后将菌体置于真空冷冻干燥机冷冻干燥，其真空冷冻干燥真空度30pa，冻干温度-50°C，冻干时间10h，将冻干后的菌体用0. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶至原发酵液体积，IOOOORpm离心20分钟收集上清液，即为农药降解酶剂。发酵培养为按重量百分比计，蛋白胨2.5%、酵母粉2.5%、甘油2.5%、K2HPO40. 25%,KH2PO4 0. 016%,NaCl 0. 05%、MgSO4 ·H2O 0. 025%，蒸馏水，121°C灭菌 20 分钟；含氨苄青霉素的发酵培养基为每毫升发酵培养基中添加50 μ g的氨苄青霉素。检测上述制备所得农药降解酶的酶活力吸取980 μ I 0. lmol/L pH7. O的磷酸盐缓冲液，10 μ I 10mg/mL的对硫磷溶液(称取对硫磷标准品IOOmg,用乙醇溶解并定容至IOmL)，充分混匀，加入10 μ I上述农药降解酶剂，30°C反应I分钟，用20 μ I 6mol/L的HCl终止反应，吸取O. 5ml加入4. 5mL O. 05mol/L ρΗΙΟ. O的NaOH-甘氨酸缓冲液(甘氨酸3. 78g，氢氧化钠1. 28g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。上述缓冲液的pH值应使用酸度计加以校正。)，充分混匀，于410nm波长下测定产物对硝基苯酚的吸光度，通过标准曲线，计算酶活力。酶活力单位(U)定义为在30°C，pH 7. O的条件下，I分钟降解I μ g甲基对硫磷所需要的酶量定义为一个酶活力单位U。测定上述制备的农药降解酶酶活力为11250U/mL,能够降解有机磷农药残留。实施例3将基因工程菌菌接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，培养温度37°C，溶氧量20%，培养时间10个小时。LB液体培养基为按重量百分比计，胰蛋白胨I %、酵母粉0.5%、氯化钠I %，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的LB液体培养基为每毫升LB液体培养基中添加50的氨苄青霉素。而后按体积比2%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，在370C，溶氧量30%，培养3小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到22°C，诱导表达20个小时后将发酵液以5000rpm离心10分钟收集菌体，并加入1/20发酵液体积的O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液(称取Na2HPO4 · 2H20 10. 86g，NaH2PO4 · H2O 5. 38g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。上述缓冲液的pH值应使用酸度计加以校正。)回溶菌体，5000rpm离心10分钟重新收集菌体，将收集的菌体平铺于铁制或钢制 容器中，菌体厚度O. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌体，液氮的高度高于菌体表面1cm，待液氮挥发干净后将菌体置于真空冷冻干燥机冷冻干燥，其中真空冷冻干燥真空度30pa，冻干温度-50°C，冻干时间12h)，将冻干后的菌体用O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶至原发酵液体积，IOOOORpm离心20分钟收集上清液，即为农药降解酶剂。发酵培养为按重量百分比计，蛋白胨3%、酵母粉2%、甘油2. 5%、K2HP04 0. 25%,KH2PO4 0. 016%, NaCl 0. 05%, MgSO4 · H2O 0. 025%，蒸馏水，121°C灭菌 20 分钟；含氨苄青霉素的发酵培养基为每毫升发酵培养基中添加75 μ g的氨苄青霉素。检测上述制备所得农药降解酶的酶活力吸取980 μ I 0. lmol/L pH7. O的磷酸盐缓冲液，10 μ I 10mg/mL的对硫磷溶液(称取对硫磷标准品IOOmg,用乙醇溶解并定容至IOmL)，充分混匀，加入10 μ I上述农药降解酶剂，30°C反应I分钟，用20 μ I 6mol/L的HCl终止反应，吸取0. 5ml加入4. 5mL0. 05mol/L ρΗΙΟ. O的NaOH-甘氨酸缓冲液(甘氨酸3. 78g，氢氧化钠1. 28g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。上述缓冲液的pH值应使用酸度计加以校正。)，充分混匀，于410nm波长下测定产物对硝基苯酚的吸光度，通过标准曲线，计算酶活力。酶活力单位(U)定义为在30°C，pH 7. O的条件下，I分钟降解I μ g甲基对硫磷所需要的酶量定义为一个酶活力单位U。测定上述制备的农药降解酶酶活力为11532U/mL，能够降解有机磷农药残留。
