睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶及其用途的制作方法
专利名称：睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于应用环境微生物技术领域，涉及ー种利用分子生物学技术，从睾丸酮丛毛单胞菌中克隆到一个新的基因，在降解环境污染物睾丸酮、胆固醇上的应用。
背景技术：
，17 P -羟基类固醇脱氢酶(3，17 ^ -HSD)是睾丸酮丛毛单胞菌(C. testosteroni) 中降解类固醇等物质的系列酶中的关键酶，阿根廷科学家利用Northern的分子生物学手段研究发现，此酶受部分类固醇激素诱导(Identification of a novel steroid inducible gene associated with The ^hsd locus of Comamonas testosteroni,Jose Luis Pruneda-Paz and so on, Argentina),然而对于其基因结构及功能未进行研究，国内未见报道。尤其是在C. testosteroni以及假单胞杆菌中未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供ー种睾丸酮丛毛单胞菌3，17 0 -羟基类固醇脱氢酶及其用途，3，17 ^ -HSD基因是首次从C. testosteroni中克隆得到的，并对它进行了序列測定与分祈。同时在大肠杆菌中进行了该基因的高表达以及生物功能的确定。此酶是由254个氨基酸残基组成的，SDS-PAGE显示分子量为29. 5KD。研究发现3，17 P -HSD对睾丸酮、胆固醇有高效降解作用(降解率达90%以上)，是ー种可作用于多种类固醇的酶，该酶的研究、开发和应用在检测和降解环境中睾丸酮、胆固醇及其衍生物具有极大的价值。本发明的睾丸酮丛毛单胞菌3，17 0 -羟基类固醇脱氢酶(3，17 ^-HSD)是
Xho I起始密码子
GCTCGAGATGACAAATCGTTTGCAGGGTAAGGTGGCGCTGGTCACTGGTGGTGCCAGCGGTGTGGGTCTTGA
GGTGGTGAAGCTGCTTCTTGGCGAAGGCGCCAAGGTCGCATTCAGCGATATCAATGAAGCGGCGGGGCAGCAACTGG
CGGCTGAACTGGGCGAACGCTCCATGTTTGTCCGCCATGACGTGAGCAGCGAGGCGGACTGGACGCTTGTGATGGCG
GCGGTGCAGCGGCGTCTGGGCACGCTCAATGTGCTGGTCAACAATGCCGGCATCCTGCTGCCTGGTGACATGGAAAC
AGGGCGTCTGGAGGATTTCAGCCGCCTGCTCAAGATCAACACCGAGTCAGTCTTCATTGGTTGCCAGCAGGGCATTG
CGGCGATGAAGGAGACAGGAGGCTCCATCATCAATATGGCCTCGGTATCGAGCTGGCTGCCCATAGAGCAATACGCC
GGCTATAGCGCCAGCAAGGCCGCCGTGTCGGCACTGACCCGCGCCGCTGCACTGAGCTGTCGAAAGCAAGGCTATGC
GATTCGCGTCAATTCCATTCATCCCGATGGCATCTATACGCCCATGATGCAGGCTTCGCTGCCAAAGGGCGTGAGCA
AGGAAATGGTCTTGCATGACCCCAAGCTCAACCGTGCCGGCCGCGCCTATATGCCCGAGCGTATCGCGCAGCTGGTG
TTGTTCCTGGCCAGCGACGAGTCCAGTGTCATGAGCGGTAGCGAGCTGCATGCAGATAACTCGATTCTGGGCATGGG
GCTATAGGGATCCTTAT
终止密码子BamH I
本发明的睾丸酮丛毛单胞菌3，17 P -羟基类固醇脱氢酶(3，17 ^ -HSD)制取方法是
