一种谷胱甘肽-s转移酶(gst)蛋白在降解多种农药中的应用的制作方法
专利名称：一种谷胱甘肽-s转移酶(gst)蛋白在降解多种农药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种GST蛋白在降解多种农药中的应用。
背景技术：
化学农药是农业不可缺少的生产资料，每年有数以百万吨的农药应用到农田中，然而仅有小于5%农药真正能到达靶标生物，剩余的大部分则沉积到农田和非靶标生物当中。有相当一部分的农药具有难降解、容易在环境中累积的特点，在斯德哥尔摩公约中提到的15中持久性有机污染物(Pops)中，有9种为农药。农田农药污染物的存在直接影响到农牧业生产。同时，农药会随着粮食、蔬菜、水果中的残留进入人体进而影响人类的身体健康。近年来随着人民生活水平的提高，如何有效地降解农田环境中农药残留物，减少其对环境的负面影响，成为重要课题。其中生物修复对于清除农药的残留和污染起着重要的作用。生物修复是通过活的生物来降解和转化有毒的有机污染物。生物对有机污染物的降解过程都是在生物催化剂酶的参加、催化和调控下进行的。所有的生物都具有生物转化酶和解毒酶，这些酶系在生物体的生命活动中起重要作用。在农药化学品对生物产生影响的过程当中，解毒酶系对于生物体减少外来有毒物质的影响是非常重要的，可将有毒的、脂溶性的有机及外来物质转化成低毒、水溶性的易被生物排泄的代谢产物。微生物繁殖迅速、利于培养、可以在逆境中生存并进行代谢，早已成为环境污染生物修复的主力军，对多种农药亦有降解作用。展开其相关酶系的研究，建立工业化的微生物降解技术具有极大的应用前景。在对微生物的相关酶系的研究中，谷胱甘肽S转移酶(GST)是重要的二相解毒酶。二相解毒酶即催化还原型谷胱甘肽(GSH)、UDP-葡萄糖醛酸或氨基乙酸与活性外源毒性物质相结合，使其变为水溶性较高的内源性物质，以便机体将其进一步降解或排出体外。在公开号为CN101948817的专利申请中，申请人从农药厂周边土壤中筛选得到了一株可高效降解乙酰甲胺磷农药的细菌，经16S RNA鉴定为Stenotrophomonas sp.。该菌株已于2010年9月保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No:4152.依据常规分子生物学试验方法，从菌株中提取基因组后，以下述引物:SPGSTl UP:TCGCGGATCCAATGCTGGAACTGTACGGAAAG ；SPGSTl DN:TCGCCTCGAGCTATCAGGCCACGCCGTTGTCGAC进行PCR扩增，得到605bp大小的核酸片段，将其转入pet28a载体中，转入大肠杆菌中表达，得到了一个约28KDa大小的蛋白，该蛋白尾部因为pet28a载体的编码，带着一个6个精氨酸组成的亲和尾巴，因此可以由N1-NTA亲和柱纯化，并由高浓度咪唑洗脱下来。该GST蛋白属于GST超家族，是参与多种解毒机制的二项解毒酶。在本发明中，将克隆表达得到的GST蛋白用于对多种农药的降解作用，研究其对广谱性农药的作用机理
发明内容
本发明的目的是提供一种GST蛋白用于多种农药降解的应用。为实现本发明的目的，本发明的GST蛋白具有如下的氨基酸序列:MLELYGKPTSINVRKVLWLCAGLDLPLHHEPAPPADLLATLNPNRQVPVLRDGEFVLWESNSICRYLASRAGRDDLLPRAAQDRARVEQWMDWQASDLNSAWRHVFMARVRQHPDYPDDARAEASLAQffNRLMGVLDAQLAAGGYAAGSTFTLADIVLGLSTQRWRSTPGHTPALAHGGAWFERLRQQPGFAEHVDNGVSD本发明提供该GST蛋白对多种农药的降解作用应用，其中所述农药是S-氰戊菊酯、甲基硫菌灵、毒死蜱、马拉硫磷、辛硫酸、吡虫啉、二甲戊灵、苯磺隆、高效氯氰菊酯、乙草胺、戊唑醇之一。本发明还提供上述GST蛋白对多种农药降解作用的应用，其检测方法为HPLC法，检测条件为流速Iml/分钟，检测波长215 295nm，依据不同农药的紫外吸收光谱不同，检测时的检测波长应进行适应性调整。农药降解率按下式计算:W= (1-m/mO) X 100%w-降解率。m0-对照组中的农药峰面积。m-酶反应组中的农药峰面积。
图1为PCR扩增605bp大小的GST片段图2为将GST目的片段插入载体pet28a中结构示意3为在大肠杆菌中的诱导表达、纯化后SDS检测获得28KDa大小的GST蛋白(纯化后的蛋白在左数第3、4条泳道)图4为重组GST蛋白对高效氰戊菊酯农药的降解作用HPLC检测5为重组GST蛋白对戊唑醇农药的降解作用HPLC检测图