权利要求
1.一种农药降解酶剂，其特征在于所述农药降解酶剂为，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCC No. 1529的基因工程菌株发酵培养后的菌体破碎的上清液。
2.按权利要求1所述的农药降解酶剂，其特征在于农药降解酶剂为在LB培养基中培养后的基因工程菌菌液再经发酵培养后的发酵液；即将基因工程菌在含氨苄青霉素的LB液体培养基中37°C，溶氧量20-30%，培养10-15小时，而后按体积比1% _5%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，37 °C，溶氧量20-30 %，培养2-4小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到22°C _25°C，诱导表达18-22个小时后菌体经过破碎并回溶于原发酵液体积的O. lmol/L pH7. O的磷酸盐缓冲液，离心得到的上清液即为降解酶剂。
3.—种权利要求1所述的农药降解酶剂的制备方法，其特征在于将基因工程菌在含氨苄青霉素的LB液体培养基中37 °C，溶氧量20-30 %，培养I O-15小时，而后按体积比1% -5%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，37°C，溶氧量20-30%，培养2-4小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到220C -25°C，诱导表达18-22个小时后菌体经过破碎并回溶于原发酵液体积的O. lmol/LpH7. O的磷酸盐缓冲液，离心得到的上清液即为降解酶剂。
4.按权利要求4所述的农药降解酶剂的制备方法，其特征在于将上述所得发酵液以5000rpm离心10分钟收集菌体，并加入发酵液体积1/10-1/20的O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶菌体，而后以5000rpm离心10分钟收集菌体，将收集的菌体中加入液氮破碎菌体，待液氮挥发干净后将菌体冷冻干燥，将冻干后的菌体用O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶至原发酵液体积，再以10000-12000Rpm离心10-20分钟收集上清液，即为农药降解酶剂。
5.按权利要求4所述的农药降解酶剂的制备方法，其特征在于所述发酵培养为按重量百分比计，蛋白胨2% -3%、酵母粉2% -3%、甘油2% -3%、K2HPO4 O. 25%, KH2PO4O.016%, NaCl O. 05%, MgSO4 · H2O O. 025%，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的发酵培养基为每毫升发酵培养基中添加50-75 μ g的氨苄青霉素。
6.按权利要求4所述的农药降解酶剂的制备方法，其特征在于所述LB液体培养基为按重量百分比计，胰蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠1%，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的LB液体培养基为每毫升LB液体培养基中添加50-75 μ g的氨苄青霉素。
7.按权利要求4所述的农药降解酶剂的制备方法，其特征在于所述回溶菌体离心收集菌体，将收集的菌体平铺于铁制或钢制容器中，菌体厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌体，加入液氮的高度高于菌体表面O. 5-lcm，待液氮挥发干净后将菌体真空冷冻干燥，其真空度30pa，冻干温度_50°C，冻干时间8-12h。
8.按权利要求4所述的农药降解酶剂的制备方法，其特征在于所述降解酶剂用于降解有机磷农药的残留。
全文摘要
本发明涉及酶剂制备工艺的技术领域，具体地说是一种农药降解酶剂及其制备方法。所述所述农药降解酶剂为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.1529的基因工程菌株发酵培养后的菌体破碎的上清液。本发明制备的农药降解酶剂能够降解有机磷农药残留，可以去除水果、蔬菜表面农药残留，保障食品安全。
文档编号A62D101/26GK102994462SQ20111043107
公开日2013年3月27日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者谢建飞, 石元亮, 卢宗云, 张惠文, 李鹏程, 邢云鹏, 李敏 申请人:辽宁中科生物工程有限公司
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