I.以C. testosteroni基因组为模板，通过PCR技术扩增了末端含有Xho I和BamH I 酶切位点的DNA片段，对其进行了亚克隆及测序，用软件Vector nti 11.5. I对所測定序列进行开放阅读框分析，为ー个完整的开放阅读框，基因全长765bp (如下所示)，通过所測定序列做BLAST分析，确定该基因为3，17 P -HSD。通过XboI和BamHI进行双酶切，使3，17 ^ -HSD基因连接在大肠杆菌高表达载体 pET-15b的Xho I和BamH I酶切位点上构建重组质粒p3/17 P-HSD，转化表达宿主菌BL21 (DE3) (Studier F W，et al. J. Mol. Biol. 1986, 189:113),进行 IPTG 诱导表达。研究发现此酶是由254个氨基酸残基组成的(如下所示)，SDS-PAGE显示分子量为29. 5KD。对大肠杆菌中3,17 0-HSD的表达产物进行了 western blotting验证。确定构建的重组表达宿主菌可进行高表达3，17 ^ -HSD。对大肠杆菌中3，17 ^ -HSD的表达产物做生物活性測定。以睾丸酮和胆固醇为底物，以高效液相色谱法(HPLC)进行残留量測定，研究发现该酶对睾丸酮和胆固醇的生物活性都很强。采用Ni-柱亲和层析，对3，17 P-HSD的表达产物进行了纯化，获得了高纯度 (99. 5%)的3，17 P -HSD。同时它保持了很高的生物活性。本发明的睾丸酮丛毛单胞菌3，17 P -羟基类固醇脱氢酶(3，17 ^ -HSD)用途是 利用本发明构建的工程菌及其产生的酶降解环境中的睾丸酮、胆固醇及其衍生物，改
善环境，它与其他的降解方法相比更高效、经济、安全。本发明的有益效果是3，17 P-HSD基因是首次从C. testosteroni中克隆得到的， 并对它进行了序列測定与分析。同时在大肠杆菌中进行了该基因的高表达以及生物功能的确定。研究发现此酶是由254个氨基酸残基组成的，SDS-PAGE显示分子量为29. 5KD。研究发现3，17 ^ -HSD对睾丸酮、胆固醇有高效降解作用(降解率达90%以上)，是ー种可作用于多种类固醇的酶，该酶的研究、开发和应用在检测和降解环境中睾丸酮、胆固醇及其衍生物具有极大的价值。
图I质粒p3/[email protected]的构建过程示意图2 SDS-PAGE检测3，17 ^ -HSD基因在大肠杆菌中的表达，
Line I、line 10 :蛋白质低分子量标准，
Line 2 BL21 (DE3)/pET_15b 菌体蛋白提取物，
Line 3-9 BL21 (DE3) /p3/17 ^ -HSD 菌体蛋白提取物；
图3 western blotting检测3,17 0-HSD基因在大肠杆菌中的表达,
Line I:蛋白质低分子量标准，
Line 2 DAB 显色 3，17 P -HSD ；
图4 :3，17 P -HSD降解睾丸酮的HPLC图谱，
4. I :ImM睾丸酮标准品色谱图，
4.2 :3,17^ -HSD降解睾丸酮色谱图5 :3，17 P -HSD降解胆固醇的HPLC图谱，
5.I lmM胆固醇标准品色谱图，
5.2 :3,17^ -HSD降解胆固醇色谱图。
具体实施例方式实施例I.睾丸酮丛毛单胞菌3，17 0-羟基类固醇脱氢酶的获得及其用于对睾丸酮的降解
1.1睾丸酮丛毛单胞菌3，17 0-羟基类固醇脱氢酶的获得 I. I. I C. testosteroni 基因组的提取
1)按照I50的比例接种C. testosteroni于IOmlLB培养基中，27°C，180rpm培养过
夜；
2)取过夜培养的菌液Iml于I.5ml Eppendorf管中，13000rpm,4°C离心30s,倒掉上清， 收集沉淀；
3)向管中加入500ul经过高压灭菌的双蒸水，彻底悬浮菌体；
4)加入500ul酹氯仿(I1)混合均勻，室温下放置5min ; 13000rpm,室温离心5min ； 小心吸取上层于新的I. 5mlEppendorf管中；
5)重复步骤4)一次；
6)小心吸取上层于新的I.5mlEppendorf管中，加入1/20V 5M NaCl和2V无水こ醇，震荡混勻，放置-20°C, 30min ; 13000rpm, 4°C,离心 IOmin ；
7)将上清倒掉，加入Iml70%こ醇彻底悬浮沉淀；
8)倒掉上清，将离心管放置数分钟，晾干；
9)加入20-50ul高压灭菌的双蒸水溶解沉淀，进行后续实验或者_20°C保存。，17 3-HSD基因片段的PCR扩增
以 5’ -GCTCGAGATGACAAATCGTTTGCAG-3’ 和 5’ -ATAAGGATCCCTATAGCCCCATGCC-3 ’ 为引物，以I. I提取的C. testosteroni基因组为模板，在以下条件下进行PCR扩增
反应体系
模板 3ul，引物 I 2ul，引物 2 2ul, 10X PCR buffer 5ul，聚合酶(Taq+pfu) lul，dNTP 2ul,双蒸水35ul。扩增条件
a.95°C变性 5min ；
b.95°C变性lmin,54°C退火lmin,72°C延伸lmin,进行30个循环；
c.72°C延伸 IOmin ；
d.4°C保存，放置至室温，1%琼脂糖凝胶电泳检测
I.I. 3目的基因的序列測定及分析
