一种阿维菌素农药残留降解菌及其生产的菌剂的制作方法
专利名称：一种阿维菌素农药残留降解菌及其生产的菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种阿维菌素农药残留降解菌及其生产的菌剂，属于生物技术领域，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工。
背景技术：
农药在农业生产过程中对防治病虫害、提高农作物产量必不可少，然而，农药在广泛使用的同时也给环境造成了严重的污染，使得农业产量和环境质量之间的矛盾日益突出，许多农药对人和非靶动物具有干扰内分泌作用和“三致”作用(致癌、致畸和致突变)。阿维菌素(Avermectins简称 AVMs)是由放线菌 iStreptomyces avermi til is)产生的一组大环内酯类抗生素，已在很多国家登记使用，在我国已成为甲胺磷等高毒农药的替代品，其单剂和混剂产品在害虫防治工作中发挥着重要作用，广泛适用于蔬菜、果树、棉花和花齐等。近年来，阿维菌素及其复配农药品种和使用量不断增长，但是，由于其被公认属于生物源农药，致使其对土壤和环境的残留污染隐患，一直未被公众重视。但是，按世界卫生组织(WHO)五级分级标准，AVMs仍属高毒化合物，会对环境或生物直接造成影响，而且进入到环境中的药物可能在生物体内富集，并通过食物链的传递而影响到人类的安全，因此AVMS在生物组织中的残留必须引起我们的重视。目前，阿维菌素类药物在农产品或畜产品中的最闻残留限量(MRLs)已有规定，欧盟规定AVMs在果蔬广品、谷物等农广品中MRLs为10ug/kgo然而，目前学术界对AVMs残留降解问题研究报道甚少，市场上也没有可以工业化生产和大面积使用的阿维菌素残留降解剂产品问世。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种阿维菌素农药残留降解菌及用其生产的菌剂。研究表明，微生物对土壤和水环境中残留农药的降解有重要的作用，从自然环境中驯化和筛选出来的土著微生物，对农药有一定的降解作用。本发明人从长期堆放的阿维菌素发酵废渣中，分离、筛选到一株可降解阿维菌素的菌株，经鉴定为嗜热脂肪芽孢杆菌stearothermophilus\舊株命名为kl\\。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，名称为嗜热脂肪芽孢杆菌
5tearo thermophilus )AZ 11，保藏号为 CGMCC NO. 6119，保藏日期为 2012年5 月 17 日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明人使用上述嗜热脂肪芽孢杆菌iBaciIlus s tearo thermophiIus )菌株AZ11，经工业化发酵生产过程，制备了阿维菌素农药残留降解菌剂(含菌量30X 108cfu/g)，该菌剂对阿维菌素残留的降解率达到90%以上，可广泛用于土壤、水体中阿维菌素污染的修复及阿维菌素发酵废渣中残留的降解。本发明的技术方案包括以下方面
本发明提供了一种阿维菌素农药残留降解菌株，该菌株是从长期堆放的阿维菌素发酵废渣中，分离、筛选获得的一株可降解阿维菌素的菌株AZ11，经鉴定为耐高温的嗜热脂肪芽孢杆菌{Bacillus s tearo thermophi Ius ),革兰氏染色为阳性；镜检观察菌体呈杆状，可形成芽孢，芽孢为椭圆形，端生。在LB平板上菌落圆形，灰白色，表面干燥光滑，边缘整齐，半透明；菌株AZll能在葡萄糖复合琼脂上进行厌氧生长，且能在含7% NaCl肉汤培养基中生长，V. P.试验呈阴性，柠檬酸盐利用试验、卵磷脂酶反应、淀粉水解试验、酪素水解试验均呈阳性反应，甲基红试验、吲哚产生试验和苯丙氨酸脱氨试验呈阴性反应，具有分解葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖、甘露醇和木糖的能力，适宜生长PH为7. 0-8. O。上述阿维菌素农药残留降解菌剂的生产过程包括如下步骤
斜面、摇瓶种子培养-种子发酵罐发酵培养-生产发酵罐发酵生产-与载体混匀-产品包装。上述阿维菌素残留降解菌剂的具体生产步骤和工艺条件如下
1)将阿维菌素降解菌AZll斜面保存试管种子，接种至LB液体培养基中，40-45°C振荡培养至对数生长期；