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1GST蛋白的获得(一 )菌株来源乙酰甲胺磷降解细菌Stenotrophomonas sp.由本实验自己筛选保存。它是一株可高效降解乙酰甲胺磷农药的细菌，经16S RNA鉴定为Stenotrophomonas sp.。该菌株已经保存中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No:4152。(二)GST基因的克隆用常规分子实验方法进行以下实验。根据鉴定的菌株种属，在NCBI上查阅同一科属的GST基因序列，依据相似保守基序设计引物如下:SPGSTl UP:TCGCGGATCCAATGCTGGAACTGTACGGAAAGSPGSTl DN: TCGCCTCGAGCTATCAGGCCACGCCGTTGTCGAC其中用下划线标注部分分别为Bam H I和Xho I酶切位点。以SPGSTl UP和SPGSTlDN为引物，基因组为模板，使用天根公司Trans pfu Taq DNA聚合酶对GST基因进行扩增，PCR反应体系及条件:
权利要求
1.一种序列为SEQ NO:1的GST蛋白在降解多种农药中的应用，其特征是降解的农药为S-氰戊菊酯、甲基硫菌灵、毒死蜱、马拉硫磷、辛硫酸、吡虫啉、二甲戊灵、苯磺隆、高效氯氰菊酯、乙草胺、戊唑醇之一。
2.如权利要求1所述GST蛋白在降解多种农药中的应用，其特征是检测降解农药的方法为HPLC法。
3.如权利要求2所述GST蛋白在降解多种农药中的应用，其特征是HPLC检测条件为流速Iml/分钟，检测波长215 295nm。
4.如权利要求3所述GST蛋白在降解多种农药中的应用，HPLC检测条件为流速Iml/分钟，检测波长215 295nm，以酶反应和对照的峰面积比值检测降解率，农药降解率按下式计算:w = (1-m/mO) X 100% w-降解率。
m0-对照组中的农药峰面积。
m-酶反应组中的农药峰面积。
全文摘要
本发明涉及一种GST蛋白降解多种农药的应用。该GST蛋白具有如Seq No1的蛋白序列，其具有对S-氰戊菊酯、甲基硫菌灵、毒死蜱、马拉硫磷、辛硫酸、吡虫啉、二甲戊灵、苯磺隆、高效氯氰菊酯、乙草胺、戊唑醇多种农药的降解作用。本发明为降解上述农药提供了一种新的途径。
文档编号A62D101/28GK103170089SQ20121019306
公开日2013年6月26日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年6月13日
发明者于彩虹, 汪未申, 陈敏, 黄莹, 张春辉, 何绪文 申请人:中国矿业大学(北京)
技术领域：
本发明涉及一种GST蛋白在降解多种农药中的应用。
背景技术：
化学农药是农业不可缺少的生产资料，每年有数以百万吨的农药应用到农田中，然而仅有小于5%农药真正能到达靶标生物，剩余的大部分则沉积到农田和非靶标生物当中。有相当一部分的农药具有难降解、容易在环境中累积的特点，在斯德哥尔摩公约中提到的15中持久性有机污染物(Pops)中，有9种为农药。农田农药污染物的存在直接影响到农牧业生产。同时，农药会随着粮食、蔬菜、水果中的残留进入人体进而影响人类的身体健康。近年来随着人民生活水平的提高，如何有效地降解农田环境中农药残留物，减少其对环境的负面影响，成为重要课题。其中生物修复对于清除农药的残留和污染起着重要的作用。生物修复是通过活的生物来降解和转化有毒的有机污染物。生物对有机污染物的降解过程都是在生物催化剂酶的参加、催化和调控下进行的。所有的生物都具有生物转化酶和解毒酶，这些酶系在生物体的生命活动中起重要作用。在农药化学品对生物产生影响的过程当中，解毒酶系对于生物体减少外来有毒物质的影响是非常重要的，可将有毒的、脂溶性的有机及外来物质转化成低毒、水溶性的易被生物排泄的代谢产物。微生物繁殖迅速、利于培养、可以在逆境中生存并进行代谢，早已成为环境污染生物修复的主力军，对多种农药亦有降解作用。展开其相关酶系的研究，建立工业化的微生物降解技术具有极大的应用前景。在对微生物的相关酶系的研究中，谷胱甘肽S转移酶(GST)是重要的二相解毒酶。二相解毒酶即催化还原型谷胱甘肽(GSH)、UDP-葡萄糖醛酸或氨基乙酸与活性外源毒性物质相结合，使其变为水溶性较高的内源性物质，以便机体将其进一步降解或排出体外。在公开号为CN101948817的专利申请中，申请人从农药厂周边土壤中筛选得到了一株可高效降解乙酰甲胺磷农药的细菌，经16S RNA鉴定为Stenotrophomonas sp.。该菌株已于2010年9月保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No:4152.依据常规分子生物学试验方法，从菌株中提取基因组后，以下述引物:SPGSTl UP:TCGCGGATCCAATGCTGGAACTGTACGGAAAG ；SPGSTl DN:TCGCCTCGAGCTATCAGGCCACGCCGTTGTCGAC进行PCR扩增，得到605bp大小的核酸片段，将其转入pet28a载体中，转入大肠杆菌中表达，得到了一个约28KDa大小的蛋白，该蛋白尾部因为pet28a载体的编码，带着一个6个精氨酸组成的亲和尾巴，因此可以由N1-NTA亲和柱纯化，并由高浓度咪唑洗脱下来。该GST蛋白属于GST超家族，是参与多种解毒机制的二项解毒酶。在本发明中，将克隆表达得到的GST蛋白用于对多种农药的降解作用，研究其对广谱性农药的作用机理