将1%琼脂糖凝胶电泳检测得到的大小合适的片段，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行目的片段的回收，经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的浓度及纯度，之后在T4 DNA连接酶的作用下，与购自上海生エ生物技术有限公司的PUCm-T载体，22°C连接16h，构建重组质粒 T-3/17 3 HSD0采用CaC12转化感受态大肠杆菌DH5 a (TaKaBa),进行氨苄青霉素抗性筛选，挑取平板上的单菌落进行PCR及双酶切鉴定，挑出测序所用的亚克隆，送往测序公司进行DNA测序。测序结果出来后，利用Vector nti 11. 5. I软件对所測定序列进行分析，发现所克隆的DNA片段为ー完整的开放阅读框，其基因全长765bp，编码254个氨基酸残基。重组质粒p3/[email protected]的构建(如图I)质粒T-3/17 ^ HSD以Xho I和BamH I酶切，回收765bp的小片段，连接到经Xho I和 BamH I酶切的质粒pET_15b上(Novagen)，得到了正确的重组质粒，将此质粒转入宿主菌 BL21 (DE3)。，17 P-HSD基因在大肠杆菌中的诱导表达
将含有质粒P3/17 ^ -HSD的BL21 (DE3)菌株按照I :50的比例接种在LB液体培养基中(含有终浓度为100ug/ml氨苄青霉素)，37°C恒温震荡摇床培养过夜(180rpm)，作为种子液使用。将种子液按照I :20的接种量转接到新鲜的LB液体培养基中(含有终浓度为 100ug/ml氨苄青霉素)，37摄氏度，180rpm摇床培养2_3h。加入IPTG(终浓度ImM)，继续摇床培养5h。于IOOOOrpm下离心lOmin，取沉淀(菌体)。用于SDS-PAGE、western blotting检测目的蛋白带的表达。SDS-PAGE检测结果(图 2)和western blotting检测结果(图3)均表明在29. 5KD附近有一条目的蛋白带，与预期
大小一致。，17 ^ -HSD的分离纯化
采用I. 5的方法诱导表达工程菌,在4°C条件下，IOOOOrpm, IOmin离心收集菌体；菌体沉淀用0. 2M pH7. 0磷酸缓冲液悬浮，加入溶菌酶(100ug/ml)进行细胞超声波破碎(200w， 20min), IOOOOrpm,离心15min,取上清,得到酶储备液。 酶储备液进行Ni-柱亲和层析。分别以10倍柱体积的ImM和20mM的咪唑进行洗涤，最后用50mM的咪唑洗脱，以SDS-PAGE检测纯度。结果表明，经过以上纯化过程，获得了纯度高(99. 5%)的3，17 P-HSD目的蛋白。，17 @ -HSD用于降解睾丸酮
1.2. I所需培养基及睾丸酮标准样
无机盐培养基MgS04. 7H20 0. 2g/L;KH2P04 0. 5g/L; (NH4) 2S04 0. 5g/L;K2HP04. 3H20
I.96g/L: 121 °C湿热灭菌20min ;加1%微量元素溶液；加底物S.
微量元素Na2EDTA. 2H20 12g/L;FeS04. 7H20 2g/L;CaC12 lg/L;ZnS04. 7H20 0. 4g/ L;MnS04. H20 0. 4g/L;CuS04. 5H20 0. I g/L;Na2Mo04. 2H20 0. lg/L:pH 7.0，115°C湿热灭菌15min，冷却后4°C保存备用。睾丸酮标准样按照2010版《中国药典》配制。上述培养基中无机盐均为分析纯，睾丸酮标准品购自sigma公司。实验方法
将0. 5mg酶液加入到50ml无机盐培养基(睾丸酮浓度为IuM)中，27°C，180rpm震荡2h， 采用IOOOOrpm离心lOmin，收集无机盐培养基，采用HPLC色谱(色谱柱为C18反相色谱柱； 流动相为水甲醇=45 55 ;流速为I. 0ml/mim;检测波长为250nm ;进样量为50ul ;柱温为 40°C)分析睾丸酮的残留量。结果(图4)表明，本发明构建的3，17 ^-HSD表达工程菌表达的酶对降解睾丸酮(降解率达到90%以上)活性高。实施例2.睾丸酮丛毛单胞菌3，17 P -羟基类固醇脱氢酶的获得及其用于对胆固醇的降解
2.I睾丸酮丛毛单胞菌3，17 P -羟基类固醇脱氢酶的获得及其分离纯化參照实施例2.2 3，17 P -HSD用于降解胆固醇
2.2. I所需培养基及胆固醇标准样
无机盐培养基MgS04. 7H20 0. 2g/L;KH2P04 0. 5g/L; (NH4) 2S04 0. 5g/L;K2HP04. 3H20 I. 96g/L: 121 °C湿热灭菌20min ;加1%微量元素溶液；加底物S.