2)将培养好的菌液以10%的接种量接种到IOL种子发酵罐中，40-45°C培养至对数生长期。种子发酵罐的培养及配方为玉米粉2%;豆饼粉1%;葡萄糖0.5%;K2HP04 0 . 4%;MgSO4 7H20 0. 02% ；CaCO3 0. 2% ；pH 7. 2-7. 5 ；
3)将种子发酵罐的发酵液以10%的接种量接种到生产发酵罐中发酵生产，发酵生产中使用的培养基配方为玉米粉3% ;豆饼粉2% ；CaCO3 0. 5% ；K2HPO4 0. 2% ；ZnSO4 5H20 0. 05% ；MgSO4 7H20 0. 05% ；pH 值 7. 2 ;
发酵生产的工艺条件为培养温度40— 45°C，搅拌速度150r/min，罐压为0. 04—0. 06Mpa，无菌空气通气量1:0. 8-1，培养48小时菌数达到35 X 108cfu/mL。4)发酵完成后，发酵完成后，发酵液可以直接稀释为液体菌剂作为产品使用，也可以用草炭或硅藻土吸附，形成固体菌剂，调整菌数为30X 108cfu/g，然后分装为袋装产品。。本发明所制备的阿维菌素降解菌剂对阿维菌素残留的降解率达到90%以上，可广泛用于土壤、水体中阿维菌素残留污染的修复，也可用于阿维菌素发酵废渣及其他有机肥料原料中的阿维菌素残留的降解，还可以在农业生产中直接喷洒于土壤或植物表面，可有效降解去除阿维菌素农药残留，使用方便，成本低，可有效降解去除阿维菌素等农药残留，去除率达到97%以上；还可以直接用于阿维菌素废渣的发酵生产过程中，使废渣发酵产品达到无害化、资源化利用。本发明对于保护环境、土壤及水体污染修复和减少农产品农药残留，改善农产品品质具有重要的意义，适合用于无公害绿色农产品的生产及利用阿维菌素发酵废渣进行无残留生物有机肥料的生产应用。
图I为添加外源营养物质对阿维菌素降解的影响 图2为不同浓度阿维菌素对菌株AZll生长的影响
图3为阿维菌素对温室盆栽模拟污染土壤的降解效果。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明并不局限于此。实施例I:降解菌株的分离
取阿维菌素发酵废渣样品10g，加入装有90mL无菌水的三角瓶中(250mL规格，内装玻璃珠)。振荡15min，静止澄清后，取ImL上清加入99mL基础培养基，分别置4(rC、50°C、60°C恒温箱中，150r/min振荡培养。3天为一周期进行驯化，共5个周期，阿维菌素浓度设置为25mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，每个驯化周期逐步提高。将每次的驯化培养液按照10_\10_2和10_3稀释度涂布基础培养基平板(作为对照)及含阿维菌素的选择培养基平板，挑选生长速度快且能以阿维菌素为唯一碳源的单菌落进一步分离纯化，直至有单菌落出现。
将生长良好的菌株，摇菌培养后，接种到含阿维菌素(浓度为100mg/L)的基础培养基中，置于400C、500C和600C摇床中，150r/min振荡培养，设不接菌的处理为对照，每处理重复3次。分别于接种后6h、12h、24h、48h、72h取培养液，4 °C，lOOOOr/min离心5min，取上清液2mL，用HPLC方法测定阿维菌素含量，计算降解率。降解率(%) = (对照样品残留量-处理样品残留量)/对照样品残留量X 100%。
__表I. ___薩麵釀铢觀_
权利要求
1.一种阿维菌素农药残留降解菌株，从阿维菌素发酵废渣中分离、筛选获得，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，名称为嗜热脂肪芽孢杆菌 Cfeci77w5· stearothermophiIusIklW，媒氣号% CGMCC NO. 6119,保藏日期为 2012 年5月17日。
2.应用权利要求I所述的阿维菌素农药残留降解菌株AZll生产阿维菌素残留降解菌剂的方法，其特征在于生产过程如下 斜面、摇瓶种子培养；种子发酵罐发酵培养；生产发酵罐发酵生产；产品剂型加工、分装。
3.如权利要求2所述生产阿维菌素残留降解菌剂的方法，其特征在于具体生产步骤和工艺条件如下 1)将阿维菌素降解菌AZll斜面保存试管种子，接种至LB液体培养基中，40-45°C振荡培养至对数生长期； 2)将培养好的菌液以10%的接种量接种到IOL种子发酵罐中，40-45°C培养至对数生长期，种子发酵罐的培养及配方为玉米粉2% ;豆饼粉1% ;葡萄糖O. 5% ；Κ2ΗΡ04 O. 4% ；MgSO4 · 7H20 O. 02% ；CaCO3 O. 2% ；pH 7. 2-7. 5 ； 3)将种子发酵罐的发酵液以10%的接种量接种到生产发酵罐中发酵生产，发酵生产中使用的培养基配方为玉米粉3% ;豆饼粉2% ；CaCO3 O. 5% ；K2HPO4 O. 2% ；ZnSO4 · 5H20 O. 05% ；MgSO4 · 7H20 O. 05% ；pH 值 7· 2 ;发酵生产的工艺条件为培养温度40— 45°C，搅拌速度150r/min，罐压为O. 04—O.06Mpa，无菌空气通气量1:0. 8_1，培养48小时菌数达到35X 108cfu/mL ；4)发酵完成后，发酵液可以直接稀释为液体菌剂或用草炭或硅藻土吸附，形成固体菌剂。