发明内容
本发明的目的是提供一种GST蛋白用于多种农药降解的应用。为实现本发明的目的，本发明的GST蛋白具有如下的氨基酸序列:MLELYGKPTSINVRKVLWLCAGLDLPLHHEPAPPADLLATLNPNRQVPVLRDGEFVLWESNSICRYLASRAGRDDLLPRAAQDRARVEQWMDWQASDLNSAWRHVFMARVRQHPDYPDDARAEASLAQffNRLMGVLDAQLAAGGYAAGSTFTLADIVLGLSTQRWRSTPGHTPALAHGGAWFERLRQQPGFAEHVDNGVSD本发明提供该GST蛋白对多种农药的降解作用应用，其中所述农药是S-氰戊菊酯、甲基硫菌灵、毒死蜱、马拉硫磷、辛硫酸、吡虫啉、二甲戊灵、苯磺隆、高效氯氰菊酯、乙草胺、戊唑醇之一。本发明还提供上述GST蛋白对多种农药降解作用的应用，其检测方法为HPLC法，检测条件为流速Iml/分钟，检测波长215 295nm，依据不同农药的紫外吸收光谱不同，检测时的检测波长应进行适应性调整。农药降解率按下式计算:W= (1-m/mO) X 100%w-降解率。m0-对照组中的农药峰面积。m-酶反应组中的农药峰面积。
图1为PCR扩增605bp大小的GST片段图2为将GST目的片段插入载体pet28a中结构示意3为在大肠杆菌中的诱导表达、纯化后SDS检测获得28KDa大小的GST蛋白(纯化后的蛋白在左数第3、4条泳道)图4为重组GST蛋白对高效氰戊菊酯农药的降解作用HPLC检测5为重组GST蛋白对戊唑醇农药的降解作用HPLC检测图
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1GST蛋白的获得(一 )菌株来源乙酰甲胺磷降解细菌Stenotrophomonas sp.由本实验自己筛选保存。它是一株可高效降解乙酰甲胺磷农药的细菌，经16S RNA鉴定为Stenotrophomonas sp.。该菌株已经保存中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No:4152。(二)GST基因的克隆用常规分子实验方法进行以下实验。根据鉴定的菌株种属，在NCBI上查阅同一科属的GST基因序列，依据相似保守基序设计引物如下:SPGSTl UP:TCGCGGATCCAATGCTGGAACTGTACGGAAAGSPGSTl DN: TCGCCTCGAGCTATCAGGCCACGCCGTTGTCGAC其中用下划线标注部分分别为Bam H I和Xho I酶切位点。以SPGSTl UP和SPGSTlDN为引物，基因组为模板，使用天根公司Trans pfu Taq DNA聚合酶对GST基因进行扩增，PCR反应体系及条件:
权利要求
1.一种序列为SEQ NO:1的GST蛋白在降解多种农药中的应用，其特征是降解的农药为S-氰戊菊酯、甲基硫菌灵、毒死蜱、马拉硫磷、辛硫酸、吡虫啉、二甲戊灵、苯磺隆、高效氯氰菊酯、乙草胺、戊唑醇之一。
2.如权利要求1所述GST蛋白在降解多种农药中的应用，其特征是检测降解农药的方法为HPLC法。
3.如权利要求2所述GST蛋白在降解多种农药中的应用，其特征是HPLC检测条件为流速Iml/分钟，检测波长215 295nm。
4.如权利要求3所述GST蛋白在降解多种农药中的应用，HPLC检测条件为流速Iml/分钟，检测波长215 295nm，以酶反应和对照的峰面积比值检测降解率，农药降解率按下式计算:w = (1-m/mO) X 100% w-降解率。
m0-对照组中的农药峰面积。
m-酶反应组中的农药峰面积。
全文摘要
本发明涉及一种GST蛋白降解多种农药的应用。该GST蛋白具有如Seq No1的蛋白序列，其具有对S-氰戊菊酯、甲基硫菌灵、毒死蜱、马拉硫磷、辛硫酸、吡虫啉、二甲戊灵、苯磺隆、高效氯氰菊酯、乙草胺、戊唑醇多种农药的降解作用。本发明为降解上述农药提供了一种新的途径。
文档编号A62D101/28GK103170089SQ20121019306
公开日2013年6月26日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年6月13日
发明者于彩虹, 汪未申, 陈敏, 黄莹, 张春辉, 何绪文 申请人:中国矿业大学(北京)
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