微量元素Na2EDTA. 2H20 12g/L;FeS04. 7H20 2g/L;CaC12 lg/L;ZnS04. 7H20 0. 4g/ L;MnS04. H20 0. 4g/L;CuS04. 5H20 0. I g/L;Na2Mo04. 2H20 0. lg/L:pH 7.0，115°C湿热灭菌15min，冷却后4°C保存备用。胆固醇标准样按照2010版《中国药典》配制。上述培养基中无机盐均为分析纯，胆固醇标准品购自sigma公司。实验方法
将0. 5mg酶液加入到50ml无机盐培养基(胆固醇浓度为IuM)中，27°C，180rpm震荡 2h，采用IOOOOrpm离心lOmin，收集无机盐培养基，采用HPLC色谱(色谱柱为C18反相色谱柱；流动相为100%こ腈；流速为0.检测波长为205nm ;进样量为50ul ;柱温为
35°C)分析睾丸酮的残留量。结果(图5)表明，本发明构建的3，17 ^-HSD表达工程菌表达的酶对降解胆固醇(降解率达到90%以上)活性高。
权利要求
1.ー种睾丸酮丛毛单胞菌3，17 P -羟基类固醇脱氢酶，其特征是Xho I起始密码子GCTCGAGATGACAAATCGTTTGCAGGGTAAGGTGGCGCTGGTCACTGGTGGTGCCAGCGGTGTGGGTCTTGAGGTGGTGAAGCTGCTTCTTGGCGAAGGCGCCAAGGTCGCATTCAGCGATATCAATGAAGCGGCGGGGCAGCAACTGGCGGCTGAACTGGGCGAACGCTCCATGTTTGTCCGCCATGACGTGAGCAGCGAGGCGGACTGGACGCTTGTGATGGCGGCGGTGCAGCGGCGTCTGGGCACGCTCAATGTGCTGGTCAACAATGCCGGCATCCTGCTGCCTGGTGACATGGAAACAGGGCGTCTGGAGGATTTCAGCCGCCTGCTCAAGATCAACACCGAGTCAGTCTTCATTGGTTGCCAGCAGGGCATTGCGGCGATGAAGGAGACAGGAGGCTCCATCATCAATATGGCCTCGGTATCGAGCTGGCTGCCCATAGAGCAATACGCCGGCTATAGCGCCAGCAAGGCCGCCGTGTCGGCACTGACCCGCGCCGCTGCACTGAGCTGTCGAAAGCAAGGCTATGCGATTCGCGTCAATTCCATTCATCCCGATGGCATCTATACGCCCATGATGCAGGCTTCGCTGCCAAAGGGCGTGAGCAAGGAAATGGTCTTGCATGACCCCAAGCTCAACCGTGCCGGCCGCGCCTATATGCCCGAGCGTATCGCGCAGCTGGTGTTGTTCCTGGCCAGCGACGAGTCCAGTGTCATGAGCGGTAGCGAGCTGCATGCAGATAACTCGATTCTGGGCATGGGGCTATAGGGATCCTTAT终止密码子BamH I。
2.ー种睾丸酮丛毛单胞菌3，17 P -羟基类固醇脱氢酶的用途是利用睾丸酮丛毛单胞菌3，17 P -羟基类固醇脱氢酶降解环境中的睾丸酮、胆固醇及其衍生物。
3.如权利要求I所述的ー种睾丸酮丛毛单胞菌3，170-羟基类固醇脱氢酶的制取方法是a.以C.testosteroni基因组为模板，通过PCR技术扩增了末端含有Xho I和BamH I酶切位点的DNA片段，对其进行了亚克隆及测序，用软件Vector nti 11. 5. I对所測定序列进行开放阅读框分析，为ー个完整的开放阅读框，基因全长765bp，通过所測定序列做BLAST 分析，确定该基因为3，17 P-HSD ；b.通过XboI和BamHI进行双酶切，使3，17P-HSD基因连接在大肠杆菌高表达载体 pET-15b的Xho I和BamH I酶切位点上构建重组质粒p3/17 P-HSD，转化表达宿主菌BL21， 进行IPTG诱导表达；此酶是由254个氨基酸残基组成的，SDS-PAGE显示分子量为29. 5KD ；MTNRLQGKVALVTGGASGVGLEVVKLLLGEGAKVAFSDINEAAGQQLAAELGERSMFVRHDVSSEADWTLVM AAVQRRLGTLNVLVNNAGILLPGDMETGRLEDFSRLLKINTESVFIGCQQGIAAMKETGGSIINMASVSSWLPIEQY AGYSASKAAVSALTRAAALSCRKQGYAIRVNSIHPDGIYTPMMQASLPKGVSKEMVLHDPKLNRAGRAYMPERIAQL VLFLASDESSVMSGSELHADNSILGMGL ；c.对大肠杆菌中3,170-HSD的表达产物进行了 western blotting验证；确定构建的重组表达宿主菌可进行高表达3，17 ^ -HSD ；d.对大肠杆菌中3，17^ -HSD的表达产物做生物活性測定；以睾丸酮和胆固醇为底物， 以高效液相色谱法进行残留量測定，该酶对睾丸酮和胆固醇的生物活性都很强；e.采用Ni-柱亲和层析，对3，17P-HSD的表达产物进行了纯化，获得了高纯度的3， 17 3 -HSD。