4.如权利要求2或3所述生产方法制备的阿维菌素残留降解菌剂的应用，其特征在于用于土壤、水体中阿维菌素残留污染的修复。
5.如权利要求2或3所述生产方法制备的阿维菌素残留降解菌剂的应用，其特征在于用于阿维菌素发酵废渣及其他有机肥料原料中的阿维菌素残留的降解。
6.如权利要求2或3所述生产方法制备的阿维菌素残留降解菌剂的应用，其特征在于直接用于阿维菌素废渣发酵生产过程中，使废渣发酵产品达到无害化。
7.如权利要求2或3所述生产方法制备的阿维菌素残留降解菌剂的应用，其特征在于在农业生产中直接喷洒于土壤或植物表面，有效降解去除阿维菌素农药残留。
全文摘要
本发明为一种阿维菌素农药残留降解菌及其生产的菌剂，涉及嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)AZ11的分离、筛选及用其发酵生产的菌剂及应用。所述菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.6119。使用所述菌株AZ11发酵生产的阿维菌素农药残留降解菌剂可广泛用于土壤、水体中阿维菌素残留污染的修复，也可用于阿维菌素发酵废渣及其他有机肥料原料中的阿维菌素残留的降解，还可以在农业生产中直接喷洒于土壤或植物表面，可有效降解去除阿维菌素农药残留，使用方便，成本低，还可以直接用于阿维菌素废渣的发酵生产过程中，使废渣发酵产品达到无害化、资源化利用。
文档编号A62D3/02GK102732455SQ201210181069
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者周红姿, 李红梅, 李纪顺, 杨合同, 陈凯, 魏艳丽 申请人:山东省科学院生物研究所
技术领域：
本发明涉及一种阿维菌素农药残留降解菌及其生产的菌剂，属于生物技术领域，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工。
背景技术：
农药在农业生产过程中对防治病虫害、提高农作物产量必不可少，然而，农药在广泛使用的同时也给环境造成了严重的污染，使得农业产量和环境质量之间的矛盾日益突出，许多农药对人和非靶动物具有干扰内分泌作用和“三致”作用(致癌、致畸和致突变)。阿维菌素(Avermectins简称 AVMs)是由放线菌 iStreptomyces avermi til is)产生的一组大环内酯类抗生素，已在很多国家登记使用，在我国已成为甲胺磷等高毒农药的替代品，其单剂和混剂产品在害虫防治工作中发挥着重要作用，广泛适用于蔬菜、果树、棉花和花齐等。近年来，阿维菌素及其复配农药品种和使用量不断增长，但是，由于其被公认属于生物源农药，致使其对土壤和环境的残留污染隐患，一直未被公众重视。但是，按世界卫生组织(WHO)五级分级标准，AVMs仍属高毒化合物，会对环境或生物直接造成影响，而且进入到环境中的药物可能在生物体内富集，并通过食物链的传递而影响到人类的安全，因此AVMS在生物组织中的残留必须引起我们的重视。目前，阿维菌素类药物在农产品或畜产品中的最闻残留限量(MRLs)已有规定，欧盟规定AVMs在果蔬广品、谷物等农广品中MRLs为10ug/kgo然而，目前学术界对AVMs残留降解问题研究报道甚少，市场上也没有可以工业化生产和大面积使用的阿维菌素残留降解剂产品问世。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种阿维菌素农药残留降解菌及用其生产的菌剂。研究表明，微生物对土壤和水环境中残留农药的降解有重要的作用，从自然环境中驯化和筛选出来的土著微生物，对农药有一定的降解作用。本发明人从长期堆放的阿维菌素发酵废渣中，分离、筛选到一株可降解阿维菌素的菌株，经鉴定为嗜热脂肪芽孢杆菌stearothermophilus\舊株命名为kl\\。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，名称为嗜热脂肪芽孢杆菌