全文摘要
一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶及其用途，属于应用环境微生物技术领域，其特征是通过分子生物学技术从睾丸酮丛毛单胞菌(C.testosteroni，ATCC11996)中克隆到一个新的基因，其编码的产物是3，17β-羟基类固醇脱氢酶，本发明对其进行了克隆、表达及功能研究发现3，17β-HSD对睾丸酮、胆固醇有高效降解作用，在降解环境中睾丸酮、胆固醇及其衍生物有极大的应用价值。有益效果是3，17β-HSD基因是首次从C.testosteroni中克隆得到的，在大肠杆菌中进行了该基因的高表达以及生物功能的确定。3，17β-HSD对睾丸酮、胆固醇有高效降解作用，是一种可作用于多种类固醇的酶，该酶在检测和降解环境中睾丸酮、胆固醇及其衍生物具有极大的价值。
文档编号A62D101/28GK102604905SQ20121011344
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者于化东, 于源华, 张昊, 张晓 , 王保学 申请人:长春理工大学
技术领域：
本发明属于应用环境微生物技术领域，涉及ー种利用分子生物学技术，从睾丸酮丛毛单胞菌中克隆到一个新的基因，在降解环境污染物睾丸酮、胆固醇上的应用。
背景技术：
，17 P -羟基类固醇脱氢酶(3，17 ^ -HSD)是睾丸酮丛毛单胞菌(C. testosteroni) 中降解类固醇等物质的系列酶中的关键酶，阿根廷科学家利用Northern的分子生物学手段研究发现，此酶受部分类固醇激素诱导(Identification of a novel steroid inducible gene associated with The ^hsd locus of Comamonas testosteroni,Jose Luis Pruneda-Paz and so on, Argentina),然而对于其基因结构及功能未进行研究，国内未见报道。尤其是在C. testosteroni以及假单胞杆菌中未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供ー种睾丸酮丛毛单胞菌3，17 0 -羟基类固醇脱氢酶及其用途，3，17 ^ -HSD基因是首次从C. testosteroni中克隆得到的，并对它进行了序列測定与分祈。同时在大肠杆菌中进行了该基因的高表达以及生物功能的确定。此酶是由254个氨基酸残基组成的，SDS-PAGE显示分子量为29. 5KD。研究发现3，17 P -HSD对睾丸酮、胆固醇有高效降解作用(降解率达90%以上)，是ー种可作用于多种类固醇的酶，该酶的研究、开发和应用在检测和降解环境中睾丸酮、胆固醇及其衍生物具有极大的价值。本发明的睾丸酮丛毛单胞菌3，17 0 -羟基类固醇脱氢酶(3，17 ^-HSD)是
Xho I起始密码子
GCTCGAGATGACAAATCGTTTGCAGGGTAAGGTGGCGCTGGTCACTGGTGGTGCCAGCGGTGTGGGTCTTGA
GGTGGTGAAGCTGCTTCTTGGCGAAGGCGCCAAGGTCGCATTCAGCGATATCAATGAAGCGGCGGGGCAGCAACTGG
CGGCTGAACTGGGCGAACGCTCCATGTTTGTCCGCCATGACGTGAGCAGCGAGGCGGACTGGACGCTTGTGATGGCG
GCGGTGCAGCGGCGTCTGGGCACGCTCAATGTGCTGGTCAACAATGCCGGCATCCTGCTGCCTGGTGACATGGAAAC
AGGGCGTCTGGAGGATTTCAGCCGCCTGCTCAAGATCAACACCGAGTCAGTCTTCATTGGTTGCCAGCAGGGCATTG
CGGCGATGAAGGAGACAGGAGGCTCCATCATCAATATGGCCTCGGTATCGAGCTGGCTGCCCATAGAGCAATACGCC
GGCTATAGCGCCAGCAAGGCCGCCGTGTCGGCACTGACCCGCGCCGCTGCACTGAGCTGTCGAAAGCAAGGCTATGC
GATTCGCGTCAATTCCATTCATCCCGATGGCATCTATACGCCCATGATGCAGGCTTCGCTGCCAAAGGGCGTGAGCA
AGGAAATGGTCTTGCATGACCCCAAGCTCAACCGTGCCGGCCGCGCCTATATGCCCGAGCGTATCGCGCAGCTGGTG
TTGTTCCTGGCCAGCGACGAGTCCAGTGTCATGAGCGGTAGCGAGCTGCATGCAGATAACTCGATTCTGGGCATGGG
GCTATAGGGATCCTTAT
终止密码子BamH I
本发明的睾丸酮丛毛单胞菌3，17 P -羟基类固醇脱氢酶(3，17 ^ -HSD)制取方法是
I.以C. testosteroni基因组为模板，通过PCR技术扩增了末端含有Xho I和BamH I 酶切位点的DNA片段，对其进行了亚克隆及测序，用软件Vector nti 11.5. I对所測定序列进行开放阅读框分析，为ー个完整的开放阅读框，基因全长765bp (如下所示)，通过所測定序列做BLAST分析，确定该基因为3，17 P -HSD。通过XboI和BamHI进行双酶切，使3，17 ^ -HSD基因连接在大肠杆菌高表达载体 pET-15b的Xho I和BamH I酶切位点上构建重组质粒p3/17 P-HSD，转化表达宿主菌BL21 (DE3) (Studier F W，et al. J. Mol. Biol. 1986, 189:113),进行 IPTG 诱导表达。研究发现此酶是由254个氨基酸残基组成的(如下所示)，SDS-PAGE显示分子量为29. 5KD。对大肠杆菌中3,17 0-HSD的表达产物进行了 western blotting验证。确定构建的重组表达宿主菌可进行高表达3，17 ^ -HSD。对大肠杆菌中3，17 ^ -HSD的表达产物做生物活性測定。以睾丸酮和胆固醇为底物，以高效液相色谱法(HPLC)进行残留量測定，研究发现该酶对睾丸酮和胆固醇的生物活性都很强。采用Ni-柱亲和层析，对3，17 P-HSD的表达产物进行了纯化，获得了高纯度 (99. 5%)的3，17 P -HSD。同时它保持了很高的生物活性。本发明的睾丸酮丛毛单胞菌3，17 P -羟基类固醇脱氢酶(3，17 ^ -HSD)用途是 利用本发明构建的工程菌及其产生的酶降解环境中的睾丸酮、胆固醇及其衍生物，改
善环境，它与其他的降解方法相比更高效、经济、安全。本发明的有益效果是3，17 P-HSD基因是首次从C. testosteroni中克隆得到的， 并对它进行了序列測定与分析。同时在大肠杆菌中进行了该基因的高表达以及生物功能的确定。研究发现此酶是由254个氨基酸残基组成的，SDS-PAGE显示分子量为29. 5KD。研究发现3，17 ^ -HSD对睾丸酮、胆固醇有高效降解作用(降解率达90%以上)，是ー种可作用于多种类固醇的酶，该酶的研究、开发和应用在检测和降解环境中睾丸酮、胆固醇及其衍生物具有极大的价值。
图I质粒p3/[email protected]的构建过程示意图2 SDS-PAGE检测3，17 ^ -HSD基因在大肠杆菌中的表达，
Line I、line 10 :蛋白质低分子量标准，
Line 2 BL21 (DE3)/pET_15b 菌体蛋白提取物，
Line 3-9 BL21 (DE3) /p3/17 ^ -HSD 菌体蛋白提取物；
图3 western blotting检测3,17 0-HSD基因在大肠杆菌中的表达,
Line I:蛋白质低分子量标准，
Line 2 DAB 显色 3，17 P -HSD ；
图4 :3，17 P -HSD降解睾丸酮的HPLC图谱，
4. I :ImM睾丸酮标准品色谱图，
4.2 :3,17^ -HSD降解睾丸酮色谱图5 :3，17 P -HSD降解胆固醇的HPLC图谱，
5.I lmM胆固醇标准品色谱图，
5.2 :3,17^ -HSD降解胆固醇色谱图。
具体实施例方式实施例I.睾丸酮丛毛单胞菌3，17 0-羟基类固醇脱氢酶的获得及其用于对睾丸酮的降解
1.1睾丸酮丛毛单胞菌3，17 0-羟基类固醇脱氢酶的获得 I. I. I C. testosteroni 基因组的提取
1)按照I50的比例接种C. testosteroni于IOmlLB培养基中，27°C，180rpm培养过
夜；
2)取过夜培养的菌液Iml于I.5ml Eppendorf管中，13000rpm,4°C离心30s,倒掉上清， 收集沉淀；
3)向管中加入500ul经过高压灭菌的双蒸水，彻底悬浮菌体；
4)加入500ul酹氯仿(I1)混合均勻，室温下放置5min ; 13000rpm,室温离心5min ； 小心吸取上层于新的I. 5mlEppendorf管中；
5)重复步骤4)一次；
6)小心吸取上层于新的I.5mlEppendorf管中，加入1/20V 5M NaCl和2V无水こ醇，震荡混勻，放置-20°C, 30min ; 13000rpm, 4°C,离心 IOmin ；
7)将上清倒掉，加入Iml70%こ醇彻底悬浮沉淀；
8)倒掉上清，将离心管放置数分钟，晾干；
9)加入20-50ul高压灭菌的双蒸水溶解沉淀，进行后续实验或者_20°C保存。，17 3-HSD基因片段的PCR扩增
以 5’ -GCTCGAGATGACAAATCGTTTGCAG-3’ 和 5’ -ATAAGGATCCCTATAGCCCCATGCC-3 ’ 为引物，以I. I提取的C. testosteroni基因组为模板，在以下条件下进行PCR扩增
反应体系
模板 3ul，引物 I 2ul，引物 2 2ul, 10X PCR buffer 5ul，聚合酶(Taq+pfu) lul，dNTP 2ul,双蒸水35ul。扩增条件