5tearo thermophilus )AZ 11，保藏号为 CGMCC NO. 6119，保藏日期为 2012年5 月 17 日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明人使用上述嗜热脂肪芽孢杆菌iBaciIlus s tearo thermophiIus )菌株AZ11，经工业化发酵生产过程，制备了阿维菌素农药残留降解菌剂(含菌量30X 108cfu/g)，该菌剂对阿维菌素残留的降解率达到90%以上，可广泛用于土壤、水体中阿维菌素污染的修复及阿维菌素发酵废渣中残留的降解。本发明的技术方案包括以下方面
本发明提供了一种阿维菌素农药残留降解菌株，该菌株是从长期堆放的阿维菌素发酵废渣中，分离、筛选获得的一株可降解阿维菌素的菌株AZ11，经鉴定为耐高温的嗜热脂肪芽孢杆菌{Bacillus s tearo thermophi Ius ),革兰氏染色为阳性；镜检观察菌体呈杆状，可形成芽孢，芽孢为椭圆形，端生。在LB平板上菌落圆形，灰白色，表面干燥光滑，边缘整齐，半透明；菌株AZll能在葡萄糖复合琼脂上进行厌氧生长，且能在含7% NaCl肉汤培养基中生长，V. P.试验呈阴性，柠檬酸盐利用试验、卵磷脂酶反应、淀粉水解试验、酪素水解试验均呈阳性反应，甲基红试验、吲哚产生试验和苯丙氨酸脱氨试验呈阴性反应，具有分解葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖、甘露醇和木糖的能力，适宜生长PH为7. 0-8. O。上述阿维菌素农药残留降解菌剂的生产过程包括如下步骤
斜面、摇瓶种子培养-种子发酵罐发酵培养-生产发酵罐发酵生产-与载体混匀-产品包装。上述阿维菌素残留降解菌剂的具体生产步骤和工艺条件如下
1)将阿维菌素降解菌AZll斜面保存试管种子，接种至LB液体培养基中，40-45°C振荡培养至对数生长期；
2)将培养好的菌液以10%的接种量接种到IOL种子发酵罐中，40-45°C培养至对数生长期。种子发酵罐的培养及配方为玉米粉2%;豆饼粉1%;葡萄糖0.5%;K2HP04 0 . 4%;MgSO4 7H20 0. 02% ；CaCO3 0. 2% ；pH 7. 2-7. 5 ；
3)将种子发酵罐的发酵液以10%的接种量接种到生产发酵罐中发酵生产，发酵生产中使用的培养基配方为玉米粉3% ;豆饼粉2% ；CaCO3 0. 5% ；K2HPO4 0. 2% ；ZnSO4 5H20 0. 05% ；MgSO4 7H20 0. 05% ；pH 值 7. 2 ;
发酵生产的工艺条件为培养温度40— 45°C，搅拌速度150r/min，罐压为0. 04—0. 06Mpa，无菌空气通气量1:0. 8-1，培养48小时菌数达到35 X 108cfu/mL。4)发酵完成后，发酵完成后，发酵液可以直接稀释为液体菌剂作为产品使用，也可以用草炭或硅藻土吸附，形成固体菌剂，调整菌数为30X 108cfu/g，然后分装为袋装产品。。本发明所制备的阿维菌素降解菌剂对阿维菌素残留的降解率达到90%以上，可广泛用于土壤、水体中阿维菌素残留污染的修复，也可用于阿维菌素发酵废渣及其他有机肥料原料中的阿维菌素残留的降解，还可以在农业生产中直接喷洒于土壤或植物表面，可有效降解去除阿维菌素农药残留，使用方便，成本低，可有效降解去除阿维菌素等农药残留，去除率达到97%以上；还可以直接用于阿维菌素废渣的发酵生产过程中，使废渣发酵产品达到无害化、资源化利用。本发明对于保护环境、土壤及水体污染修复和减少农产品农药残留，改善农产品品质具有重要的意义，适合用于无公害绿色农产品的生产及利用阿维菌素发酵废渣进行无残留生物有机肥料的生产应用。
图I为添加外源营养物质对阿维菌素降解的影响 图2为不同浓度阿维菌素对菌株AZll生长的影响
图3为阿维菌素对温室盆栽模拟污染土壤的降解效果。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明并不局限于此。实施例I:降解菌株的分离
取阿维菌素发酵废渣样品10g，加入装有90mL无菌水的三角瓶中(250mL规格，内装玻璃珠)。振荡15min，静止澄清后，取ImL上清加入99mL基础培养基，分别置4(rC、50°C、60°C恒温箱中，150r/min振荡培养。3天为一周期进行驯化，共5个周期，阿维菌素浓度设置为25mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，每个驯化周期逐步提高。将每次的驯化培养液按照10_\10_2和10_3稀释度涂布基础培养基平板(作为对照)及含阿维菌素的选择培养基平板，挑选生长速度快且能以阿维菌素为唯一碳源的单菌落进一步分离纯化，直至有单菌落出现。