a.95°C变性 5min ；
b.95°C变性lmin,54°C退火lmin,72°C延伸lmin,进行30个循环；
c.72°C延伸 IOmin ；
d.4°C保存，放置至室温，1%琼脂糖凝胶电泳检测
I.I. 3目的基因的序列測定及分析
将1%琼脂糖凝胶电泳检测得到的大小合适的片段，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行目的片段的回收，经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的浓度及纯度，之后在T4 DNA连接酶的作用下，与购自上海生エ生物技术有限公司的PUCm-T载体，22°C连接16h，构建重组质粒 T-3/17 3 HSD0采用CaC12转化感受态大肠杆菌DH5 a (TaKaBa),进行氨苄青霉素抗性筛选，挑取平板上的单菌落进行PCR及双酶切鉴定，挑出测序所用的亚克隆，送往测序公司进行DNA测序。测序结果出来后，利用Vector nti 11. 5. I软件对所測定序列进行分析，发现所克隆的DNA片段为ー完整的开放阅读框，其基因全长765bp，编码254个氨基酸残基。重组质粒p3/[email protected]的构建(如图I)质粒T-3/17 ^ HSD以Xho I和BamH I酶切，回收765bp的小片段，连接到经Xho I和 BamH I酶切的质粒pET_15b上(Novagen)，得到了正确的重组质粒，将此质粒转入宿主菌 BL21 (DE3)。，17 P-HSD基因在大肠杆菌中的诱导表达
将含有质粒P3/17 ^ -HSD的BL21 (DE3)菌株按照I :50的比例接种在LB液体培养基中(含有终浓度为100ug/ml氨苄青霉素)，37°C恒温震荡摇床培养过夜(180rpm)，作为种子液使用。将种子液按照I :20的接种量转接到新鲜的LB液体培养基中(含有终浓度为 100ug/ml氨苄青霉素)，37摄氏度，180rpm摇床培养2_3h。加入IPTG(终浓度ImM)，继续摇床培养5h。于IOOOOrpm下离心lOmin，取沉淀(菌体)。用于SDS-PAGE、western blotting检测目的蛋白带的表达。SDS-PAGE检测结果(图 2)和western blotting检测结果(图3)均表明在29. 5KD附近有一条目的蛋白带，与预期
大小一致。，17 ^ -HSD的分离纯化
采用I. 5的方法诱导表达工程菌,在4°C条件下，IOOOOrpm, IOmin离心收集菌体；菌体沉淀用0. 2M pH7. 0磷酸缓冲液悬浮，加入溶菌酶(100ug/ml)进行细胞超声波破碎(200w， 20min), IOOOOrpm,离心15min,取上清,得到酶储备液。 酶储备液进行Ni-柱亲和层析。分别以10倍柱体积的ImM和20mM的咪唑进行洗涤，最后用50mM的咪唑洗脱，以SDS-PAGE检测纯度。结果表明，经过以上纯化过程，获得了纯度高(99. 5%)的3，17 P-HSD目的蛋白。，17 @ -HSD用于降解睾丸酮
1.2. I所需培养基及睾丸酮标准样
无机盐培养基MgS04. 7H20 0. 2g/L;KH2P04 0. 5g/L; (NH4) 2S04 0. 5g/L;K2HP04. 3H20
I.96g/L: 121 °C湿热灭菌20min ;加1%微量元素溶液；加底物S.
微量元素Na2EDTA. 2H20 12g/L;FeS04. 7H20 2g/L;CaC12 lg/L;ZnS04. 7H20 0. 4g/ L;MnS04. H20 0. 4g/L;CuS04. 5H20 0. I g/L;Na2Mo04. 2H20 0. lg/L:pH 7.0，115°C湿热灭菌15min，冷却后4°C保存备用。睾丸酮标准样按照2010版《中国药典》配制。上述培养基中无机盐均为分析纯，睾丸酮标准品购自sigma公司。实验方法
将0. 5mg酶液加入到50ml无机盐培养基(睾丸酮浓度为IuM)中，27°C，180rpm震荡2h， 采用IOOOOrpm离心lOmin，收集无机盐培养基，采用HPLC色谱(色谱柱为C18反相色谱柱； 流动相为水甲醇=45 55 ;流速为I. 0ml/mim;检测波长为250nm ;进样量为50ul ;柱温为 40°C)分析睾丸酮的残留量。结果(图4)表明，本发明构建的3，17 ^-HSD表达工程菌表达的酶对降解睾丸酮(降解率达到90%以上)活性高。实施例2.睾丸酮丛毛单胞菌3，17 P -羟基类固醇脱氢酶的获得及其用于对胆固醇的降解
2.I睾丸酮丛毛单胞菌3，17 P -羟基类固醇脱氢酶的获得及其分离纯化參照实施例2.2 3，17 P -HSD用于降解胆固醇
2.2. I所需培养基及胆固醇标准样
无机盐培养基MgS04. 7H20 0. 2g/L;KH2P04 0. 5g/L; (NH4) 2S04 0. 5g/L;K2HP04. 3H20 I. 96g/L: 121 °C湿热灭菌20min ;加1%微量元素溶液；加底物S.