将生长良好的菌株，摇菌培养后，接种到含阿维菌素(浓度为100mg/L)的基础培养基中，置于400C、500C和600C摇床中，150r/min振荡培养，设不接菌的处理为对照，每处理重复3次。分别于接种后6h、12h、24h、48h、72h取培养液，4 °C，lOOOOr/min离心5min，取上清液2mL，用HPLC方法测定阿维菌素含量，计算降解率。降解率(%) = (对照样品残留量-处理样品残留量)/对照样品残留量X 100%。
__表I. ___薩麵釀铢觀_
权利要求
1.一种阿维菌素农药残留降解菌株，从阿维菌素发酵废渣中分离、筛选获得，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，名称为嗜热脂肪芽孢杆菌 Cfeci77w5· stearothermophiIusIklW，媒氣号% CGMCC NO. 6119,保藏日期为 2012 年5月17日。
2.应用权利要求I所述的阿维菌素农药残留降解菌株AZll生产阿维菌素残留降解菌剂的方法，其特征在于生产过程如下 斜面、摇瓶种子培养；种子发酵罐发酵培养；生产发酵罐发酵生产；产品剂型加工、分装。
3.如权利要求2所述生产阿维菌素残留降解菌剂的方法，其特征在于具体生产步骤和工艺条件如下 1)将阿维菌素降解菌AZll斜面保存试管种子，接种至LB液体培养基中，40-45°C振荡培养至对数生长期； 2)将培养好的菌液以10%的接种量接种到IOL种子发酵罐中，40-45°C培养至对数生长期，种子发酵罐的培养及配方为玉米粉2% ;豆饼粉1% ;葡萄糖O. 5% ；Κ2ΗΡ04 O. 4% ；MgSO4 · 7H20 O. 02% ；CaCO3 O. 2% ；pH 7. 2-7. 5 ； 3)将种子发酵罐的发酵液以10%的接种量接种到生产发酵罐中发酵生产，发酵生产中使用的培养基配方为玉米粉3% ;豆饼粉2% ；CaCO3 O. 5% ；K2HPO4 O. 2% ；ZnSO4 · 5H20 O. 05% ；MgSO4 · 7H20 O. 05% ；pH 值 7· 2 ;发酵生产的工艺条件为培养温度40— 45°C，搅拌速度150r/min，罐压为O. 04—O.06Mpa，无菌空气通气量1:0. 8_1，培养48小时菌数达到35X 108cfu/mL ；4)发酵完成后，发酵液可以直接稀释为液体菌剂或用草炭或硅藻土吸附，形成固体菌剂。
4.如权利要求2或3所述生产方法制备的阿维菌素残留降解菌剂的应用，其特征在于用于土壤、水体中阿维菌素残留污染的修复。
5.如权利要求2或3所述生产方法制备的阿维菌素残留降解菌剂的应用，其特征在于用于阿维菌素发酵废渣及其他有机肥料原料中的阿维菌素残留的降解。
6.如权利要求2或3所述生产方法制备的阿维菌素残留降解菌剂的应用，其特征在于直接用于阿维菌素废渣发酵生产过程中，使废渣发酵产品达到无害化。
7.如权利要求2或3所述生产方法制备的阿维菌素残留降解菌剂的应用，其特征在于在农业生产中直接喷洒于土壤或植物表面，有效降解去除阿维菌素农药残留。
全文摘要
本发明为一种阿维菌素农药残留降解菌及其生产的菌剂，涉及嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)AZ11的分离、筛选及用其发酵生产的菌剂及应用。所述菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.6119。使用所述菌株AZ11发酵生产的阿维菌素农药残留降解菌剂可广泛用于土壤、水体中阿维菌素残留污染的修复，也可用于阿维菌素发酵废渣及其他有机肥料原料中的阿维菌素残留的降解，还可以在农业生产中直接喷洒于土壤或植物表面，可有效降解去除阿维菌素农药残留，使用方便，成本低，还可以直接用于阿维菌素废渣的发酵生产过程中，使废渣发酵产品达到无害化、资源化利用。
文档编号A62D3/02GK102732455SQ201210181069
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者周红姿, 李红梅, 李纪顺, 杨合同, 陈凯, 魏艳丽 申请人:山东省科学院生物研究所
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