微量元素Na2EDTA. 2H20 12g/L;FeS04. 7H20 2g/L;CaC12 lg/L;ZnS04. 7H20 0. 4g/ L;MnS04. H20 0. 4g/L;CuS04. 5H20 0. I g/L;Na2Mo04. 2H20 0. lg/L:pH 7.0，115°C湿热灭菌15min，冷却后4°C保存备用。胆固醇标准样按照2010版《中国药典》配制。上述培养基中无机盐均为分析纯，胆固醇标准品购自sigma公司。实验方法
将0. 5mg酶液加入到50ml无机盐培养基(胆固醇浓度为IuM)中，27°C，180rpm震荡 2h，采用IOOOOrpm离心lOmin，收集无机盐培养基，采用HPLC色谱(色谱柱为C18反相色谱柱；流动相为100%こ腈；流速为0.检测波长为205nm ;进样量为50ul ;柱温为
35°C)分析睾丸酮的残留量。结果(图5)表明，本发明构建的3，17 ^-HSD表达工程菌表达的酶对降解胆固醇(降解率达到90%以上)活性高。
权利要求
1.ー种睾丸酮丛毛单胞菌3，17 P -羟基类固醇脱氢酶，其特征是Xho I起始密码子GCTCGAGATGACAAATCGTTTGCAGGGTAAGGTGGCGCTGGTCACTGGTGGTGCCAGCGGTGTGGGTCTTGAGGTGGTGAAGCTGCTTCTTGGCGAAGGCGCCAAGGTCGCATTCAGCGATATCAATGAAGCGGCGGGGCAGCAACTGGCGGCTGAACTGGGCGAACGCTCCATGTTTGTCCGCCATGACGTGAGCAGCGAGGCGGACTGGACGCTTGTGATGGCGGCGGTGCAGCGGCGTCTGGGCACGCTCAATGTGCTGGTCAACAATGCCGGCATCCTGCTGCCTGGTGACATGGAAACAGGGCGTCTGGAGGATTTCAGCCGCCTGCTCAAGATCAACACCGAGTCAGTCTTCATTGGTTGCCAGCAGGGCATTGCGGCGATGAAGGAGACAGGAGGCTCCATCATCAATATGGCCTCGGTATCGAGCTGGCTGCCCATAGAGCAATACGCCGGCTATAGCGCCAGCAAGGCCGCCGTGTCGGCACTGACCCGCGCCGCTGCACTGAGCTGTCGAAAGCAAGGCTATGCGATTCGCGTCAATTCCATTCATCCCGATGGCATCTATACGCCCATGATGCAGGCTTCGCTGCCAAAGGGCGTGAGCAAGGAAATGGTCTTGCATGACCCCAAGCTCAACCGTGCCGGCCGCGCCTATATGCCCGAGCGTATCGCGCAGCTGGTGTTGTTCCTGGCCAGCGACGAGTCCAGTGTCATGAGCGGTAGCGAGCTGCATGCAGATAACTCGATTCTGGGCATGGGGCTATAGGGATCCTTAT终止密码子BamH I。
2.ー种睾丸酮丛毛单胞菌3，17 P -羟基类固醇脱氢酶的用途是利用睾丸酮丛毛单胞菌3，17 P -羟基类固醇脱氢酶降解环境中的睾丸酮、胆固醇及其衍生物。
3.如权利要求I所述的ー种睾丸酮丛毛单胞菌3，170-羟基类固醇脱氢酶的制取方法是a.以C.testosteroni基因组为模板，通过PCR技术扩增了末端含有Xho I和BamH I酶切位点的DNA片段，对其进行了亚克隆及测序，用软件Vector nti 11. 5. I对所測定序列进行开放阅读框分析，为ー个完整的开放阅读框，基因全长765bp，通过所測定序列做BLAST 分析，确定该基因为3，17 P-HSD ；b.通过XboI和BamHI进行双酶切，使3，17P-HSD基因连接在大肠杆菌高表达载体 pET-15b的Xho I和BamH I酶切位点上构建重组质粒p3/17 P-HSD，转化表达宿主菌BL21， 进行IPTG诱导表达；此酶是由254个氨基酸残基组成的，SDS-PAGE显示分子量为29. 5KD ；MTNRLQGKVALVTGGASGVGLEVVKLLLGEGAKVAFSDINEAAGQQLAAELGERSMFVRHDVSSEADWTLVM AAVQRRLGTLNVLVNNAGILLPGDMETGRLEDFSRLLKINTESVFIGCQQGIAAMKETGGSIINMASVSSWLPIEQY AGYSASKAAVSALTRAAALSCRKQGYAIRVNSIHPDGIYTPMMQASLPKGVSKEMVLHDPKLNRAGRAYMPERIAQL VLFLASDESSVMSGSELHADNSILGMGL ；c.对大肠杆菌中3,170-HSD的表达产物进行了 western blotting验证；确定构建的重组表达宿主菌可进行高表达3，17 ^ -HSD ；d.对大肠杆菌中3，17^ -HSD的表达产物做生物活性測定；以睾丸酮和胆固醇为底物， 以高效液相色谱法进行残留量測定，该酶对睾丸酮和胆固醇的生物活性都很强；e.采用Ni-柱亲和层析，对3，17P-HSD的表达产物进行了纯化，获得了高纯度的3， 17 3 -HSD。
全文摘要
一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶及其用途，属于应用环境微生物技术领域，其特征是通过分子生物学技术从睾丸酮丛毛单胞菌(C.testosteroni，ATCC11996)中克隆到一个新的基因，其编码的产物是3，17β-羟基类固醇脱氢酶，本发明对其进行了克隆、表达及功能研究发现3，17β-HSD对睾丸酮、胆固醇有高效降解作用，在降解环境中睾丸酮、胆固醇及其衍生物有极大的应用价值。有益效果是3，17β-HSD基因是首次从C.testosteroni中克隆得到的，在大肠杆菌中进行了该基因的高表达以及生物功能的确定。3，17β-HSD对睾丸酮、胆固醇有高效降解作用，是一种可作用于多种类固醇的酶，该酶在检测和降解环境中睾丸酮、胆固醇及其衍生物具有极大的价值。
文档编号A62D101/28GK102604905SQ20121011344
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者于化东, 于源华, 张昊, 张晓 , 王保学 申请人:长春理工大学
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